DE2751717A1

DE2751717A1 - Neue verbesserte gammaglobuline fuer intravenoese injektion und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2751717A1
Application number: DE19772751717
Authority: DE
Inventors: Myer Louis Dr Coval
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1976-12-03
Filing date: 1977-11-19
Publication date: 1978-07-13
Also published as: FI773477A7; US4124576A; KR810001001B1; AU3119677A; BE861463A; ATA833377A; DE2751717C2; JPS5372816A; AR215037A1; ZA777185B; AU516176B2; PT67350A; HK50581A; FR2372841A1; SE443294B; YU276577A; FI60022C; DK529377A; ES464681A1; FR2372841B1

Description

Beschreibung;

Die Erfindung betrifft Gamma-Globuline bzw. diese enthaltende Präparate, die sich für die intravenöse Verabreichung eignen sowie Verfahren zur Herstellung der besagten Gamma-Globuline bzw. ihrer Präparate. ;

Die Immuno-Globulin-G-Fraktion aus gesammeltem menschlichem Plasma' enthält Antikörper gegen viele Viren und Bakterien. Immunoglobuline sind wirksam bei der klinischen Behandlung einer breiten Palette von Krankheitszuständen, beispielsweise bei !

1. der Prophylaxe und Therapie von Infektionen bei Personen mit

genetischen und nososomischen Antikörper-Mangelzuständen, I speziell bei Staphylokokken-, Pneumokokken-, Streptkokken- j und H. influenζae-Infektionen j

2. der Prophylaxe bei Patienten mit normalem Immuno-Globulin- !

Spiegel gegen Virus-Infektionen, z,B. gegen Hepatitis-, ■ Polio-, Masern-, Röteln-, Tollwut-, Herpes- und Parotitis-, ' Infektionen oder bei der Prophylaxe gegen Tetanus und bei ί

vorliegender Rh-Ünverträglichkeit, desweiteren j

3. der Therapie von schweren bakteriellen Infektionen: Staphylokokken, Coil, Pseudomonas, Pyocyanaeus septicemia und auch bei der Therapie einiger Virusinfektionen wie z.B. Herpes Zoster.

Sämtliche klinische Möglichkeiten für die Anwendung des Immuno-I globuline sind aus den folgenden Gründen noch nicht realisiert worden: Millionen von Immunoglobulin-Dosen sind bereits intramuskulär mit den weiter unten beschriebenen Polgen verabreicht worden; j die intravenös verabreichten Präparate werden aber sehr schnell j abgebaut, hinzu kommt, daß zu niedere Dosen angewendet wurden. Die j meisten antibakteriellen Antikörper des Human-Gamma-Globulins sind gegen Mikroorganismen, die den oberen Respirationstrakt, die Haut und den Gastrointestinaltrakt bewohnen, gerichtet. Die Menge Gammaglobulin, die benötigt wird, um eine experimentelle in vivo-

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Infektion zu bewältigen, ist proportional der Anzahl infektiöser Organismen in dem Inokulat. Diese Tatsache wurde im Falle von Pseudomonas aeruginosa, E. CoIi, Proteus und Staphylokokkus aureus bewiesen. Die benötigte Menge Gamma-Globulin ist aber auch proportional dem jeweils vorliegenden spezifischen Antikörper-Spiegel. Mit Chloramphenicol ergibt sich eine synergistische Wirkung, aber mit anderen Antikörpern ergibt 3ich nur ein additiver Effekt.

Human-Immuno-Globuline wurden zuerst in großem Maßstab im Zeitraum von 19^5 bis 1950 in Harvard im Labor von F. J. Cohn isoliert. Sehr bald wurde beobachtet, daß eine intravenöse Injektion dieser Präparate Schockreaktionen bei manchen Patienten hervorrief und später wurde festgestellt, daß die antikomplementäre Aktivität von Ig G-Präparaten für diese Schockreaktionen verant-'wortlich ist. Diese antikomplemenfire Aktivität geht auf Ig G-Aggregate zurück, die sich während der Fraktionierung gebildet haben.

Mit Rücksicht auf diese mit der intravenösen Verabreichung von jlmmuno-Globulinen verbundenen Schockreaktionen wurden diese therapeutisch wertvollen Stoffe stattdessen intramuskulär verabreicht. '■ Jedoch hat die intramuskuläre Verabreichung von Immuno-Globulinen j viele Schranken: |

a) sie ist schmerzhaft, ;

b) die Menge, die verabreicht werden kann, ist begrenzt, j

c) die Proteolyse am Ort der Injektion vermindert das ver- !

i fügbare Ig G und

d) maximale Blutspiegel werden erst nach drei bis vier ! Tagen erzielt, was ein ernsthafter Nachteil in jenen : Fällen darstellt, die hohe Blutspiegel gleich nach der ι Injektion erfordern. ;

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Darüber hinaus gibt die intravenöse Verabreichung von Immunoglobulinen breitere klinische Anwendungsmöglichkeiten, da die volle Dosis an Ig G sogleich in den Blutstrom gelangt, ohne daß ein Abbau an der Injektionsstelle eintritt und dann bedeutend höhere Blutspiegel erreicht werden können. Diese Überlegungen haben die Suche nach Methoden zur Herstellung von Ig G mit niederer antikomplementärer Aktivität, welches für intravenöse Anwendung geeignet ist, beschleunigt. Die entwickelten Methoden basieren auf einer proteolytischen oder chemischen Behandlung zur Beseitigung der antikomplementären Eigenschaften der Aggregate.

