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DE2624002C2 - Verfahren zur Verwendung eines Enzyms zur Umwandlung einer organischen Substanz in mindestens eine andere organische Substanz durch enzymatische Reaktion - Google Patents

Verfahren zur Verwendung eines Enzyms zur Umwandlung einer organischen Substanz in mindestens eine andere organische Substanz durch enzymatische Reaktion

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DE2624002C2
DE2624002C2 DE2624002A DE2624002A DE2624002C2 DE 2624002 C2 DE2624002 C2 DE 2624002C2 DE 2624002 A DE2624002 A DE 2624002A DE 2624002 A DE2624002 A DE 2624002A DE 2624002 C2 DE2624002 C2 DE 2624002C2
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enzymatic
complex
reaction
enzyme
substance
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DE2624002A
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Michel Grand-Lancy Schneider
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Battelle Memorial Institute Inc
Original Assignee
Battelle Memorial Institute Inc
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Publication date
Application filed by Battelle Memorial Institute Inc filed Critical Battelle Memorial Institute Inc
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Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Verwendung eines Enzyms zur Umwandlung einer organischen Substanz in mindestens eine andere organische Substanz durch enzymatische Reaktion, nach welchem man das Enzym durch kovalente Bindungen auf einem organischen, in wäßrigem Milieu löslichen Polymer befestigt, so daß ein aktiver, in wäßrigem Milieu löslicher enzymatischer Komplex gebildet wird, und nach welchem man diesen Komplex in aufgelöstem Zustand in einer wäßrigen Lösung der umzuwandelnden Substanz während eines Zeitraums und bei einer Temperatur aufrechterhält, die ausreichen, um den gewünschten Umwandlungsgrad dieser Substanz zu erreichen.
Die Verwendung von Enzymen zur Umwandlung einer organischen Substanz in mindestens eine andere organische Substanz ist in der Industrie, insbesondere in der Nahrungsmittelindustrie, bekannt.
Die bekannten Verfahren der Verwendung eines Enzyms, um eine enzymatische Reaktion hervorzurufen,
bestehen darin, das Enzym in aufgelöstem Zustand in ein im allgemeinen flüssiges Reaktionsmilieu einzuführen, das die Substanz (genannt »Substrat«), die man umwandeln will, umschließt, und dieses Reaktionsmilieu auf einer Temperatur und während eines Zeitraums zu halten, die ausreichen, um den für diese Substanz gewünschten Grad der Umwandlung zu erreichen.
Bei der Anwendung dieser Verfahren ist es nicht möglich, am Ende der Reaktion den etwaigen nicht verbrauchten Überschuß an Enzymen zurückzugewinnen. Daher zerstört man gewöhnlich die Restmenge an Enzymen an Ort und Stelle, um das Vorhandensein von Enzymen in Mischung mit dem Reaktionsprodukt zu vermeiden.
Da Enzyme im allgemeinen teuer sind, kann man praktisch aus wirtschaftlichen Gründen nur geringe Mengen verwenden, was eine schwache enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit zur Folge hat, die in der Mehrzahl der Fälle nicht ausreicht, um Enzyme auf industrieller Basis zu verwenden. Nur im Fall von Enzymen, die relativ preiswert sind, wie Proteasen und Amylasen, kann eine Anwendung dieser Verfahren auf industrieller Basis in Betracht gezogen werden.
Nach neueren Verfahren verwendet man »stillgelegte« Enzyme, d. h. durch kovalente Bindungen auf einem geeigneten organischen Polymer befestigte Enzyme, wodurch ein aktiver enzymatischer Komplex erhalten wird. Diese letzteren Verfahren erlauben es, den möglichen Enzymüberschuß nach der enzymatischen Reaktion erneut brauchbar zu machen. Diese Verfahren machen daher die Verwendung einer größeren Menge Enzyme möglich, als theoretisch für die Umwandlung der der enzymatischen Reaktionen unterworfenen Substanz erforderlich ist, wodurch eine Erhöhung der Geschwindigkeit dieser Reaktion und damit des stündlichen Ausbringens erreicht wird.
