DE10141018A1

DE10141018A1 - Verwendung von negativ geladenen Phospholipiden, sowie Zusammensetzungen umfassend Phospholipide zur Behandlung des Auges

Info

Publication number: DE10141018A1
Application number: DE10141018A
Authority: DE
Inventors: Christoph Richter; Paolo Gazzotti; Hamdy Shaban
Original assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Current assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Priority date: 2001-08-22
Filing date: 2001-08-22
Publication date: 2003-03-13
Also published as: JP2005501109A; US20030050283A1; EP1418922A1; ATE398456T1; WO2003018028A1; DE60227178D1; EP1418922B1; CA2458132A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft negativ geladene Phospholipide sowie Zusammensetzungen, umfassend negativ geladene Phospholipide und gegebenenfalls Carotinoide und/oder Antioxidantien, zur Behandlung des Auges. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung von negativ geladenen Phospholipiden zur Behandlung der altersabhängigen Makuladegeneration. Sie betrifft auch Verfahren zur Herstellung der negativ geladenen Phospholipide, sowie Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzungen, umfassend negativ geladene Phospholipide und gegebenenfalls Carotinoide und/oder Antioxidantien zur Behandlung der altersabhängigen Makuladegeneration.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft negativ geladene Phospholipide, sowie Zusammensetzungen umfassend negativ geladene Phospholipide und gegebenenfalls Carotinoide und/oder Antioxidantien, zur Behandlung des Auges. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung von negativ geladenen Phospholipiden zur Behandlung der altersabhängigen Makuladegeneration. Sie betrifft auch Verfahren zur Herstellung der negativ geladenen Phospholipide, sowie Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzungen umfassend negativ geladene Phospholipide und gegebenenfalls Carotinoide und/oder Antioxidantien zur Behandlung der altersabhängigen Makuladegeneration.
Altersabhängige Makuladegeneration (AMD) betrifft 10 bis 20% der Bevölkerung über 65 Jahre und stellt eine der Hauptursachen für ernsthafte Sehschäden und/oder Sehprobleme alter Leute in den Industrienationen dar (Klein, R., Klein B. E., und Linton, K. L. (1992) Ophthalmology 99, 933-943). Man unterscheidet zwischen der nassen Form der Makuladegeneration, die etwa 20% der Patienten betrifft und mit photodynamischer Therapie behandelbar ist, sowie der trockenen Form der AMD, die etwa 80% der Patienten betrifft. Die trockene Form der AMD weist meist einen langsamen Verlauf auf und kann bisher nicht behandelt werden.
Die molekularen Ursachen dieser besonders in der Geriatrie bedeutenden Erkrankung sind nur wenig erforscht. Neueste Untersuchungen haben gezeigt, dass ein Farbstoff (A2E, N-Rethinyl-N-Rethinylidenäthanolamin), welcher natürlicherweise im Auge während des Sehvorgangs gebildet wird und sich mit fortschreitendem Alter 10-fach anreichert (Eldrid, G. E., Lasky, M. R. (1993) Nature 361, 724-726; Parish, C. A., Hashimoto, M., Nakanishi, K., Dylon, J., Sparrow, J. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14609-14613), den Tod von Pigmentepitelzellen der Retina hervorruft (Suter, M., Remé, C. E., Grimm, C., Wenzel, A., Jäättela, M., Esser, P., Kociok, N., Leist, M. und Richter, C. (2000) J. Biol. Chem. 275, 39625-39630). Es sprechen einige Anzeichen dafür, dass A2E für die trockene Form der AMD mitverantwortlich ist.
Neue Untersuchungen zeigen, dass die Zelltoxizität des A2E durch eine äußerst spezifische Wirkungsweise verursacht wird (s. Suter et al., a. a. 0.): A2E verhindert in den Mitochondrien die Wechselwirkung von Cytochrom c mit Cytochrom c Oxidase. Dies hat für die Zelle dramatische Konsequenzen, da eine Unterbrechung der mitochondrialen Atmungskette stattfindet und deshalb ein Abfall des Energieumsatzes und die Freisetzung von reaktivem Sauerstoff erfolgt. Des weiteren findet eine Freisetzung von Cytochrom c in das Cytoplasma statt, wobei sogenannte Apoptosomen gebildet werden und Apoptose stattfindet, d. h. dass programmierter Zelltod eintritt.
Letztendlich sind aber die genauen Mechanismen, die zum programmierten Zelltod in der Makula führen und damit die Zerstörung der Makula und die Herabsetzung bzw. das völlige Einbüßen der Sehfähigkeit bei älteren Patienten verursachen, noch ungeklärt.
Folglich besteht ein starkes Bedürfnis im Stand der Technik, Stoffe und Zusammensetzungen bereit zu stellen, die als Medikamente verwendet werden können, um pathologische Zustände des Auges und insbesondere AMD zu behandeln, so dass eine Prävention, Linderung oder Heilung dieser Krankheit möglich ist. Insbesondere besteht ein zunehmendes Bedürfnis nach derartigen Verwendungen, da der Altersdurchschnitt der Bevölkerung aufgrund des medizinischen Fortschritts steigt und damit - bezogen auf die Gesamtbevölkerung - immer mehr Patienten von dieser Krankheit betroffen werden. Des weiteren besteht ein Bedürfnis, pathologische Zustände der Retina, die aufgrund anderer, möglicherweise noch nicht geklärter, Vorgänge hervorgerufen werden, behandeln zu können. Hierbei handelt es sich in erster Linie um oxidative Schädigungen des Auges bzw. der Retina, sowie Schäden durch Einwirken von aggressiven Agenzien bzw. hochenergetischer Strahlung.
Demgemäß ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verwendungen bereit zu stellen, die es ermöglichen, Augenkrankheiten, insbesondere Makuladegeneration und AMD, zu behandeln bzw. die eine Prävention dieser Erkrankungen ermöglichen. Des weiteren ist es eine Aufgabe der Erfindung Stoffe bzw. Zusammensetzungen und pharmazeutische Zubereitungen bereit zu stellen, die zur Behandlung von Makuladegeneration im allgemeinen und insbesondere von AMD verwendet werden können. Des weiteren ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Stoffe und/oder Zusammensetzungen bereit zu stellen.
Diese und andere Aufgaben werden durch die erfindungsgemäß bereitgestellten Verwendungen, Stoffe und Zusammensetzungen, sowie Verfahren zu deren Herstellung, gelöst.
Demgemäss betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines negativ geladenen Phospholipids zur Behandlung des Auges oder zur Prävention von pathologischen Zuständen des Auges.