DE2720041A1

DE2720041A1 - Herzstaerkendes mittel

Info

Publication number: DE2720041A1
Application number: DE19772720041
Authority: DE
Inventors: Midori Kashiwagi; Ted Raymond Norton; Shoji Shibata
Original assignee: University of Hawaii at Manoa
Current assignee: University of Hawaii at Manoa
Priority date: 1976-05-05
Filing date: 1977-05-04
Publication date: 1977-11-24
Also published as: JPS6042800B2; FR2350328A1; GB1532128A; JPS52134008A; FR2350328B1; US4059694A

Description

Patentanwälte 2 7 2 O O A

Dr.-Ing. Walter Abitz Dr. Dieter F. M ο rf Dipl.-Phys. M. Gritschneder 8 München 8b, Pienzenauerstr. 28 ^

1977 15 881Y

UNIVERSITY OF HAWAII

2540 Maile Way Honolulu, Hawaii/ V. St. A.

Herzstärkendes Mittel

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Es wurde gefunden, daß das als Anthopleurin-A bezeichnete neue Peptid, das im folgenden als AP-A bezeichnet wird und aus der Seeanemone Anthopleura xanthogrammica erhalten wird, herzstärkende Aktivität aufweist.

Die Mittel, die derzeit zur Stimulierung des gestörten Herzens verwendet werden, sind wegen ihrer toxischen Wirkungen auf das Herz oder der schädlichen Nebenwirkungen auf den peripheren Kreislauf begrenzt. Obgleich beispielsweise die Herzglycoside myocardiale Stimulierungsmittel sind und eine Störung des Herzens wieder beseitigen können, wirken sie in Dosismengen, die sehr nahe an denen liegen, die toxische Symptome, wie Herzarrhythmie, Übelsein und Erbrechen ergeben.

Die Verwendung sympathomimetischer Mittel ist durch ihre assoziierte Arrhythmie, Tachycardie, Tachyphylaxie oder geänderten peripheren Widerstand beschränkt.

Die erfindungsgemäße Verbindung zeigt überraschende pharmakologische Eigenschaften. Sie beeinflußt hauptsächlich die kontraktilen Kräfte des Herzmuskels. Sie besitzt insbesondere eine potente, herztonische Wirkung auf den Herzmuskel verschiedener Lebewesen in vivo und in vitro und hat keine erkennbare Wirkung auf den Blutdruck, die Herzrate und den vaskulären glatten Muskel. Die Verbindung verursacht weiterhin eine positive inotrope Wirkung auf das Atrium bei starken Temperaturbeanspruchungen, Anoxie und in Anwesenheit niedriger Ca⁺⁺-Konzentrationen. Die Herzglycoside sind bei diesen Belastungszuständen unwirksam. Die spezifischen positiven inotropen Eigenschaften von AP-A und die damit einhergehende Zunahme im Herzminutenvolumen bewirken, daß sie bei der Behandlung von Stauungsherzstörungen nützlich ist.

Die Erfindung betrifft ein neues Peptid, das aus der Seeanemone Anthopleura xanthogrammica extrahiert wird und das ausgeprägte Herzstimulationswirkungen zeigt. Der vorliegenden

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Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, dieses neue Peptid zu schaffen. Erfindungsgemäß soll weiterhin ein Verfahren zur Erzeugung des neuen Peptid aus Seeanemonen geschaffen werden.

Erfindungsgemäß sollen weiterhin Zubereitungen und Verfahren für die Behandlung von Herzversagen unter Verwendung dieses Peptids zur Verfügung gestellt werden.

Das erfindungsgemäße neue Peptid Anthopleurin-A (AP-A) wird aus der Seeanemone Anthopleura xantogrammica, die an der Bodega Bay (Bodega Bucht) in Californien gesammelt wird, erhalten.

Die Seeanemonen werden homogenisiert und mit Wasser oder mit einer Lösung aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Der Anthopleurin-A enthaltende Rohextrakt wird einer Gelfiltration unterworfen. Dabei erhält man eine 40fache Steigerung in der Reinheit von Anthopleurin-A. Alternativ können semi-permeable Membranen zur Erreichung der Ergebnisse verwendet werden, die man durch Gelfiltration erzielt. Kationenaustausch-Chromatographie ergibt eine sehr gute Trennung von Anthopleurin-A in einer Reinheit von etwa 30 bis 8O?o, abhängig von der besonderen Sammlung der Anemonen. Der Rest besteht aus biologisch inaktiven Peptiden und den Puffersalzen. Zur Herstellung von analytisch reinem, salzfreiem Material wird das obige Material weiter durch Gelfiltration, Kationenaustausch-Chromatographie gereinigt und entsalzt. Alle erfindungsgemäßen Trennverfahren werden durch Bioassay (Bioanalyse) unter Verwendung isolierter Rattenatria für die Bestimmung der positiven inotropen Wirkung unter Verwendung des Verfahrens, wie es in dem Teil mit der Überschrift "Bioassay" beschrieben wird, verfolgt.