Einerseits hat die Befestigung eines Enzyms auf einem Polymer in Form eines aktiven enzymatischen Komplexes allgemein zur Folge, daß die Stabilität des Enzyms verstärkt wird, und sie erlaubt andererseits in bestimmten Fällen, den für das Reaktionsmilieu nützlichen pH-Bereich zu erhöhen und die Steuerung des Ablaufs der enzymatischen Reaktion zu erleichtern.
Schließlich ermöglicht die Verwendung eines Enzyms in »stillgelegtem« Zustand in Form aktiven enzymatischen Komplexes, daß man das von Enzymen freie Produkt unmittelbar aus der enzymatischen Reaktion erhält.
Man kann die Befestigung des Enzyms entweder auf einem in Wasser nicht löslichen Polymer vornehmen, so daß ein aktiver enzymatischer Komplex in festem, in wäßrigem Milieu nicht löslichen Zustand gebildet wird, oder auf einem in Wasser löslichen Polymer, so daß ein aktiver, in wäßrigem Milieu löslicher enzymatischer Komplex gebildet wird.
Im ersteren Fall kann man den aktiven, nicht löslichen enzymatischen Komplex in Form von Pulverpailikeln in einer Säule verwenden, die den Chromatographiesäulen in Feststoffphase entspricht, durch die hindurch man das Reaktionsmilieu laufen läßt, oder auch in Aufschlämmung in einem Behälter, der das Reaktionsmilieu enthält. bo Dank der Tatsache, daß der aktive enzymatische Komplex sich in dem Reaktionsmilieu in festem Zustand ^
befindet, kann man leicht und auf wenig kostspielige Weise die Trennung dieses Komplexes aus dem Reaktions- \{
milieu sowie seine Rückgewinnung am Ende der enzymatischen Reaktion erreichen. l|i
Auf joden Fall hat dieses Verfahren in dem Fall, wo eine Säule verwendet wird, den Nachteil, daß ein Zustopfen der Säule riskiert wird oder daß ein »channeling« genanntes Phänomen (Abfließen des Reaktionsmib") Heus in Form von flüssigen Adern, die allein auf den Abschnitt der Säule beschränkt sind) erzeugt wird.
In dem Fall, wo man die enzymatische Reaktion in einem Behälter durchführt, hat die Verwendung eines jy
festen, aktiven enzymatischen Komplexes den Nachteil, daß nur eine schwache Kontaktwirkung zwischen den 'V'i
Teilchen dieses Komplexes und der Substanz besteht, die man umwandeln will, und zwar als Folge der Schwic- H
rigkeit oder der Unmöglichkeit, daß dieses Milieu in das Innere dieser Teilchen eindringt
Die Verwendung eines aktiven enzymatischen Komplexes in dem Reaktionsmilieu in aufgelöstem Zustand erlaubt es, die enzyniatische Reaktion in homogenem Flüssigmilieu durchzuführen, was die Wirksamkeit des Kontaktes zwischen dem enzymatischen Komplex und der umzuwandelnden Substanz verbessert und damit den Ertrag der Reaktion erhöht
Außerdem ist die Wirkung im allgemeinen größer, wenn das Enzym auf einem in wäßrigem Milieu löslichen organischen Polymer befestigt wird, als wenn das gleiche Enzym auf einem unlöslichen organischen Polymer befestigt wird. Die Verwendung eines in wäßrigem Milieu löslichen Polymers zur Befestigung des Enzyms erlaubt es also, einen enzymatischen Komplex zu erhalten, dessen spezifische Aktivität, ausgedrückt in Enzymeinheiten pro Masseeinheit des Komplexes, im allgemeinen höher liegt als die der enzymatischen Komplexe, die durch Befestigen des Enzyms auf einem unlöslichen Polymer erhalten werden.
