DE2812569C2

DE2812569C2 -

Info

Publication number: DE2812569C2
Application number: DE2812569A
Authority: DE
Inventors: Renato Varese It Cricchio
Original assignee: Gruppo Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1977-04-20
Filing date: 1978-03-22
Publication date: 1992-02-27
Also published as: FI63241B; IE780770L; IE46728B1; NL7804206A; NO150840C; AT356271B; IL54245A0; AU3401178A; ATA277178A; AU512144B2; SE436035B; IT7822418A0; CA1092604A; HK11381A; CH640860A5; SE7804473L; DK159078A; NO150840B; NO781158L; LU79462A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 4- Deoxy-thiazolo[5,4-c]rifamycin-SV-Derivaten der folgenden allgemeinen Formel

worin
R Wasserstoff oder eine geradkettige oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet und
R₁ Wasserstoff oder Acetyl bedeutet, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen molaren Anteil einer Rifamycinverbindung der Formel

mit etwa 1 bis etwa 2 molaren Äquivalenten einer Thioaminosäure der allgemeinen Formel

worin R und R₁ die zuvor gegebenen Bedeutungen besitzen, in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels während einer Zeit von etwa 2 bis etwa 10 Stunden bei einer Temperatur von Zimmertemperatur bis etwa 50°C kondensiert.

Die Erfindung betrifft weiterhin Verbindungen der Formel I, worin R eine geradkettige oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und R₁ Acetyl bedeuten. Die Verbindungen besitzen antimikrobielle Aktivität.

Die Verbindung der obigen Formel I, in der R Wasserstoff und R₁ Acetyl bedeuten, ist als Rifamycin-P bekannt. Sie wird in der DE-PS 25 37 902 und in der US-PS 40 42 683 beschrieben, in der ebenfalls ihre Herstellung durch Fermentation von Nocardia mediterranea-Stämmen ATCC 31 064, 31 065 und 31 066 beschrieben wird. Andere Rifamycinderivate werden zum Beispiel in der DE-PS 26 20 782, der DE-PS 26 09 210 und der DE-OS 26 08 218 beschrieben.

Ringschlußreaktionen, ausgehend von der Chinongruppe unter Einschluß des reaktiven Wasserstoffs in der 3-Stellung, sind an sich bekannt (vgl. zum Beispiel die DE-AS 16 95 384 und die DE-OS 24 28 387). Ringschlußreaktionen von den entsprechenden Aminderivaten werden beispielsweise in der DE-OS 26 22 638 beschrieben.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, erstmals Rifamycin-P und Alkylderivate auf chemischem Weg herzustellen. Die direkte Alkylierung von Rifamycin-P ist nicht möglich, da andere Funktionen des Rifamycin-Ausgangsmaterials, wie die 8-Hydroxygruppe, gleichzeitig alkyliert werden können.

Beispiele für die oben erwähnten Alkylketten sind Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, sek.-Butyl, Isobutyl, tert.-Butyl, Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, Hexyl, 2-Äthylbutyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 2,3-Dimethylbutyl, Heptyl, 2-Äthylpentyl, 3-Äthylpentyl, 2-Methylhexyl, 2,3- Dimethylpentyl, 2,4-Dimethylpentyl, Octyl, 2-Methylheptyl, 3-Methylheptyl, 4-Methylheptyl, 3-Äthylhexyl, 2,3,4-Trimethylpentyl, 3,4-Dimethylhexyl, 2-Methyl-3-äthylpentyl, Nonyl, 2-Methyloctyl, 3-Methyl-4-äthylhexyl, 3,3,4-Trimethylhexyl, 3,4,5-Trimethylhexyl, 4-Methyloctyl, 4-Äthylheptyl, Decyl, 5-Methylnonyl, 3-Methyl-2-äthylheptyl, 1-Methylnonyl, 2,3,5-Trimethylheptyl, 3-Methyl-4-äthylheptyl, 2,2,3,3-Tetramethylhexyl, 4-Propylheptyl, 3,3-Dimethyloctyl, 4-Äthyloctyl und 2,4-Dimethyl-3-äthylhexyl.

Eine bevorzugte Gruppe von Verbindungen sind Verbindungen der Formel I, worin R eine geradkettige oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und R₁ Acetyl bedeuten.

Eine noch bevorzugtere Gruppe von Verbindungen sind solche Verbindungen der Formel I, worin R eine geradkettige oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und R₁ Acetyl bedeuten.