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Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Anthopleurin-A ist die Extraktion der gesammelten, nassen Seeanemone Anthopleura xanthogrammica mit Wasser, Alkohol oder einem wäßrigen alkoholischen Gemisch, Durchführung einer Gelfiltrationschromatographie mit dem Rohextrakt an einer mit vernetzten! Dextran gepackten Säule und Eluieren mit wäßriger NHaHCO,-Lösung oder einer anderen flüchtigen Salzlösung. Die aktive Fraktion wird lyophilisiert und an einer mit Kationenaustauschharz gepackten Säule chromatographiert und mit einem Puffer oder mit einem Puffer und einem Gradienten aus einer ionisierbaren Salzlösung eluiert. Eine geeignete Lösung für die Eluierung des Kationenaustauschharzes ist ein Phosphatpuffer oder ein Phosphatpuffer mit einem Gradienten aus NaCl-Lösung. Die aktive Fraktion wird zur Herstellung von gereinigtem Anthopleurin-A lyophilisiert. Das lyophilisierte Material enthält 1,0 bis 1,4% Anthopleurin-A, der Rest besteht aus 0,2 bis 2,0% inaktiven Polypeptiden, Puffersalzen und ionisierbaren Salzen. Zur Herstellung des salzfreien Materials wird das getrocknete Material an einer mit vernetztem Dextran gepackten Säule chromatographiert und zur Entfernung des Phosphats mit einer Salzlösung eluiert. Die aktive Fraktion wird gesammelt und durch Chromatographie an einer Säule entsalzt, die mit vernetztem Dextranharz gepackt ist, wobei mit einer verdünnten Lösung aus einer niedrigen organischen Säure, wie Essigsäure, eluiert wird.

Zur Herstellung von analytisch reinem AP-A wird das entsalzte Material der Gelfiltrationschromatographie an einer mit vernetztem Dextran gepackten Säule unter Elution mit Wasser und der Ionenaustauschchromatographie an einer mit Sulfoäthylcellulose gepackten Säule und Elution mit Pyridinacetat-Puffern unterworfen.

Bei einem weiteren bevorzugten Verfahren zur Herstellung von Anthopleurin-A aus Anthopleura xanthogrammica

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werden die nassen Anemonen in etwa 2 cm Stücke geschnitten, homogenisiert und mit 3O?oigem wäßrigem Äthanol t :trahiert. Der Rohextrakt wird zu einer wäßrigen Lösung konzentriert, die zur Entfernung von Feststoffen zentrifugiert wird und mit Chloroform verteilt wird. Die mit Chloroform extrahierte, wäßrige Lösung wird lyophilisiert und der Rückstand wird der Gelfiltrationschromatographie an einer mit vernetztem Dextran, wie Sephadex G-50 gepackten Säule mit einer Ausschlußgrenze von 30 000 für kugelförmige Proteine (hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals, Box 175, S-751 04, Uppsala) unterworfen, wobei mit 0,1 M NH^HCO, eluiert wird. Die Fraktion mit einem Ve/Vo-Wert von 1,84 bis 2,57 enthält 4Ofach gereinigtes Anthopleurin-A. Die Fraktion mit einem Ve/Vo-Wert von 1,84 bis 2,57 wird lyophilisiert und weiter durch Chromatographie an einer mit schwach saurem Kationenaustauschharz, v/ie CM-Sephadex C-25, gepackten Säule unter Eluierung mit 0,03 M, pH 7,5, Phosphatpuffer mit Gradientenelution bis zu 0,5n NaCl gereinigt. Anthopleurin-A wird bei Ve/Vo 2,99 bis 3,39 eluiert und wird lyophilisiert. Die Ve/Vo 2,99 bis 3,39 Fraktion wird an einer mit Sephadex G-50 gepackten Säule mit einer Ausschlußgrenze von 30 000 erneut chromatographiert, wobei mit 0,017 M Essigsäure, die 0,03 M in NaCl ist, eluiert. Die bei Ve/Vo 1,66 bis 2,16 eluierte Fraktion wird zur Herstellung von im wesentlichen phosphatfreiem Anthopleurin-A lyophilisiert. Das Natriumchlorid wird entfernt, indem man die Probe auf eine Säule gibt, die mit einem vernetzten Dextranharz, wie Sephadex G-10, mit einer Ausschlußgrenze von 700 gepackt ist, gefolgt von etwa dem 3fachen Probenvolumen von 20%iger Natriumchloridlösung und anschließende Eluierung mit 0,017 M Essigsäure. Reines (30-8096 AP-A), salzfreies Anthopleurin-A eluiert bei Ve/Vo 0,93 bis 1,12. Da gefunden wurde, daß die assoziierten Polypeptide inaktiv sind, ist dieses Material für pharmakologische Untersuchungen geeignet.