Es sind folgende Herstellungsverfahren bekannt:

1. Pepsinbehandlung von Immuno-Globulinen. Das Protein wird weitgehend zu Antikörper-Fragmenten (5 S, F (ab ¹K) abgebaut. Seine Brauchbarkeit zur Bekämpfung bakterieller Infektionen ist dadurch begrenzt, daß es eine nur kurze Halbwertszeit (etwa Stunden im Vergleich zu 20 bis 30 Tagen für negatives Ig G) besitzt. Nach der Kombination mit Antigenen fixierten die 5 S-Fragmente kein Kompliment. Es findet in der Prophylaxe keine Anwendung.

2. Mit Plasmin behandeltes Immuno-Globulin. Mehr als 60 %

dieses Präparates werden zu Fragmenten (F ab und Fc) abgebaut. Das verbleibende 7S-Globulin hat eine normale Halbwertzeit (drei bis vier Wochen), aber das Antikörper-Spektrum ist beschränkt.

3. Bei einem pH-Wert von 4 behandeltes Immuno-Globulin. Dieses Präparat hat die Tendenz, bei der Lagerung antikomplementär zu werden. Seine Verträglichkeit ist daher begrenzt und hohe Dosen können nicht verabreicht werden. Die Halbwertzeit ist ein wenig geringer (12 bis Ii Tage) und die antibakterielle Aktivität auf einen nicht vorhersehbaren Grad reduziert.

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¹I. Mit ß-Propiolacton behandeltes Immuno-Globulin. Die Moleküle sind stark abgewandelt, wodurch sie wahrscheinlich neue Antigen-Determinanten bilden. Die Halbwertzeit ist etwa 10 Tage. Die bakteriolytische Aktivität ist herabgesetzt.

Die vier Ig G-Unterklassen haben eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegen Proteolyse. Die Pepsin-, Plasmin- und pH-^-(Pepsin)-Präparate unterscheiden sich demgemäß beträchtlich von unbehandtem Ig G in ihrer Unterklassen-Verteilung.

Wie bereits erwähnt, ist die unerwünschte, antikomplementäre Aktivität, welche die Ursache für die Schockreaktion bei der intravenösen Verabreichung von Ig G bildet, durch die Anwesenheit von Aggregaten bedingt, welche während der Fraktionierung durch die angewandten Fraktionierungs-Methoden entstehen. Bei den oben beschriebenen Präparaten werden diese Aggregate nach ihrer Bildung zerstört, in den meisten Fällen entweder durch chemischen oder enzymatischen Abbau. Dieser Abbau führt aber auch zu einer gewissen Degradation des Ig G und demzufolge zu einem Verlust an Aktivität; so sind solche Präparate nicht so aktiv wie gewünscht. Wenig Arbeit ist in die Entwicklung von Methoden gesteckt worden, die die Bildung von Aggregaten verhindern und Ig , G-Präparate bereitstellen, die im wesentlichen keine antikomplementäre Aktivität aufweisen. Kürzlich ist in der DT-OS 2 357 800, , veröffentlicht am 6. Juni 197²J, eine Methode zur Herstellung von ; für die intravenöse Verabreichung geeignetem Oamma-Globulin ver- ! öffentlicht worden. Dieses Verfahren erfordert, ebenso wie andere '■ veröffentlichte Verfahren zur Herstellung von Gamma-Olobulin, als Ausgangsmaterial eine relativ reine Gamma-Globulin-Fraktion. Jedoch bedeutsamer ist, daß das nach dieser Methode erhaltene Gamma-Globulin immer noch eine außergewöhnlich hohe antikomplementäre Aktivität bei intravenöser Anwendung besitzt. :

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Es wurde auch vorgeschlagen (vgl. US-Patent 3 763 135), ein filr intravenöse Injektionen geeignetes Material aus Fraktion III herzustellen, jedoch ergibt das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine wesentlich höhere Ausbeute, und das Produkt hat einen wesentlich geringeren Gehalt an antikomplementärem Material.

Ea gibt "Food and Drug-Administration" (FDA)-Standards für intramuskuläres Gamma-Globulin, aber nicht für intravenöses Oammaßlobulin. Solche Standards sind jedoch erforderlich, um zwischen Gamma-Globulin, das schockähnliche Reaktionen bei der Anwendung auf intravenösem Wege bei empfindlichen Personen verursacht, und Gamma-Globulin, das solche Reaktionen nicht hervorruft, unterscheiden zu können.