Die Verbindung der Formel I, worin R Wasserstoff und R₁ Acetyl bedeuten, entspricht dem natürlichen Produkt, das in der US-PS 40 42 683 als Rifamycin-P bezeichnet wird. Dieser mikrobiologisch aktive Metabolit wird zusammen mit anderen Naturprodukten durch Fermentation von Stämmen von Nocardia mediterranea, identifiziert durch die folgenden ATCC-Nummern: 31 064, 31 065 und 31 066, erhalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Herstellung der bekannten antibiotischen Substanz Rifamycin P.

Erfindungsgemäß wird Rifamycin-S (oder das entsprechende 25-Desacetylderivat) mit einer geeigneten Thioaminosäure gemäß dem folgenden allgemeinen Schema kondensiert

Bei der tatsächlichen Durchführung wird das erfindungsgemäße Verfahren einfach durchgeführt, indem man einen molaren Anteil an Rifamycin S oder seines 25-Desacetylderivats in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie zum Beispiel einem niedrigen Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, löst und zu dieser Lösung eine Menge der ausgewählten Thioaminosäure der Formel III entsprechend etwa 1 bis etwa 2 molaren Äquivalenten, bezogen auf das Ausgangs-Rifamycin der Formel II, zugibt. Eine Menge an tertiärer, organischer, Stickstoff enthaltender Base entsprechend etwa 2 molaren Anteilen, bezogen auf das Ausgangs-Rifamycin der Formel II, kann zu dem Reaktionsgemisch zugegeben werden, um die Bildung der gewünschten Endverbindungen zu begünstigen.

Geeignete Amine, die verwendet werden können, sind Trimethylamin, Triäthylamin, Pyridin, Picolin, Chinolin, Isochinolin und Analoge. Obgleich diese Amine der Lösung einen alkalischen pH-Wert verleihen, wurde gefunden, daß der Verlauf der Umsetzung nicht durch den pH-Wert des Mediums beeinflußt wird, da gute Ausbeuten von Verbindungen der Formel I ebenfalls erhalten werden können, wenn man sowohl unter neutralen als auch unter sauren Bedingungen arbeitet. Das Reaktionsgemisch wird dann während einer Zeit von etwa 2 bis etwa 10 Stunden bei einer Temperatur zwischen Zimmertemperatur und etwa 50°C stehengelassen, bis eine Prüfung durch Dünnschichtchromatographie das Verschwinden von Rifamycin S, die Anwesenheit eines neuen Fleckens mit einem R_f-Wert von 0,8 und einen Flecken aufgrund von Rifamycin mit R_f=0,05 anzeigt. Die gewünschten Endverbindungen der Formel I werden schließlich gewonnen und nach üblichen chemischen Verfahren gereinigt.

Solche Verfahren umfassen die Verdampfung bis zur Trockene der Reaktionslösung, Reinigung des Rückstands durch Säulenchromatographie und schließlich Umkristallisation aus geeigneten Lösungsmitteln.

Wie oben ausgeführt, besitzen die Verbindungen der Formel I, worin R eine geradkettige oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet, nämlich die 4- Deoxy-2′-alkyl-thiazolo[5,4-c]rifamycin-SV-Derivate, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, antimikrobielle Aktivität. Genauer gesagt, zeigen sie ein breites Spektrum in vito von antibakterieller Aktivität gegenüber grampositiven und gramnegativen Mikroorganismen wie auch Mycobakterien, was aus der folgenden Tabelle erkennbar ist, in der die minimale Hemmkonzentration (MIC) einiger beispielhafter erfindungsgemäßer Verbindungen aufgeführt wird. Die MIC wird als µg/ml angegeben.

Tabelle (MIC)

Die erfindungsgemäßen 4-Deoxy-2′-alkyl-thiazolo[5,4-c]- rifamycin-SV-Derivate sind ebenfalls wirksam gegenüber Rifamycin-resistenten Staphylococcus aureus-Stämmen und besitzen eine überraschende in-vivo-Aktivität gegenüber Versuchsinfektionen durch Staphylococcus aureus, wenn sie sowohl per os als auch subkutan verabreicht werden. Diese in-vivo-Aktivität, ausgedrückt als ED₅₀, kann von etwa 0,3 bis etwa 1 mg/kg per os und etwa 0,1 bis etwa 0,4 mg/kg subkutan variieren.