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von negativ geladenen Phospholipiden zur Behandlung und Prävention von Makuladegeneration und/oder pathologischen Zuständen der Retina. Unter "Makuladegeneration" ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine fortschreitende (progredierende) Zerstörung der Makula zu verstehen. Diese Zerstörung bzw. Degeneration kann altersbedingt sein (AMD), es sind aber auch pathologische Vorgänge denkbar, die nicht altersbedingt sind. Des weiteren sind Zielindikationen der erfindungsgemäßen Verwendungen, Stoffe und Zusammensetzungen, bzw. Verfahren zu deren Herstellung, Pathologien des Auges und der Retina, die z. B. durch schädigende Agenzien oder Strahlung ausgelöst werden können und die eine medikamentöse Behandlung erforderlich machen. Derartige Agenzien umfassen z. B. aggressive Säuren, Basen, Radikale und Radikalbildner sowie weitere irritativ oder pathogen wirkende Chemikalien. Diese pathologischen Zustände können sich dergestalt äußern, dass eine fortschreitende Beeinträchtigung des Sehvermögens von jüngeren Patienten auftritt. Die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft ausdrücklich auch diese Patientengruppe. Des weiteren betrifft die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung auch die Behandlung pathologischer Vorgänge auf oder innerhalb der Retina, deren Genese ungeklärter Natur ist. Dementsprechend können die Phospholipide der vorliegenden Erfindung (sowie Gemische derselben und die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, s. u.) zur Behandlung verschiedener pathologischer Zustände der Retina unterschiedlicher Genese eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Verwendung, bei der das negativ geladene Phospholipid ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Phosphatidylinosit (PI), Cardiolipin (CL, Synonym: 1,3 Diphosphatidylglycerin, DPG) und Phosphatidylglycerin (PG). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird Phosphatidylglycerin zur Behandlung des Auges und von Makuladegeneration verwendet. Die Singularform "ein negativ geladenes Phospholipid" bezieht sich auf eine Spezies von Molekülen, die jeweils die gleiche Kopfgruppe aufweisen. Unter "Kopfgruppe" ist der an die Phosphatgruppe gebundene organische Rest zu verstehen, wobei im Gegensatz dazu die "Anker" (im Sinne von Membrananker) des Phospholipides durch die Fettsäuren gebildet werden. Die die gleiche Kopfgruppe aufweisenden Phospholipide, die eine Spezies bilden, können jedoch individuell mit Fettsäuren unterschiedlicher Kettenlänge verestert sein, die einen unterschiedlichen Sättigungsgrad aufweisen können. Dies ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, da auch natürlich vorkommende biologische Systeme (so z. B. natürlich vorkommende Membranen) derart aufgebaut sind (s. a. Erklärungen unten).
Die oben beschriebenen Phospholipidsysteme kommen den körpereigenen Lipidsystemen (z. B. der Retina) des Patienten erheblich näher als z. B. synthetische Phospholipide, die einen engeren Schmelzbereich aufweisen, da in ihnen nur eine oder wenige verschiedene Fettsäuren verestert sind. Damit sind die erfindungsgemäß bevorzugten Zusammensetzungen besser geeignet, in das biologische System der Retina eingebracht zu werden und dort ihre heilende Wirkung zu entfalten.
Die Verwendung des negativ geladenen Phospholipids zur Behandlung des Auges und von Makuladegeneration umfasst Präparationen des jeweiligen Phospholipides, die pharmazeutisch akzeptabel sind. Letztgenanntes bedeutet zunächst, dass das verwendete Phospholipid frei von - insbesondere durch Oxidation entstandenen - Degradationsprodukten (z. B. freie niederkettige Carbonsäuren und Aldehyde) ist, bzw. die Konzentrationen dieser Abbauprodukte möglichst gering sind. Als Leitfaden bezüglich der erfindungsgemäßen Verwendung sind die Richtlinien der "good manufacturing practice" (GMP-Richtlinien) hilfreich, die Vorschriften zur adäquaten und sicheren Herstellung von Pharmazeutika enthalten und auf die im Rahmen der vorliegenden Erfindung explizit Bezug genommen wird. Des weiteren sollen bei der Auswahl und Bereitstellung des zu verwendenden Phospholipides, sowie bei der Verwendung, Bereitstellung und Herstellung der unten ausführlich erläuterten Zusammensetzungen und Mischungen neben den GMP-Richtlinien auch die entsprechenden EU-Standards und Vorschriften beachtet werden, so dass eine pharmazeutisch möglichst sichere, diesen Standards entsprechende Herstellung und Verwendung gewährleistet ist.
Bezüglich der Kettenlängen ist ferner anzumerken, daß die einzelnen in einer Population vorkommenden negativ geladenen Phospholipide jeweils auf molekularer Ebene mit unterschiedlichen Fettsäuren verestert sein können, so daß sich bezüglich der Gesamtkettenlänge einer Spezies von negativ geladenen Phospholipiden lediglich ein statistischer Wert angeben lässt. Kettenlängen der über eine Esterbindung an das Glycerin gebundenen Fettsäuren, die in Naturprodukten vorkommen, sind bevorzugt, wobei unter Naturprodukten z. B. Lipide aus (Säugetier-) Retina, pflanzlichen Quellen oder Fisch zu verstehen sind. Die Vorteile eines derartigen "gemischten" Aufbaus der Fettsäuren liegt in der dadurch erhaltenen günstigeren Packungsdichte der Lipidmoleküle in der Membran bzw. dem Vesikel (s. u.), sowie in einem dadurch begründeten Übergangsbereich (bzw. Schmelzbereich). Bezüglich des Sättigungsgrades der im Phospholipid vorkommenden Fettäuren gilt, dass ein höherer Sättigungsgrad (d. h. es sind weniger C-C- Doppelbindungen vorhanden) der veresterten Fettsäuremoleküle zu einer geringeren Fluidität der Membran und einem höheren Schmelzpunkt führt. Aus diesem Grunde sind die bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Phospholipidmischungen vorzugsweise mit einem Anteil an einfach oder mehrfach ungesättigten Fettsäuren verestert, der dem in natürlichen Membranen von Säugetieren vorkommenden Anteil, besonders bevorzugt dem der Säugetier- Retina, entspricht. Derartige (sog. mikroheterogene) Zusammensetzungen sind typisch für natürlich vorkommende Phospholipidzusammensetzungen und sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt, da diese vorteilhafte biologische Eigenschaften (d. h. Biokompatibilität) sowie einen für biologische Systeme (zu denen die Retina zählt) geeigneten Schmelzpunkt bzw. Schmelzbereich - gemeint ist hier der Phasenübergang zwischen kristalliner und flüssiger Lipidphase - aufweisen. Dieser Effekt trifft häufig nicht bei synthetischen Lipiden bzw. Lipidmischungen auf, so dass diese gegebenenfalls im Rahmen der Erfindung nicht universell einsetzbar sind. In jedem Fall sollte deren Eignung bezüglich Phasenübergangstemperatur und Biokompatibilität vor der Verwendung untersucht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Zusammensetzung umfassend mindestens zwei verschiedene negativ geladene Phospholipide zur Behandlung von Makuladegeneration und/oder pathologischen Zuständen der Retina. Die Mischungsverhältnisse der beiden negativ geladenen Phospholipid- Komponenten können dabei beliebig gewählt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Mischungsverhältnisse gewählt, die sich als besonders effektiv bei der zu behandelnden Erkrankung des Auges bzw. der Retina herausgestellt haben und/oder die eine optimale Durchmischung der beiden negativ geladenen Phospholipide ermöglichen. Bezüglich der jeweils zu verwendenden Kettenlängen und des Sättigungsgrades der im Phospholipid vorhandenen Fettsäuren gelten die bereits oben bezüglich der Verwendung eines einzigen Phospholipides (d. h. einer Spezies) erwähnten Prinzipien.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Verwendung, bei der die negativ geladenen Phospholipide ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Phosphatidylglycerin, Phosphatidylinosit und Cardiolipin. Als besonders geeignet und damit besonders bevorzugt hat sich die Verwendung von Phosphatidylglycerin erwiesen (s. a. Ausführungsbeispiele).