(Eine Enzymeinheit ist definiert als die Enzymmenge, die die volle Umwandlung eines Mikromol an »Substrat« pro Minute unter optimalen Reaktionsbedingungen auslösen kann).
Andererseits liegt bei gegebenen Versuchsbedingungen die Aktivität eines Enzyms gegenüber einem »Substrat« mit erhöhter Molekularmasse allgemein in dem Fall höher, wo dieses Enzym auf einem in dem Reaktionsmilieu löslichen Polymer befestigt ist, als in einem Fall, wo dieses Enzym auf einem unlöslichen Polymer befestigt ist.
Die Verwendung eines aktiven enzymatischen Komplexes in Lösung in dem Reaktionsmilieu bietet auch gegenüber derjenigen eines unlöslichen festen, aktiven enzymatischen Komplexes den Vorteil, daß eine Ausbreitung von Mikroorganismen vermieden wird, die häufig im Fall fester enzymatisch er Komplexe auftritt Zu diesem Zweck genügt es, eine Filtrierung der Lösung aus dem löslichen enzymatischen Komplex vorzunehmen und zwar durch einen Mikrofilter hindurch, z. B. einen Filter mit Porengrößen in der Größenordnung von 0,2 Mikron, so daß die Mikroorganismen zurückbehalten werden und eine sterile Lösung des aktiven enzymatischen Komplexes als Filtrat erhalten wird.
Die Verwendung bisher vorgeschlagener, aktiver enzymatischer Komplexe, die in wäßrigem Milieu löslich sind, hat den Nachteil, daß ein Ultrafittrationsvorgang des Reaktionsmilieus erforderlich ist, um das Reaktionsprodukt von dem enzymatischen Komplex zu trennen und letzteren für seine spätere Wiederverwendung zurück zu gewinnen. Eine solche Ultrafiltration erfordert die Verwendung eines teuren Materials und sie ist außerdem ein Grund für die Verringerung des Gesamtertrages des Verfahrens. Dieser Nachteil spricht also gegen die industrielle Verwertung aktiver, in wäßrigem Milieu löslicher enzymatischer Komplexe.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Vorteile der Verwendung eines aktiven, unlöslichen enzymatischen Komplexes mit denen der Verwendung eines löslichen enzymatischen Komplexes zu verbinden, ohne die Nachteile zu haben, wobei das organische Polymer einen in reversibler Weise ausfällbaren, aktiven enzymatischen Komplex bildet, unter Aufrechterhaltung seiner enzymatischen Aktivität nach Wiederauflösung.
In dei vorliegenden Beschreibung bedeutet »in reversibler Weise ausfällbar«, daß der enzymatische Komplex nach seiner Ausfällung wieder aufgelöst werden kann und daß er auch aus der derart erhaltenen Lösung erneut ausgefällt werden kann, wobei diese aufeinanderfolgenden Vorgänge des Ausfällens und der Wiederauflösung in unbestimmter Zahl wiederholt werden können, ohne Verlängerungen der physikalischchemischen und enzymatischen Eigenschaften des Komplexe·- sowohl in aufgelöstem Zustand als auch in ausgefälltem Zustand zur Folge zu haben.
Es sei bemerkt, daß die Phänomene, die bei der Ausfällung und der Wiederauflösung des enzymatischen Komplexes ins Spiel gebracht werden können, nicht unbedingt »reversibel« im thermodynamisch^; Sinn dieses Ausdrucks zu sein brauchen, d. h. daß sie thermische Austausche mit dem Außenmilieu nicht ausschließen.