Weiterhin wurde die antibakterielle in-vitro-Aktivität gegenüber 19 klinischen Isolaten von Mycobacterium avium- Komplex der im folgenden angegebenen Verbindungen gemäß dem folgenden Verfahren bestimmt:
Subkulturen der klinischen Isolate, die aus Schrägkulturen von Lowenstein-Jensen erhalten wurden, wurden in Middlebrook- 7H9-Medium (Difco) plus OADC (Difco) subkultiviert. Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) wurden nach dem zweifachen Agarverdünnungsverfahren (Konzentrationsbereich: 128 bis 0,125 µg/ml) unter Verwendung von Middlebrook-7H10- Agar (Difco), supplementiert mit OADC, bestimmt. Die Platten wurden abgegossen und konnten trocknen und wurden dann mit einem Multipoint-Inokulator (Dynatech) mit einer Suspension mit jedem Isolat eingestellt auf eine optische Dichte, vergleichbar mit der Trübung von Nr. 1 McFarland Standard, inokuliert. Die Platten wurden abgedichtet und bei 37°C drei Wochen inkubiert.

Die MIC (minimale Hemmkonzentration; µg/ml) wurde als die niedrigste Konzentration der Testverbindung definiert, die ein sichtbares Wachstum vollständig inhibiert.

Testverbindungen

Verbindung Nr. 1 (Vergleichsverbindung): Rifamycin der Formel

Ergebnisse

Die in vitro antibakterielle Aktivität gegenüber M. avium-intrazellular (klinische Isolate); MIC (µg/ml)

Verbindung

Weiterhin wurde die minimale Hemmkonzentration gegenüber klinischen Isolaten von Mycobacterium avium (µg/ml) in vitro bestimmt. Die erhaltenen Werte sind wie folgt:

Rifamycin-P zeigt keine Aktivität.

Weiterhin wurde die akute Toxizität der Verbindung Nr. 3 (Isopropylderivat - Beispiel 4) und der Verbindung Nr. 4 (Isobutylderivat - Beispiel 5) im Vergleich mit Rifamycin bestimmt. Die Bestimmung erfolgte mit Mäusen per os.

Gruppen von vier CD1-Mäusen (2 männliche und 2 weibliche; Charles River Labs., Gewicht: 20 bis 22 g) erhielten eine einfache Dosis von 500 mg/kg der Verbindung Nr. 3, der Verbindung Nr. 4 und Rifamycin, suspendiert in 25 mg/ml Dimethylsulfoxid (DMSO): 0,5% Methocel K15 M Premium® (Dow Chem.) in Wasser (5 : 95). Das verabreichte Volumen betrug 20 ml/kg.

Alle Tiere überlebten. Es wurden keine nachteiligen klinischen Zeichen oder ein Gewichtsverlust beobachtet. Die akute Toxizität der Verbindung Nr. 3, der Verbindung Nr. 4 und Rifamycin beträgt somit <500 mg/kg p. o.

Die Literatur berichtet, daß die orale LD₅₀ für die Maus von Rifamycin 858,4 mg/kg (829,5-884,4) beträgt (vgl. Binda et al., Arzneimittelforschung, Bd. 12a, S. 1939, 1971). Zum Vergleich läßt sich folgern, daß die Verbindung Nr. 3 und die Verbindung Nr. 4 keine orale Toxizität in Mäusen zeigen, die schlechter ist als Rifamycin bei den verwendeten Versuchsbedingungen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 4-Deoxy-2′-äthyl-thiazolo[5,4-c]rifamycin-SV

(A) Zu einer Lösung aus 7 g (0,01 Mol) Rifamycin S in 1000 ml Äthanol werden 2,8 g Triäthylamin und 1,5 g (0,0126 Mol) α-Amino-thiobuttersäure zugegeben. Die entstehende Lösung wird 3 h bei etwa 36 °C gehalten, bis das Rifamycin-S vollständig verschwunden ist (Prüfung durch Dünnschichtchromatographie). Das Reaktionsgemisch wird dann zur Trockene eingedampft und der erhaltene Rückstand wird nach dem Auflösen in 15 ml CHCl₃ durch Silikagel unter Eluierung mit einem Gemisch aus Chloroform/ Methanol=99/1 (Vol/Vol) chromatographiert. Die die Titelverbindung enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, zur Trockene konzentriert und der erhaltene Rückstand wird nach dem Auflösen in Äthylacetat unter Rühren in 150 ml Hexan gegossen. Es kristallisiert ein Niederschlag aus, der gesammelt und getrocknet wird. Ausbeute 2,0 g, Fp. 160 bis 165°C.