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Zusammensetzung umfassend ein negativ geladenes Phospholipid, mindestens ein Carotinoid und gegebenenfalls mindestens ein Antioxidans zur Behandlung des Auges oder zur Prävention von pathologischen Zuständen des Auges.
Weiterhin betrifft die Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform die Verwendung einer Zusammensetzung umfassend ein negativ geladenes Phospholipid, mindestens ein Carotinoid und gegebenenfalls mindestens ein Antioxidans zur Behandlung oder zur Prävention von Makuladegeneration und/oder pathologischen Zuständen der Retina. Als vorteilhaft hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Phospholipides vorliegend in Mischung mit einem oder mehreren Carotinoiden herausgestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Lutein und Zeaxanthin verwendet. Die Carotinoide können jeweils einzeln verwendet werden, besonders bevorzugt ist jedoch ein Gemisch von Lutein und Zeaxanthin. Eine mögliche Ursache für die vorteilhafte Verwendung eines oder mehrere Carotinoide ist der dadurch vermittelte Schutz der in der Retina vorhandenen Lipide vor Oxidation bzw. oxidativem Abbau durch reaktive Sauerstoffspezies und andere Radikale, sowie ein schützender Effekt bezüglich der pathogenen Wirkung von A2E. Letzgenanntes läßt sich mit der Filterwirkung der Carotinoide erklären (diese stellen Blaulichtfilter dar), was zu einem Abschirmen der Retina und der verwendeten Zusammensetzungen umfassend Phospholipide von energiereicher Strahlung führt. Selbstverständlich schützt das bzw. die Carotinoide und gegebenenfalls das Antioxidans das verwendete Phospholipid auch vor dem Einbringen in das Auge bzw. in die Retina. Dies erhöht die Lagerstabilität der verwendeten Zusammensetzungen. Im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung können das Carotinoid, das Phospholipid und gegebenenfalls das Antioxidans in jedem möglichen Mischungsverhältnis vorliegen.
Die Erfindung betrifft des weiteren die Verwendung einer Zusammensetzung umfassend ein negativ geladenes Phospholipid, mindestens ein Carotinoid und gegebenenfalls mindestens ein Antioxidans, bei der das negativ geladene Phospholipid ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Phosphatidylinosit, Cardiolipin und Phosphatidylglycerin. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat sich die Verwendung von Phosphatidylglycerin (PG) in Verbindung mit mindestens einem Carotinoid als besonders vorteilhaft herausgestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Lutein und/oder Zeaxanthin als Carotinoide verwendet.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend mindestens zwei verschiedene negativ geladene Phospholipide und mindestens ein Carotinoid und gegebenenfalls mindestens ein Antioxidans zur Behandlung des Auges.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend mindestens zwei verschiedene negativ geladene Phospholipide, mindestens ein Carotinoid und gegebenenfalls mindestens ein Antioxidans zur Behandlung oder zur Prävention von Makuladegeneration und/oder pathologischen Zuständen der Retina.
Bevorzugt ist eine Ausführungsform der o. g. erfindungsgemäßen Verwendungen, bei der das Antioxidans bzw. die Oxidantien ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Ubichinon (Coenzym Q10), Vitamin E und Ascorbinsäure, wobei Ubichinon besonders bevorzugt ist.
Die Erfindung betrifft weiterhin Verwendungen, bei denen die Zusammensetzung zusätzlich zu den negativ geladenen Phospholipiden neutrale und/oder positv geladene Phospholipide umfasst. Ein im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugtes Gemisch stellt Asolectin dar, ein Phospholipidgemisch aus Sojabohnen, welches einen hohen Anteil an negativ geladenen Phospholipiden umfaßt (ca. 15%), sowie weitere neutrale bzw. positiv geladene Phospholipide. Als neutrale Phospholipide werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle Phospholipide bezeichnet, deren Nettoladung bei neutralem pH (d. h. pH 7,0 bei 25°C und biochemischen Standardbedingungen) "0" beträgt, d. h. deren Kopfgruppe entweder völlig ohne Ladungen vorliegt (wie z. B. bei Phosphatidylserin, PS), als Zwitterion, oder derart, dass sich positive und negative Ladungen jeweils kompensieren. Als positiv geladene Phospholipide werden entsprechend Phospholipide bezeichnet, deren Nettoladung unter den o. g. Bedingungen positiv ist (wie z. B. bei Phosphatidylcholin, PC). Bezüglich der Kettenlängen und des Sättigungsgrades gelten hier die selben Definitionen wie diejenigen, die oben bereits im Zusammenhang mit den negativ geladenen Phospholipiden verwendet wurden. Allgemein ist dem Fachmann bekannt, dass die Verwendung von weiteren, neutralen und/oder positiv geladenen Phospholipiden vorteilhaft oder sogar erforderlich sein kann, damit die negativ geladenen Phospholipide der vorliegenden Erfindung im Auge bzw. in der Retina optimal wirksam und verträglich sind. So ist z. B. das Hinzufügen weiterer Phospholipide (neutral oder positiv geladen) häufig erforderlich, um eine Verwendung als Liposom bzw. Lipidvesikel (s. u.) zu ermöglichen, da sich ausschliesslich negativ geladene Kopfgruppen abstossen und so die Membranstruktur u. U. destabilisiert wird, so dass als "Matrix" weitere Lipide verwendet werden müssen. Ein solches, häufig in der Membranbiochemie verwendetes (Phospho-)Lipid ist z. B. Phosphatidylcholin (PC) aus Hühnereiern ("egg PC"). Dem Fachmann ist ohne weiteres klar, dass die Verwendung einer Mischung von erfindungsgemäßen negativ geladenen Phospholipiden und/oder Antioxidantien mit PC ein in vivo-nahes System darstellt, dessen Verwendung gegenüber der Verwendung von ausschliesslich negativ geladenen Phospholipiden vorteilhaft sein kann. In einer vorteilhaften Ausführungsform werden die zusätzlichen neutralen und/oder positiv geladenen Phospholipide vor der Verwendung mit negativ geladenem Phospholipid (bzw. Phospholipiden) gemischt. Ein vorteilhaftes Mischungsverhältnis (neutrale und/oder positiv geladenen Phospholipide : negativ geladene Phospholipide) liegt bei ca. 2 : 1, bevorzugt ist ca. 1 : 1, besonders bevorzugt ist ein Mischungsverhältnis von 1 : 2 bis 1 : 5.
Des weiteren betrifft die Erfindung Verwendungen, die zusätzlich Lutein und/oder Zeaxanthin umfassen.
Die Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen umfassend mindestens ein negativ geladenes Phospholipid und mindestens ein neutrales und/oder positiv geladenes Phospholipid.
Desweiteren betrifft die Erfindung Zusammensetzungen, bei denen das negativ geladene Phospholipid oder die negativ geladenen Phospholipide ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Phosphatidylinosit, Cardiolipin, Phosphatidylglycerin und Asolectin, sowie Zusammensetzungen umfassend ein Gemisch aus mindestens einem negativ geladenen Phospholipid, mindestens einem neutralen und/oder positiv geladenen Phospholipid, mindestens einem Carotinoid und gegebenenfalls mindestens einem Antioxidans.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der o. g. Zusammensetzungen zur Behandlung des Auges, insbesondere von Makuladegeneration und/oder pathologischen Zuständen der Retina.
Schliesslich betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer der o. g. Zusammensetzungen, umfassend die folgenden Schritte:

