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DE2242710A1 - Komplex eines biologisch aktiven proteins mit einem polymeren - Google Patents

Komplex eines biologisch aktiven proteins mit einem polymeren

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Publication number
DE2242710A1
DE2242710A1 DE2242710A DE2242710A DE2242710A1 DE 2242710 A1 DE2242710 A1 DE 2242710A1 DE 2242710 A DE2242710 A DE 2242710A DE 2242710 A DE2242710 A DE 2242710A DE 2242710 A1 DE2242710 A1 DE 2242710A1
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DE
Germany
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acid
polymer
enzyme
complex
poly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
DE2242710A
Other languages
English (en)
Inventor
Sidney Alan Barker
John Epton
John Frederick Kennedy
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aspro Nicholas Ltd
Original Assignee
Aspro Nicholas Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aspro Nicholas Ltd filed Critical Aspro Nicholas Ltd
Publication of DE2242710A1 publication Critical patent/DE2242710A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/44—Antibodies bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
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Description

Die Erfindung bezieht sich auf Enzym-Polymeren-Komplexe, in denen das Polymere einen festen Träger für das Enzym darstellt. Die in dieser Beschreibung verwendete Bezeichnung "Enzym" umfaßt auch ähnliche biologisch aktive Proteine, wie Antikörper und Antigene, wenn nicht aus der entsprechenden Textstelle klar hervorgeht, daß es sich um echte Enzyme handelt.
In Jüngerer Zeit bestand großes Interesse an der Verwendung von v/asserunlöslichen Derivaten von Enzymen und ähnlichen biologisch aktiven Proteinen, wie Antikörpern und Antigenen, um die Schwierigkeiten zu vermindern, die unvermeidlich beim Arbeiten mit diesen relativ instabilen wasserlöslichen Substanzen auftreten♦ Derartige Derivate werden "Enzyme in fester Phase" oder "unlösliche Enzyme" genannt und mehrere dieser Produkte-sind heute im Handel erhältlich. Die Enzyme in fester Phase, die heute hergestellt oder vorgeschlagen werden, lassen sich in folgende vier gesonderte Kategorien einteilen:
1. Den Adsorptionstyp,
2. den ionischen Typ, 3· den Einschlußtyp und 4. den covalenten Typ.
8 8 10 / 11 1 B
Bei dem ersten Typ des Enzyms in fester Phase ist das Enzym an einen inerten Träger adsorbiert, wie Glasperlen, Aktivkohle oder Polysacchariden, beispielsweise Cellulose. Ein Hauptnachteil dieses Typs des Enzyms in fester Phase besteht darin, daß wegen der Schwäche der physikalischen Adsorptionsbindung die Desorption des Enzyms eintreten kann, v/enn Änderungen unter anderem der IonenkonzeTitration (ionic strength), Temperatur und des pH-Werts stattfinden.
Bei dem zweiten Typ des Enzyms in fester Phase ist das Enzym durch ionische Bindung an einen polyionischen Träger, wie ein Methacrylsäure-Copolymeres oder ein anderes Ladungen tragendes Polymeres in Form eines Ionenaustauscherharzes gebunden. Ungünstigerweise verleiht der polyionische Träger dem daran gebundenen Enzym kaum den gewünschten Stabilitätsgrad.
Bei dem dritten Typ des Enzyms in fester Phase ist das Enzym physikalisch in einer polymeren Matrix in Form eines Molekularsiebs eingeschlossen, wie in einem vernetzten Polyacrylamidgel. Die Hauptnachteile dieses Typs eines Enzyms in fester Phase liegen in seiner relativen Unzugänglichkeit für große Moleküle und der Diffusion des Enzyms von dem Träger, die bewirkt, daß geringe Mengen des Enzyms selbst nach erschöpfendem Waschen des Enzyms in fester Phase immer noch austreten.
Bei dem vierten Typ des Enzyms in fester Phase ist das Enzym unter milden Bedingungen covalent an eine reaktive Gruppe eines Polymeren gebunden, wie von Acrylamid-Copolymeren, die unter dem Warenzeichen "Enzacryls" erhältlich sind. Die meisten neueren Forschungsarbeiten auf dem Gebiet der Enzyme in fester Phase haben sich mit diesem Typ von covalent gebundenem Enzym beschäftigt. Die für die covalente Bindung erforderlichen Reaktionsbedingungen müssen jedoch sorgfältig geregelt werden, um die Zerstörung des Ensyiaraoleküls zu verhin-
309810/1116
dem, und es.ist gewöhnlich schwierig, erschöpftes Enzym von dem Polymeren zu entfernen, um zu ermöglichen-, daß das Polymere erneut mit frischem Enzym beladen wird.
Erfindungsgemäß wurde nun festgestellt, daß zwischen dem Enzym und dem Träger eine solche Bindung erzielt werden kann, daß zahlreiche Nachteile -der vorstehend genannten Arten von Enzymen in fester Phase ausgeschaltet werden können, -wenn als feste Träger für Enzyme Polymere verwendet werden, die chelatbildende Zentren aufweisen, welche durch Paare benachbarter Hydroxy- und Carbonsäurereste gebildet werden. So kann insbesondere das Enzym unter relativ milden Bedingungen an das Polymere gebunden und von diesem entfernt werden. Das Enzym in fester Phase zeigt im allgemeinen einen wünschenswerten Grad der Enzymstabilität.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Komplex eines biologisch aktiven Proteins, wie eines Enzyms, Antikörpers oder Antigens, mit einem Polymeren, das wiederkehrende chelatbildende Zentren aufweist, die durch Paare von benachbarten Hydroxy- und Carbonsäuregruppen gebildet werden, wobei einige oder alle chelatbildenden Zentren gegebenenfalls mit Metallionen oder ähnlichen Ionen chelatisiert sind.