Elementaranalyse:
C₄₀H₅₀N₂O₁₁S

berechnet:
C 62,64%, H 6,57%, N 3,65%, S 4,13%;
gefunden:
C 61,76%, H 6,68%, N 3,44%, S 3,96%.

UV- und sichtbare Absorptionsbande
Puffer pH 7,38
λ max (mµ)
E 1% 1 cm
410
166
299	329
260	420
225	557

(B) Die Titelverbindung wird ebenfalls durch Auflösen der obigen Mengen an Rifamycin-S und α-Amino-thiobuttersäure in 1000 ml Methanol und Zugabe von 100 ml Phosphatpuffer, pH 4,6, hergestellt. Die entstehende Lösung wird 9 h bei Zimmertemperatur stehengelassen. Ausbeute 28%.

Beispiele 2 bis 8

Die folgenden 4-Deoxy-2′-alkyl-thiazolo[5,4-c]rifamycin- SV-Derivate werden im wesentlichen wie in Beispiel 1(A) beschrieben hergestellt, ausgehend von einer Rifamycinverbindung der Formel II und einer geeigneten Thioaminsäure der Formel III.

Beispiel 2

4-Deoxy-2′-methyl-thiazolo[5,4-c]rifamycin SV aus Rifamycin-S und α-Amino-thiopropionsäure; Ausbeute 32%, Fp. 157 bis 160°C (Zers.)

Elementaranalyse:
C₃₉H₄₈N₂O₁₁S

berechnet:
C 62,22%, H 6,42%, N 3,72%, S 4,26%;
gefunden:
C 61,03%, H 6,36%, N 3,61%, S 4,08%.

UV- und sichtbare Absorptionsbande
Puffer pH 7,38
λ max (mµ)
E 1% 1 cm
408
172
297	316
257	419

Beispiel 3

4-Deoxy-2′-propyl-thiazolo[5,4-c]rifamycin-SV aus Rifamycin-S und α-Amino-thiovaleriansäure, Ausbeute 26%, Fp. 168 bis 170°C.

Elementaranalyse:
C₄₁H₅₂N₂O₁₁S

berechnet:
C 63,09%, H 6,66%, N 3,59%, S 4,11%;
gefunden:
C 62,15%, H 6,66%, N 3,46%, S 3,82%.

UV- und sichtbare Absorptionsbande
Puffer pH 7,38
λ max (mµ)
E 1% 1 cm
404
176
298	353
258	455

Die Titelverbindung wird ebenfalls in 29%iger Ausbeute gemäß dem in Beispiel 1 (B) beschriebenen Verfahren erhalten, mit dem einzigen Unterschied, daß ein Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,8 anstelle des Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 4,6 verwendet wird.

Beispiel 4

4-Deoxy-2′-isopropyl-thiazolo[5,4-c]rifamycin-SV aus Rifamycin-S und α-Amino-3-methyl-thiobuttersäure; Ausbeute 28%; Fp. 168 bis 172°C.

Elementaranalyse:
C₃₆H₄₄N₂O₁₀S

berechnet:
C 63,09%, H 6,66%, N 3,59%, S 4,11%;
gefunden:
C 62,22%, H 6,72%, N 3,49%, S 4,02%.

UV- und sichtbare Absorptionsbande
Puffer pH 7,38
λ max (mµ)
E 1% 1 cm
410
162,5
299	322,4
260	421
225	544

Beispiel 5

4-Deoxy-2′-isobutyl-thiazolo[5,4-c]rifamycin-SV aus Rifamycin-S und α-Amino-4-methyl-thiovaleriansäure; Ausbeute 31%, Fp. 170 bis 175°C.

Elementaranalyse:
C₄₂H₅₄N₂O₁₁S

berechnet:
C 63,46%, H 6,85%, N 3,52%, S 4,03%;
gefunden:
C 62,45%, H 7,05%, N 3,88%, S 3,80%.

UV- und sichtbare Absorptionsbande
Puffer pH 7,38
λ max (mµ)
E 1% 1 cm
410
155
299	260
260	398
225	515

Beispiel 6

4-Deoxy-2′-hexyl-thiazolo[5,4-c]rifamycin-SV aus Rifamycin-S und α-Amino-thiooctansäure; Ausbeute 27%, Fp. 148 bis 150°C (Zers.).

Elementaranalyse:
C₄₄H₅₈N₂O₁₁S

berechnet:
C 64,21%, H 7,10%, N 3,40%, S 3,89%;
gefunden:
C 63,12%, H 7,31%, N 3,58%, S 3,42%.