Als in Wasser lösliches organisches Polymer kann man z. B. ein Derivat der Polyacrylsäure, wie Polyacrylamid, verwenden oder auch ein Dextran, die Carboxymethylzellulose, das Polyäthyl-Glycol usw., wobei dieses Polymer chemische Gruppierungen aufweist, die ihm die Eigenschaft verleihen, in reversibler Weise in wäßrigem Milieu Flocken auszufällen oder abzusondern aufgrund einer Veränderung mindestens eines physikalisch-chemischen Parameters dieses Milieus, wie seiner Temperatur, seines pH-Wertes, seiner Konzentration in Lösungszustand usw. oder auch aufgrund der Hinzufügung von Ionen in dieses Milieu, wie bivalenter oder trivalenter Meiallionen, die in der Lage sind, die Ausfällung des enzymatischen Komplexes hervorzurufen, verbunden mit der weiteren Verwendung von mindestens einem komplexbildenden Mittel dieser Ionen, um die Wiederauflösung des aktiven enzymatischen Komplexes hervorzurufen.
Als organisches Polymer kann man insbesondere ein Derivat des Polyacrylamid mit Seitengruppen -COOH verwenden, die ihm die Eigenschaft verleihen, sich quantitativ und auf reversible Weise durch Senkung des pH-Wertes des Milieus unter einen Wert in der Größenordnung von 4,5 bis 5 bei Löslichkeit in dem gleichen Milieu mit einem höheren als diesem pH-Wert zu beschleunigen.
Dementsprechend wird zur Lösung der vorgenannten Aufgabe bei einem Verfahren der eingangs erwähnten Art erfindungsgemäß vorgeschlagen, daß das organische Polymer unter denen ausgewählt wird, die saure Seitengruppen des Benzoesäure- oder Isophthaltyps aufweisen, und daß nach Erhalt des gewünschten Umwandlungsgrades der umzuwandelnden Substanz der enzymatische Komplex ausgefällt und vom Reaktionsmilieu ho getrennt wird. Derartige Polymere haben den Vorteil, bei einem pH-Wert unter 4,5 auf praktisch quantitativer Weise ausfällbar zu sein, da das Verhältnis des nach der Ausfällung in Lösung verbleibenden Komplexes im Vergleich zur ursprünglichen Quantität im allgemeinen unter 1 ppm liegt.
Beispiel 1
A. Bereitung des aktiven enzymatischen Komplexes
Man läßt das Acrylsäurechlorid u.id die p-Aminobenzoesäure wie folgt reagieren:
CH=CH2 CH=CH2
C = O + H2N-<f\— COOH >
CI
Dann polymerisiert man das auf diese Weise erhaltene Monomer in wäßrigem Milieu bei Stickstoffatmosphäre und in Gegenwart einer geringen Menge von N,N'-Methy)en-bis-Acrylamid und Ammoniumpersulfat, wobei diese letztere Verbindung als Katalysator auf die Polymerisation dient.
Man erhält auf diese Weise ein in Wasser lösliches Polymer, ein Derivat des Polyacrylamid, das aus linearen, miteinander verbundenen makromolekularen Ketten besteht, die die Folgeeinheit aufweisen:
25
-CH-CH2-
Man filtriert eine wäßrige Lösung dieses Polymers durch Hindurchleiten durch einen Filter mit Poren von 0,22 Mikron, dann fällt man das Polymer durch Senkung des pH-Wertes auf 4,5 mittels einer wäßrigen, mit Zitronensäure verdünnten Lösung in das Filtrat aus. Danach gewinnt und trocknet man den Niederschlag.
Man befestigt Glucose-Isomerase-Moleküle auf diesem Polymer, indem man wie folgt vorgeht:
— Aufschlämmung des wie oben beschrieben erhaltenen Polymc-Niederschlags in Dioxan (im Verhältnis von 10 Millilitern Dioxan pro Gramm Niederschlag) und Hinzufügen von 1.1 Millilitern N-Tributylamin auf
10 Millilitern der Aufschlämmung;
— Abkühlung der Aufschlämmung auf 00C und Zufügung von 0,4 Millilitern Äthyl-Chloroformat;
— Halten der Aufschlämmung bei 00C während einer Dauer von 10 Minuten, dann Hinzufügen von 10 Millilitern der wäßrigen Glucose-Isomerase-Lösung (20g pro Liter) auf 10 Milliliter Aufschlämmung;
— Halten der derart gebildeten Mischung während einer Dauer von 15 Minuten bei 00C. dann Trockenverdampfen und Auflösen des derart erhaltenen Rückstandes in Wasser;
— Ausfällen des derart erhaltenen enzymatischen Komplexes durch Senkung des pH-Wertes mittels einer mit Zitronensäure verdünnten wäßrigen Lösung auf 4,5;
— Waschen des Niederschlags mittels, einer wäßrigen Natriumchlorid-Lösung (0,1 M), bis sich keine enzymatisehe Aktivität mehr in der Flüssigkeit zeigt, dann abschließendes Waschen mit destilliertem Wasser und
Trocknen.