Es wird angenommen, daß die Enzymkomponente über die chelatbildenden Zentren mit dem Polymeren verknüpft ist, die genaue Art der Bindung wurde jedoch noch nicht nachgewiesen. In dem erfindungsgemäßen Enzym-Polymeren-Koraplex ist das Enzym an das Polymere mit ausreichender Festigkeit gebunden, sodaß das Polymere einen festen Träger für das Enzym darstellt . Manchmal ist diese Bindungsfestigkeit so niedrig, daß ermöglicht wird, daß das Enzym leicht durch Behandlung mit einer wässerigen starken Salzlösung oder einem wässerigen Puffer von dem Polymeren abgestreift oder entfernt werden kann. Manchmal geht jedoch das Enzym in Gegenwart seines Substrats in Lösung über.
309810/1115
-A-
Polymere mit chelatbildenden Zentren waren bereits seit mehreren Jahren bekannt und wurden für Verwendungszwecke angewendet, wie zum Extrahieren von Metallionen oder ähnlichen Ionen aus ihren wässerigen Lösungen. Beispiele für solche Polymere sind Salizylsäure-Formaldehyd-Polymere (US-PS 3 089 885 und US-PS • 3 035 022) und Schiffsche Basen, die aus Salizylaldehyd und Polyaminen erhalten v/erden (US-PS 3 089 885). Für die Zwecke der Erfindung werden die chelatbildenden Zentren an den Polymeren durch Paare benachbarter Hydroxy- und Carbonsäurereste dargestellt. Vorzugsv/eise hat das Polymere wiederkehrende aromatische Kerne, an deren benachbarten Ringatomen ein solches Paar von Resten als Substituenten gebunden ist. Stärker bevorzugt werden Polymere, die wiederkehrende Orthohydroxybenzoesäuregruppen aufweisen und deren Hydroxy- und Carbonßäurereste chelatbildende Zentren darstellen. Solche Polymere können Homopolymere von Orthohydroxybenzoesäuren, die als Ringsubstituenten einen äthylenisch ungesättigten Rest aufweisen oder Copolymere eines solchen Orthohydroxybenzoesäurederivats und eines oder mehrerer äthylenisch ungesättigter Comonomerer sein. Der ungesättigte Rest kann der Formel -X.(CO)n-CR=CR1R2 entsprechen, in der Jedes Symbol R unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder ein Halogenatom, η 0 oder 1 und X eine direkte Bindung, Sauerstoff, Schwefel, -NH- oder eine Methylengruppe bedeuten. Bevorzugte ungesättigte Reste sind Reste der Fqrmel -X,(CO). .CR=CH2, in der R eine Methylgruppe, oder, bevorzugter, ein Wasserstoffatom bedeutet, η und X die angegebene Definition haben, Jedoch im bevorzugteren Fall η für 1 und X für -NH- steht. Vorteilhaft befindet sich der äthylenisch ungesättigte Rest in 4- oder 5-Stellung des Phenylrings.
Beispiele für bevorzugte Polymere für die Zwecke der Erfindung sind. Homopolymere und Copolymere von N-Acryloylaminosalizylsäuren, beispielsweise N-Acryloyl-4-aininosalizylsäure oder N-Acryloyl-5-auinosali::ylsäure. Im Fall von Copolymeren ver-
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den besonders bevorzugt die Copolymeren mit Acrylamide
Diese Polymeren können vernetzt sein, beispielsweise mit H= Methylen-bis-acrylamid.
Einige oder alle der chelatbildenden Zentren des Polymeren können mit Metallionen ader ähnlichen Ionen ch.elatisiert sein, beispielsweise mit Titan- oder Borationen*
Die Enzyme, die an irgendein spezielles Polymeres gebunden werden können, sind von der genauen Art des Enzyms und des Polymeren abhängig. Faktoren, wie sterische Hinderung, können beispielsv/eise verhindern» daß ein spezielles Enzym an ein spezielles Polymeres gebunden wird ο Die Eignung eines speziellen Polymeren als fester Träger für ein spezielles Enzym kann jedoch durch einfache Versuche in gleicher Weise festgekeilt werden, wie die Eignung der bereits bekannten Träger für diesen Zweck geprüft wird. Beispiele von spezifischen Enzym/Polymer-Systemen, die sich als Enzyme in fester Phase als' zufriedenstellend erwiesen haben, werden nachstehend genannt?
ß-Glucosidase/Titankomplex von N<=Acryloyl~4~aminosalizylsäure-Homopolymerem,
ß-Glueosidase/Titankoiiplex von N-AcryJoyl-S-aminosalizylsäure-
Lactat-Dehydrogenas©/Boratkomplex to N~Aeryloyl-4-aminosalizylsäure-Homopolymerem,
Lactat~Dehydrogenase/N"=Acryloyl-4=aminosalizylsäure=-Homopolymeres,
ß-Glucosidase/N-Acryloyl-4-aminosalizylsäure-Hoinopolymeress ß-Glucosidase/N-Acryloyl-S-arainosalizylsäxire-Homopolymeres,
Lactat-Dehydrogenase/Boratkornplex von N-Acryloyl-5~aniinosa·= lizylsäure-Homopolynere-11,
Lactat-Dehydrogenase/H-Acryloyl-S-aminosalizylsäure-Horaopolymeres,
Ot-Air.ylase/Titankomplex von N-Acryloyl-4-aminosalizylsäure-, Homopolynierem,
DC-Amylase/Titankoiüplex von N™Acryloyl-5-aminosalizylsäure~ Hcmopolymerera»
Glucamylase/Titankomplex von N-Acryloyl-4-aminosalizylsäure-Homopolymereiii,
Glucamylase/Titankoffiplex von N-Äcryloyl-5-aininosalizylsaure-Homopοlynerem.