a) Trocknung einer o. g. Zusammensetzung, die in einem geeigneten Lösungsmittel vorliegt, und
b) Rekonstitution der Zusammensetzung in einer physiologisch akzeptablen Lösung.
c) Gegebenenfalls weitere Behandlung der Lösung nach Schritt b), so daß Lipidvesikel bzw. Liposomen gebildet werden.

Bei dem hier offenbarten Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen handelt es sich um ein Verfahren, das im Wesentlichen aus den Schritten Trocknung und Rekonstitution besteht. Der Begriff "Trocknung" (Schritt a) soll hier derart verstanden werden, dass das die Zusammensetzung enthaltende Lösungsmittel entfernt wird. Dies geschieht vorzugsweise unter sterilen Bedingungen sowie unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren wie z. B. Abziehen des Lösungsmittels unter Vakuum und anschließende Trocknung unter Hochvakuum. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Abziehen des Lösungsmittels derart vorgenommen, dass ein möglichst dünner Lipidfilm in dem die Zusammensetzung enthaltenden Gefäß zurückbleibt (Deposition des Phospholipids). Ein möglichst dünner Lipidfilm hat den Vorteil, dass eventuell noch vorhandenes Rest-Lösungsmittel ohne Probleme entfernt wird (durch Verdampfen), während die Deposition dicker Filme den Nachteil birgt, dass noch vorhandenes Rest-Lösungsmittel im gegebenen Zeitintervall schwerer zu entfernen ist. Die Mischung verschiedener Phospholipide, gegebenenfalls in Verbindung mit Carotionoid(en) bzw. Antioxidantien, findet bevorzugt statt, solange sich diese Verbindungen noch im Lösungsmittel befinden, da eine Mischung nach der Ablagerung und Rekonstitution in Puffer (s. u.) eine weniger homogene Durchmischung der Lösung bewirkt. Als Lösungsmittel eignen sich organische Lösungsmittel, wobei diejenigen Lösungsmittel, die in Spuren eine geringe Toxizität aufweisen besonders bevorzugt sind (z. B. Ethanol abs., klinischer Reinheitsgrad).
Selbstverständlich muß bei dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren beachtet werden, dass auch hier gemäß den GMP-Richtlinien bzw. den Europäischen Arzneimittelrichtlinien gearbeitet wird, so dass eine pyrogenfreie Zusammensetzung ohne toxische Fremdstoffanteile erhalten wird, die ein hohes Maß an physiologischer Verträglichkeit aufweist.
In Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Rekonstitution der Zusammensetzung in einer physiologisch akzeptablen Lösung erreicht. Unter "Rekonstitution" ist ein Lösen der Phospholipid umfassenden Zusammensetzungen in Puffer zu verstehen. Unter "Lösen" oder "Lösung" soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch die Suspension der Lipide in einer Lösung verstanden werden. Dies geschieht in einer bevorzugten Ausführungsform durch Zugabe von Glaskügelchen in das den Lipidfilm enthaltende Gefäß, Rotation der Glaskügelchen auf dem Lipidfilm in Anwesenheit der physiologisch akzeptablen Lösung und anschließendes Frieren und Auftauen ("freeze thaw") der Suspension (z. B. Frieren in flüssigem Stickstoff, Auftauen im Wasserbad). Auf diese Art bilden sich große multilamellare Vesikel, die die erfindungsgemäße Zusammensetzung umfassen und gegebenenfalls Rekonstitutions-Lösung einschließen. Diese Vesikel können durch kurzes Anzentrifugieren (10-30 sec, 4000 rpm, Heraeus Laborzentrifuge) von größeren Lipidaggregaten befreit werden. Zusätzlich kann Filterung bzw. Sterilfilterung vorgenommen werden. Um eine noch definierter Vesikelpopulation zu erhalten, kann zusätzlich eine Extrusion der Lipidlösung durch eine Membran mit definiertem Porendurchmesser stattfinden (Schritt c). In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Lösung 10 bis 20 mal durch eine sterile Membran extrudiert, wobei darauf zu achten ist, dass die fertige Phospholipid (Vesikel)-Lösung auf der der Eingabeseite der Membran gegenüberliegenden Seite entnommen wird, da so eine Zurückhaltung von Lipidaggregaten und "giant vesicles" auf der der fertigen Lösung abgewandten Seite der Membran stattfindet. Geeignete Vorrichtungen zur Extrusion von Lipidlösungen bzw. -suspensionen sind dem Fachmann bekannt (Mini-Extruder, French Press etc.). Neben der Erzeugung und Verwendung von Liposomen bzw. Vesikeln umfasst Schritt b) auch die Rekonstitution der Lipide als "Roh"-Suspension - d. h. die Rekonstitution findet statt, ohne dass Techniken verwendet werden, die auf die Erzeugung von Liposomen oder Vesikeln gerichtet sind. Des weiteren umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von milden Detergentien um die Lipide in der physiologisch akzeptablen Lösung zu rekonstituieren.
Die weitere Behandlung im Rahmen von Schritt c) umfasst alternativ auch andere dem Fachmann bekannte Verfahren zur Herstellung von Liposomen bzw. Vesikeln, wie z. B. Cholat-Dialyseverfahren, sowie weitere Verfahren zur Reinigung, Homogenisierung und Klärung der Lipide umfassenden Zusammensetzung.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung erhältlich nach einem der o. g. Verfahren zur Behandlung des Auges, insbesondere von Makuladegeneration und/oder pathologischen Zuständen der Retina. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Zusammensetzung erhältlich nach einem der o. g. Verfahren als Augentropfen, Augenbäder, Augeninserte oder halbfeste Zubereitungen zur Anwendung am Auge. In diesem Zusammenhang ist zu beachten, dass die Verwendung als Augentropfen, Augenbäder, Augeninserte oder halbfeste Zubereitungen zur Anwendung am Auge die bereits oben erwähnten Maßnahmen bezüglich der Herstellung von richtlinienkonformen Arzneimitteln erforderlich macht. Es wird in diesem Zusammenhang auf die bereits oben in diesem Zusammenhang gemachten Anmerkungen verwiesen, sowie auf die im folgenden ausgeführten allgemeinen Prinzipien bezüglich der Herstellung von Augentropfen, Augenbädern, Augeninserten oder halbfesten Zubereitungen zur Anwendung am Auge.
Die Erfindung betrifft auch Augentropfen, Augenbäder, Augeninserte oder halbfeste Zubereitungen zur Anwendung am Auge umfassend ein negativ geladenes Phospholipid, sowie Augentropfen, Augenbäder, Augeninserte oder halbfeste Zubereitungen zur Anwendung am Auge umfassend mindestens zwei verschiedene negativ geladene Phospholipide. Bei Augentropfen im Sinne der vorliegenden Erfindung handelt es sich um wässrige oder ölige Lösungen zur Anwendung im oder am Auge. Verwendet werden bevorzugt sterile bzw. keim- und pathogenfreie Lösungen oder Suspensionen umfassend das oder die negativ geladenen Phospholipide der vorliegenden Erfindung, weitere Inhaltsstoffe (Carotinoid(e), Antioxidans/Antioxidantien, s. u.).
Augenbäder im Sinne der vorliegenden Erfindung sind wässrige Lösungen zum Baden und Spülen der Augen oder zum Tränken von Augenverbänden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden sterile bzw. keim- und pathogenfreie Lösungen oder Suspensionen umfassend das oder die negativ geladenen Phospholipide der vorliegenden Erfindung, weitere Inhaltsstoffe (Carotinoid(e), Antioxidans/Antioxidantien, s. u.) verwendet. Augeninserte im Sinne der vorliegenden Erfindung stellen feste oder halbfeste Zubereitungen von geeigneter Größe und Form dar, die in den Bindehautsack eingebracht werden um eine Wirkung am bzw. im Auge hervorzurufen. Dies geschieht in einer bevorzugten Ausführungsform durch eine sukzessive Freisetzung des oder der Wirk- und Inhaltsstoffe der Zusammensetzung umfassend das oder die negativ geladenen Phospholipide im Bindehautsack, so dass die Zusammensetzung an den zu behandelnden Ort diffundieren bzw. fließen kann. Als halbfeste Zubereitungen gelten im Rahmen der vorliegenden Erfindung Salben, Cremes oder Gele.
Des weiteren betrifft die Erfindung Augentropfen, Augenbäder, Augeninserte oder halbfeste Zubereitungen zur Anwendung am Auge umfassend ein negativ geladenes Phospholipid und mindestens ein Carotinoid, gegebenenfalls mindestens ein Antioxidans, sowie Augentropfen umfassend mindestens zwei verschiedene negativ geladene Phospholipide, mindestens ein Carotinoid und gegebenenfalls mindestens ein Antioxidans.
Die Erfindung betrifft auch Augentropfen, Augenbäder, Augeninserte oder halbfeste Zubereitungen zur Anwendung am Auge umfassend eine der o. g. Zusammensetzungen.
Die erfindungsgemäßen Augentropfen, Augenbäder, Augeninserte oder halbfeste Zubereitungen zur Anwendung am Auge können Hilfsstoffe enthalten, die z. B. die Tonizität oder Viskosität der Zubereitung verbessern, den pH-Wert einstellen oder stabilisieren (Puffersubstanzen), die Löslichkeit des Phospholipids, Antioxidans oder des Carotinoids erhöhen oder die Zubereitung haltbarer machen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Behandlung des Auges, charakterisiert durch die Applikation einer physiologisch akzeptablen Lösung umfassend ein negativ geladenes Phospholipid in das Auge des Patienten. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von PG in Verbindung mit einem Carotinoid bevorzugt. Als physiologisch akzeptable Lösung ist sterile, sterilfiltrierte und pyrogenfreie physiologische Kochsalzlösung bevorzugt. Der Begriff "Lösung" ist hier derart zu verstehen, dass auch Suspensionen von Lipiden oder Lipidvesikeln bzw. -aggregaten in der physiologisch akzeptablen Lösung umfasst sind. Des weiteren sind auch halbfeste Zubereitungen, wie z. B. Cremes, Salben oder Gele als "Lösung" im Sinne der Erfindung zu verstehen. Dem Fachmann, insbesondere dem Galeniker, sind aber auch alternative Lösungen bekannt, die physiologisch akzeptabel sind und die sich im Rahmen der Verwendung und Herstellung von Augentropfen, Augenbädern, Augeninserten oder halbfesten Zubereitungen zur Anwendung am Auge eignen. Der Begriff "Applikation" ist hier derart zu verstehen, dass dem Fachmann bekannte Verfahren zum Einbringen einer Lösung in das Auge angewandt werden. Dies umfasst die Gabe von Augentropfen, Augenbädern, Augeninserten oder halbfesten Zubereitungen zur Anwendung am Auge bzw. Lösungen, Spülungen und die Injektionen an geeigneter Stelle.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung oder zur Prävention von Makuladegeneration und/oder pathologischen Zuständen der Retina, charakterisiert durch die Applikation einer physiologisch akzeptablen Lösung umfassend ein negativ geladenes Phospholipid in das Auge des Patienten. Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einer bevorzugten Ausführungsform zur Behandlung von pathologischen Zuständen der Retina und von Makuladegeneration, insbesondere von AMD, eingesetzt.
Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren, bei dem das negativ geladene Phospholipid ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Phosphatidylglycerin, Phosphatidylinosit und Cardiolipin, ein Verfahren, bei dem die physiologisch akzeptable Lösung mindestens zwei verschiedene negativ geladene Phospholipide umfasst, sowie ein Verfahren, bei dem die physiologisch akzeptable Lösung zusätzlich mindestens ein Carotinoid und gegebenenfalls mindestens ein Antioxidans umfasst.
Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren, bei dem die physiologisch akzeptable Lösung zusätzlich neutrale und/oder positiv geladene Phospholipide umfasst.
Schließlich soll die vorliegende Erfindung anhand der Abbildungen, Tabellen und Beispiele weiter erläutert werden. Die Abbildungen und Beispiele sind nicht als limitierend zu verstehen, sondern dienen der näheren Erläuterung der erfindungsgemäßen Verwendungen, Zusammensetzungen und Verfahren.