Während der letzten fünfzehn Jahre ist nachgewiesen worden, daß - sogar bei hochempfindlichen Empfängern - keine klinischen Symptome beobachtet werden, wenn die Höhe der antikomplementären Aktivität nur genügend niedrig ist. Bezieht man sich auf die Einheiten des Standard-Tests von Mayer (Experimental Immunochemistry, E. A. Kabat und M. M. Mayer, zweite Auflage, S. 133, Thomas, Springfield, Illinois, 1961), so liegt die sichere Konzentration bei 0,OU bis 0,02 Einheiten oder weniger an antikomplementärem Material pro Milligramm Immuno-Globulin G, sie kann auch etwas höher als 0,04 sein; aber Reaktionen werden in der Regel erst beobachtet, wenn die Höhe bei 0,¹» Einheiten pro Milligramm liegt. Die Verwendbarkeit von Gamma-Globulin-Präparaten für eine intravenöse Anwendung, die die Abwesenheit von Nebenreaktionen erfordert, setzt ein besonders niedriges Niveau an antikomplementärer Akti- j iVität voraus. Es ist notwendig, die physiologische Antikörper-JAktivität und Spezifizität zu erhalten, um ein klinisch sicheres iund wirksames Präparat bereitzustellen.

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Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung· eines
Gamma-Globulins vorgeschlagen, bei welchem die Eigenschaften des
aktiven Gamma-Olobulin-NOleküls erhalten bleibt, und das im wesentlichen keine Aggregate mit antikomplementärer Aktivität
aufweist, wodurch das Produkt sicher und wirksam für die intravenöse Anwendung wird.

Es ist demnach ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Gamma-
Globulin-Präpurat zu schaffen, das für die intravenöse Injektion geeignet ist.

Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein für die
intravenöse Injektion geeignetes Oanuna-Olotmlin-Präparat zu
schaffen, welches in vitro im wesentlichen keine antikomplementäre Aktivität mehr aufweist.

Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein für die
^jintravenöse Injektion geeignetes Gamma-Globulin-Priparat zu
schaffen, welches eine biologische Halbwertzeit von 3 bis t
Wochen hat. ,

Es ist wieder ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein für j Idie intravenöse Injektion geeignetes Gamma-Globulin-Präparat zu ; Ι ι

'schaffen, welches die Fähigkeit hat, Komplemente zu fixieren,

jwenn es mit dem korrespondierenden Antigen kombiniert wird, und > jwelches ein im wesentlichen unverändertes Antikörper-Spektrum ! jbeibehält, immer im Vergleich zu den Plasmaarten und Mengen an
j Gamma-Globulin-Antikörpern, die im Ausgangs-Plasma-Pool und in
dem Standard-Gamma-Globulin, das nach Conn's klassicher Äthanol- j Fraktionierung von Plasma erhalten wurde, enthalten sind. ;

Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Ver- ₍ 'fahren zur Herstellung eines Gamma-Globulin-Präparates zu schaffen,;

das für intravenöse Verabreichung geeignet ist. I

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Es ist auch ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines für die intravenöse Injektion geeigneten Gamma-Globulin-Präparates, ausgehend von leicht verfügbaren Blutprotein-Fraktionen, zu schaffen.

Es ist ferner ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Methode für die Herstellung eines für die intravenöse Injektion geeigneten Gamma-Globulin-Präparates zu schaffen, wobei es zu keiner Bildung von Aggregaten kommt.

Aus der DT-OS 2 ßO6 118 ist ein Verfahren bekannt, das zu einem für die intravenöse Injektion geeignetem Produkt mit weniger als 0,020 Einheiten an antikoirplementärem Material führt. Dieses wurde nach der Methode von Kabat und Mayer Experimental Immunochemistry, 2. Aufl. Seite 22h (1961 Thomas-Verl. Springfield Illinois) bestimmt. Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird jedoch durch geänderte Fraktionierungsbedingungen ein Produkt erhalten, dessen pH innerhalb des physiologischen Bereichs liegt und dessen antikomplimentäre Aktivität selbst während der Lyophylisierung nicht steigt. Letzteres war ein Nachteil aller bekannten Produkte.

Die antikomplementäre Aktivität des vorliegenden Verfahrensproduktes ist so niedrig, daß sie mittels der obengenannten Methode nicht mehr bestimmt werden kann. In einer neuen Bestimmungsirethode müssen die Bedingungen der obigen bekannten Methode in der Weise geändert werden, daß die Zahl der Erythrocyten auf ein Zehntel verringert wird. Das Komplement wurde entsprechend herabgesetzt und diese Methode ist 10-llx so empfindlich. Auf diese Weise kann man das antikorpplementfre Material des neuen Produkts bestimmen: es sind 0,0005 bis 0,0025 Einheiten pro mg, während das Produkt der obenbe7,eichneten DT-OS 0,010 bis 0,020 Einheiten per mg an antikomplimentärem Material enthält. Man kann daher eingefriergetrocknetes Präparat darstellen, das eine lange Lebensdauer hat und leicht in eine gebrauchsfertige Form gebracht werden kann.

