DE2248475C3 - Verfahren zur Gewinnung von hepatitissicheren, lagerungsstabilen und infundierbaren Hämoglobinlösungen - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von hepatitissicheren, lagerungsstabilen und infundierbaren HämoglobinlösungenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von hepatitissicheren, lagerungsstabilen und infundierbaren
Hämoglobinlösungen mit einem stabilisierten 2,3-Di-phosphoglyceiatspiegel durch Hämolyse
von menschlichen Erythrozyten, quantitative Abtrennung des Stromalipids, Senkung des Kaliumgehaltes
und Stcrilfiltration der Lösung.
Die im Handel befindlichen, sogenannten »Bluter-Siitzstoffe«
weisen gegenüber Blutkonserven folgende Vorteile auf:
1. Ihre Anwendung erfordert keine Blutgruppen-Diagnostik,
2. sie sind langer haltbar,
3. sie sind hepatitissicher.
Ihr Hauptnachteil ist, daß sie viele Spczialfunktionen
des Blute* nicht ersetzen können, so zum Beispiel
nicht den Sauerstofftransport der roten Blutkörperchen. Speziell dafür befinden sich als Alternative zum
Blut isotonische Losungen von menschlichem Hämoglobin seit einigen Jahren in der vorklinischen Prüfunu.
Da offenbar der entscheidende Faktor für die
Entstehung eines Schocks die mangelnde Sauerstoffversorgung ist, erscheint ein solches Präparat vor allem
für die Schock-Therapie erstrebenswert.
Man hat bereits versucht, als Sauerstoffträger wäßrige Emulsionen von Fluorkohlenstoffverbindungen,
insbesondere zur Perfusion von isolierten Organen einzusetzen. Da es jedoch für diese Substanzgruppen
keinen natürlichen Eliminierungsweg gibt, steht eine intravenöse Infusion in den Körper jetzt noch vor einem
entscheidenden Hindernis, zumal solche physiologisch nicht abbaufähigen Fremdstoffe zwangsläufig
im Gewebe gespeichert werden.
Freies Hämoglobin ist demgegenüber harnfähig, beziehungsweise wird zum Teil resorbiert und dem
natürlichen Stoffwechsel unterworfen. Bei den bekannten Hämoglobinpräparaten ist die Frage nach der
Hepatitissicherheit noch nicht angesprochen worden. Für die klinische Anwendung kommt ihr jedoch eine
erhebliche Bedeutung zu, da bei Spenderblut als Ausgangsmaterial eine Infektiosität nicht ausgeschlossen
werden kann. Während es Verfahren gibt, mit denen Blutplasmakomponenten sicher sterilisiert werden
können, ist bis heute kein Verfahren bekannt, Blutzellen, und damit Hämoglobin, sicher von Hepatitiserregern
zu befreien.
Es sind zwar Versuche bekannt, mit /3-Propiolacton Erythrozyten zu sterilisieren, die aber entweder wirkungslos
oder zellschädigend verliefen, auf keinen Fall aber zur Herstellung von Hämaglobin-Infusionslösungen
geeignet waren.