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Zur Erzeugung von AP-A, das von assoziierten inaktiven Peptiden frei ist, wird die Ve/Vo 0,93Ms 1,12 Fraktion in destilliertem Wasser gelöst und an freien Sephadex G-25 in destilliertem Wasser chromatographiert. Die Eluierung mit dem destillierten V/asser ergibt die Hauptmenge des aktiven Peptids (90%) 75% rein bei Ve/Vo zwischen 1,3 und 1,7, während der Rest des aktiven Peptids rein mit 0,2 M NHaOAc eluiert wird. Die Ve/Vo 1,3 bis 1,7 Fraktion wird lyophilisiert, in destilliertem Wasser erneut aufgelöst und an Cellex-SE Cellulose (Bio Rad Laboratories, Richmond, Californien) chromatographiert, mit 0,05 M Pyridin äquilibriert und mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 2,7 eingestellt. AP-A wird rein durch einen linearen Gradienten mit gleichen Volumen von je 0,05 M Pyridinacetat, pH 2,7, und 0,2 M Pyridinacetat, pH 3,1, in einem Gebiet, das 0,1 M Pyridinacetat entspricht, eluiert. Dieses Material ist analytisch rein, bestimmt durch Aminosäure-Analyse und Sequenzbestimmung.

Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung von reinem Anthopleurin-A wird in dem folgenden Schema 1 erläutert.

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Schema 1

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Extraktions- und Reinigungsschema von Anthopleurin-A aus A. xanthogrammica

5,5 kg nasses A.xanthogrammica

27 1 3096 EtOH homogenisiert, filtriert,zentrifugiert 27 000 χ g

ausgelaugtes Material, überstehende Lösung

verworfen

13 g CHCl₃,löslich auf 2,5 1 flashdestilliert(< 4O°C), mit 12,5 1 CHCI3 ^extrahi^e**t, zentrifugiert, lyophilisiert

g in Wasser lösliche Stoffe

6,4 g in V/asser lösliche Stoffe

19,5 g Grenzflächenmaterial

Gelfiltrationchromatographie mit 2600 ml Sephadex G-50 in vierzig 6,4 g Ansätzen

0,215 g A

0,107 g B 0,163 g 5,034g 0,73 g CDE

0,0

4 g

Ve/Vo = 0,95-1,18 1,18-1,84 1,84-2,57 2,57-3,08 3,08-3,38 3,38-4,10 ^akj^tiv 98,5% Gewinnung

mg Fraktion C

ι CM-Sephadex C-25,eluiert mit Phosphatpuffer bei pH 7,5 und Gradien- v tenelution mit 0,5n NaCl

mg Fraktion G
Ve/Vo 2,99 bis 3,39

Gelpermeationschromatographie an

Sephadex G-50,eluiert mit 0,017 M ν Essigsäure, 0,03 M in NaCl

mg Fraktion H
Ve/Vo 1,66 bis 2,16

entsalzt an Sephadex G-10,eluiert mit 0,017 M Essigsäure

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Schema 1 (Fortsetzung)

1,4 mg 20-80% reines Anthopleurin-A Ve/Vo 0,93 bis 1,12

Sephadex G-25(fein), eluiert mit Wasser und dann mit 0,2 M NH^OAc

Fraktion I
Ve/Vo 1,3 bis 1,7

Chromatographie an Sulfoäthylcellulose,Gradientenelution mit gleichen Volumen an 0,05 M Pyridinacetat, pH 2,7, und 0,2 M Pyridinacetat, pH 3,1

0,7 mg >95% reines Anthopleurin-A

Das erfindungsgemäße neue Peptid wird Patienten mit Herzversagen bzw. Herzstörungen in einer Rate von etwa 0,01 bis etwa 5/ug/kg Körpergewicht/h entweder durch Infusion oder durch eine Einzeldosis, wie es dem Arzt geläufig ist, verabreicht.

Für eine solche Verwendung kann die erfindungsgemäße Verbindung oral oder parenteral als solche oder vermischt mit an sich bekannten pharmazeutischen Trägerstoffen verabreicht werden. Der parenterale Weg ist bevorzugt. Sie kann oral in solchen Formen, wie Tabletten, dispergierbaren Pulvern, Granulaten, Kapseln, Sirupen und Elixieren, und parenteral in Form von Lösungen, Suspensionen, Dispersionen, Emulsionen u.a., z. B. als sterile, injizierbare, wäßrige Lösung, verabreicht werden. Die Verbindung kann ebenfalls chemisch, wie durch Acylierung und Veresterung, oder physikalisch, wie unter Herstellung eines künstlichen Liposoms, zur Verminderung von Verdauungsstörungen geändert v/erden. Der bevorzugte Verabreichungsweg ist durch Injektion.

