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DE2740053A1 - Verwendung von allosterischen effektoren mit hilfe von lipidvesikeln ueber eine irreversible inkorporierung zwecks verbesserter o tief 2 -entladung des haemoglobins in erythrozyten - Google Patents

Verwendung von allosterischen effektoren mit hilfe von lipidvesikeln ueber eine irreversible inkorporierung zwecks verbesserter o tief 2 -entladung des haemoglobins in erythrozyten

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Publication number
DE2740053A1
DE2740053A1 DE19772740053 DE2740053A DE2740053A1 DE 2740053 A1 DE2740053 A1 DE 2740053A1 DE 19772740053 DE19772740053 DE 19772740053 DE 2740053 A DE2740053 A DE 2740053A DE 2740053 A1 DE2740053 A1 DE 2740053A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
erythrocytes
ihp
vesicles
discharge
hemoglobin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19772740053
Other languages
English (en)
Inventor
Klaus Prof Dr Med Gersonde
Yves-Claude Prof Dipl Nicolau
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Studiengesellschaft Kohle gGmbH
Original Assignee
Studiengesellschaft Kohle gGmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Studiengesellschaft Kohle gGmbH filed Critical Studiengesellschaft Kohle gGmbH
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Priority to ES473087A priority patent/ES473087A1/es
Priority to IN641/DEL/78A priority patent/IN149223B/en
Priority to YU02080/78A priority patent/YU208078A/xx
Priority to EP78100816A priority patent/EP0001104B1/de
Priority to DE7878100816T priority patent/DE2860719D1/de
Priority to AT0642478A priority patent/AT364086B/de
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Priority to JP53109520A priority patent/JPS6022683B2/ja
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Priority to CA310,662A priority patent/CA1130724A/en
Priority to IE1800/78A priority patent/IE47329B1/en
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Priority to DK393878A priority patent/DK393878A/da
Priority to US05/952,224 priority patent/US4192869A/en
Priority to US06/023,044 priority patent/US4321259A/en
Publication of DE2740053A1 publication Critical patent/DE2740053A1/de
Priority to JP9072881A priority patent/JPS5726620A/ja
Priority to JP56090729A priority patent/JPS6059213B2/ja
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Description

VON KREISLER SCHONWALD MEYER EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING
PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler + 1973
Dr. Ing. K. Schönwald, Köln
Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln
Dr. Ing. K. W. Eishold, Bad Soden
Dr. J. F. Fues, Köln
Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln
Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln
Dipl.-Intj. G. Selling, Köln
5 KÖLN 1
DtICIIMANNHAUS AM HAUPTÜAIINHOF
5. September 1977 AvK/IM
Studiengesellschaft Kohle mbH., Mülheim/Ruhr
Kaiser-Wilhelm-Platz 1
Verwendung von allosterischen Effektoren mit Hilfe von Lipidvesikeln über eine irreversible Inkorporierung zwecks verbesserter O_-Entladung des Hämoglobins in
Erythrozyten
909818/0011
Telefon: (0221) 23 45 41-4 ■ Tc It» : ö. (2307 dopo d Ielcfiramin: Dompcilcnl Köln
Eine der Hauptfunktionen der Erythrozyten ist der Transport des molekularen Sauerstoffes von den Lungen zum peripheren Gewebe. Die Erythrozyten besitzen eine hohe Konzentration (30 pg pro Zelle = 33,5 g/100 ml Zellen) von Hämoglobin, das ein reversibles 02-Addukt zu bilden vermag. Der 02-Partialdruck in den Lungenalveolen beträgt ca. 100 Torr, der Sauerstoff in der Endstrombahn ca. 70 Torr und der kritische O2-Partialdruck zum Beispiel im Gehirn 30 Torr. Unter normalen Bedingungen werden nur ca. 25 % des 02-beladenen Hämoglobins desoxigeniert und ca. 75 i° mit dem venösen Blut den Lungen wieder zugeführt, also nicht für den O2-Transport ausgenutzt.