Es sind bereits Verfahren beschrieben, wie man aus menschlichen Erythrozyten unter Verminderung des
Kaliumgehaltes und Entfernung des bei der Hämolyse ebenfalls anfallenden Stromalipids der Blutplasma-Physiologie
angepaßte Hämoglobinlösungen herstellen kann. Bei Erprobung dieser bekannten Hämoglobinlösungen
haben sich jedoch Nachteile herausgestellt, die bisher eine klinische Anwendung verhinderten,
weil insbesondere Nierenstörungen beobachtet wurden. Andere bekannte Hämoglobinlösungen sind
zwar nierenverträglich, zu ihrer Herstellung wird jedoch unter anderem ein Dialyseverfahren angewendet,
wodurch der für die physiologisch wichtige Sauerstoffaffinität verantwortiche Phosphatester, das 2,3-Diphospho-glyccrat,
quantitativ entfernt wird.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von hepatitissicheren, lagerungsstabilen
und iiifundierbaren Hämoglobinlösungen mit einem stabilisierten 2,3-Diphospho-glyceratspiegel durch
Hämolyse von menschlichen Erythrozyten, quantitative Abtrennung des Stromalipids, Senkung des Kaliumgehaltes
und Sterilfiltration der Lösung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Erythrozyten
enthaltende Ausgangsmaterial bei Temperaturen zwischen 5 und 15° C bis 25 Minuten mit verdünnten
Lösungen von /3-Propiolacton 4 bis 12 g je Liter Erythrozytensediment
beträgt, anschließend mit einer Natriumchlorid enthaltenden Waschlösung behandelt
und/oder mit einer Natriumbicarbonat enthaltenden Lösung überschüssiges /3-Propiolacton und dessen
Reaktionsprodukte herauswäscht, das erhaltene Hämolysat dann mit einem Kationenaustauscherharz in
H ' -Form behandelt, bis der pH-Wert auf 5,0 bis 5,5 abgesunken ist, vom Harz und der ausgefällten
Stromamasse durch Zentrifugieren befreit, die gewünschte Hämoglobinkonzentration durch Verdünnen
mit Wasser einstellt. Mittel zur Regelung der Isolonie
und zur Stabilisierung \on pH-Wert und
phosphorgebundenem zweiwertigem Eisen zugibt und dann steriJfütriert.
Durch diese Kombination von kritischen Verfahrensschritten wird ein Produkt erhalten, bei dessen
Anwendung die Gefahr einer Hepatitis ausgeschaltet ist. Die Behandlung mit der Lösung des jS-Propiolactons
wird vorzugsweise nicht langer als 25 Minuten durchgeführt. Durch 4maliges Waschen auf der Zentrifuge
wird dann der Gehalt an noch nicht abreagiertem 0-Propiolacton im Erythrozytenüberstand auf 20
bis 10 mg% herabgesetzt, wobei vorzugsweise Waschlösungen
verwendet werden, die Kochslaz oder Natriumbicarbonat enthalten. Andere geeignete Waschmittel
sind Lösungen von tert. Natriumeitrat, tert. Natriumphosphat und Natriumcarbonat. Bei der anschließenden
Hämolyse wird auf '/su weiterverdünnt.
Erst in einer solchen Konzentration kommt das ß-Propiolacton in direkte Berührung mit dem Hämoglobin
und den anderen Komponenten des Zellinneren. Es kann vollständig dann abreagieren.
Als bevorzugtes Verdünnungsmittel wird destilliertes Wasser verwendet. Man kann aber auch physiologisch
geeignete Elektrolytlösungen zusetzen, zum Beispiel Kochsalz-, Glukose- oder Bicarbonatlösungen.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß bei einem derart durchgeführten Verfahren vor allem das
für die Hydrolyse des 2,3-Diphospho-glycerats verantwortliche
Enzymsystem deutlich gehemmt wird. Arbeitet man bei dem Verfahren gemäß der Erfindung
ohne die Stufe der /J-Propiolactonbehandlung,
dann weist das Verfahrensprodukt nach '/Jähriger Lagerung etwa das Doppelte an freiem Phosphat auf
wie das erfindungsgemäß hergestellte Produkt. Wie direkte Messungen ergaben, wird durch die erfindungsgemäße
Behandlung mit /3-Propiolacton der 2,3-Diphospho-glyceratgehalt in Hämoglobinlösungen
auf einem Wert von etwa 0,4 mmol je 0,8 mmol
Hämoglobin über einen Zeitraum von mehr als einem Vierteljahr stabilisiert. Ohne diese Stabilisierung
schwankt der entsprechende 2,3-Diphospbo-glyceratwert
von Charge zu Charge zwischen 0 und 0,25 mmol. Bei dem erfindungsgemäßen Produkt wird die
Sauerstoffabgabebereitschaft in vivo so lange auf einem höheren Wert gehalten, bis der Effektor 2,3-Diphospho-glycerat
vollständig abdissoziiert und über die Nieren ausgeschieden ist. Dann erst sinkt die
Wirksamkeit des beanspruchten Präparates auf die der bekannter Hämoglobinlösungen ab. Diese sind
entweder aus abgelaufenem Spenderblut hergestellt und enthalten dann bekanntermaßen nur noch Spuren
an 2,3-Diphosphoglycerat oder ein noch vorhandener 2,3-Diphospho-glyceratspiegel sinkt innerhalb weniger
Wochen infolge der enzymatischen Esterase-Restaktivität bei der Lagerung rasch ab.