Auf diese Weise erhält man einen in Wasser löslichen enzymatischen Komplex (mit über 4,5 liegendem pH-Wert), der eine enzymatische Aktivität entsprechend 1500 enzymatischen Einheiten pro Gramm des Komplexes entwickelt (eine enzymatische Einheit wird definiert durch die Menge an in Mikromol ausgedrückter bo Fructose, die in 30 Minuten bei 500C aus einer Glucoselösung von 0,66 M gebildet wird, wobei dieser enzymatische Komplex von Lösung umgeben ist).
B. Verwendung des enzymatischen Komplexes zur Umwandlung von Glucose in Fructose
hl Reaktionsmilieu: 250 Milliliter wäßrige Lösung mit 12 Gcw.-% Glucose.
Reaktionstemperatui:50°C.
pH-Wert des Reaktionsmilieus während der en/.ymatischen Reaktion: 7,0.
Man führt zwei Versuche durch, den einen unter Verwendung von 0.18 g und den anderen unter Verwendung von 1 g des aktiven enzymatischen Komplexes (wobei der Komplex vorher in etwas Wasser aufgelöst wurde).
Man erhöht die teilweise Umwandlung der Glucose in Fructose (51 Gew.-% Fructose, 49 Gew.-% Glucose) nach einer 40stündigen Reaktionsdauer bei Verwendung von 0.18 g des enzymaiisehen Komplexes und nach 9 Stunden bei Verwendung von 1 g des enzymatischen Komplexes.
Nach der Reaktion fällt man den enzymaiisehen Komplex durch Senkung des pH-Wertes des Reaktionsmilieus mittels einer wäßrigen Zitronensäurelösung auf 4,5; dann trennt man diesen Niederschlag vom Reaküonsmilieu, indem man ihn sich absetzen läßt.
Danach wäscht man diesen Niederschlag mittels einer wäßrigen Zitronensihiivlnsiing mit einem pl 1-Werl von 4,5, löst ihn in Wasser, filtert die derart erhaltene Lösung durch einen Filler mit einer Purengiöße von 0. 22 Mikron und fällt den enzymatischen Komplex durch Senkung des pH-Wertes auf 4.5 aus. Danach trockne; man ihn schließlich.
Der auf diese Weise erhaltene enzymatische Komplex in Pulverform kann wie oben ausgeführt auf gleiche Weise wieder verwendet werden, und zwar mit einer unveränderten enzymatischen Aktivität.
Beispiel 2
Man geht vor wie in Beispiel 1, statt jedoch nach der Reaktion die Ausfällung des enzymaiisehen Komplexes durch Senkung des pH-Wertes des Reaktionsmilieus auf 4,5 zu bewirken, ruft man diese Ausfällung hervor, indem man diesem Milieu 2 Milliliter einer IM-Lösung von Calciumchlorid CaCI: mit einem pH-Wert von 7,0 hinzufügt, wobei der pH-Wert des Reaktionsmilieus auf dem Wert 7,0 gehalten wird.
Auf diese Weise erhält man einen Niederschlag von 98% des aktiven enzymatischen Komplexes.