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In Übereinstimmung mit einem Aspekt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird das Gamma-Globulin aus der leicht zugänglichen Plasma-Protein-Fraktion II + III von Cohn et al. (vgl. J. Am. Chem. Soc. 6J3, 1J59 - ^75 /(19Ί6/) erhalten. Diese Fraktion, die nahezu alle Immuno-Globuline neben anderen Proteinen enthält, wird neuen Fraktionierungs-Techniken unterworfen, welche die Bildung von Aggregaten, die bei Anwendung der bekannten Fraktionierungsmaßnahmen entstehen, verhindern und die zu einem aktiven Gamma-Globulin führen, welches praktisch völlig bar jeder antikompletnehtären Aktivität und damit für die intravenöse Verabreichung geeignet ist.

Eine andere wertvolle Rohmaterial-Quelle ist das Material der Fraktion II, das leicht als Immun-Serumglobulin zugänglich ist. Dieses Material ist billig, es ist als gefriergetrocknetes Pulver oder gefrorene Paste stabil und ist frei von Hepatitis-Viren. Es kann in der gleichen Weise wie das Material der Fraktion II + III behandelt werden.

Noch ein weiteres wertvolles Ausgangsmaterial ist ein Placenta-Extrakt, der entsprechende Fraktionen enthält.

Bei dem erfindungscem^ften Verfahren wird eine Paste, bestehend aus den Plasma-Proteinen der Fraktionen II oder II + III, mit Wasser bei einem pH von etwa Ί.9 bis 6.0, vorzugsweise 5.1 extrahiert. Man verwendet pyrogenfreies Wasser in einem Volumen von 25 bis Ί5 Liter, vorzugsweise 30 Liter pro kg der Paste, die einen Proteingehalt von etwa 25 bis 30 % aufweist. Jede nichttoxische, pharmazeutisch akzeptable organische oder anorganische Säure, wie Essig-, Milch-, Zitronen-, Salz- oder Schwefelsäure oder ähnliche Säuren, kann verwendet werden, um den pH einzustellen. Das wasserunlösliche Material wird abgetrennt und das Filtrat dann fraktionierten Fällungen unterworfen. Zunächst mit Polyäthylenglykol bei einer Konzentration von ¹J %_t dann mit Äthanol bei Konzentrationen von ¹J bis 12 %_t vorzugsweise bei etwa 6 %, und zuletzt mit PoIy-

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äthylenglykol bei 12 Jf, das letztere bei einem pH von etwa 8.0. Die ersten zwei fraktionierten Fällungen beseitigen Verunreinigungen und die letzte Fällung ergibt das gewünschte Gamma-Globulin der vorliegenden Erfindung. Bevorzugt wird ein Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa ¹^ 000 bis 12 000. Jede nichttoxische, pharmazeutisch akzeptable anorganische Base kann benützt werden, um den pH auf etwa 8.0 einzustellen. Das Verfahren kann bei einer Temperatur von etwa -10 bis +20 C ausgeführt werden.

Das Verfahren ist im einzelnen in den Beispielen beschrieben. Diese Beispiele sind als Erläuterung und nicht als Beschränkung; der Erfindung aufzufassen.

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Beispiel 1

Paste der Cohn-Fraktionen II + III wird bei 0-5°C in pyrogenfreiem destilliertem Wasser - Konzentration 30 Liter pro kg Paste - suspendiert. (Ein Bereich von 20 bis 50 Liter kann benutzt werden). Der pH der Suspension wird dann auf 5.1 (Bereich 4.9 bis 6.0) mit verdünnter Essigsäure eingestellt (andere Sauren als die erwähnte können eingesetzt werden). Die Suspension wird daraufhin bei 0-5°C filtriert oder zentrifugiert und der Rückstand verworfen. Das Filtrat wird auf eine Konzentration von Ί % Polyäthylenglykol H 000 (PEG Ί 000) gebracht (PEG 6 000 und 12 000 können, in anderen Konzentrationsbereichen, ebenfalls verwendet werden). Der Niederschlag, der sich während einer Stunde bildet, wird wie bei der vorhergehenden Stufe verworfen. Das Filtrat wird dann auf eine 6 !Ε-ige (Bereich 4 bis 12 %) Äthanol-Konzentration gebracht, wobei der Zusatz vorsichtig bei -2 C (Bereich 0 bis -6 C) erfolgt. Der Niederschlag wird ebenfalls nach 1 bis 2*1 Stunden, vorzugsweise nach 2 Stunden entfernt .