Die zugegebene /3-Propiolactonmenge wird gemäß
der Erfindung in einer Weise dosiert, daß sie (a) die Esterase-Restaktivität der Hämoglobinlösung deutlich
hemmt, (b) zugleich aber auch in Kombination mit den anderen Verfahrensschritten wie der Ansäuerung
mit saurem Ionenaustauscher eine Testphagenpopulation von 106 Phagen pro ml sicher auf 0
senkt.
Diese Effekte werden erzielt, ohne daß dabei die
Verträglichkeit und die Wirksamkeit im Sauerstofftransport, etwa durch entstehende Pyrogenität oder
Methämoglobinbildung, beeinträchtigt werden. Das tritt bei jeglicher Manipulation am Hämoglobinmolekül
sonst sehr leicht ein.
Für die erfindungsgemäße Waschbehandlung besonders geeignete Lösungen sind 3,8%ige Natriumbicarbonatlösungen
oder l,6%ige Kochsalzlösungen.
Wie bereits erwähnt, wird als Verdünnungsmittel vorzugsweise destilliertes Wasser verwendet, wobei insbesondere
das Erythrozytenvolumen auf das 4,5fache verdünnt wird. Besonders geeignete Kationenaustauscherharze
sind saure Polystyrol-suIfonat-Kationenaustauscher,
insbesondere die im Handel von der Firma Dow Chemical Comp., Midland, Michigan, vertriebenen, die eine Austauscherkapazität von 4-5
mval je g trockenes Harz haben. Andere geeignete Austauscher sind zum Beispiel Polystyrolsulfonat-Harze,
welche derzeit von den Firmen Röhm und Haas Comp., Philadelphia, Permutit AG, Berlin, und
Farbenfabriken Bayer, Leverkusen vertrieben werden. Sie unterscheiden sich im wesentlichen hinsichtlich
Hitzestabilität, Körnung, Pigmentgehalt und
->0 Austausch-Kapazität. Näheres in K. Dorfner: »Ionenaustauscher«
(Walter de Gruyter/Berlin 1964). Die Verringerung des Kaliumgehaltes erfolgt bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise durch den Kationenaustausch K+ gegen H+ und die
> anschließende Zentrifugenbehandlung bei Zusatz von destilliertem Wasser. Vorteilhaft sollen dann etwa
6,3 g Hämoglobin je 100 ml vorliegen. Der stabilisierte pH-Wert beträgt bei Verfahrensende vorteilhaft
7,4. Ein bevorzugtes Mittel zur Regelung der Isotonie
ω ist Glukose, alle für diesen Zweck sonst bekannten
Mittel sind aber ebenfalls geeignet.
Beim Einfrieren der erfindungsgemäß erhaltenen Hämoglobinlösung und teilweisem Wiederauftauen
läßt sich ein an Hämoglobin konzentrierteres Produkt
i) abziehen, das durch Wiederholung dieses Verfahrens
auf 15% Hämoglobin gebracht werden kann (das entspricht dem Gesamthämoglobingehalt von Blut). Die
relative Viskosität einer solchen Lösung von etwa 1,8 bei 37° C liegt noch im Normalbereich von Plasma.