Eine Anpassung an dieses physiologische Erfordernis, nämlich eine maximale Entladung des oxigenierten Hämoglobins bei Aufrechterhaltung eines möglichst hohen O2-Partialdruckes in der Endstrombahn, wird möglich durch \7echselwirkung des Hamoglobinmoleküls mit allosterischen Effektoren. Die Allosterie des Hämoglobins führt zur Bildung einer sigmoidförmigen O2-Bindungskurve, deren Halbsättigungsdruck pn (-,/o\
ein Mass der Affinität ist. Die Steigung der sigmoiden O2-Bindungskurve im mittleren Sättigungsbereich ergibt ein Mass der Kooperativität der vier O2-Bindungsorte im Hämoglobin (Hill-Koeffizient: η = 2,8 - 3,2). Eine Erhöhung des Hill-Koeffizienten (d.h. eine steilere sigmoide Bindungskurve) oder eine Verschiebung der gesamten Bindungskurve zu höheren O2-Partialdrucken (sogenannte "Rechtsverschiebung11)· würden daher zu einer erleichterten O2-Abgabe in der Endstrombahn und besseren O2-Ausnutzung im Gewebe führen. In vivo wird tatsächlich eine Rechtsverschiebung der O2-Bindungskurve z.B. erreicht, wenn der 2,3-Bisphosphoglycerat-Spiegel im Erythrozyten steigt und dieser allosterische Effektor an Hämoglobin gebunden v/ird. Durch Bindung des 2,3-Bisphophoglycerat an Hämoglobin wird die O2-Affinität herabgesetzt
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- ar -
bzw. der O2-Halbsättigungsdruck heraufgesetzt. Da das 2,3-Bisphosphoglycerat im Nebenschluss der Glykolyse in den Erythrozyten gebildet wird, kann dieser Effekt aber nur zu einer langsamen Anpassung an O2-Mangel-Bedingungen dienen. Die maximale Anhebung des O2-Halbwertsdruckes bei physiologischem pH (pH 7.4) und bei einer Temperatur von 37° C bzw. 25° C beträgt für isoliertes menschliches Hämoglobin nach Bindung von 2,3-Bisphosphoglycerat +155 % bzw. +193 % (stripped Hb; p0 /n /?\ = 9,3 bzw. 4,1 Torr; Hb nach Bindung, von 2,3-Bisphosphoglycerat: pQ (λ/2) ~ 23,7 bzw. 12,0 Torr (Inai, D. und Yonetani,T. (1975), J. Biol. Chem. 250, 7093 7098) ). Eine erheblich grössere Herabsetzung der O2-Af f inität bzw. Heraufsetzung des O2-Halbsättigungsdruckes hat man auch durch Bindung von Inositolhexaphosphat (Phytinsäure, IHP), das aus Pflanzen in grossen Mengen isoliert werden kann, an isoliertes Hämoglobin erreichen können. Im Falle einer Bindung von IHP an Hämoglobin bei 37° C bzw. 25° C und bei pH 7.4 wird der O2-Halbsättigungsdruck um +940 # bzw. 1080 % erhöht (Hb nach Bindung von IHP: p0 i-\/o\ =96,4 bzw. 48,4 Torr). Das IHP kann aber wie das 2,3-Bisphosphoglycerat die Erythrozyten-Membran nicht passieren (Gersonde K., unpublished results).