Die Lösung wird sodann 0,01 molar an Kochsalz gemacht und der pH mit 1^-iger Natronlauge auf 8.0 (Bereich 7 bis 8.2) eingestellt. Der Niederschlag, der sich durch Zusatz von Äthanol bis zu einer Konzentration von 25 %, oder von Polyäthylenglykol 4 000 bis zu 10 - 12 %_t vorzugsweise 12 %_t bildet, wird durch kontinuierliches Durchfluß-Zentrifugieren bei hoher Geschwindigkeit entfernt. Die so erhaltene Paste wird in folgender Lösung aufgelöst, die wie folgt erhalten wird: 5 bis 25 mg/ml erhitztes Human-Albumin, vorzugsweise 5-10 mg/ml, 0,025 Mol/Liter Natriumacetat, 0,15 Mol/Liter Glycin und 1-2 g/100ml, vorzugsweise 2 g/100ml, Mannit werden in Wasser gelöst und die Lösung mit Essigsäure auf pH 5.1 eingestellt. Lactose kann anstelle von Mannit verwendet werden. Die erhaltene Lösung, die 5-6 % Ig G enthält, kann lyophilisiert oder als Flüssigkeit bei Temperaturen unter 10 C aufbewahrt werden. Wenn sie als Flüssigkeit aufbewahrt wird, so wird in der zum Auflösen benutzten Lösung das Mannit weggelassen.

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Die Lösung kann lyophilisiert, bzw. gefriergetrocknet werden, und zwar in folgender Weise: Der pH wird auf 6.4 bis 6.6 mit 1tigern Natriumhydroxid eingestellt. Die Lösung wird, nach Abfüllen der gewünschten Mengen in Fliischchen, schnell schalen-gefroren und die Lyophilisation dann nach gängigen Verfahren durchgeführt, wobei eine überhitzung nach Entfernung des Wassers sorgfältig vermieden wird. Das lyophilisierte Produkt lfl.ßt sich jederzeit wieder zu einer 5 bis 6?igen Gamma-Globulin-Lösung auflösen. Die Lösung ist, gefroren oder bei Temperaturen bis 10⁰C, für mindestens 1 Jahr und das gefriergetrocknete Pulver für mindestens 2 Jahre stabil.

Die erhaltene Feinheit ist mindestens 97 % mit der einzigen auffindbaren Verunreinigung Albumin. Die antikomplernent'ire Aktivitit liegt unter 0,01 Einheiten pro mg fJamma-Globulin (im Bereich 0,0005 bis 0,0025 Einheiten). Die Einheiten werden nach dem "Zwei Einheiten-Test" von Mayer, vgl. oben, gemessen.

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Beispiel 2

In pyragenfreiem destilliertem Wasser das 1 bis H % vorzugsweise 2 f Polyathylenglykol 4000 und 0,1 bis 1 % vorzugsweise 0,2 % Humanalbumin enthalt, wird Cohn-Fraktion-II-Paste oder Pulver bei 0-5 C gelöst, so daß eine Lösung mit einem Proteingehalt von 1-5 % vorzugsweise 2 %, entsteht. Der pH wird auf 5.1 (Bereich 4.9 bis 6.0, vorzugsweise 5.0 bis 5.8) eingestellt und der resultierende Niederschlag, der nach einer Stunde gebildet wird, wird durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt. Die Polyäthylenglykol-(PEO)-Konzentration des Filtrats wird mittels einer 50^igen PEG-4000-Lösung oder mit trockenem PE0-4000-Pulver auf 4 % erhöht. Der innerhalb einer Stunde gebildete Niederschlag wird entfernt. Dann wird Äthanol bis zu einer Konzentration von 6 % langsam zugesetzt, so daß die Temperatur nicht über 2°C steigt. Der gebildete Niederschlag wird nach 1-12 Stunden, vorzugsweise 12 Stunden, entfernt. Der pH wird dann auf 8.0 (Bereich 6.8 - 8.1) erhöht. Der resultierende Niederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt, nachdem man den Xthanol-Gehalt auf 25 % erhöht hat, und unter den gleichen Bedingungen wie im ersten Beispiel wiederaufgelöst. Das Produkt enthält über 99 % Gamma-Globulin, gemessen vor dem Zusatz von Albumin zu der zum Wiederauflösen benutzten Lösung. Es ergibt sich keine wahrnehmbare Hemmung der Hämolyse, wenn 50 mg des Gamma-Globulins pro ml (eine 5^ige Lösung) im Standard-Test von Mayer getestet werden; d.h. die antikomplementäre Aktivität liegt unter 0,01 Einheiten pro mg Ig G. Die zum Schluß erhaltene Lösung enthält nur das zugesetzte Albumin, das zuvor in bekannter Weise erhitzt worden ist um jegliche Hepatitis-B-Viren zu entfernen. Keine anderen Proteine können mit konventionellen Techniken wie z.B. Celluloseacetat-Elektrophorese, Immun-Elektrophorese oder Immunodiffusion, festgestellt werden.

Beispiel 3

Piacentares Gamma-Globulin, das durch bekannte Maßnahmen isoliert worden ist, kann wie im Beispiel 2 aufgearbeitet werden.