Bei Verwendung von sterilen Flaschen und Blutübertragungsgeräten kann man auf diese schonende Weise
in einem geschlossenen System eine Variante mit verstärkter Wirkstoffkonzentration gewinnen. Die Endeinstellung
der Isotonie wird vorteilhaft erst nach der Ankonzentrierung durchgeführt, damit das erhaltene
hyperonkotische Konzentrat nicht auch hypertonisch ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert. Die nach diesen
Beispielen erhaltenen Produkte wurden an Mäusen, Ratten, Kaninchen, Hunden, Schweinen und Menschen
bereits erprobt und verträglich sowie transportwirksam befunden.
Erythrozytensedimente von 6 Blutspendern zu je 500 ml Blut wurden vom Plasma getrennt, vereint,
mit l,6%iger Kochsalzlösung auf ein Volumen von 2 Litern verdünnt und bei 10° C mit 6 g frisch destil-
bo liertem ß-Propiolacton 15 Minuten bei 10 bis 12° C
verrührt. Es wurde 20 Minuten einer Kühlzentrifugation unterworfen, der Überstand abgesaugt und die
Erythrozytensedimente 4mal hintereinander mit frischer, l,6%iger Kochsalzlösung in Anteilen von jc-
hi weils 1,1 Liter auf der Zentrifuge gewaschen und anschließend
in 5,2 Liter steriles, cntmincralisicrtcs und destilliertes Wasser eingetragen. Nach 5 Minuten
Rühren wurden 500 ml hochreine! (pA-Qualitiit)
Kationenaustauscher mit einer Kapazität von 4 mval pro g Trockensubstanz, einem Divinylbenzolanteil
von 8% bei der Herstellung seiner Polystyrolmatrix und einer Körnung zwischen 20 und 50 mesh in H + Form
zugegeben und der pH-Wert durch Zugabe von normaler Natronlauge bei 5,0 gestoppt, bis Stromalipid
sichtbar sedimentierte. Danach wurde auf einen pH-Wert von 5,5 abgestumpft und nach 10 Minuten
bei 2000 g zentrifugiert.
Von etwa 1 Liter abgesetztem Sediment (Strontia und Auiiauscherharz) wurde etwa 5 Liter 6- bis
7%iger Hämoglobinlösung abdekantiert. Nach Zugabe von 40 g Glukose wurde mit Natronlauge ein
pH-Wert von 7,4 eingestellt, die Lösung nochmals in der vorstehend beschriebenen Weise zentrifugiert und
durch ein Cellulose-Asbest-Filter (des weitporigsten Sterilfiltertyps der Firma Seitz-Werke, Bad Kreuznach)
sterilfiltriert. Man kann auch mit gutem Erfolg Filter folgender Typen verwenden: Tiefen-Filtroxsterilfilter
der Filtrox-Werke AG, St. Gallen, Filterkerzen der Firma Pail jeweils vom Celfulose-Asbest-Filtertyp
oder Cellulose-Acetat-Membranfilter mit einer Porenweite von 0,22 μΐη der Millipore Corp., Bedford/Massachusetts,
oder der Sartorius-Werke, Göttingen, u. a.
Die Sauerstoff-Bindungskurve eines nach diesem Beispiel hergestellten Produktes zeigte nach 2monatiger
Lagerung bei 10° C einen P 50-Wert von 19 Torr bei einem pH-Wert von 7,4. Umgerechnet auf einen
intraerythrozytären pH-Wert von 7,2 entspräche der P 50-Wert des Hämoglobins des genannten Präparates
23 Torr. Der P 50-Wert von frischen Erythrozyten liegt um 27 Torr.
Beispiel 2
Es wurde wie in Beispiel 1 gearbeitet, jedoch wurden zu 2 Litern Erythrozytensuspension 16 g /3-Propiolacton gegeben. Nach dem Abzentrifugieren und Absaugen des Überstandes wurde das Erythrozyten-Sediment mit etwa 1,1 Liter jeder der folgenden Lösungen gewaschen:
Es wurde wie in Beispiel 1 gearbeitet, jedoch wurden zu 2 Litern Erythrozytensuspension 16 g /3-Propiolacton gegeben. Nach dem Abzentrifugieren und Absaugen des Überstandes wurde das Erythrozyten-Sediment mit etwa 1,1 Liter jeder der folgenden Lösungen gewaschen:
1. Natriumbicarbonatlösung mit einem Gehalt von 38 g je Liter,
2. wie 1. und
3. mit einer Lösung, die 38 g Natriumbicarbonat ι» und 16 g NaCI je Liter enthielt und im Verhältnis
1 :1 gemischt war,
4. mit einer Kochsalzlösung mit einem Gehalt von 16 g NaCl je Liter.