Die Polymer-Bnzym-Komplexe können durch einfaches Vermischen des Enzyms mit wässerigen Suspensionen des Polymeren und anschließendes Abtrennen des Feststoffes, beispielsweise mit Hilfe einer Zentrifuge, von der überstehenden Flüssigkeit, gebildet werden.
Die erfindungsgemäßen Enzyme in fester Phase bzw. Festphasenenzyme können an Stelle der löslichen und häufig relativ instabilen Enzyme in technischen und industriellen Verfahren verwendet werden, die enzymatische Reaktionen umfassen. Nach einer anderen Ausführungsform können sie angewendet werden, um das Enzym aus einer Lösung des Enzyms zu isolieren '. und dadurch zur Reinigung des Enzyms beizutragen. Andere Anwendungszwecke sind für den Fachmann leicht ersichtlich.
Bei ihrer Anwendung können die Polymer-Erizym-Komplexe in eine Säule gefüllt werden, die ein festes inertes Trägermedium enthält, wie Glasperlen, und das Rohmaterial kann der Säule in wässeriger Lösung zugesetzt werden. Während des Durchgangs dieser Lösung durch die Säule verursachen die Enzyme die gewünschte enzymatische Reaktion des Rohmaterials.
Andere technisch geeignete Enzyme, die gemäß der Erfindung an Polymere gebunden werden können, sind folgende:
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Glucose-Isomerase
Lipase · - ..
Cellulase
Katalase ■ · .
Glucose-Oxydase Invertase Lactase Protease Pectinase .
Zur Verdeutlichung der Erfindung werden die nachstehenden Beispiele gegeben. Darin werden folgende Abkürzungen benutzt:
Poly - 4- Säure = N-Äcryloyl-4-aminosalizylsäure-
Homopolymeres
Poly - 5- Säure = f?~Acryloyl-5-aminosalizylsäure-
Homopol^ meres
O.JD. . = . optische Dichte bei gegebener
' Wellenlänge
Beispiel 1
Umsetzung von mit Borat komplexgebundener und nicht komplexgebundender Poly-4-Säure mit Lactat-Dehydrogenase.
Lactat-Dehydrogenase (10 ^aI) wurde, zu zwei verschiedenen · Proben von freier und mit Borat komplexgebundener Poly-4~ Säure gegeben. Die Mischungen wurden sofort zentrifugiert, um den Dehydrogenasekomplex der freien bzw, mit Borat komplexgebundenen Poly-4-Säure abzutrennen.
Herstellung von mit Borat komplexgebundener und nicht komplexgebundener Poly~4-Säure.
Die in dem vorstehend beschriebenen Versuch verwendeten Polymeren wurden in folgender Weise hergestellt:
400 g Natrium-4-aminosalizylat und 60 g Natriumbicarbonat wurden in 250 ml destilliertem Y/asser gelöst und eine Stunde gerührt. Zv/ei Zugaben von je 20 ml und 10 ml Aci^yloylchlorid wurden durchgeführt, wobei die Lösung nach jeder Zugabe eine
309 8 1 07 m5
22A271O
Stunde gerührt wurde. Die so erhaltene Lösung wurde durch Zusatz von 10 η Chlorwasserstoffsäure leicht angesäuert (pH 4 bis 5), filtriert und mit 500 ml destilliertem Wasser gewaschen. N-Acryloyl-4-aminosalizylsäure wurde in einer Ausbeute von 27,0 g aus wässerigem Äthanol umkristallisiert.
Diese Säure hatte einen Schmelzpunkt von 227 bis 229°C und zeigte folgende Analysenwerte:
berechnet C 58,0% H 4,35% N 6,76%
c10H9°4N
gefunden C 57,7% H 4,35% N 6,65%
15,0 g der N-Acryloyl-4-aminosalizylsäure und 9,36 g Borax wurden in 180 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH-V/ert wurde mit 10 η Natriumhydroxyd auf 9,0 eingestellt.
150 g Azobisisobutyronitril in 50 ml Äthanol wurden zugegeben und die Lösung wurde 48 Stunden in einem mit Rückflußkühler versehenen Kolben auf 800C erhitzt. Die resultierende viskose Lösung wurde mit 200 ml destilliertem Wasser verdünnt und durch Zugabe von 5 η Chlorwasserstoffsäure bis zu einem pH-Wert von 2 wurde ein weißes Polymeres in Form eines schweren weißen flockigen Niederschlags ausgefällt. Das Polymere wurde zehnmal mit 1 1-Anteilen an destilliertem V/asser durch Dekantation gewaschen. Dann wurde das Polymere mit Methanol einer Rotationsverdampfung unterworfen, um verbliebene Borsäure zu entfernen. Das Polymere wurde in Form einer Suspension in destilliertem Wasser (200 ml ) aufbewahrt.
Um den Wassergehalt des Polymeren zu ermitteln, wurde eine abgewogene Menge des filtrierten Polymeren über Phosphorpentoxyd im Vakuum bei 600C getrocknet. Beim Trocknen wurde ein harter, spröder, brauner, durchscheinender Feststoff erhalten. Das filtrierte Polymere enthielt 93 Gew.% V/asser.
Das mit Borat kowplexgebundene Polymere wurde erhalten, indem das filtrierte Polymere (93OHpO, 500 mg) in einer wässe-
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rigen Lösung (1,0 ml) von Borax (100 mg/ml) suspendiert wurde. Der pH-Wert des Gemisches wurde auf 7*0 eingestellt und das Polymere wurde durch Zentrifugieren entfernt.
Das nicht komplexgebundene Polymere wurde durch Suspendieren des filtrierten Polymeren (93% H2O, 500 mg) in destilliertem Wasser (1,0-ml) erhalten. Der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt, die Probe zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit entfernt.