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Weil placentares Gamma-Globulin, das in bekannter Weise isoliert worden ist, einige wenige Prozent Verunreinigungen enthalt, die Plasma-Proteine sind, wird zusatzliche Sorgfalt darauf verwendet, alles unlösliche Material in jeder Stufe zu entfernen, insbesondere unlösliches Material abzuschwemmen, bevor der pH in der ersten und allen weiteren Stufen eingestellt wird. Das Filtrat der 6jEigen Äthanol-Lösung wird wie im ersten Beispiel 0.01 molar an Kochsalz gemacht. Die anderen Schritte sind alle wie in Beispiel 2 angegeben. Die Reinheit des Produkts ist mindestens 98 % an Gamma-Globulin, gemessen (vor dem Zusatz der zum Auflösen verwendeten Lösung, die 5-10 mg ml Albumin enthält) mit denselben Techniken wie in Beispiel 2.

Dieselben Auflöse-Lösungen wie in Beispiel 1 werden verwendet, wobei Mannit weggelassen wird, wenn das Produkt eine Lösung sein und nicht lyophilisiert werden soll.

Beispiel

Immuno-Globulin-G-Paste oder Fraktion II, oder getrocknetes Fraktion Il-Pulver plazentaren Ursprungs kann, benützt werden, um ein zur intravenösen Anwendung geeignetes, hoch gereinigtes, Produkt herzustellen. Folgende Maßnahmen werden durchgeführt:

1. Die Paste oder das Pulver wird bis zu einer Konzentration von 1 % (Bereich 0,3 - 5 %) in Wasser suspendiert, welchem 2 % Polyäthylenglykol 4000 (PEG 2000, 6000, 8000 und 12 000 - durchschnittliches Molekulargewicht - können ebenfalls benützt werden) und 0,2 % erhitztes Human-Albumin bei 1°C (Bereich 0 - 5°C) zugesetzt sind. Das unlösliche aufschwimmende Material wird durch Abschöpfen entfernt.

2. Der pH wird dann auf 5.1 (Bereich Ί.9 - 6.0) mit Essig- oder Salzsäure oder Zitronensäure oder anderen Säuren eingestellt. Der Niederschlag wird bei 1°C nach einer Stunde entfernt, und zwar durch Filtrieren oder Zentrifugieren.

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3. Die Polyäthylenglykol 4 OOO-Konzentration wird dann auf *J % erhöht. Das aufschwimmende Material wird wiederum entfernt. Später wird der sich bildende Niederschlag durch Filtrieren oder Zentrifugieren ebenfalls entfernt.

H. Äthanol wird bis zu einer Konzentration von 6 % (Bereich 2-12 %) langsam bei -6°C (Bereich + 2 bis - 15°C) zugesetzt.

5. Der Niederschlag und das aufgeschwommene Material werden wie bei den vorhergehenden Stufen entfernt.

6. Kochsalz wird bis zu einer Konzentration von 0,01 M (Bereich 0,0025 - 0,15 N) zugesetzt.

7. Der pH wird dann auf 8.0 (Bereich 7-8) at>;-ehoben.

8. Äthanol wird langsam bei -6°C bis zu einer Endkonzentration von 25 % zugesetzt.

9. Der Niederschlag wird mittels Zentrifugieren gesammelt.

10. Der Niederschlag wird bis zu einer Endkonzentration von 5 - 6 % auf der Basis von Bestimmungen mit bekannten Gewichten der Paste und bekannten Volumina in der Lösung, die folgendes enthält, aufgelöst: 6,5 % erhitztes Human-Albumin (Bereich 0,3 5 %), Natriumacetat (0,0125 oder 0,025 N), Glycin 0,15 N, pH 5.1 (eingestellt mit Essigsäure). Der pH der aufgelösten Paste wird mit Alkali, wie z.B. 1 5?-iger Natronlauge oder Kalilauge oder Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, auf 6.6 eingestellt.

ill. Wenn die Lösung lyophilisiert werden soll, werden 2 % Mannit (Bereich 1-3 %) zugesetzt.

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12. Die resultierende Lösung bzw. das gefriergetrocknete Pulver enthält keine bekannten Verunreinigungen und hat weniger als 0,003 Einheiten an antikomplementärer Aktivität in dem "Zwei-Einheiten-Komplement-Test¹¹ von Mayer.

13. Wenn der Niederschlag von Stufe 9 analysiert wird, enthält er mehr als 98 % Gamma-Globulin.

Das Gamma-Globulin dieser Erfindung kann leicht in die Form von pharmazeutischen Präparaten, die sich zur intravenösen- Verabreichung eignen, gebracht werden. Bei der Formulierung solcher Präparate wird das Gamma-Globulin in einer auf etwa pH 5.Ί - 6.7 gepufferten und Glycin, Albumin und ein nichtionisches Tensid enthaltenden wäßrigen Lösung aufgelöst. Der pH des Präparates wird dann, wie gewünscht, auf einen Wert zwischen 5.¹J und 6.7 gebracht und die Konzentration an Gamma-Globulin in dem Präparat auf 5 % eingestellt. Geeignete Puffer schließen Phosphat- und Natriumacetat/Essigsäure-Systeme ein.