Es wurde nun überraschend gefunden, dass mit Hilfe von fluiden, geladenen Lipid-Vesikeln, die mit Erythrozyten-Membranen fusionieren, das IHP in das Innere der Erythrozyten hineintransportiert wird, wo wegen der sehr viel grösseren Bindungskonstante des IHP das 2,3-Bisphosphoglycerat aus seinem Bindungsort im Hämoglobin verdrängt wird. Dabei wird das Hämoglobin in eine allosterische Konformation im Erythrozyten überführt, die eine wesentlich niedrigere O2-Affinität besitzt. Zwar ist der Einfluss des IHP auf die Struktur und somit die Funktion des isolierten Hämoglobins detailliert untersucht
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worden (Inai, K. und Yonetani, T. (1975), J.Biol.Chem.25o 7o93-7o98; Ruckpaul,K., Rein,H., Ristan,O., Jänig, G.-R. und Jung,F.,(1971) Biochem.Biophys.Acta 236,211-221),aber man hat keine Kenntnisse über die Wechselwirkung des IHP mit Hämoglobin innerhalb der Erythrozyten,da es bisher nicht möglich war, das IHP in die intakten Erythrozyten zu inkorporieren.Die Herabsetzung der O2~Affinität bzw. Heraufsetzung des O2-Halbsättigungsdruckes des Hämoglobins in Erythrozyten durch Bindung von IHP verstärkt die Fähigkeit der Erythrozyten auch gegen höhere 02-Partial-drucke den gebundenen Sauerstoff abzugeben und ermöglicht somit eine Verbesserung der O2-Versorgung der Gewebe.
Erythrozyten, die IHP inkorporiert haben und somit eine bessere O2-Ausnutzung im Gewebe gewährleisten, können in folgenden Fällen zur Anwendung kommen:
1. Bei niedrigem O2-Partialdruck in der Atemluft: Bergsteiger in grösserer Höhe, Raumfahrer in verdünnter O2-Atmosphäre.
2. .Bei Verringerung der O2-Austauschfläche: Verminderung der
Zahl der Lungenalveolen bei Lungenemphysem.
3. Bei Erhöhung des O2-Diffusionswiderstandes in der Lunge: Pneumonie, Asthma.
4. Bei Verringerung der O2-Transportkapazität: Erythropenie, anämische Zustände aller Art, arteriovenöser Shunt, Hämoglobin-Mutationen, Enzymdefekte in Erythrozyten.
5. Bei Zirkulationsstörungen: Artheriosklerose, thromboembolische Prozesse.
6. Bei Erniedrigung der O2-Affinität des konservierten Blutes, dessen O2-Affinität infolge der Hydrolyse des 2,3-Bisphosphoglycerates erheblich gesteigert ist. Dies ist wichtig bei Bluttransfusionen aller Art, da das
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konservierte Blut eine geringere O2-Abgabefähigkeit als das zirkulierende Blut besitzt und im Falle von operativen Eingriffen und in Schockzuständen der gegenteilige Effekt erwünscht ist.
Lipid-Vesikel können bestimmte Eigenschaften von Zellplasmamembranen widerspiegeln. Es ist bekannt, dass sie in Zellen eindringen können entweder durch Fusion mit der Zellplasma-Membran oder durch Endozytose. Die Fusion spielt eine wichtige Rolle bei zahlreichen Zellmembran-Prozessen wie z.B. bei der synaptischen Uebertragung, bei der Sekretion, bei der Bildung der Plasmamembran (Assembly), bei der Infektion durch Membranviren, etc.. Die Fusion der Zellen mit Lipid-Vesikeln wurde sowohl mit Zellen in Kulturen als auch mit Erythrozyten-"ghosts" (Erythrozyten-Membranen ohne Zellinhalt) beobachtet. Experimente haben gezeigt, dass Lipid-Vesikel gefahrlos in Tiere injiziert werden können. In vitro-Experirnente an ML-Zellen sind bekannt, wonach solche Zellen, mit dem Coxsackie-Virus infiziert, zeigen, dass man mit Hilfe der Fusion mit Lipid-Vesikeln IgG in die Zellen inkorporieren kann. Gregoriadis, G., und Buckland, R.A. (1973),Nature 23£, 252, haben z.B. Invertase mit dieser Methode in Makrophagen der Maus, die einen Invertase-Defekt aufwiesen, inkorporiert. In vivo-Experimente führten aber zu keinen eindeutigen Ergebnissen, da die Vesikel in alle Zellen eingebaut werden oder aber in der Leber sehr schnell abgebaut werden.