Eine bevorzugte pharmazeutische Zubereitung von AP-A enthält den aktiven Bestandteil in Gelatine und ein PhenoIkonservie-

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rungsmittel. Eine weitere, bevorzugte pharmazeutische Zubereitung, die für die Injektion geeignet ist, enthält steriles, pulverförmiges, lyophilisiertes AP-A, das in trockener Form bei Zimmertemperatur stabil ist. Das lyophilisierte Pulver kann in hydrolysierte Gelatine enthaltenden Ampullen abgepackt sein. AP-A muß zum Zeitpunkt der Verwendung durch Auflösen in einem geeigneten Volumen an sterilem Wasser für die Injektion oder Natriumchloridlösung für die Injektion auf solche Weise rekonstituiert werden, daß die individuelle Dosis in 1 bis 2 ml Lösung enthalten ist. Die rekonstituierte Lösung sollte im Kühlschrank aufbewahrt werden und vor der Zersetzung oder bevorzugt innerhalb von 24 Stunden verwendet werden.

Diese pharmazeutischen Zubereitungen können bis zu etwa aktiven Bestandteil zusammen mit dem Träger oder Adjuvans en"thalten.

Die herzstärkende, wirksame Menge an aktivem Bestandteil, die zur Behandlung von Stauungsherzversagen bzw. Stauungsherzstörungen verwendet wird, kann variieren, abhängig von der Heftigkeit des zu behandelnden Zustands. Im allgemeinen werden jedoch zufriedenstellende Ergebnisse erhalten, wenn Anthopleurin-A in einer stündlichen Dosis von etwa 0,01 bis etwa 5/Ug/kg Lebewesenkörpergewicht oder in Depotform verabreicht wird, die während einer vom Arzt, bestimmten.Zeit wirkt.

Die für die innere Verwendung geeigneten Dosiseinheitsformen enthalten etwa 2 bis etwa 360 /ug an aktiver Verbindung in innigem Gemisch mit einem festen oder flüssigen, pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel. Die bevorzugten pharmazeutischen Zubereitungen sind bezüglich der Herstellung und der Leichtigkeit der Verabreichung injizierbare Zubereitungen, insbesondere solche, die etwa 0,05 bis etwa 10/Ug/ml enthalten.

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Bioassay (Bioversuch bzw. -analyse) für die Bestimmung der positiven inotropen Wirkung

Die Bioassays von Anthopleurin-A enthaltenden Lösungen werden an isolierten Atria von Rattenherzen durchgeführt. Das Atrium wird von dem Rest des Herzens abgetrennt und in einem isolierten Organbad (20, 25 oder 50 ml), das Krebs Ringer-Bicarbonatmedium (pH 7,4) der folgenden Zusammensetzung in destilliertem, entionisiertem Wasser enthält (in mMol), suspendiert: Na⁺ 145; K⁺ 6,02; Ca⁺² 1,22; Mg⁺² 1,33; Cl" 126; HCO₃"³ 25,3; PO^"³ 1,2; SO^ 1,33; und Glucose 5,5. Die Temperatur des Organbads wird bei 30⁰C gehalten, und das Krebs Ringer-Medium wird kontinuierlich mit 95% 0₂_5%C0₂ belüftet.

Die spontan schlagende Atriumpräparation wird mit einem dünnen Seidenfaden mit einem Kraftverdrängungswandler (Graas Modell FT.03) verbunden, und die kontraktilen Bewegungen werden auf einem Polygraphen Grass Modell 7 mit sechs Kanälen aufgezeichnet. Die Präparation kann unter einer Spannung von 750 mg während 60 Minuten vor dem Versuchsbeginn den Gleichgewichtszustand annehmen. Nach dieser Gleichgewichtseinstellung, während der die Präparationen alle 30 Minuten gewaschen werden, bleibt die spontane Schlagrate der Atrla konstant. Die Änderung während einer lOminütigen Beobachtung ist geringer als 5 Schläge/min. Änderungen, die durch die Anthopleurin-A enthaltende Testlösung in der kontraktilen Kraft und der Rate hervorgerufen werden, werden als Prozentgehalt Erhöhung oder Abnahme in der Spannung und im Rhythmus angegeben, verglichen mit der Zeit unmittelbar vor der Zugabe der Testlösung zu dem Gewebebad als Grundlinie für den Vergleich.