Das mit Borat komplexgebundene Polymere kann' auch erhalten werden, indem die viskose Lösung, die vorstehend bei der Polymerisation von N-Acryloyl-4-aminosalizylsäure (5g) beschrieben wurde, mit destilliertem V/asser (70 ml) verdünnt wird und danach die Lösung 48 Stünden gegen eine zehnmal gewechselte Menge von je 5 1 0,0005 m-Boratpuffer (pH 7,0) dialysiert wird ..
Entfernung von Lactat-Dehydrogenase aus dem Poly-4-Säure/Lactat-Dehydrogenase-Komplex.
Eine Probe des wie vorstehend hergestellten Poly-4-Säure/Lactat-Dehydrogenase-komplexes wurde zentrifugiert und ein Teil der überstehenden Flüssigkeit wurde abgezogen. Der verbleibende Anteil der überstehenden Flüssigkeit wurde entfernt, das Polymere mit destilliertem Wasser in drei Anteilen von je 1,0 ml gewsfchen und schließlich mit 1 m Milchsäurelösung (1,0 ml)„gewaschen. Anteile (500 JLiI) aus jeder y^sche wurden in einem Lactat-Dehydrogenase-Test für Brenztraubensäure verwendet, wobei 0,4 jMol des Natriumsalzes von Brenztraubensäure in destilliertem Wasser (1,0 ml) verwendet wurden. Vergleichsversuche wurden ebenfalls durchgeführt, bei denen die angegebene Lösung des Natriumsalzes von Brenztraubensäure (Vergleichsversuch A) und eine Lösung des Natriumsalzes von Brenztraubensäure in 1 m Milchsäure (0,4JUMoI in 1,0 ml) (Vergleichsversuch B) verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. '
309810/1115 ■ . ' " ' -
Anfangs- Endwert Differenz
wert der der O.D.
O.D. bei bei
340 nm 340 nm •
überstehende Flüssigkeit, anfangs
Wasserwäsche 1 Wasserwäsche 2 Wasserwäsche 3 Milchsäurewätehe Vergleichsversuch A Vergleichsversuch B
1.240 0.630 0.610
1.200 0.910 0.290
1.140 0.940 0.200
1.100 0.960 0.140
1.100 0.215 0.885
1.204 0.162 1.042
1.170 0.136 1.034
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen an» daß Poly-4-Säurs Lactat-Dehydrogenase aufnimmt und daß die Lactat-Dehydrogenase aus diesen Komplexen durch Waschen mit einem starken Enzymsubstrat, d.h., Milchsäure, entfernt werden kann.
Es ist festzustellen, daß in dem vorliegenden Fall der Enzym/ Polymer-Komplex keine enzymatische Aktivität hat, obwohl er ein Ausgangsmaterial bzw. eine Quelle für das aktive Enzym darstellt. Dieser Marigel an Aktivität des Enzyms in fester ' Form ist wahrscheinlich auf die Ähnlichkeit der Struktur der Orthohydroxy-Säure-Gruppierung in dem Polymeren und der <X-Hydroxy-Säure-Gruppierung in Milchsäure zurückzuführen.
Beispiel 2
Umsetzung von nicht komplexgebundener Poly-4-Säure und PoIy-5-Säure mit Lactat-Dehydrogenase und mit Glucamylase.
A. 5 g Poly-5-Säure wurden mit Hilfe einer Gewebemühle (tissue grinder) in 10 ml destilliertem V/asser dispergiert. 1,0 ml-Anteile des dispergierten Polymeren wurden mit 5 η HCl oder NaOH auf den gewünschten pH-Wert eingestellt. Lösungen von Lactat-Dehydrogenase (10^uI) v/urden zu Jedem Anteil gegeben
309610/1115
und eine halbe Stunde stehengelassen, bevor zentrifugiert wurde. Der Rückstand wurde zweimal mit destilliertem Vasser ('1 ml) gewaschen und nach jeder Wäsche zentrifugiert. Schließlich wurde das Polymere zweimal mit 1 m Milchsäure (1,0 ml) gewaschen und zentrifugiert. Jeder Anteil der überstehenden Flüssigkeit wurde auf Lactat-Dehydrogenase-Aktivität geprüft. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.
pH- Erste über-Wert stehende Flüssigkeit
Erste Wäsche
Zweite Wäsche Milchsäu-
rewäsche
(Differenz der O.D. 340 nm)
2 0,93 0,91
3 0,73 0,66
4 0,54 0,30
VJl 0,45. 0,16
6 0,20 0,11
7 0,00 0,25
8 0,07 0,20
9 0,07 0,13
1,06 1 ,08
0,05 1,15
0,26 1,25
0,34 1,49
0,14 1,15
0,29 1,53
0,26 1,36
0,00 1,45
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen an, daß Poly-5-Säure bei steigendem pH-Y.Tert im Bereich von 2 bis 9 einen erhöhten Anteil an Lactat-Dehydrogenase komple:x(bindet.
B. Ein Anteil von 2,0 ml des suspendierten Polymeren wurde zentrifugiert und der Rückstand wurde zweimal mit Acetatpuffer (pH 4,5) gewaschen. 1,0 ml einer wässerigen Lösung von Glucamylase (18,6 jüg/ml) und 10 ^LiI Lactat-Dehydrogenase wurden dem Polymeren zugesetzt und das Gemisch wurde zentrifugiert. Der Rückstand wurde zweimal mit 1,0 ml Wasser und mit 1 m Milchsäure gewaschen, wobei nach jeder Wäsche zentrifugiert wurde. Jede überstehende Flüssigkeit nach der Enzymzugabe wurde auf Lactat-Dehydrogcnase- und Glucamylase-Aktivität geprüft. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle
309810/111S
aufgeführt:
Lactat-Dehydroffenase-Test
Erste überstehende Flüssigkeit Erste Wäsche
Zweite Wäsche
1 m Milchsäure-Wäsche
Differenz der O.D. 340 nm
0,09
0,37
0,04
1,67
Glucamylase-Test
Erste überstehende Flüssigkeit Erste Wäsche
Zweite Wäsche
1 m Milchsäure-Wäsche
Differenz der O.D. 460 nm
0,609 0,235 0,039 0,060
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen an, daß Lactat-Dehydrogenase durch Poly-5-Säure bevorzugt gegenüber Glucamylase komplexgebunden wird, wodurch ein Weg zum Trennen dieser Enzyme gezeigt wird.