Die Inkorporierung allosterischer Effektoren oder anderer Stoffe in intakte Erythrozyten mit Hilfe der Lipid-Vesikel ist bisher nicht beschrieben worden.
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Herstellung der für die Erythrozyten-Fusion geeigneten Vesikel und Ihre Anreicherung mit Inositolhexaphosphat.
Im isotonischen bis-tris-Puffer pH 7.4 wird IHP bis zu einer Molarität von 0.19 mol/l (gesättigte Lösung) bei 37° C gelöst, Ein Lipid-Gemisch von Phosphatidylcholin : Phosphatidylserin : Cholesterin (molares Verhältnis 8:2:7) wird in dieser Lösung suspendiert und 45 min bei ca. +50° C beschallt (Typ: Schwöller 125, 10 kHz, mit Titankopf). Nach der Beschallung wird die Suspension 1 h bei 100 000 g zentrifugiert. Der Ueberstand enthält die Lipid-Vesikel, die einen Durchmesser
von ca. 300 A haben. Bei der Bildung der Vesikel schliessen diese ihr Umgebungsmedium ein. Die Reinheit der Lipide wurde durch DünnschichtChromatographie geprüft. Es ist darauf zu
2+ 2+ achten, dass die Pufferlösung frei von Ca - und Mg -Ionen
Phosphatidylserin ist aus Rinderhirn und Phosphatidylcholin aus Eigelb gewonnen. Cholesterin und das Natriumsalz des Inositolhexaphosphats ist im Chemie-Handel erhältlich. 1 nmol/1 Lipid ergibt 2 χ 1011 Lipid-Vesikel, die mit doppelschichtigen Lipid-Membranen ausgestattet sind. 2 χ 10 Lipid-Vesikel wurden mit 10 Erythrozyten inkubiert.
Menschliche Erythrozyten werden durch Zentrifugation vom Plasma getrennt und in isotonischer bis-tris-Lösung pH 7.4, die IHP-Vesikel enthält, aufgenommen. Durch Inkubation bei 37°C wird die Fusion der Erythrozyten mit den Vesikeln herbeigeführt.
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Anwendung der behandelten Erythrozyten-Suspension.
Die Fusionskinetik kann mit Hilfe der sich ändernden O2-Affinität dargestellt werden (siehe Fig. l). Der O2-Halbsättigungsdruck wurde in Abhängigkeit von der Inkubationszeit (37° C) mit Hilfe der Diffusionstechnik bei 25° C (Sichi, H., and Gersonde, K., (1969) Analyt. Biochem. 32, 362 - 376; Sichi, H., and Gersonde, K. (1972) Analyt. Biochem. 47, 46 56) an intakten Erythrozyten gemessen. Nach einer Inkubationszeit von 30 min ändert sich die O2-Affinität der Erythrozyten nicht mehr (siehe Fig. l).
Es wurden verschiedene Molverhältnisse der Lipidkomponenten in den Vesikeln getestet. Das oben angegebene Verhältnis erwies sich als am günstigsten, sowohl bezüglich der Fusionskinetik als auch bezüglich der Herabsetzung der O2-Affinität (siehe Fig. 2). Die Konzentration an IHP wurde hierbei konstant bei einer Molarität von 0.19 mol/1 gehalten.