Physikalische und chemische Eigenschaften von AP-A

Zur Durchführung der elektrophoretischen und Aminosäure-Analyse wird das gemäß Beispiel 1 erhaltene Anthopleurin-A an CM Sephadex C-25, Sephadex G-50 und G-10 entsprechend dem in

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Beispiel 1, Stufen c, d und e, beschriebenen Verfahren erneut chromatographiert. Das doppelt gereinigte Material wird unter Verwendung im Handel erhältlicher, vorgegossener 12#iger Acrylamidgels und passender Puffersysteme, erhältlich von Bio Rad Laboratories, 32nd and Griffin, Richmond, Californien, der elektrophoretischen Analyse unterworfen.

Die isoelektrische Fokussierung ergibt den isoelektrischen Punkt bei einem pH-Wert von 8,2. Scheibengelelektrophorese mit 12%igem Polyacrylamidgel bei pH 3»6 ergibt einen R^-Wert von 0,46 gegenüber einem gleichlaufenden Methylgrünfarbstoff. AP-A tritt in ein basisches Gel bei pH 8,9 nicht ein, was ein mögliches Fehlen verfügbarer Carboxylgruppen anzeigt. Natriumdodecylsulfat (SDS)-Scheibengelelektrophorese unter Verwendung von 1Obigem Gel zeigt eine Molekulargewicht von etwa 4700 nach der Inkubierung mit Dithioerythrit unter Verwendung von RNase A und pankreatisehern Trypsin-Inhibitor (PTI) zum Vergleich an. Das Molekulargewicht ist so niedrig, daß diese Werte nur ungefähre Werte sind. Aufgrund des Verlustes der biologischen Aktivität nach der Behandlung mit proteolytischen Enzymen wurde festgestellt, daß AP-A ein Peptid ist.

Aminosäurensequenz des analytisch reinen S-carboxymethylierten Anthopleurins-A ergibt die folgende Sequenz (in Übereinstimmung mit der Aminosäureanalyse eines Hydrolysats): GIy-Val-Ser-Cys-Leu-Cys-Asp-Ser-Asp-Gly-Pro-Ser-Val-Arg-Gly-Asn-Thr-Leu-Ser-Gly-Thr-Leu-Trp-Leu-Tyr-Pro-Ser-Gly-Cys-Pro-Ser-Gly-Trp-Hi s-Asn-Cys-Lys-AIa-His-Gly-Pro-Thr-Ile-Gly-Trp-Cys-Cys-Lys-GIn.

Diese Sequenz entspricht einem Molekulargewicht von 5183 Dalton.

Die abgekürzten, für die Aminosäurekomponenten verwendeten Bezeichnungen sind die folgenden:

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Abgekürzte Bezeichnung Aminosäure

Lys Lysin

His Histidin

Arg Arginin

Asp Asparaginsäure

Thr Threonin

Ser Serin

GIn Glutamin

Pro Prolin

GIy Glycin

AIa Alanin

Cys Cystein

VaI Valin

He Isoleucin

Leu Leucin

Tyr Tyrosin

Trp Tryptophan

Asn Asparagin

Anthopleurin ist bei neutralen und niedrigen pH-Werten relativ stabil und in entionisiertem Wasser sehr löslich.

Anthopleurin kann weiter durch seine pharmakologischen Eigenschaften charakterisiert werden. Die pharmakologischen Eigenschaften ergeben, daß Anthopleurin-A etwa 200 bis 1000 Mal so potent ist wie Ouabain in der positiven inotropen Wirkung mit einem EDcQ-Wert bei 1,1 χ 10~" M auf isolierte Meerschweinchen- Atria . Der LDcQ-Wert bei Mäusen (i.p.) beträgt etwa 0,2 bis 0,3 mg/kg. Es zeigt keinerlei chronotrope Wir-

kung. Bei 3 x 10" M Konzentrationen von Anthopleurin-A wird keines der folgenden Enzyme inhibiert: Na, K-ATPase; Monoamin-oxydase; Catechol-O-methyltransferase; cyclische 3',5'-Nucleotid-Phosphodiesterase; noch beeinflußt es den 3« ,5'-cyclischen AMP-Gehalt des Meerschweinchenherzens. Anthopleurin-A ist nicht annähernd so empfindlich gegenüber Ca -

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Konzentrationen wie Ouabain. AP-A zeigt eine positive inotrope Wirkung an Atria in Anwesenheit von niedrigen Ca⁺⁺-Konzentrationen. Erniedrigte externe K⁺-Werte ergeben keine Erhöhung der Toxizität des Arzneimittels, wie bei Ouabain. Es wurde gezeigt, daß Anthopleurin-A ein wirksames Cardiotonikum bzw. herzstärkendes Mittel beim isolierten Herzen von Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Hunden und Katzen ist, und in dem in situ Herzen bei Hunden und Katzen. Es besitzt eine vernachlässigbare Wirkung auf den Blutdruck und keine erkennbare mechanische Wirkung auf den isolierten vaskulären Muskel.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Isolierung von Anthopleurin-A aus Anthopleura Xanthogrammica Stufe a - Extraktion