Erläuterung der Abbildungen

Abb. 1 zeigt die Konzentrationsabhängigkeit der Hemmung solubilisierter Cytochrom c Oxidase durch A2E. Der Sauerstoffverbrauch solubilisierter Cytochrom c Oxidase (c = 2 µg/mL) wurde in einer Elektrode vom Clarke-Typ in An- und Abwesenheit von A2E gemessen. Nähere Erläuterungen zum experimentellen Aufbau sind in Beispiel 1 zu finden.
Abb. 2 zeigt die Beleuchtungsabhängigkeit der Hemmung solubilisierter Cytochrom c Oxidase durch A2E. Der Sauerstoffverbrauch von solubilisierter Cytochrom c Oxidase (c = 4 µg/mL) wurde in einer Elektrode vom Clarke-Typ in der Anwesenheit von A2E in der Dunkelheit bzw. unter Lichtexpostiton gemessen wie in Beispiel 2 beschrieben. Teil a) zeigt die Zeitabhängigkeit der Inaktivierung in der Dunkelheit (dunkle Linie) oder unter Lichteinfall (helle Linie). Teil b) zeigt den Effekt einer Vorinkubation unter Lichteinfall mit 20 µM A2E (Dreiecke) oder ohne A2E (Quadrate), gefolgt von Aktivitätsmessungen in der Dunkelheit. Teil c) zeigt die Sauerstoff-Supplementation. Das Experiment wurde in der Dunkelheit (dunkle Linie) bzw. unter Lichteinfall (helle Linie) durchgeführt. An den durch Pfeile markierten Positionen wurden 5 µg Katalase auf Rinderleber mit 500 µM H₂O₂ hinzugegeben. Teil d) zeigt die Erholungsphase mit Cardiolipin unter Lichteinfall. Zwei separate Messungen sind dargestellt (dunkle und helle Linie). An der durch gestrichelte Pfeile markierten Position wurden bei t = 210 sec und t = 950 sec 300 µg/mL Cardiolipin hinzugegeben (dunkle Linie). An der Position des Pfeils wurden 5 µg Katalase aus Rinderleber mit 500 µM H₂O₂ hinzugegeben. Es ist darauf hinzuweisen, dass in der Abwesenheit von A2E Cytochrom c Oxidase in der Dunkelheit und unter Lichteinfall gleich aktiv ist (Daten nicht gezeigt).
Abb. 3 zeigt die Wirkung des besonders bevorzugten Phosphatidylglycerins auf die Aktivität der COX wie in Ausführungsbeispiel 2 beschrieben. Dabei ist der Sauerstoffverbrauch der COX in Gegenwart von PG (300 µg/mL) und A2E (40 µM) [Kurve 4], CL (300 µg/mL) und A2E (40 µM) [Kurve 2], nur A2E (40 µM) [Kurve 1], sowie ohne zusätzliche Substanzen (Kontrolle: nur COX) [Kurve 3] gegen die Zeit aufgetragen.
Abb. 4 zeigt die Abhängigkeit der Inhibierung von rekonstituierter Cytochrom c Oxidase durch A2E von dem verwendeten Phospholipid. Cytochrom c Oxidase wurde in Phosphatidylcholin/Phosphatidylethanolamin-Vesikeln (Quadrate) oder Asolectin-Vesikeln (Kreise) rekonstituiert. Der Sauerstoffverbrauch des Enzyms (c = 3.8 µg/mL) wurde in einer Elektrode vom Clarke-Typ in der An- und Abwesenheit von A2E gemessen wie in Ausführungsbeispiel 3 beschrieben.
Abb. 5 zeigt die Beleuchtungsabhängigkeit der Inhibierung von rekonstituierter Cytochrom c Oxidase durch A2E. Der Sauerstoffverbrauch von rekonstituierter Cytochrom c Oxidase (c = 3.8 µg/mL) wurde in der Anwesenheit von 30 µM A2E in einer Elektrode vom Clarke-Typ, wie in Ausführungsbeispiel 4 beschrieben, gemessen. An den durch Pfeile markierten Positionen wurde 5 µg Katalase aus Rinderleber mit 500 µM H₂O₂ hinzugegeben. An der durch den gestrichelten Pfeil markierten Position wurde 300 µg/mL Cardiolipin (CL) hinzugegeben. Das Experiment wurde in der Dunkelheit durchgeführt (Elektrodenaufbau wurde in Aluminiumfolie gewickelt; dunkle Linie) oder unter Lichteinfall (helle Linie). Es ist darauf hinzuweisen, dass in der Abwesenheit von A2E Cytochrom c Oxidase in der Dunkelheit und unter Lichteinfall gleich aktiv ist (Daten nicht gezeigt).

Ausführungsbeispiele

Verwendete Materialien und Verfahren

A) Materialien

A2E wurde aus all-trans Retinal und Ethanolamin synthetisiert (Parish, C. A., Hashimoto, M., Nakanishi, K., Dillon, J., and Sparrow, J. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14609-14613) und mittels Chromatographie auf Silica-Gel wie beschrieben gereinigt (Suter, M., Remé, C. E., Grimm, C., Wenzel, A., Jäättela, M., Esser, P., Kociok, N., Leist, M., and Richter, C. (2000) J. Biol. Chem. 275, 39625-39630). [³H]-A2E (spez. Aktivität 4.4 Cl/mol) wurde unter Verwendung von [1-³H] Ethan-1-ol-2-amin Hydrochlorid synthetisiert (Amersham Schweiz). Peroxynitrite wurde wie beschrieben hergestellt (Kissner, R., Beckman, J. S., and Koppenol, W. (1996) Methods Enzymol. 269, 296-302) und wurde von Dr. R. Kissner, Inst. f. anorganische Chemie, ETH Zürich, zur Verfügung gestellt. Die übrigen verwendeten Chemikalien wiesen den höchstmöglichen Reinheitsgrad auf und wurden käuflich von den entsprechenden Firmen erworben.
Cytochrom c Oxidase wurde aus Rattenlebermitochondrien weiblicher Wistar- Ratten aufgereinigt wie von Frei et al. beschrieben (Frei, B., Winterhalter, K. H., and Richter, C. (1985) J. Biol. (Ehem. 260, 7394-7401). Das Homogenisierungsmedium enthielt 210 mM Mannitol, 70 mM Saccharose, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,1 mM EDTA und 0,5 mg/mL BSA. Die Herzmitochondrien wurden mittels eines ähnlichen Verfahrens aufgereinigt, wobei ein Polytron Homogenisator verwendet wurde. Die COX wurde gemäß dem von Adez und Cascarano beschriebenen Verfahren aufgereinigt (Adez, I.Z., and Cascarano, J. (1977) J. Bioenerg. Biomemb. 9, 237-253). Mittels Triton X-100 solubilisierte COX wurde in verschieden zusammengesetzte Phospholipidvesikel unterschiedlicher Dimension rekonstituiert, wobei eine modifizierte Cholat-Dialysemethode verwendet wurde (Niggli, V., Siegel, E., and Carafoli, E. (1982) J. Biol. (Ehem. 257, 2350-2356). 1 mL einer Phospholipid-Suspension (10 mg/mL in 50 mM KCl, 10 mM HEPES- KOH (pH 7,0), 0,1 mM K⁺-EDTA; Puffer A) wurde in 0,2 mL einer 400 mM Cholat-Lösung solubilisiert. Die aufgereinigte COX (40 µg) wurde zu 0,4 mL der Cholat-Phospholipid-Michung hinzugegeben. Nach einer Stunde auf Eis wurde die Probe in Dialyserörchen gegeben und in der Kälte gegen 1 L Puffer A dialysiert (24 h), wobei drei Pufferwechsel vorgenommen wurden. COX aus Paracoccus denitrificans wurde freundlicherweise von Dr. Bernd Ludwig, Biozentrum der Universität, Frankfurt am Main/Deutschland zur Verfügung gestellt.