Die "Rechtsverschiebung" der O2-Bindungskurven nach Inkorporierung von Inositolhexaphosphat ist in Fig. 3 dargestellt. Dabei wird nach Fusion der Erythrozyten mit den Vesikeln, die mit 0,19 M IHP beladen sind, der O2-Halbsättigungsdruck bei pH 7.4 und 25° C bei Verwendung von 41 Tage alten Erythrozyten von 7 Torr auf 28 Torr erniedrigt. Das bedeutet, dass bei 25° C der normale, aber gealterte Erythrozyt bei einem 02-Partialdruck von 30 mm Hg zu 95 # mit O2 beladen ist, während der Vesikel-fusionierte Erythrozyt nur noch zu 53 % mit O2 beladen ist. Unter den obengenannten Bedingungen hat etwa ein Anteil von 60 % des Hämoglobins in den Erythrozyten nach Fusion mit Vesikeln IHP gebunden. Ueberträgt man die bei 25° C gewonnenen Messdaten auf die in-vivo-Verhältnisse bei 37° C, dann errechnet man für die IHP-beladenen Erythrozyten
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einen Halbwertsdruck von 60 mm Hg bei pH 7·4. Bei einem kritischen 02-Partialdruck im Gehirn von 30 Torr wurden bereits 80 $ des Hämoglobins in den Vesikel-fusionierten und IHP-beladenen Erythrozyten ihren Sauerstoff abgegeben haben, während die Normal-Erythrozyten unter diesen Bedingungen nur 20 - 25 $ ihres Sauerstoffes entladen würden. Zwischen den beiden Extremzuständen kann nun die effektive O2-Affinität der Erythrozyten variiert werden, wenn man entweder die IHP-Konzentration in den Vesikeln ändert oder aber das Verhältnis der Normal-Erythrozyten zu den Vesikel-fusionierten Erythrozyten im Blut variiert.
In Fig. 4 ist der Einfluss des pH-V/ertes auf den Halbsättigungsdruck in Normal- und Vesikel-fusionierten Erythrozyten dargestellt. Die Inkorporierung des IHP erfolgte bei pH 7·4. Der pH-Wert der Erythrozyten wurde dann durch Aufnahme der Zellen in isotonischen Pufferlösungen geändert. Da das IHP die Erythrozyten nicht verlassen kann, wird auch der Bohr-Effekt (pH-Abhängigkeit der O2-Affinität) verstärkt.
Die Fusion der Erythrozyten mit den Vesikeln ist pH-abhängig und erreicht bei pH 7.4 ein Maximum (siehe Fig. 5).
Die Ergebnisse zeigen, dass die von uns vorgeschlagene Methode der Inkorporierung des IHP in Erythrozyten eine dauerhafte, wesentliche und kontrollierbare Herabsetzung des O2-Halbsättigungsdruckes und eine Verstärkung des Bohr-Effektes bewirkt. Daher eignen sich die mit IHP beladenen Erythrozyten bei Transfusion in den oben genannten Fällen zu einer Steuerung der O2-Ausnutzung im Gewebe. Dadurch wird eine Behandlung von physiologisch und pathologisch-bedingten O2-Mangelzuständen im Gewebe möglich.
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-sr- r 77AOQSl1
' \ NACHCEREICHTI
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Fig. 1: Zeitabhängigkeit der Inkorporierung von Inositolhexaphosphat (IHP) in Erythrozyten durch Fusion mit IHP-Vesikeln. Aenderung des Halbsättigungsdruckes durch Bindung von inkorporiertem IHP an Hämoglobin
: 54 Tage alt, suspendiert in isotonem bis-Tris-Puffer pH 7.38;. Vesikel: Zusammensetzung: PC : PS : Ch = 8 : 2 : 7, suspendiert in isotonem bis-Tris-Puffer pH 7.38, enthaltend 0,19 M IHP,
Durchmesser: 300 A; Temperatur der Inkubation: 37° C; Temperatur im O2-Bindungsexperiment: 25° C.
Fig. 2: O--Bindungskurven der Erythrozyten unter dem Einfluss ,' der lilP-Inkorporierung bei Fusion mit IHP-Vesikeln.
Einfluss der Vesikelzusammensetzung auf die Inkorporierung von Inositolhexaphosphat in Erythrozyten. Erythrozyten: 20 Tage alt, suspendiert in isotonem bis-Tris-Puffer pH 7.6; Vosikel: suspendiert in isotonem bis-Tris-Puffer pH 7.6, enthaltend 0,19 M IHP, Durchmesser 300 A. Temperatur der Inkubation: 37° C; Inkubationszeit: 30 min; Temperatur im O2-Bindungsexperiment: 25° C.