Man trennt den derart aus dem Reaktionsmilieu erhaltenen Niederschlag durch Zentrifugieren, dann führt man ihn in einer wäßrigen Lösung aus tetrasaurer Äthylendiaminsäure (Äthylendiamintetrasäure: Bekanntes komplexbildendes Mittel der Calciumionen). Auf diese Weise verursacht man die Wiederauflösung des aktiven enzymatischen Komplexes und man trennt den Äthylendiamintetrasäure-Calcium -Komplex vom wäßrigen Milieu der Wiederauflösung durch Dialyse. Durch erneute Umwandlung von Glucose in Fructose, wie im Beispiel 1 beschrieben, kann man die wäßrige Lösung des enzymatischen Komplexes frei von derart erhaltenen Calciumionen wieder verwenden, wobei die Lösung im Vergleich zu ihrer ursprünglichen Aktivität eine unveränderte enzymatische Aktivität hat.
Beispiel 3
Man geht vor wie in den Beispielen 1 und 2, ruft jedoch die Ausfällung des enzymatischen Komplexes nach Reaktion durch gleichzeitiges Hinzufügen von 2 Millilitern IM-Lösung von Calciumchlorid mit einem pH-Wert von 7,0 und von 50 Millilitern Äthanol in das Reaktionsmilieu hervor, wobei der pH-Wert des Reaktionsmittels auf 7,0 gehalten wird. Auf diese Weise erhält man die Ausfällung von 99,7% des aktiven enzymatischen Komplexes.
Beispiel 4
A. Bereitung des aktiven enzymatischen Komplexes
Man läßt ein Methylester der Polyacrylsäure aus linearen Makromolekülen mit der Folgeeinheit:
-CH2-CH-
C = O
OCH3
und mit einer Moiekuiarmasse vuii 80 000 mit Hydrazin bei 9011C derart reagieren, daß ein Hydrazid-Polyacryls mid gebildet wird (ein aus linearen Makromolekülen gebildetes Polymer mit der Folgeeinheit:
— CH2-CH-C=O NH-NH2).
Man wandelt dann die Polyacrylamid-Hydrazid in entsprechendes Säurederivat um durch Reaktion bei O0C in Gegenwart einer Mischung von Chlorwasserstoffsäure und Natriumnitrit nach folgender Reaktion:
50
-CH2-CH-C=O
NH—NH2
NaNO2 + HCl
-CH2-CH-C=O
N3
60 65
wobei η die Anzahl der Folgccinheiten pro Molekül der makromolekularen Substanz darstellt.
Danach befestigt man Glycoamylase-Molekülc auf dem derart erhaltenen Polymer, indem man dieses Enzym bei 00C mit diesem Polymer in einem wäßrigen Milieu mit einem p! 1 Wert von 9.4 reagieren läßt.
Auf diese Weise erhält man einen aktiven enzymatischen Komplex in Lösung in wäßrigem Milieu, der aber nicht in reversibler Weise ausfällbar ist, wie dies für die enzymatischen Komplexe erforderlich ist. die für die Anwendung der Erfindung in Betracht gezogen werden.
Um einen enzymatischen löslichen und in reversibler Weise ausfällbaren Komplex zu erhalten, bildet man ein Copolymer zwischen dem löslichen, nicht ausfällbaren Komplex, der wie beschrieben erhalten wird, und dem aus dem Acrylamid abgeleiteten Monomer, das die folgende Formel hat:
CH = CH2
COOH
und das nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise bereitet wurde. w
Zu diesem Zweck bereitet man eine wäßrige Lösung, die in Mischung diesen Komplex und dieses Monomer in ||
aufgelöstem Zustand erhält, und ruft die Polymerisation des Monomers in dieser Lösung in Gegenwart von Ammoniumpersulfat bei Stickstoffatmosphäre hervor.