C. Das in A beschriebene Verfahren wurde wiederholt, wobei
Poly-4-Säure verwendet wurde. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt:
PH Erste überstehende
Flüssigkeit		 Erste Wäsche Zweite 0,46 Wäsche Milch
säure-
Wäsche
(Unterschied der 0 0,40 .D. 340 nm)
2 0,80 0,52 0,26 0,68
3 0,79 0,43 0,00 0,80
4 0,42 0,40 0,10 O1SO
5 0,10 0,24 0,00 0,90
6 0,20 0,00 0,92
7 0,07 0,11 0,92
(Poly-4-Säure neigte bei pH von mehr als 7 zum Gelieren).
309810/1115
Standard 0,92
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen an, daß Poly-4-Säure bei steigendem pH-Wert im Bereich von 2 bis 7 einen erhöhten Anteil an Lactat-Dehydrogenase komplexbindet.
D. Das unter B beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung von Poly-4-Säure wiederholt, wobei folgende Ergebnisse erzielt wurden.
Lactat-Dehydrogenase-Te st
Erste überstehende Flüssigkeit Erste Vasserwäsche Zweite '..asserwäsche Wäsche mit 1 m Milchsäure
Glucamylase-Test
Erste überstehende Flüssigkeit Erste Wasserwäsche Zweite V.'asserwäsche V/äs ehe mit 1m Milchsäure
Differenz der. O.D. 340 nm
0,32 0,20 0,10 0,85
Aktivität*(mg/l/m)
15
.5
^Gewicht der Glucose, die aus einer Standard-Stärkelösung abgespalten wurde.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen an, daß Lactat-Dehydrogenase bevorzugt gegenüber Glucamylase durch Poly-4-Säure komplexgebunden wird, wodurch ein Weg zur Trennung dieser Enzyme aufgezeigt wird.
E. Das vorstehend unter B beschriebene Verfahren wurde wiederholt, wobei nur Glucamylase verwendet wurde. Die Verwendung von 1 ml (18,6jug/ml) und Waschen mit Acetatpuffer . (1 ml, pH 4,5) führte zu folgenden Ergebnissen beim Glucamylase-Test;
30 9 81 07 11.1 S
Aktivität*·(mg/l/m)
Erste überstehende Flüssigkeit 14
Erste Wäsche mit Puffer 5
Zweite Y/äsche mit Puffer °
Standard 18
♦Gewicht der Glucose, die aus einer Standard-Stärkelösung abgespalten wurde.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen an, daß Poly-5-Säure keinen Komplex mit Glucamylase bildet (vergleiche nachstehendes Beispiel 5) ·
Herstellung von Poly-5-Säure.
Die vorstehend in A, B und C verwendete Poly-5-Säure wurde nach der in Beispiel 1 zur Herstellung von Poly-4-Säure beschriebenen Methode hergestellt, wobei jedoch 5-Aminosalizylsäure (40 g) anstelle des Natrium-4-aminosalizylats verwendet wurde und 25»Θ g N-Acryloyl-5-aminosalizylsäure erhalten wurde. Schmelzpunkt: 218 bis 219°C. Analysenwerte:
Berechnet C 58 ,0% H 4 ,35% N 6 ,75%
gefunden C 57 ,5% H 4 ,5 % N 6 ,5 %
Das endgültige Polymerprodukt war rosafarben.
Mit Borat komplexgebundene Poly-5-Säure kann in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestellt werden, wobei jedoch von 5-Aminosalizylsäure oder in entsprechender Weise von Poly-5-Säure ausgegangen wird.
Beispiel 3
Umsetzung von mit Titan komplexgebundener und nicht komplexgebundener Poly-4-Säure und Poly-5-Säure mit ß-Glucosidase.
Die folgenden Proben wurden in der angegebenen Weise mit
ß-Glucosidase kombiniert:
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• — 15 -
Probe ■
4A Getrocknete, mit Titan komplexgebundene Poly-4-Säure 4B entwässerte (dessicated), mit Titan komplexgebundene
Poly-4-Säure
4C nicht komplexgebundene Poly-4-Säure 5A getrocknete, mit Titan komplexgebundene Poly-5-Säure 5B entwässerte (dessicated), mit Titan komplexgebundene
Poly-5-Säure 5C nicht komplexgebundene Poly-5-Säure.
Jede -Probe (20 mg) wurde fünfmal (bei jeder Wäsche 5 Minuten)" mit destilliertem Wasser gewaschen. ß-Glucosidase (1 mg) in destilliertem Wasser (5 ml) wurde jeder Probe zugesetzt und das Gemisch wurde bei etwa 4°C 16 Stunden gerührt. Die Gemische wurden zentrifugiert und die jeweilige überstehende Flüssigkeit entfernt. Aus der ursprünglichen Enzymlösung wurde ein Anteil (25 ml) entnommen und ein weiterer Anteil wurde aus jeder überstehenden Flüssigkeit nach der Kombination (Kopplung) entnommen. Diese Teilmengen wurden analysiert, um die Enzymaufnahme durch das Polymere zu prüfen. Die Proben wurden fünfmal je 5 Minuten mit destilliertem Wasser gewaschen und die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt. 0,005 m Acetatpuffer (pH 5) (2 ml) wurde zugesetzt und ein Anteil wurde zur Analyse entnommen.