Um jegliche Denaturierung des gelösten Produktes an einer Flüssigkeit/Gas- oder Flüssigkeit/Feststoff-Grenzfläche zu verhindern oder zu reduzieren, ist es vorteilhaft, dem pharmazeutischen Präparat ein Tensid zuzusetzen. Geeignete Tenside sind nichtionische Tenside, wie die Block-Copolymeren von Propylen- und Äthylenoxiden wie z.B. Pluronic 68 (Poloxamer 188), und Partialester von Sorbit und Polyoxyäthylenoxid mit langkettigen Fettsäuren, wie die Tweens^R 20, 40, 60, 80 und 95 (Polysorbate 20, 40, 60, 80 und 95), wasserlösliche Substanzen, die in der 1973er Ausgabe des CFTA Cosmetic Ingredient Dictionary's der Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association Inc. beschrieben sind, und Fluoro-Tenside wie ζ.3. Zonyl FSA, FSB, FSC und FSN. Diese nichtionischen Tenside stabilisieren Proteine gegen Oberflächen-Denaturierung und enthalten als Struktur keinerlei chemische Gruppen, welche auf andere Weise mit Proteinen in Wechselwirkung treten oder sie denaturieren könnten.

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Das Gamma-Globulin der vorliegenden Erfindung· hat, wenn es air, pharmazeutisches Präparat gemäß der vorliegenden Erfindung aufbewahrt wird, eine längere Halbwertzeit als die anderen .jetzt auf dem Markt befindlichen Gamma-Globulin-Pr^parate. Das Gamma-Globulin der vorliegenden Erfindung hat sich als wertvoll bei der intravenösen Verabreichung bei allen Gelegenheiten und unter allen Bedingungen erwiesen, bei denen eine intravenöse Verabreichung gefordert war ohne daft hierbei die üblichen unerwünschten Effekte, die sonst mit der intravenösen Verabreichung von Gamma-Globulin einhergehen, auftraten.

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Claims

Dr. Myer Louis Coval, Oakland, CaI./USA Case 5/721

Neue verbesserte Gammaglobuline für intravenöse Injektion und Verfahren zu ihrer Herstellung

Verfahren zur Herstellung eines praktisch von antikomplementärer Aktivität freien und für die intravenöse Verarbeitung geeigneten Gamma-Globulins, dessen Antikörperspektrum und Unterklassen-Verteilung gegenttber dem als Ausgangsmaterial verwendeten Plasma praktisch unverändert ist, dadurch gekennzeichnet, daß eine Paste von Cohn-Fraktionen II oder II + III oder von diese enthaltendem Placenta-Extrakt mit pyrogenfreiem Wasser bei einem pH-Wert von M, 9 bis 6 extrahiert wird, der filtrierte Extrakt mit Polyäthylenglykol bis zu einer Konzentration von 4 % (Gewicht/Volumen) und anschließend mit Xthanol bis zu einer Konzentration von *t bis 12 t (Gewicht/Volumen) bei -6 bis +1O⁰C versetzt wird, wobei jedesmal die ausgefallenen Verunreinigungen abgetrennt werden und anschließend aus dem PiItrat bei pH 7 bis 8,2 durch Erhöhung der Polyäthylenglykolkonzentration auf bis zu 12 % (Gewicht/Volumen) bzw. durch Erhöhung der Xthanolkonzentration auf bis zu 25 % (Volumen/Volumen) das gewünschte Gamma-Globulin bei einer Temperatur zwischen -6 und +20 C ausgefällt und isoliert wird.

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ORIGINAL INSPECTr

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2. Verfahren zur Herstellung eines praktisch von antikomplementärer Aktivität freien und für die intravenöse Verabreichung geeigneten Gamma-Globulins, welches praktisch frei ist von Aggregaten und Abbauprodukten F (ab K, P (ab)_ oder Fc, einen SediiTientationskoeffizienten von vorzugsweise 7 S besitzt und sich in Wasser zu klaren und farblosen Lösungen löst, wobei dessen Antikörperspektrum und Unterklassen-Verteilung gegenüber dem ursprünglich verwendeten Plasma im wesentlichen unverändert ist, wobei dieses aus den Cohn-Fraktionen II oder II + III eines pastenförmigen Plasmaproteins mit einem Proteingehalt von 20 bis 30 % oder aus einem Placenta-Extrakt, der diese Fraktionen enthält, dadurch gewonnen wird, daß man besagte Paste bei 0 bis 5°C in 25 bis *J5 Liter pyrogenfreiem Wasser pro kg Paste löst, den pH-Wert mit einer pharmakologisch verträglichen anorganischen oder organischen Säure auf 4,9 bis 6,0 einstellt, gegebenenfalls durch Zugabe eines Salzes, beispielsweise von Kochsalz, die Ionnenstärke so einstellt, daß die Lösung eine Leitfähigkeit von etwa 300 χ ίο" -10 -1