Es wurde dann wie im Beispiel 1 weitergearbeitet bis nach der Stromaabtrennung. Vor der Sterilftitration
wurde noch der pH-Wert mit n-NaOH auf 7,0 eingestellt, 33 g je Liter Glukose zugegeben, dann
2,5 g je Liter Natriumbicarbonat zugesetzt und mit n-NaOH der pH-Endwert auf 7,4 eingestellt.
Es wurde wie in den Beispielen 1 oder 2 bis nach der Stromaabtrennung gearbeitet. Danach wurde auf
einen blutanalogen Hämoglobingchalt von 15 g/100
2'i ml durch das nachstehend beschriebene Verfahren
ankonzentriert: Die Hämoglobinlösung wurde in Anteilen von je 500 ml in liegenden 1000 ml-Flaschen
eingefroren und anschließend bei Raumtemperatur in den auf den Kopf gestellten Flaschen so aufgetaut,
i» daß durch Perforation des Stopfenverschlusses mit einem
sterilen Blutentnahmegerät laufend die tiefrote Schmelze von der verbliebenen weißen Eisstange abgelassen
werden konnte. Eine Wiederholung des Verfahrens ergab eine etwa 150 g/Liter Hämoglobin ent-
i"> haltende Lösung, die dann gemäß Beispiel 1 zu einem
infundierbaren Produkt aufgearbeitet wurde.
Claims (3)
1. Verfahren zur Gewinnung von hepatitissicheren, lagerungsstabilen und infundierbaren Hämoglobinlösungen
mit einem stabilisierten 2,3-Diphospho-glyceratspifcgel
durch Hämolyse von menschlichen Erythrozyten, quantitative Abtrennung des Stromalipids, Senkung des Kaliumgehaltes
und Sterilfiltration der Lösung, dadurch gekennzeicnet,
daß man das Erythrozyten enthaltende Ausgangsmaterial bei Temperaturen zwischen 5 und 15° C wenige bis 25 Minuten mit
verdünnten Lösungen von /3-Propiolacton behandelt, wobei der Anteil an /3-Propiolacton 4 bis 12g
je Liter Erythrozytensediment beträgt, anschließend mit einer Natriumchlorid enthaltenden
Waschlösung behandelt und/oder mit einer Natriumbicarbonat enthaltenden Lösung überschüssiges
ß-Propiolacton und dessen Reaktionsprodukte herauswäscht, das durch Einrühren der
Erythrozyten in destilliertes Wasser erhaltene Hamolysat dann mit einem Kationenaustauscherharz
in H + -Form behandelt, bis der pH-Wert auf 5,0 bis 5,5 abgesunken ist, vom Harz und der ausgefällten
Stromamasse durch Zentrifugieren befreit, die gewünschte Hämoglobinkonzentration durch
Verdünnen mit Wasser einstellt, Mittel zur Regelung der Isotonie und zur Stabilisierung von pH-Wert
und Ferrohäm zugibt und dann sterilfiltriert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 6 bis 16 g /3-Propiolaeton
in Lösungen von 1,2 bis 3,2 g/100 ml auf 1,5 Liter
Erythrozytensediment anwendet.
3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Einstellung
einer höheren Hämoglobinkonzentration die nach der Stromaabtrennung vorliegende Lösung stangenförmig
einfriert und in aufrechter Stellung dann auftaut, die aus dem Eisblock ablaufende hämoglobinreiche
Schmelze abtrennt und gegebenenfalls dieses Verfahren wiederholt.
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