Die genannten Anteile wurden analysiert, indem die Abspaltung des 0-Nltrophenyl-Anions aus einer Lösung von O-Nitrophenylß-D-glucopyranosid gemessen wurde» Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt;
Probe Anfängliche überstehende Feststoff Enzymlösung Flüssigkeit (25 iil-Anteil) nach der Kombination (25 JUl)
Differenz der O.D. 420 nra 4A 0,80 0,052 2,0
309810/1 1 16
2242710 > 2,0
0,048 2,0
0,034 >2,0
0,064 1,95
0,050 1,30
0,062 0,013
0,042
4B 0,80
4C 0,80
5A 0,80
5B 0,80
5C 0,60
Reagenz-BlindprobeO,014
Die erzielten Ergebnisse zeigen, daß fast die gesamte ß-Glucosidase der ursprünglichen Lösungen durch die Polymerproben aufgenommen wurde.
Die Aktivität der so erhaltenen Enzyme in fester Phase wurde nicht merklich vermindert, wenn zehnmal (Je 5 Minuten) mit 0,005 m Acetatpuffer, 0,1 m Acetatpuffer oder 0,5 m Calciumchlorioßjewaschen wurde. 5-minütige Wäschen mit 1 m Saccharose in 1 m Natriumchlorid, denen sich 5-minütige Wäschen mit 0,005 Acetatpuffer anschlossen, verminderten jedoch die Aktivität auf etwa 1 Drittel des Verts vor dem Waschen.
Die als Proben 4A, 4B, 5A und 5B verv/endeten, mit Titan komplexgebundenen Polymeren wurden in folgender Weise hergestellt:
Gemäß Beispiel 1 erhaltene Poly-4-Säure wurde zweimal mit 5 η Chlorwasserstoffsäure und dann zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend in 12,5% (Gewicht/Volumen) Titanochlorid (10 ml) suspendiert und 5 Minuten gerührt. Das Gemisch wurde abfiltriert, um Oxydationsmittel zu entfernen, wobei ein orangefarbener Feststoff verblieb.
Die Probe wurde in zwei Teile geteilt, wovon einer über Nacht in einem Trockenschrank bei 45 C getrocknet wurde um Probe 4Λ zu erhalten. Der zweite Teil wurde über Nacht in einem Exsikkator bei 40C gehalten und ergab Probe 4B.
Der entsprechende 5-Amino-Komplex vnarde nach der vorstehenden Methode erhalten, wobei jedoch gemäß Beispiel 2 erhaltene rosafarbene Poly-5-Säure anstelle der weißen Poly-4-Säure verwendet wurde.
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ßAD ORIGINAL
Der nach der Filtration verbleibende Feststoff hatte dunkel^ braune Farbe. Diese" Probe wurde in zwei. Teile geteilt und in der vorstehend beschriebenen 'weise behandelt, v/ob ei Proben 5A (entsprechend 4A) und 5B (entsprechend 4B) erhaltsn wurden.
Beispiel 4
Umsetzung von mit Titan komplexgebundener Poly-4-Säure und Poly-5-Säure mit c* -Amylase.
20 mg-Proben 4A, 4B, 5A und 5B, wie sie in Beispiel 3 definiert wurden, wurden je fünfmal (2 Minuten in jeder "Wäsche) mit 5 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die letzte überstehende Flüssigkeit wurde entfernt, O?-Amylase von Bazillus subtilis (1 mg) in destilliertem Wasser (5 ml) zu jeder Probe gegeben und das Gemisch wurde 16 Stunden bei 40C gerührt. Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt und der Aufschluß (digest) wurde fünfmal mit 5 ml destilliertem Wasser und zehnmal (2 Minuten bei jeder Wäsche) mit 5 ml 0,1 m Acetatpuffer von pH-Wert 5 gewaschen. . .
Dann wurden die Festphasen-Enzyme in 2 ml 0,005 m Acetatpuffer von pH 5 suspendiert und gerührt, bis eine homogene Suspension erhalten wurde. Anteile des Festphasen-Enzyms (1 ml bei 4A und 5A und 0,5 ml bei 4B und 5B) wurden auf die Umwandlung von Stärke -in Maltose geprüft, wobei die Methode von Bernfeld et al (Samuelsori and Stramberg, Carbohydrate Research 3, (1966), 89) verwendet wurde. Die Aktivität der Festphasen-Enzyme zeigte folgende Werte:
4A -2,56 Aktivitätseinheiten*/mg
4B 2,27 η
5A 1,51 "
5B 4,44 . "
* Als eine oc -Araylaseeinheit wurde die Menge angenommen, die bei 200C- in einer Minute reduzierenden Zucker freisetzte, der 1 yUMol Maltose äquivalent war.
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It Il
If If
η Il
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen an, daß O6-Amylase durch mit Titan komplexgebundene Poly-4-Säure und mit Titan komplexgebundene Poly-5-Säure komplexgebunden wird und daß die so erhaltenen Enzyme in fester Phase bedeutende enzyraatische Aktivität zeigen.
Beispiel 5
Umsetzung von mit Titan komplexgebundener Poly-4-Säure und Poly-5-Säure mit Glucamylase.
Die Verfahrensweise des Beispiels 4 wurde wiederholt, wobei jedoch anstelle der Oi-Amylase 5 ml Agidex-Glucamylase-Zubereitung (etwa 1 mg/ml) verwendet wurden.
0,5 ml-Anteile einer homogenen Suspension des Festphasen-Enzyms in 0,005 m Acetatpuffer von pH 4,5 (2 ml) wurden unter Verwendung der Methode von Bernfeld et al. auf die Umwandlung von Stärke in Glucose geprüft. Di© Festphasen-Enzyme zeigten folgende Aktivität:
4A 0,304 Aktiv!tätseinheiten*/mg 4B 0,630
5A 0,323 5B 0,450
*Eine Glucamylaseeinheit wurde als die Menge angenommen, die bei 450C in einer Minute reduzierenden Zucker freisetzte, der 1yUMol Glucose äquivalent war.