O2-Entladung bei 8 mm Hg:
2'j "β, -.. — .—.— Erythrozyten;
u,7 fa Erythrozyten + Vesikel Ia
(PC : PS :Ch = 9 : 1 : 8)
Y8 cf0 _ Erythrozyten + Vesikel Ha
(PC : PS : Ch = 8 : 2 : 7).
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I M/Ä
zu Fig. 3: ?ϊΥί^Ι25ΥΪ52: 41 Tage alt, suspendiert in isotonem bis-Tris-Puffer pH 7,4; Vesikel: Zusammensetzung: PC : PS : Ch = 8:2:7, suspendiert in isotonem bis-Tris-Puffer pH 7,4, enthaltend 0,19 M IHP, Durchines-
ser: 300 A; Temperatur der Inkubation: 37° C; Inkubationszeit: 30 min; Temperatur im O2-Bindungsexperiment : 25° C.
O2-Entladung der Erythrozyten gegen den kritischen O2-Partialdruck im Gehirn (30 Torr).
bei 25° C: Erythrozyten (nach Alterung) : 5 % Entladung,
Erythrozyten nach Fusion mit
IHP-Vesikel Ha (Aufhebung
der Alterung) :47 i* Entladung,
bei 37° C: — Erythrozyten (nach Alterung) : 21 $ Entladung,
Erythrozyten nach Fusion mit
IHP-Vesikel Ha (Aufhebung
der Alterung) : 80 % Entladung.
- 12 909818/0011
H Γ'
Fig. 4: Bohr-Effekt der Erythrozyten in Abhängigkeit von der IHP-Inkorporierung durch Fusion mit IHP-Vesikel Ua.
20 Tage alte Erythrozyten, suspendiert in isotonem bis-Tris-Puffer pH 7,4.
25 Tage alte Erythrozyten nach Fusion mit IHP-Vesikel Ha, (PC : PS :Ch = 8 : 2 : 7) bei pH 7,4.
35 Tage alte Erythrozyten nach Fusion mit oxidierter, IHP-Vesikel Ha bei pH 7,4. Inkubationszeit: 30 min; Temperatur im O2-Bindungsexperiment: 25° C; Aenderung des pH-Wertes 'erfolgte nach Inkorporierung des UiP bei pH 7,4 durch Suspension der Erythrozyten in einem isotonischen Puffer mit gewünschtem pH-Wert.
Fig. 5: pH-Abhängigkeit der Fusion der Erythrozyten mit IHP-Vesikel Ha.
-o— <s-$ — f 41 Tage alte Erythrozyten, suspendiert in isotoner: Pufferlösungen des jeweiligen pH-Wertes und inhibiert mit IHP-Vesikel (Ha) bei 37° C.
-^j- _o- -o-, 40 Tage alte Erythrozyten, suspendiert in isotoner. Pufferlösungen des jeweiligen pH-Wertes und inhibiert mit Vesikel Ha, das kein IHP enthält.
-4—A- -4-, 40 Tage alte Erythrozyten, suspendiert in isotonei Pufferlösungen des jeweiligen pH-Wertes.
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Claims (4)

Patentansprüche
1. Verfahren zum Inkorporieren von allosterischen Effektoren in Erythrozyten, dadurch gekennzeichnet, daß man mit allosterischen Effektoren beladene Lipid-Vesikel in das Innere von Erythrozyten transportiert und dort irreversibel inkorporiert,
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als allosterische Effektoren Inositolphosphate verwendet.
3. Verwendung von allosterischen Effektoren mit Hilfe von Lipidvesikeln über eine irreversible Inkorporierung zwecks verbesserter O--Entladung des Hämoglobins in Erythrozyten.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als allosterische Effektoren Inositolphosphate verwendet.
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ORIGINAL INSPECTED
DE19772740053 1977-09-06 1977-09-06 Verwendung von allosterischen effektoren mit hilfe von lipidvesikeln ueber eine irreversible inkorporierung zwecks verbesserter o tief 2 -entladung des haemoglobins in erythrozyten Withdrawn DE2740053A1 (de)

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