B) Verfahren

Die COX-Aktivität wurde durch Ermittlung des Sauerstoffverbrauches bestimmt. Dazu wurde eine Elektrode vom Clarke-Typ bei 25°C verwendet (Yellow Spring Instruments, Yellow Spring, OH), wobei die Messung unter ständigem Rühren erfolgte. Solubilisierte COX wurde in 40 mM K⁺-Phosphat, 0,005 mM EDTA (pH 7,0), 0,1% Tween 20 enthaltend 0,02 mM Cytochrom c als Substrat und eine Mischung aus Ascorbat und Tetramethyl-p-Phenylendiamin (TMPD) (10 mM/1 mM). Rekonstituierte COX wurde mit Ascorbat/TPMD (10 mM/0,2 mM) in einem Medium enthaltend 100 mM KCl, 0,01 M HEPES-KOH (pH 7,0) und 0,1 mM EDTA gemessen. Die maximale Aktivität (V max) wurde durch Vernichtung des Membran-Protonengradienten mit 2 µM Carbonylcyanid-3- chlorophenylhydrazon und 0,8 µg Valinomycin/(mL Testmedium) bestimmt.
Die Bestrahlung mit Licht wurde mittels einer 70 Watt Lampe, die in 10 cm Höhe über der Elektrode angebracht wurde, durchgeführt.
Die Oxidation von Lipiden mittels Peroxynitrit wurde durch Suspension von 20 mg DPG in 1 mL 40 mM K⁺-Phosphat, 0,05 mM EDTA (pH 7,0) und Mischen mit 0,94 µmol Peroxynitrit erreicht (Stammlösung 94 mM in 0,1 N NaOH). Malondialdehyd wurde wie bereits beschrieben (Klein, S. D., Walt, H., and Richter, C. (1997) Arch. Biochem. Biophys., 348, 313-319) als Index für die Lipidoxidation gemessen.
Die Bindung von A2E an COX wurde wie folgt gemessen: [³H]-A2E (Endkonzentration 40 µM) wurde zu solubilisierter oder rekonstituierter COX oder zu anderen Proteinen hinzu gegeben. Die jeweils verwendete Proteinmenge betrug etwa 50 µmol. Nach 20 min Inkubation in der Dunkelheit oder unter Bestrahlung mit Licht, wurde 10% (Endkonzentration) Trichloressigsäure hinzugegeben, das Präzipitat auf Millipore-Filtern gesammelt und die aufgelösten Filter auf Radioaktivität untersucht.

Beispiel 1

Hemmung solubilisierter Cytochrom c Oxidase durch A2E

Es wurde die Hemmung von solubilisierter Cytochrom c Oxidase (COX) durch A2E gemessen. Die Aktivität der COX läßt sich leicht durch die Registrierung des Sauerstoffverbrauchs des Enzyms in der Anwesenheit von Ascorbat und TPMD (Tetramethyl-p-Phenylendiamin) als Elektronenquelle zur Reduktion von Cytochrom c messen. Es zeigte sich, dass das Ausmaß der COX-Hemmung sowohl von der Menge an Enzym, als auch von der eingesetzten A2E-Konzentration abhängt. Die zum Erreichen einer 50%-igen Hemmung erforderliche A2E-Konzentration (d. h., der IC₅₀-Wert) beträgt für 1 µg COX/mL 3 µM, 7 µM für 2 µg COX/mL (s. Abb. 1) und 20 µM für 4 µg COX/mL.
Des weiteren wurde die Zeitabhängigkeit der Inaktivierung der COX durch A2E gemessen (Abb. 2). In der Dunkelheit ist COX durch A2E bereits teilweise inaktiviert. Unter Lichteinfall kann eine fortschreitende Inaktivierung der COX gemessen werden (Abb. 2a und 2b). Kontrollexperimente zeigen, dass dies nicht mit einer Schädigung von Cytochrom c, Ascorbat oder TPMD durch Licht und A2E zusammenhängt. Die Inaktivierung der COX beruht auch nicht auf einer Änderung von deren Affinität gegenüber Sauerstoff, da die Supplementation von O₂ nach dessen vollständigem Verbrauch das Enzym nicht stimuliert ( Abb. 2c). Vielmehr wird die vollständige Inaktivierung von COX durch A2E durch weitere Lichtexposition vollendet (Abb. 2c). Die Aktivität der COX kann teilweise wiederhergestellt werden, wenn in einem frühen Stadium Cardiolipin hinzugefügt wird (Abb. 2d), dies gilt jedoch nicht für eine spätere Zugabe von Cardiolipin.

Beispiel 2

Spezifität der COX Hemmung durch A2E, sowie Abhängigkeit der Inhibierung von solubilisierter Cytochrom c Oxidase vom verwendeten Phospholipid und Verhinderung der Hemmung durch negativ geladene Phospholipide

Es wurde weiterhin untersucht, welche Substanzen in Bezug auf COX die durch A2E induzierte Inaktivierung verhindern oder abschwächen. Zu diesem Zwecke wurde zunächst die Wirkung mehrerer kationischer und lipophiler Substanzen auf den IC₅₀-Wert von COX untersucht (s. Tabelle I). Es stellte sich heraus, dass die IC₅₀-Werte von COX bei der Verwendung der meisten dieser Verbindungen recht hoch waren, oder dass u. U. sogar überhaupt keine Hemmung der COX stattfand. Dies zeigt, dass diese Substanzen, insbesondere Dequalinium und Tamoxifen, zwar eine Hemmung der COX bewirken, jedoch bei weitem nicht so spezifisch agieren wie A2E, das den bei weitem niedrigsten IC₅₀-Wert (7 µM) aufweist und damit als ein hochgradig spezifischer Inhibitor der COX anzusehen ist.
Es wurde des weiteren gefunden, dass das negativ geladene Phospholipid Cardiolipin (CL) die Inhibition von COX durch A2E verringert (s. a. Abb. 3, zweitoberste Kurve). Als Kontrolle wurden die Polykationen Ruthenium-Rot und La³⁺ verwendet, von denen bekannt ist, dass sie mit CL stark interagieren In der Tat zeigte sich bei Zugabe dieser Substanzen, dass die protektive Wirkung von CL nicht mehr vorhanden war (s. Tabelle II). Ebenso konnte die schützende Wirkung von CL aufgehoben werden, wenn man dieses mit Peroxynitrit, einem effektiven Oxidans, das in Mitochondrien gebildet wird, (vor)behandelt. Vermutlich werden bei einer derartigen Behandlung zunächst die Doppelbindungen der Fettsäuren oxidativ angegriffen und anschließend niederkettige Carbonsäuren als Abbauprodukte gebildet. Eine derartige Behandlung führt zum Verlust der protektiven Eigenschaften von CL, es findet sogar eine Förderung der COX-Inhibition statt.
Die Wirkung eines Gemisches von negativ geladenen Phospholipides auf die A2E induzierte Inhibition von COX wurde untersucht. Für dieses Experiment wurde Asolectin verwendet, eine Mischung von Phospholipiden aus Sojabohnen, die etwa 15% saure (also bei pH 7,0 negativ geladene) Phospholipide enthält. Auch die Verwendung von Asolectin führte zu einer ausgeprägten Protektion von COX in Anwesenheit von A2E (Tabelle III).
Ein weiteres Phospholipid, das im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt ist, ist Phosphatidylglycerin (PG). Die Wirkung von Phosphatidylglycerin in Gegenwart von A2E auf die COX-Aktivität wurde gemessen. Aus Abb. 3 ist ersichtlich, dass in Gegenwart von A2E allein, d. h. ohne schützendes Phospholipid, die COX Aktivität am geringsten ist, was sich im geringeren O₂- Verbrauch pro Zeiteinheit bemerkbar macht (Kurve 1). In Gegenwart von Cardiolipin, dessen Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorteilhaft ist (s. o.), zeigt sich ein protektiver Effekt auf die COX, da hier der Sauerstoffverbrauch der COX pro Zeiteinheit in Gegenwart von A2E und CL bereits erhöht ist und damit eine höhere COX-Aktivität vorliegt als ohne negativ geladenes Phospholipid (vgl. Kurve 1). Die Kontrolle (nur COX) zeigt eine im Vergleich zu den oben genannten Reaktionsmischungen erhöhte COX-Aktivität (Kurve 3), was damit zusammenhängt, dass hier kein A2E, das eine Hemmung induzieren kann, eingesetzt wird. Werden jedoch neben A2E 300 µg/ml PG eingesetzt, so ergibt sich, dass sogar in Anwesenheit von A2E keine Hemmung im Vergleich zum Kontrollwert auftritt (Kurve 4). Vielmehr ist die COX Aktivität bei Verwendung von PG als negativ geladenem, "schützenden" Phospholipid in Anwesenheit von A2E sogar leicht gesteigert, mit Sicherheit ist aber kein hemmender Effekt des A2E mehr auszumachen.