I! Il N η
ti It Il W
Il N η η
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen an, daß Glucamylase durch ■it Titan komplexgebundene Poly-4-Säure und mit Titan komplexgebundene Poly-5-Säure komplexgebunden wird und daß die so erhaltenen Enzyme in fester Phase bedeutende enzymatische Aktivität aufweisen.
Die Veränderung der Aktivität des Enzyms in fester Phase in Abhängigkeit von der Anzahl der Benutzungen wurde durch Waschen des Aufschlusses bzw. extrahierten Rückstands (digest)
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22427 TO
des vorstehenden Versuches mit 0,1 m Acetatpuffer von pH 5 (2 ml, 2 Minuten), Entfernen der überstehenden Flüssigkeit, 'Suspendieren des Rückstands in 0,005 m Acetatpuffer von pH 5 (1 ml) und Wiederholen des Tests bestimmt. Dieser Vorgang wurde dann noch zweimal wiederholt. Die Verminderung der Aktivitätals prozentualer'Anteil der ursprünglichen Aktivität zeigte folgende Werte:
Probe erste Verwendung dritte . vierte
100 zweite 54 47
4A 100 58 46 35
4B 100 58 61 57,5
5A , 100 60 63,5 59,5
5B 72,5
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen an, daß nach einem ursprünglichen1 Verlust von.etwa 30 bis hO% die enzymatische Aktivität der Enzyme in fester Phase bei einem geeigneten und brauchbaren konstanten Wert bei erneutem Gebrauch bleibt. Diese Enzyme in fester Phase wurden während einer Dauer von 10 bis 20 Stunden verwendet,,ohne daß ihre Aktivität auf einen unwirtschaftlichen Wert abgefallen ist.
Beispiel 6 .
Der Titankomplex von N-Acryloyl~4-aminosalizylsäure-Homopolymerem (20 mg), der in nachstehend beschriebener Weise hergestellt worden war, wurde fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen (5 ml, 2 Minuten in Jeder Wäsche) und die letzte überstehende Flüssigkeit, wurde entfernt. 5 mg ^-Amylase in destilliertem Wasser wurden zugesetzt und der Rückstand 16 Stunden bei 40C gerührt. Ein Anteil (25/Ul) wurde von jeder überstehenden Flüssigkeit entnommen und mit Hilfe der Umwandlung von Stärke in Glucose auf Enzymaktivität geprüft, wobei die Methode von Bernfeld et al. (Samuelson and Stramberg, Carbohydrate Research 3 (1966) 89) angewendet wurde.
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Der Feststoff wurde zehnmal mit 0,1 m Acetatpuffer (pH 5,0, 5 ml, 2 Minuten pro V/äs ehe) gewaschen. Nach dem Entfernen der letzten überstehenden Flüssigkeit wurde dei&ückstand in 0,005 m Acetatpuffer (pH 5,0, 2 ml) suspendiert. Anteile (500 ^μΐ) des Rückstands wurden dann in der vorstehend angegebenen Weise auf ihre Enzymaktivität geprüft. Die Ergebnisse der Tests der Enzymaktivität sind nachstehend in Tabelle 1 aufgeführt.
Der Titankomplex des N-Acryloyl-4-aminosalizylsäure-Homopolymeren, der in diesem Beispiel verwendet wurde, wurde in folgender Vteise hergestellt:
15g N-Acryloyl-4-aminosalizylsäure wurden in 180 ml destilliertem V/asser suspendiert und 9»36 g Borax wurden zugegeben. Der pH-Wert wurde mit 10 η Natriumhydroxyd auf 9 eingestellt und 150 mg Azobisisobutyronitril in 50 ml Äthanol wurden zugesetzt und die Lösung 48 Stunden auf einem Viasserbad auf 00°C erhitzt. Nach dem Verdünnen der Lösung mit 200 ml destilliertem Wasser wurde ein weißes Polymeres durch Zugabe von 2 η Chlorv;asserstoffsäure ausgefällt. Es wurde zeJinnal mit destilliertem Wasser (1 1-Portionen) durch Dekantation gewaschen und dann fünfmal mit Äthanol der Rotationsverdampfung unterworfen und schließlich in 200 ml destilliertem Vasser suspendiert. Ausbeute: 14,2 Trockengewicht.
1 g des so erhaltenen Polymeren wurde 20 Minuten mit 12,5, j (Qewicht/Volumen) Titanchlorid (10 ml) gerührt, wobei ein orangefarbener Feststoff erhalten wurde, der an der Pumpe filtriert und mit 100 ml destilliertem V/asser gewaschen wurde. Auabeute: 980 mg Trockengewicht.
Beispiel 7
Die Verfahrensweise des Beispiels 6 wurde wiederholt, wobei der Titankomplex von N-Acryloyl-5-aminosalizylsäure-Homopolymerem verwendet wurde, der wie in diesem Beispiel hergestellt wurde, xls wurde jedoch N-Acryloyl-5-am.inosali;:ylsäure anstelle
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der entsprechenden 4-Aminosäure verwendet. Dabei wurde ein rosafarbenes Homopolymeres und ein rötlich-brauner Titankomplex des Homopolymeren erhalten.
Die Ergebnisse der Tests auf Enzymaktivität sind in Tabelle 1 angegeben.