Anthopleura xanthogrammica (Brandt)-Proben werden gesammelt, in 95%igem Äthanol konserviert und bei 4⁰C vor der Extraktion gelagert. Nasse Anemonen (5»5 kg), von denen das Wasser abgelaufen ist, werden in <■ 2cm Stücke geschnitten und ansatzweise in einem Mischer während 5 min mit 27 1 3O#igem Äthanol homogenisiert. Das Äthanolvolumen schließt das Äthanol, das zur Konservierung der Proben verwendet wurde, mit ein. Das Gemisch wird 1 Woche bei 2O°C bei gelegentlichem Umrühren stehengelassen und dann durch sechs Schichten Mull filtriert. Das Filtrat wird bei ^4O⁰C auf etwa 2,5 1 flashdestilliert (d.h. unter Entspannung destilliert) und mit 12,5 1 Chloroform ansatzweise verteilt, wobei man gut mischt und anschließend 30 min bei 27 000 χ g zentrifugiert. Man erhält 13 g in Chloroform lösliche Stoffe, 19,5 g Grenzflächenfeststoffe und 256 g (lyophilisiertes Gewicht) wasserlösliche Stoffe, die das Anthopleurin-A enthalten.

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Stufe b - Gelpermeationschromatographie

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256 des rohen, wasserlöslichen Extrakts, der Anthopleurin-A enthält, werden in vierzig gleiche Teile für die chromatographische Trennung an Sephadex G-50 mit einer Ausschlußgrenze von 30 000 (erhalten von Pharmacia Fine Chemicals) getrennt. Eine 53 x 8,3 cm Säule, die 2600 ml nasses Sephadex G-50 (Vo = 825 ml) enthält, wird mit 0,1 M NH₄HCO₃, gesättigt mit Chloroform (zur Verhinderung des Wachstums von Mikroorganismen) äquilibriert. 50 ml Wasser, das 6,4 g des rohen, wasserlöslichen, Anthopleurin-A enthaltenden Extrakts enthält, werden auf die Säule gegeben und mit 0,1 M NH₄HCO₃ bei 8 bis 9 ml/min bei Zimmertemperatur eluiert. In der folgenden Tabelle I sind in Spalte 1 die Bereiche der Ve/Vo-Werte für jede gesammelte Fraktion und in Spalte 2 das Gewicht des Rückstands, das bei der Lyophilisxerung von jeder Fraktion erhalten wird, aufgeführt.

Frak- Bereich der tion Ve/Vo-Werte, in dem die Fraktion gesammelt wurde

Tabelle I

Gewicht des Konzentration Rückstands in ppm der nach der Lyo- Testlösung philisierung
g

^Zunahme in d.kontraktilen Kraft (Zeit bis zum Maximum in min)

A	0,95	- 1,18
B	1,18	- 1,84
C	1,84	- 2,57
D	2,57	- 3,08

E 3,08 - 3,38 F 3,38 - 4,10

0,215
0,107

0,163
5,034

0,73
0,04

0,4

100 (6 min) 120 (5 min)

0
30

(4 min)

Die Ergebnisse der Bioassays für die kontraktile Kraft isolierter Rattenatria wurden, wie in dem Teil mit der Überschrift "Bioassay", wie in Tabelle I, Spalte 4, aufgeführt, durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen keine Aktivität bei den Schnitten A, E und F. Die Fraktion C enthält ca. 99# der

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herztonischen Aktivität. Insgesamt 6,4 g Fraktion C werden so aus 256 g des wasserlöslichen, bei der Stufe a erhaltenen Rohmaterials erzeugt.