Beispiel 3

Abhängigkeit der A2E-induzierten Inhibition vom verwendeten Phospholipid bei in Lipiden rekonstituierter Cytochrom c Oxidase und Verhinderung der Inhibition durch negativ geladene Phospholipide

Die durch A2E induzierte Inhibierung der COX wurde auch anhand von der "natürlichen" Umgebung der Cytochrom c Oxidase nachempfundenen Vesikeln untersucht. Die Rekonstitution (s. o., unter "Verfahren") wurde erfolgreich durchgeführt, wobei als Parameter hierfür der durchschnittliche Respirationskontrollindex diente, der ohne Entkoppler bei einem Wert höher als 5,5 lag. Damit ist von einer erfolgreichen Rekonstitution der COX in die Lipidumgebung der Vesikel auszugehen. Während bei Rekonstitution von COX in Vesikel enthaltend Phosphatidylcholin/Phosphatidylethanolamin (PC/PE) kein Schutz vor Inhibition mit A2E festzustellen war, zeigte sich ein protektiver Effekt bei der Verwendung von Vesikeln, die negativ geladene Phospholipide enthielten. So zeigten Vesikel enthaltend Asolectin einen deutlichen Schutzeffekt bezüglich rekonstituierter COX bei Verwendung von A2E als Inaktivator (s. Abb. 4). Während bei Verwendung von PC/PE als Vesikelumgebung eine von A2E induzierte bis zu 55% Inhibition der COX-Aktivität auftrat, zeigte sich bei Verwendung von Asolectin-Vesikeln als Umgebung für die rekonstituierte COX, dass ein konstanter Wert von lediglich ca. 10% Hemmung vorlag. Bei Verwendung von Asolectin-Vesikeln zeigte sich des weiteren, dass COX weder bei Dunkelheit, noch bei Lichtexposition eine Empfindlichkeit gegenüber A2E zeigt. Dies steht im Gegensatz zu COX, die in PC- Vesikeln rekonstituiert wurde. Hier zeigte sich eine Empfindlichkeit von COX gegenüber A2E in der Dunkelheit, sowie eine erhöhte Empfindlichkeit bei Lichtexposition, die zu einer fortschreitenden Inhibition von COX führt (s. Abb. 5).
Ein Schutzeffekt durch negativ geladene Phospholipide wurde auch beobachtet, wenn zu Vesikeln enthaltend PC/PE zunehmende Mengen an Cardiolipin (s. o., ein negativ geladenes Phospholipid) gegeben wurden (s. Tabelle III). Desgleichen zeigte sich ebenfalls ein ausgeprägter Schutzeffekt bezüglich Inaktivierung der COX durch A2E, wenn Phosphatidylinosit (PI), ein weiteres negativ geladenes Phospholipid, in den Vesikeln verwendet wurde. Die Rekonstitutionsversuche wurden auch mit COX aus Rattenherz und COX von Paracoccus denitrificans durchgeführt. Auch hier zeigte sich, dass beide Enzyme sensitiv gegenüber A2E waren und von sauren (d. h. bei pH 7,0 negativ geladenen) Phospholipiden geschützt wurden.
Wurde Cardiolipin verwendet, so zeigte sich ebenfalls ein deutlicher Schutzeffekt gegenüber durch A2E-induzierter Apoptose. Zur Untersuchung dieses Effektes wurden MCF-7 Zellen in Kultur, die anfängliche Zelldichte betrug 4 × 10⁴ Zellen/Well, in An- und Abwesenheit von A2E (Konzentration jeweils 10, 30, 60 µM) mit und ohne CL (die Konzentration betrug 500 µg/mL) für einen Zeitraum von 3 bzw. 5 Tagen kultiviert. Es ergab sich, dass A2E dosis- und zeitabhängig dazu führt, dass die Zellen apoptotisch werden. Wird eine 60 µM A2E-Lösung eingesetzt, so sind nach 5 Tagen 99% der Zellen abgestorben. Gibt man hingegen das erfindungsgemäße negativ geladene Phospholipid (hier CL) hinzu, so überleben 95% der Zellen. Dies zeigt auf sehr deutliche Weise, dass die erfindungsgemäßen Phospholipide bzw. Zusammensetzungen eine Schutz der Zellen vor Apoptose ermöglichen. Diese vorteilhaften Eigenschaften prädistinieren die erfindungsgemäßen Phospholipide für eine Verwendung als Medikament zur Behandlung von pathologischen Zuständen der Retina, insbesondere zur Behandlung von AMD und Makuladegeneration.

Beispiel 4

Bindung von A2E an COX und andere Proteine; Spezifität und Stöchiometrie der Bindung

Zur Überprüfung der Hypothese, ob eine molekulare Interaktion zwischen COX und A2E stattfindet, wurde eine Säurepräzipitation der COX nach Zugabe von A2E und Bestrahlung mit Licht, bzw. nach A2E-Exposition in der Dunkelheit, durchgeführt (s. Tabelle IV). Die Dauer der A2E-Exposition der COX im Licht bzw. in der Dunkelheit betrug jeweils 20 min. Wie aus Tabelle IV ersichtlich, werden unter den gegebenen Bedingungen 17 bzw. 13 Moleküle A2E an die COX gebunden. Eine Bindung wird z. B. durch DPG (negativ geladenes Phospholipid, s. o.) nahezu vollständig verhindert, da in diesem Fall anstelle von 17 Molekülen A2E durchschnittlich lediglich 1 Molekül A2E von COX gebunden wird. Dies liefert eine Bestätigung auf molekularer Ebene für den experimentellen Befund, dass die negativ geladenen Phospholipide der vorliegenden Erfindung einen Schutz der COX vor A2E-induzierter Inaktivierung ermöglichen. Dies hat selbstverständlich vorteilhafte Auswirkungen auf den Zellstoffwechsel, da COX weiter im physiologische Rahmen arbeiten kann und keine Apoptosomen gebildet werden. Somit ist es sehr wahrscheinlich, dass der von negativen Phospholipiden und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ausgehende Schutzeffekt der Retina primär durch ein Abschirmen bzw. "Schützen" der Cytochrom c Oxidase gegen den Angriff von A2E erreicht wird.