Man erhält so einen aktiven, in Wasser bei einem pH-Wert über 4.5 löslichen enzymatischen Komplex, der in reversibler Weise bei einem pH-Wert ausfällbar ist. der unter 4,5 liegt, der eine 4 800 enzymatische Einheiten pro Gramm entsprechende enzymatische Aktivität aufweist (eine enzymatische Einheit entspricht dabei der Menge an Glucose, ausgedrückt in Mikromol, die in einer Minute bei 600C aus einer wäßrigen enzymatisch »verflüssigten« Stärke-Lösung erzeugt wird, die einen Gehalt von 30 Gew.-% Feststoff aufweist.
B. Verwendnung des enzymatischen Komplexes zur Umwandlung von Stärke in Glucose
Auf 250 Milliliter einer wäßrigen Lösung aus verflüssigter Stärke mit 30Gew.-% Feststoff, die auf 60°C gehalten wird und deren pH-Wert auf 5 festgelegt wird, fügt man 2 g des aktiven, enzymatischen Komplexes hinzu, der löslich und ausfällbar ist und dessen Zubereitung oben beschrieben wurde, und man hält das derart erhaltene Reaktionsmilieu auf 600C.
Nach 12 Stunden ist die Stärke fast vollständig in Glucose umgewandelt. Man läßt dann das Reaktionsmilieu auf Umgebungstemperatur abkühlen, dann senkt man seinen pH-Wert auf 4,5, so daß die Ausfällung des enzymatischen Komplexes hervorgerufen wird, und trennt dann diesen letzteren von dem Reaktionsmilieu ^5 durch Zentrifugieren.
Der auf diese Weise zurückgewonnene enzymatische Komplex kann mehrfach auf die oben beschriebene Weise wieder verwendet werden, wobei sich eine enzymatische Aktivität ergibt, die ebenso hoch liegt wie bei der ersten Verwendung.
Beispiel5
A. Bereitung des aktiven enzymatischen Komplexes
Man geht vor wie in Beispiel 4 beschrieben und bereitet das Säure-Derivat aus Hydrazid-Polyacrylamid. Dann befestigt man Glucose-lsomerase-Moleküle auf diesem Polymer-Derivat, indem man in der ebenfalls in Beispiel 4 im Fall der Befestigung der Glucoamylase auf dem gleichen Polymer beschriebenen Weise vorgeht Man erhält so einen enzymatischen Komplex.
Andererseits bereitet man ein Acrylmonomer mit der Formel
CH=CH2
C = O
NH-(CH2)-NH2
durch Reaktion des Acrylsäurechlorid mit dem Diaminäthylen.
Man mischt das derart erhaltene Monomer in wäßriger Lösung mit dem enzymatischen Komplex aus Glucoseisomerase und löst in dieser Lösung in Gegenwart von Ammoniumpersulfat unter Stickstoffatmosphäre die
Polymerisation des Monomers aus.
Dieser letzlere enzymatische Komplex ist ein amphoteric Polymer, das in wäßrigem Milieu löslich ist, aber durch Anpassung des pH-Wertes dieses Milieusauf 7,6 (isoclektrischcr Punkt dieses Komplexes) ausgefallt wird.
B. Verwendung des cnzymatischen Komplexes zur Umwandlung der Glucose in Fructose >
Man geht vor wie in Beispiel 1, löst aber die Ausfällung des en/.ymatischen Komplexes nach der Reaktion durch Anpassung des pH-Wertes des Reaktionsmilieus auf den Wert 7,6 aus.
B e i s ρ i e I 6 ίο
A. Bereitung des aktiven enzymatischen Komplexes
Man wandelt das Carboxymelhylcellulose-Hydrazid durch Reaktion bei 0DC in Gegenwart von Natriumnitrid und Chlorwasserstoffsäure in ein entsprechendes Derivat um. Dann läßt man das derart gebildete Azid, stets bei 00C, in wäßrigem Milieu bei einem pH-Wert von 8,7 mit einer Ortho-Aminobenzoe-Säure und Laciase reagieren. Für 1 g Hydrazid-Derivat als Ausgangsstoff verwendet man 0,5 g Lactase und 0,2 g Ortho-Aminobenzoe-Säure.