Beispiel 8 · . "
Die Verfahrensweise des Beispiels,6 wurde wiederholt, wobei in folgender Weise hergestellter Titankomplex von N-Acryloyl-4-aminosalizylsäure-Homopolymerein verwendet wurde;
N-Acryloyl-4-aminosalizylsäure (1 g) wurde in 20 ml destilliertem Wasser suspendiert und der pH-Wert eingestellt, bis er konstant bei 9,0 v;ar. In dieser Stufe war das Monomere löslich. 10 mg Azobisisobutyronitril in 10 ml Äthanol wurden zu der Lösung gegeben, die dann 48 Stunden auf einem Wasserbad auf 800C erhitzt wurde. 2 η Chlorwasserstoffsäure wurde verwendet, um ein weißes Polymeres auszufällen, welches durch Dekantieren mit 250 ml destilliertem Wasser gewaschen wurde.
1 g des Polymeren wurde mit 10 ml 12,5/o-igem (Gewicht/Volumen ) TitanJcblorid 20 Minuten gerührt und der erhaltene gelb- ' orange Feststoff abfiltriert und mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen. Ausbeute: 612 mg, Trockengewicht.
Die Ergebnisse der Tests auf Enzymaktivität sind in Tabelle 1 aufgeführt. ο .^;
Beispiel 9 .
Die Verfahrensweise des Beispiels 8 wurde wiederholt, wobei ein wie in diesem Beispiel hergestellter Titankomplex von N-Acryloyl-5-aminosalizylsäure-Homopolymeren verwendet wurde. Es wurde jedoch anstelle der entsprechenden 4-AKiinosäure N-Acryloyl-5-aniinosalizylsäure verwendet. Die Ergebnisse der Tests auf Enzymaktivität sind- in Tabelle 1
309810/1 115 - '
angegeben.
Beispiel 10
Die Verfahrensweise des Beispiels 6 wurde wiederholt, wobei der Titankomplex von N-Acryloyl-4-aminosalizylsäüre-Homopolymerem verwendet wurde, der in folgender Weise hergestellt worden war:
1 g N-Acryloyl-4-aminosalizylsäure wurde in 20 ml destilliertem \7asser suspendiert und der pH-Y/ert mit 10 η Natriumhydroxyd eingestellt, bis er konstant 4,5 betrug. Zu der erhaltenen Lösung wurden 10 mg Azobisisobutyronitril in 10 ml Äthanol zugesetzt und die Lösung dann 48 Stunden auf einem Wasserbad auf 800C erhitzt. Anschließend an die Verdünnung der Lösung mit destilliertem l/asser (20 ml) wurden 20 ml 12,5/o-iges (Gcv/icht/ Volumen) Titanchlorid zugesetzt, wobei ein gelb-orangefarbener Titankomplex ausgefällt wurde. Dieser wurde an der Pumpe filtriert und mit 200 ml destilliertem V.'asser gewaschen. Ausbeute: 920 mg.
Die Ergebnisse der Tests auf Enzymaktivität sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Beispiel 11
Die Verfahrensweise des Beispiels 10 wurde wiederholt, wobei der wie in diesem Beispiel "hergestellte Titankomplex von N-Acryloyl-5-aminosalizylsäure verwendet wurde. Es wurde jedoch N-Acryloyl-5-aminosalizylsäure anstelle der entsprechenden 4-Aminosäure verwendet.
Die Ergebnisse der Tests auf Enzymaktivität sind in Tabelle 1 aufgeführ t.
3 0 9 8 10/1115
Tabelle 1
CX) CXD
Beispiel
j 		Wert der Aktivität Dauer der üigerierung
1 (10 Minuten) .		 Fest
stoff		 Trocken
gewicht
(mg)		 anfängliche
Rate der' l
Glueöse-Ab
spaltung
(mg/Minute)		 Jilnsyraein-
lieiteii/
mg des Po-
lymeren
6
! 7
ί
8
I
; ς
ίο
i
11
i 		520 rim mg Glucose
520 nm mg Glucose
520 ma mg Glucose
520 nm mg Glucose
520 nm mg Glucose
520 nm mg Glucose.		 überste- ■
hende Flüs-*
sigkeit		 0,031
0,110
0,001 ;
0,064
0,180
O5024
0,130
0,089
Q.,210
0,086
0,208		 5,9
5,1
; 4,8
5,5
6,6 		0,110
0>180
■0,130 ,
0,210
.0,208 ' 		0,104
0,196
0,155
0,211
0,175
r-, -^ . ..... I
0,007
0,002
-0,002
-0,002
-0,002
-0,010
ro
U!
sr
SBZ
K>

Claims (5)

  1. Patentansprüche
    n\ Komplex eines biologisch aktiven Proteins mit einem Polymeren, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymere wiederkehrende chelatbildende Zentren auf v/eist, die durch Paare benachbarter Hydroxy- und Carbonsäurereste gebildet v/erden, wobei einige oder alle chelatbildenden Zentren gegebenenfalls mit Metallionen oder ähnlichen Ionen . chelatisiert sind.
  2. 2. Komplex gemäß Anspruch 1, dadurch gekenn- zeichn et, daß das Polymere ein Polymeres einer Orthohydroxybenzoesäure ist, die als Ringsubstituenten einen äthylenisch ungesättigten Rest der Formel - X(CO) . CR=CR^Ro ent hält, worin Jeder Rest R unabhängig ein Wasserstoffatom, eine C. bis Cg-Alkylgruppc oder ein Halogenatom, η O oder 1 und X eine direkte Bindung, ein Sauerstoffatom, Schwefelatom, eine Gruppe -NH- oder eine Methylengruppe bedeuten.
  3. 3. Komplex gemäß Ansx>ruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Orthohydroxybenzoesäure-Monomere N-Acryloyl-4-aminosalizylsäure oder N-Acryloyl-5-aminosalizyl- säure ist.
  4. 4. Komplex gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymere mit Titano-, Titani - oder Borationen komplexgebunden ist.
    309810/1111, 8ADORiQiNAt
    ' sr-
  5. 5. Komplex gemäß Ansprüchen 1 bis 4, d a-du r c h g e k e η η ζ e ic h η et , daß das ^i^ Glucamylase ist.
    inspected"
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