UV- und sichtbare Absorptionsbande
Puffer pH 7,38
λ max (mµ)
E 1% 1 cm
410
143
298	278
257	356
225	427

Beispiel 7

4-Deoxo-thiazolo[5,4-c]rifamycin-SV (Rifamycin-P) aus Rifamycin-S und α-Aminothioessigsäure; Ausbeute 33%, Fp.: die Verbindung schmilzt über 190°C unter Zersetzung.

Elementaranalyse:
C₃₈H₄₆N₂O₁₁S

berechnet:
C 61,77%, H 6,27%, N 3,79%, S 4,34%;
gefunden:
C 60,27%, H 6,35%, N 3,68%, S 4,19%.

UV- und sichtbare Absorptionsbande (vergl. Fig. 1)

Infrarotspektrum

Die wichtigsten Absorptionspeaks in Nujol treten bei den folgenden Frequenzen auf (cm^-1):

3700-3200 (m, br), 3120-3080 (w), 3000-2850 (vs), 1465 (s), 1380 (br):
Nujol, 1725 (m), 1640 (m, br), 1580 (m), 1520 (m), 1325 (m), 1250 (s, br), 1155 (m), 1130 (w), 1070 (m, br), 1045 (w), 975 (m), 950 (m), 920 (w), 880 (m), 805 (w), 760 (w), 730 (w).

Die Identität mit Rifamycin-P, erhalten durch Fermentation, wird ebenfalls durch das chromatographische Verhalten in verschiedenen Lösungsmittelsystemen und durch Massen- und kernmagnetische Resonanzspektroskopie bestimmt (siehe Fig. 2).

Beispiel 8

25-Desacetyl-4-deoxy-thiazolo[5,4-c]rifamycin-SV aus 25-Desacetyl- rifamycin-S und α-Amino-thioessigsäure, Fp.: die Verbindung schmilzt über 155°C unter Zersetzung.

Elementaranalyse:
berechnet:
C 62,05%, H 6,36%, N 4,02%, S 4,60%;
gefunden:
C 61,98%, H 6,32%, N 4,04%, S 4,56%.

Das UV-Spektrum ist praktisch identisch mit dem von Rifamycin-P.

Gemäß dem in den obigen Beispielen beschriebenen Verfahren können die folgenden 4-Deoxy-2′-alkylthiazolo[5,4-c]- rifamycin-SV-Derivate hergestellt werden.

Die Ausgangs-Thioaminsäuren der Formel III werden gemäß dem von T. Wieland und K. E. Euler in Chem. Ber., 91, 2305, 1958, und R. S. Dewey et al in Journ. Org. Chem., 36, 49, 1971, beschriebenen Verfahren hergestellt. Der Schmelzpunkt dieser Thioaminosäuren wird im folgenden angegeben.

Säure
Fp., °C
α-Amino-thiobuttersäure
250 (Zers.)
α-Amino-thiopropionsäure	190
α-Amino-thiovaleriansäure	200
α-Amino-3-methyl-thiobuttersäure	300
α-Amino-4-methyl-thiovaleriansäure	265 (Zers.)
α-Amino-thiooctansäure	290 (Zers.)
α-Amino-thioessigsäure	160

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von 4-Deoxy-thiazolo[5,4-c]- rifamycin-SV-Derivaten der folgenden allgemeinen Formel in der
R Wasserstoff oder eine geradkettige oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet und
R₁ Wasserstoff oder Acetyl bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man einen molaren Anteil einer Rifamycinverbindung der Formel mit etwa 1 bis etwa 2 molaren Äquivalenten einer Thioaminosäure der Formel worin R und R₁ die zuvor gegebenen Bedeutungen besitzen, in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels während einer Zeit von etwa 2 bis etwa 10 Stunden bei einer Temperatur von Zimmertemperatur bis etwa 50°C kondensiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel ein niedriges Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen verwendet.

3. Verbindungen der allgemeinen Formel in der
R eine geradkettige oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet und
R₁ Acetyl bedeutet.

4. Verbindungen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß R eine geradkettige oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und R₁ Acetyl bedeuten.

5. Verbindung nach Anspruch 3, nämlich 4-Deoxy-2′-isopropyl- thiazolo[5,4-c]rifamycin-SV.

6. Verbindung nach Anspruch 3, nämlich 4-Deoxy-2′-isobutyl- thiazolo[5,4-c]rifamycin-SV.