Auf diese Weise erhält man einen aktiven, in Wasser löslichen enzymatischen Komplex mit einem pH-Wert, der über 4,5 liegt und in reversibler Weise bei einem pH-Wert unter 4,5 ausfällbar ist, der aus einer makromolekularen Polyanhydroglucose-Kette mit seitlichen Derivatgruppen der Ortho-Aminobenzoe-Säure und anderen seitlichen Gruppen besteht, die aus Lactasemolekülen bestehen, wobei alle diese Gruppen mit der Polyanhydroglucose-Kette durch Gruppen mit der Formel
_O-CH2-CO-NH-
verbunden sind.
Dieser enzymatische Komplex hat eine 520 Lactaseeinheiten pro Gramm entsprechende enzymatische Aktivität.
30 B. Verwendung des enzymatischen Komplexes zur Umwandlung der Lactose in Galactose und Glucose
Auf 250 Milliliter einer wäßrigen Lösung mit 5 Gew.- Lactose mit einem pH-Wert von 6,6 und auf 40°C gehalten fügt man 1 g des in der oben beschriebenen Weise erhaltenen enzymatischen Komplexes bei.
Zwei Stunden lang läßt man die enzymatische Reaktion sich entwickeln und fällt den enzymatischen Komplex dann durch Senkung des ph-Wertes des Reaktionsmilieus auf 4,5 mittels einer durch Zintronensäure verdünnten Lösung aus. Man trennt den derart erhaltenen Niederschlag von dem Reaktionsmilieu, indem man ihn sich absetzen läßt. Der auf diese Weise zurückgewonnene enzymatische Komplex kann nach Reinigung durch Wiederauflösung in wäßrigem Milieu bei einem pH-Wert von 7,0 und Filtration durch einen Filter, der beispielsweise Poren von 0,22 Mikron hat, mehrere Male wieder verwendet werden, ohne seine ursprüngliche enzymatisehe Aktivität zu verlieren.
Die Analyse des Reaktionsmilieus zeigt nach Trennung des enzymatischen Komplexes, daß 30% der ursprünglichen Lactose-Menge in Galactose und Glucose umgewandelt wurde.
Das vorbeschriebene Verfahren kann sehr verschiedene industrielle Anwendungen erhalten, insbesondere auf folgenden Gebieten:
— Veredelung von Lactoserum durch Hydrolyse der Lactose,
— Isomerisation der Glucose mittels Glucose-Isomerase zur Erlangung von Glucose- und Fructo; !sin.^ mit erhöhter Süßkraft,
— Erzeugung von Invertzucker aus Saccharose durch Inversion,
— Abbau der Stärke zu Glucose mittels Alpha- Amylase und Amyloglucosidase,
— Erzeugung von Maltose aus Stärke mittels Beta-Amylase und Amyloglucosidase,
— Erzeugung von hochfermentierbaren Sirups für die Bierherstellung.

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Verwendung eines Enzyms zur Umwandlung einer organischen Substanz in mindestens eine andere organische Substanz durch enzymatische Reaktion, wonach das Enzym durch covalente Bindungen auf einem in wäßrigem Milieu löslichen organischen Polymer befestigt wird, wodurch ein aktiver, in wäßrigem Milieu löslicher enzymatischer Komplex erzeugt wird, und wonach dieser Komplex in aufgelöstem Zustand in einer wäßrigen Lösung der umzuwandelnden Substanz während einer Zeitdauer und bei einer Temperatur gehalten wird, die ausreichen, um den gewünschten Umwandlungsgrad für diese Substanz zu erreichen, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Polymer unter denen ausgewählt wird, die saure Seitengruppen des Benzoesäure- oder Isophthaltyps aufweisen, und daß nach Erhalt des gewünschten Umwandlungsgrades der umzuwandelnden Substanz der enzymatische Komplex ausgefällt und vom Reaktionsmilieu getrennt wird.
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