Tabellen

Tabelle I zeigt die Aktivität solubilisierter COX in Anwesenheit kationischer und/oder lipophiler Substanzen. Der Sauerstoffverbrauch von solubilisierter COX (2 µg/mL) wurde in der Anwesenheit verschiedener Substanzen mittels einer Clarke-Elektrode gemessen (s. Materialien und Verfahren). Wenn immer möglich, wurde ein IC₅₀-Wert ermittelt, d. h. die Konzentration, die zum Erreichen einer 50%-igen Inhibition erforderlich ist, wurde bestimmt. TPP⁺ = Tetraphenyl Phosphonium-Ion; MPP⁺ = Methylphenyl Pyridinium-Ion. Tabelle I
Tabelle II zeigt die Aktivität solubilisierter COX in Anwesenheit von A2E, Cardiolipin und Polykationen. Der Sauerstoffverbrauch von solubilisierter COX (2 µg/mL) wurde in der Anwesenheit verschiedener Substanzen mittels einer Clarke- Elektrode gemessen (s. Materialien und Verfahren). Die A2E-Konzentration betrug stets 20 µM. CL = Cardiolipin (Diphosphatidylglycerin, DPG); RR = Ruthenium-Rot. Tabelle II
Tabelle III zeigt die Aktivität von in Vesikeln aus verschiedenen Phospholipiden rekonstituierter COX. Solubilisierte COX wurde in verschiedene Typen von Phospholipid-Vesikeln rekonstituiert. Die Aktivität des Enzyms wurde in Gegenwart von 14 µM A2E wie beschrieben (s. o.) in einer Elektrode vom Clarke-Typ gemessen. PC = Phosphatidylcholin; PE = Phosphatidylethanolamin; CL = Cardiolipin (Diphosphatidylglycerin, DPG). Tabelle III
Tabelle IV zeigt die mittels Kopräzipitation untersuchte Bindung von A2E an verschiedene Proteine. [³H]-A2E wurde zu solubilisierter COX oder anderen Proteinen hinzugegeben. Nach 20 min Inkubation in der Dunkelheit (Aufbau wurde in Aluminiumfolie eingewickelt) oder unter Lichtexposition, wurde 10% Trichloressigsäure (Endkonzentration) zugegeben, das Präzipitat auf Millipore-Filtern gesammelt und anschließend die in Lösungsmittel aufgelösten Filter auf Radioaktivität untersucht. CL = Cardiolipin (Diphosphatidylglycerin, DPG); Cyt.c = Cytochrom c; BSA = Rinderserumalbumin.

Claims

1. Verwendung eines negativ geladenen Phospholipids zur Behandlung des Auges oder zur Prävention von pathologischen Zuständen des Auges.

2. Verwendung eines negativ geladenen Phospholipids zur Behandlung und Prävention von Makuladegeneration und/oder von pathologischen Zuständen der Retina.

3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, bei der das negativ geladene Phospholipid ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Phosphatidylglycerin, Phosphatidylinosit und Cardiolipin.

4. Verwendung einer Zusammensetzung umfassend mindestens zwei verschiedene negativ geladenen Phospholipide zur Behandlung des Auges oder zur Prävention von pathologischen Zuständen des Auges.

5. Verwendung gemäß Anspruch 4 zur Behandlung oder Prävention von Makuladegeneration und/oder pathologischen Zuständen der Retina.

6. Verwendung gemäß Anspruch 4 oder 5, bei der die negativ geladenen Phospholipide ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Phosphatidylglycerin, Phosphatidylinosit und Cardiolipin.

7. Verwendung einer Zusammensetzung umfassend ein negativ geladenes Phospholipid, mindestens ein Carotinoid und gegebenenfalls mindestens ein Antioxidans zur Behandlung des Auges oder zur Prävention von pathologischen Zuständen des Auges.

8. Verwendung gemäß Anspruch 7 zur Behandlung oder zur Prävention von Makuladegeneration und/oder pathologischen Zuständen der Retina.

9. Verwendung gemäß Anspruch 7 oder 8, bei der das negativ geladene Phospholipid ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Phosphatidylglycerin, Phosphatidylinosit und Cardiolipin.

10. Verwendung einer Zusammensetzung umfassend mindestens zwei verschiedene negativ geladene Phospholipide, mindestens ein Carotinoid und gegebenenfalls mindestens ein Antioxidans zur Behandlung des Auges.

11. Verwendung gemäß Anspruch 10 zur Behandlung oder zur Prävention von Makuladegeneration und/oder pathologischen Zuständen der Retina.

12. Verwendung gemäß Anspruch 10 oder 11, bei der das Antioxidans ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Ubichinon (Coenzym Q10), Vitamin E und Ascorbinsäure.

13. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, bei der die Zusammensetzung zusätzlich neutrale und/oder positiv geladene Phospholipide umfasst.

14. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 7 bis 13, bei der die Zusammensetzung zusätzlich Lutein und/oder Zeaxanthin umfasst.

15. Zusammensetzung umfassend mindestens ein negativ geladenes Phospholipid und mindestens ein neutrales und/oder positiv geladenes Phospholipid.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, bei der das negativ geladene Phospholipid oder die negativ geladenen Phospholipide ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Phosphatidylglycerin, Phosphatidylinosit, Cardiolipin und Asolectin.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16 umfassend mindestens ein Carotinoid und gegebenenfalls mindestens ein Antioxidans.

18. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 17 zur Behandlung des Auges, insbesondere von Makuladegeneration und/oder pathologischen Zuständen der Retina.

19. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, umfassend die folgenden Schritte:

a) Trocknung einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, die in einem Lösungsmittel vorliegt, und

b) Rekonstitution der Zusammensetzung in einer physiologisch akzeptablen Lösung.

c) Gegebenenfalls weitere Behandlung der Lösung nach Schritt b), so daß Lipidvesikel oder Liposomen gebildet werden.

20. Verwendung einer Zusammensetzung erhältlich nach einem Verfahren gemäß Anspruch 19 zur Behandlung des Auges.

21. Verwendung einer Zusammensetzung erhältlich nach einem Verfahren gemäß Anspruch 19 als Augentropfen, Augenbad, Augeninsert oder halbfeste Zubereitung.

22. Augentropfen, Augenbad, Augeninsert oder halbfeste Zubereitung umfassend ein negativ geladenes Phospholipid.

23. Augentropfen, Augenbad, Augeninsert oder halbfeste Zubereitung umfassend mindestens zwei verschiedene negativ geladene Phospholipide.

24. Augentropfen, Augenbad, Augeninsert oder halbfeste Zubereitung umfassend ein negativ geladenes Phospholipid, mindestens ein Carotinoid und gegebenenfalls mindestens ein Antioxidans.

25. Augentropfen, Augenbad, Augeninsert oder halbfeste Zubereitung umfassend mindestens zwei verschiedene negativ geladene Phospholipide, mindestens ein Carotinoid und gegebenenfalls mindestens ein Antioxidans.

26. Augentropfen, Augenbad, Augeninsert oder halbfeste Zubereitung umfassend eine Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17.

27. Verfahren zur Behandlung des Auges, charakterisiert durch die Applikation einer physiologisch akzeptablen Lösung umfassend ein negativ geladenes Phospholipid in das Auge des Patienten.

28. Verfahren zur Behandlung oder zur Prävention von Makuladegeneration und/oder pathologischen Zuständen der Retina, charakterisiert durch die Applikation einer physiologisch akzeptablen Lösung umfassend ein negativ geladenes Phospholipid in das Auge des Patienten.

29. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, bei dem das negativ geladene Phospholipid ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Phosphatidylglycerin, Phosphatidylinosit und Cardiolipin.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, bei dem die physiologisch akzeptable Lösung mindestens zwei verschiedene negativ geladene Phospholipide umfasst.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 30, bei dem die physiologisch akzeptable Lösung zusätzlich mindestens ein Carotinoid und gegebenenfalls mindestens ein Antioxidans umfasst.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 31, bei dem die physiologisch akzeptable Lösung mindestens zwei verschiedene negativ geladene Phospholipide, mindestens ein Carotinoid und gegebenenfalls mindestens ein Antioxidans umfasst.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 32, bei dem die physiologisch akzeptable Lösung zusätzlich neutrale und/oder positiv geladene Phospholipide umfasst.