cm Jt aufweist, das wasserunlösliche Material abtrennt und das Filtrat einer fraktionierten Fällung unterwirft, und das weitere Verfahren der fraktionierten Fällung dadurch gekennzeichnet ist, daß zunächst Polyäthylenerlykol bei 0 bis 5°C bis zu *J % (Gewicht/Volumen) zugesetzt, der sich bildende Niederschlag abgetrennt, das Filtrat bei -6 bis O⁰C mit Äthanol in einer Konzentration von ¹I bis 12 % (Gewicht/Volumen) versetzt, der sich bildende Niederschlag wiederum abgetrennt, das Filtrat anschließend mit einer physiologisch verträglichen anorganischen oder organischen Base auf einen pH-Wert von 7 bis 8,2 gebracht und atfs dem Filtrat das Gamma-Globulin durch Zusatz von Polyäthylenglykol bis zu einer Konzentration von bis 12 % (Gewicht/Volumen) oder durch Zusatz von Äthanol bis zu einer Konzentration von 20 bis 30 % (Volumen/Volumen) bei einer Temperatur zwischen 0 und -6 C ausgefüllt und gegebenenfalls anschließend der isolierte Niederschlag wieder mit anderen

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Träger- und Hilfsstoffen in Lösung gebracht und die Lösung gewUnschtenfalls anschließend gefriergetrocknet bzw. lyophilisiert wird.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Entfernung der Verunreinigungen mittels Polyäthylenglykol und anschließend Äthanol bei einem pH-Wert von 5,1 erfolgt.
H. Verfahren nach den Ansprüchen 1,2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Polyäthylenglykol ein Molekulargewicht von ¹IOOO bis 6000 besitzt.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2, 3 und Ί, dadurch gekennzeichnet, daß zur Entfernung der Verunreinigungen das Polyäthylenglykol in einer Konzentration von Ί K₁ das Äthanol in einer Konzentration von 6 % bei einer Temperatur von -2 C zur Anwendung kommen und nach Einstellung eines pH-Wertes von 8,0 die Lösung 0,01 molar an Kochsalz gemacht und, bei -6 C, mit Polyäthylenglykol 4000 bis zu einer Konzentration von 12 % (Gewicht/Volumen) oder mit Äthanol bis zu einer Konzentration von 25 % (Volumen/Volumen) zur Fällung des Gamma-Globulins versetzt wird.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die erhaltene Gamma-Globulin-Paste zusammen mit Human-Albumin, Natriumacetat, Glycin und gegebenenfalls Mannit in eine wässerige Lösung mit einem pH-Wert von 5,0 bis 5,5 gebracht wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die so hergestellte Lösung, die auch Mannit enthält, anschließend mittels einer Base auf einen pH-Wert von 6,4 bis 6,6 gebracht, anschließend gefriergetrocknet bzw. lyophilisiert wird.

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8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangssuspension mittels Wasser hergestellt wird, welches etwa 2 % Polyäthylenglykol und etwa 0,2 % Albumin enthält.
9. Ein im wesentlichen von antikomplementärer Aktivität freies und für die intravenöse Verabreichung geeignetes Gamma-Olobulin, welches praktisch frei ist von Aggregaten und Abbauprodukten F (abJ₁, F (ab)₂ oder Fc, einen Sedimentationskoeffizienten von vorzugsweise 7 S besitzt und sich in Wasser zu klaren und farblosen Lösungen löst, wobei dessen Antikörperspektrum und Unterklassenverteilung gegenüber dem ursprünglich verwendeten Plasma im wesentlichen unverändert geblieben ist, dadurch gekennzeichnet, daß dessen antikomplementäre Aktivität

! kleiner als 0,01 Einheiten pro mg Gamma-Globulin ist.
10. Ein im wesentlichen von antikomplementärer Aktivität freies und für die intravenöse Verabreichung geeignetes Gamma-Globulin, welches praktisch frei ist von Aggregaten und Abbau-

; produkten F(ab)₁, F(ab)₂ oder Fc, einen Sedimentations- ! koeffizienten von vorzugsweise 7 S besitzt und sich in Wasser zu klaren und farblosen Lösungen löst, wobei dessen Antikörperspektrum und Unterklassenverteilung gegenüber dem ursprünglich verwendeten Plasma im wesentlichen unverändert geblieben ist, hergestellt nach den in den Ansprüchen 1 bis

j beschriebenen Verfahren.
11. Lyophylisiertes Gamtna-Clobulin %uv intravenösen Verabreichung gemäß den Ansprüchen 9 und 10.
12. Verwendung von gegebenenfalls lyophilisierten Gamma-Globulinen gemäß den Ansprüchen 9 bis 11 zur Bekämpfung von Infektionen.

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