Stufe c - Ionenaustauschchromatographie

Ein 610 mg-Teil der bei der Stufe b erhaltenen Fraktion C wird in 5 ml 0,03 M Na_x(PO₄) -Puffer bei pH 7,5 gelöst und auf eine 48 χ 4 cm Säule (Vo = 205 ml) gegeben, die 6OO ml nasses Kationenaustauschharz CM-Sephadex C-25 (erhalten von Pharmacia Fine Chemicals), äquilibriert mit dem gleichen Puffer, gesättigt mit Chloroform, enthält. Ein gerührtes Reservoir von 1500 ml des Puffers wird mit der Säule verbunden, und nachdem 110 ml Puffer durch die Säule geflossen sind, wird das Reservoirvolumen konstant durch Beschickung mit einem 0,03 M Na_x(PO₄) -Puffer 0,5 M in NaCl, eingestellt auf einen pH-Wert von 7,5, für die Gradienteneluierung gehalten. Beide Lösungen sind mit Chloroform gesättigt. Die Strömungsrate von etwa 3 ml/min wird aufrechterhalten, und der Versuch wird bei Zimmertemperatur durchgeführt. Der Abstrom wird unter Verwendung eines UV-Absorption bei 280 nm mit einem Modell UA-5 Absorbance Monitor, erhalten von Instrument Specialties Company, P.O. Box 5247, 4700 Superior Street, Lincoln, Nebraska 68505, gemessen. Die Fraktion, die einen Ve/Vo-Bereich zwischen 2,99 und 3,39 und zentriert bei Ve/Vo 3,17 besitzt, wird als Fraktion G bezeichnet und entsprechend dem Bioassay, wie unter der Überschrift "Bioassay" beschrieben ist, ist diese Fraktion aktiv. Die Fraktion G wird lyophilisiert; man erhält 610 mg Material, das Anthopleurin-A, vermischt mit Salzen, enthält. Die Fraktion G wird bei -20⁰C gehalten und für alle pharmakologisehen Untersuchungen verwendet.

Anthopleurin-A zeigt keine Anzeichen für die Zersetzung, wenn es ein Jahr bei -20°C als lyophilisierte Fraktion C, erhal-

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ten bei der Stufe b, oder als lyophilisierte Fraktion G aufbewahrt wird. Die Fraktion G ist während mindestens 24 h bei 20,5°C in 10~⁷ Mol-Lösungen bei pH 4,55 bis 7,80 stabil, sie zeigt jedoch einen etwa 90#igen Verlust ihrer herztonischen Aktivität bei einem pH-Wert über 11.

Stufe d - Reinigung für die Analyse

Die bei der Stufe c erhaltene Fraktion G wird weiter durch Gelfiltrationschromatographie an Sephadex G-50 mit einer Ausschlußgrenze von 30 Ό00 (erhalten von Pharmacia Fine Chemicals) gereinigt. Eine 50 ml Bürette (54 χ 1,2 cm) (Vo = 21,1 ml), die 52 ml nasses G-50 enthält, wird mit 0,017 M CH^COOH, 0,03 M in NaCl, gesättigt mit Chloroform, äquilibriert. Eine Lösung aus 102,6 mg Fraktion G, gelöst in 0,4 ml H₂O, wird auf die Säule gegeben und dann wird bei Zimmertemperatur mit der Äquilibrierungslösung eluiert. Die Fraktion H wird bei Ve/Vo 1,66 bis 2,16, zentriert bei Ve/Vo 1,86, gesammelt. Vor der Fraktion H tritt kein Material, das UV absorbiert, bei 280 nm auf, und anschließend tritt nur eine Spur auf. Die Fraktion H wird lyophilisiert; man erhält 20 mg Anthopleurin-A (einschließlich von NaCl).

Stufe e - Entsalzung

Das Salz wird unter Verwendung einer mit Sephadex G-10 mit einer Ausschlußgrenze von 700 (erhalten von Pharmacia Fine Chemicals) gepackten Säule entfernt. Die 20 mg Fraktion H, erhalten in Stufe d, werden in 0,3 ml 1Oxigen NaCl gelöst und auf eine mit 54 ml nassem Sephadex G-10 gepackte, 59 x 1,2 cm Säule, die mit 0,017 M Essigsäure, gesättigt mit Chloroform, äquilibriert ist, gegeben. Auf die Probe gibt man 0,5 ml 10biges NaCl und dann die Äquilibrierungslösung. Anthopleurin-A fällt vollständig und scharf bei einem Leervolumen (Ve/Vo 0,93 bis 1,12) aus und ist salzfrei. Es wird sofort lyophilisiert; man erhält 1,4 mg 30 bis 80# reines Anthopleurin-A.

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Stufe f - Entfernung assoziierter, inaktiver Polypeptide

Das gemäß den Stufen a bis e erhaltene Peptid (?OO mg) wird in 10 ml destilliertem Wasser gelöst und auf eine Säule (34 χ 2,0 cm) aus Sephadex G-25, fein, in destilliertem Wasser gegeben. Die Elution mit destilliertem Wasser ergibt die Hauptmenge des aktiven Peptids (90^) 75% rein bei Ve/Vo zwischen 1,3 und 1,7, während der Rest des aktiven Peptids mit 0,2 M NHaOAc rein eluiert wird. Das lyophilisierte Peptid (113 mg) wird erneut in destilliertem Wasser gelöst und auf eine Säule (30 χ 1,5 cm) aus Cellex-SE Cellulose (Bio Rad Laboratories, Richmond, Californien), äquilibriert mit 0,05 M Pyridin, mit einem mit Essigsäure auf 2,7 eingestellten pH-Wert, gegeben. Das aktive Peptid wird rein mit einem linearen Gradienten von je 300 ml 0,05 M Pyridinacetat, pH 2,7, und 0,2 M Pyridinacetat, pH 3,1, in einem Gebiet, entsprechend 0,1 M Pyridinacetat, eluiert. Es wird lyophilisiert; man erhält 80 mg >95% reines Anthopleurin-A.

Beispiel 2 Sterile Suspension von AP-A für die Injektion

Das gemäß Beispiel 1 erhaltene Anthopleurin-A wird mit hydrolysierter, steriler Gelatine im einer Menge von 3»5/ug Anthopleurin-A zu etwa 10 mg hydrolysierter Gelatine vermischt und in sterilen Ampullen, die in Stickstoffatmosphäre abgedichtet werden, unter Verwendung an sich bekannter Verfahren abgepackt. Das AP-A wird zum Zeitpunkt des Gebrauchs durch Zugabe von 1 ml sterilem Wasser rekonstituiert. Die injizierbare Lösung ist für die Verabreichung während einer Stunde für ein Körpergewicht von 70 kg geeignet.

Ende der Beschreibung.

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Claims

University of Hav/ai 15 881Y

Patentansprüche

1 .J Als Anthopleurin-A bezeichnetes Peptid mit der

folgenden Aminosäuresequenz:

Gly-Val-Ser-Cys-Leu-Cys-Asp-Ser-Asp-Gly-Pro-Ser-Val-Arg-Gly-Asn-Thr-Leu-Ser-Gly-Thr-Leu-Trp-Leu-Tyr-Pro-Ser-Gly-Cys-Pro-Ser-Gly-Trp-His-Asn-Cys-Lys-Ala-His-Gly-Pro-Thr-Ile-Gly-Trp-Cys-Cys-Lys-Gln.
2. Verfahren zur Herstellung von Anthopleurin-A aus Seeanemomen, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) die Seeanemonen mit Wasser oder mit einem wäßrigen-alkoholischen Gemisch extrahiert,

(b) den Extrakt der Gelfiltrationschromatographie an einer Säule aus vernetztem Dextran unterwirft, mit NH^HCO,-Lösung eluiert und die aktive Fraktion sammelt und lyophilisiert;

(c) die aktive Fraktion an einer Säule aus Kationenaus tauschharz chromatographiert und mit einem Phosphatpuffer mit einem Gradienten von NaCl eluiert und die aktive Fraktion sammelt und lyophilisiert.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man

(d) die bei (c) erhaltene, aktive Fraktion an einer Säule aus vernetztem Dextran chromatographiert, mit einer NaCl-Lösung eluiert und die aktive Fraktion sammelt und lyophilisiert;

(e) die bei (d) erhaltene, aktive Fraktion durch Chromatographie an einer Säule aus vernetztem Dextran und Elution mit verdünnter Essigsäure entsalzt und die aktive Fraktion sammelt und lyophilisiert.

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4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Seeanemone Anthopleura xanthogrammica verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) die Seeanemone, Anthopleura xantogrammica, mit 30%igem wäßrigem Äthanol extrahiert,

(b) den Extrakt der Gelfiltrationschromatographie an einer Säule mit vernetztem Carboxymethyldextran mit einer Ausschlußgrenze von 30 000 unterwirft, mit 0,1 M NH^HCO,-Lösung eluiert und die aktive Fraktion sammelt und lyophilisiert,

(c) die aktive Fraktion an einer Säule mit schwach saurem Kationenaustauschharz chromatographiert, mit 0,03 M Phosphatpuffer bei pH 7,5 und einem Gradienten von 0,5n NaCl eluiert und die aktive Fraktion sammelt und lyophilisiert.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man

(d) die bei (c) erhaltene, aktive Fraktion

an einer Säule mit vernetztem Dextran mit einer Ausschlußgrenze von 30 000 chroma tographiert, mit 0,017 M Essigsäure, die 0,03 M in NaCl ist, eluiert und die aktive Fraktion sammelt und lyophilisiert;

(e) die bei (d) erhaltene, aktive Fraktion entsalzt, indem man die Lösung aus aktiver Fraktion auf eine Säule mit vernetztem Dextran mit einer Ausschlußgrenze von 700 gibt, gefolgt von einer Lösung aus 20tflger Natriumchloridlösung und mit 0,017 M Essigsäure eluiert und die aktive Fraktion sammelt und lyophilisiert.
7. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie das Peptid nach Anspruch 1, vermischt oder zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, enthält.

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