[go: up one dir, main page]

DE2001902B2 - Verfahren zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten aktiven Proteinen - Google Patents

Verfahren zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten aktiven Proteinen

Info

Publication number
DE2001902B2
DE2001902B2 DE2001902A DE2001902A DE2001902B2 DE 2001902 B2 DE2001902 B2 DE 2001902B2 DE 2001902 A DE2001902 A DE 2001902A DE 2001902 A DE2001902 A DE 2001902A DE 2001902 B2 DE2001902 B2 DE 2001902B2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
polyethyleneimine
solution
protein
precipitate
fractionation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE2001902A
Other languages
English (en)
Other versions
DE2001902A1 (de
DE2001902C3 (de
Inventor
Hans Ulrich Dr.Rer.Nat. Bergmeyer
Gotthilf Dr.Rer.Nat. Naeher
Waldemar 8132 Tutzing Thum
Guenter Dr.Rer.Nat. 8136 Percha Weimann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Boehringer Mannheim GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim GmbH filed Critical Boehringer Mannheim GmbH
Priority to DE2001902A priority Critical patent/DE2001902C3/de
Priority to AT888770A priority patent/AT307447B/de
Priority to JP45092317A priority patent/JPS4939836B1/ja
Priority to IL35497A priority patent/IL35497A/xx
Priority to ZA707605A priority patent/ZA707605B/xx
Priority to NLAANVRAGE7017514,A priority patent/NL168267C/xx
Priority to FR7047458A priority patent/FR2075149A5/fr
Priority to SE00227/71A priority patent/SE368408B/xx
Priority to CH49171A priority patent/CH560723A5/xx
Priority to GB0828/71A priority patent/GB1298431A/en
Priority to DK17071A priority patent/DK145601C/da
Publication of DE2001902A1 publication Critical patent/DE2001902A1/de
Priority to US00306124A priority patent/US3794562A/en
Publication of DE2001902B2 publication Critical patent/DE2001902B2/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2001902C3 publication Critical patent/DE2001902C3/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/60—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from yeast
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J23/00—Details of transit-time tubes of the types covered by group H01J25/00
    • H01J23/16—Circuit elements, having distributed capacitance and inductance, structurally associated with the tube and interacting with the discharge
    • H01J23/24—Slow-wave structures, e.g. delay systems
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J25/00—Transit-time tubes, e.g. klystrons, travelling-wave tubes, magnetrons
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J25/00—Transit-time tubes, e.g. klystrons, travelling-wave tubes, magnetrons
    • H01J25/02—Tubes with electron stream modulated in velocity or density in a modulator zone and thereafter giving up energy in an inducing zone, the zones being associated with one or more resonators
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814—Enzyme separation or purification

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten aktiven Proteinen.
Für die Anreicherung d. h. Reinigung und Fraktionierung von gelösten Proteinen, insbesondere aus biologischem Material, sind bereits mehrere Anreicherungsmittel bzw. Verfahren bekannt. Beispiele Tür geeignete Mittel zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten aktiven Proteinen sind Ammoniumsulfat, anorganisches Gel, Aktivkohle, Chromatografie an Austauschern und Molekularsieben und einige andere. In Anbetracht der außerordentlichen Vielfalt von natürlich vorkommenden Proteinen bzw. Enzymen und ihrer Begleitstoffe macht sich jedoch häufig das Fehlen von Variationsmöglichkeiten bei der Auftrennung bzw. Reinigung sehr nacnteilig bemerkbar. Aus der an sich schon begrenzten Anzahl von Verfahren und Mitteln zur Anreicherung von Proteinen bzw. Enzymen erweisen sich zumeist nur ganz wenige in einem speziellen Fall als brauchbar, was zur Folge hat, daß vielfach die gleichen Reinigungsschritte wiederholt werden müssen, um eine einigermaßen befriedigende Anreicherung zu erzielen. Zumeist sind die erzielten Anreicherungsgrade zudem gering und die spätere Entfernung des zur Anreicherung verwendeten Mittels erfordert besondere Aufwendungen, Eindampfen großer Flüssigkeitsvolumina u. dgl.
Es besteht daher ein Bedarf nach weiteren Verfahren zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten aktiven Proteinen, welche eine bessere Variation und daher auch wirksamere Gestaltung der Proteintrennung gestatten und die Nachteile der bisher bekannten Methoden und Mittel zur Trennung von Proteinen nicht oder nur in geringerem Grade aufweisen.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten aktiven Proteinen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der Lösung ein wasserlösliches Polyäthylenimin zugesetzt wird. Unter aktiven Proteinen werden z. B. enzymatisch aktive Proteine verstanden.
Es war bereits bekannt, Polyäthylenimin als Flokkungshilfsmittel zu verwenden, z. B. zur Klärung von Abwasser, zur Verbesserung der Filtrierbarkcit vom Niederschlägen u. dgl. Ferner wurde bereits vorgeschlagen, unlöslich gemachtes Polyäthylenimin nach Art eines Ionenaustauschers zur Chromatografie von Nucleinsäuren zu verwenden. Polyäthylenimin wird außerdem als Haftvermittler in verschiedenen Industriezweigen, z. B. für Fasern, Farben, Klebstoffe, Lacke u. dgl. verwendet. Bei Kenntnis dieser Verwendungsarten konnte nicht erwartet werden, daß sich wasserlösliches Polyäthylenimin besonders gut zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten aktiven Proteinen eignet.
Für die erfindungsgemäße Reinigung und Fraktionierung sind ais Polyäthylenimin die handelsüblichen
Sorten von schwachbasisch über mittelbasisch bis starkbasisch geeignet. Die erzielbare Trennwirkung beim erfindungsgemäßen Verfahren hängt bis zu einem gewissen Grade vom Molekulargewicht ab, so daß mit bestimmten Molekulargewichten je nach den speziellen Proteinen oft besonders günstige Trennungen erzielt werden können. Als brauchbar erwiesen sich grundsätzlich alle untersuchten wasserlöslichen Polyäthylenimine. beispielsweise solche mit Molekulargewichten zwischen 600 und 100Ό00 und darüber, entsprechend Brookfield-Viskositäten von 500 bis 25 00OcP bei 25° C. Auch die üblichen modifizierten Polyäthylenimine, beispielsweise teilweise oder vollständig äthoxy-
lierte Polyäthylenimine, können verwendet werden.
Bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Ver-
fahrens zur Reinigung von gelösten aktiven Proteinen wird der Proteinlösung eine geringe Menge wasserlösliches Polyäthylenimin zugesetzt, worauf das gewünschte aktive Protein ausfällt und gewisse Verunreinigungen gelöst zurückbleiben (sogenannte positive
Fällung). Diese Art der Ausfällung findet bei geringer Ionenkonzentration und hoher Verdünnung in bezug auf Polyäthylenimin statt. Durch Erhöhung der Ionenkonzentration kann aus Jem Niederschlag mit dem aktiven Protein dieses wieder in Lösung gebracht werden. Zurück bleibt hierbei gewöhnlich ein an Polyäthylenimin reicher, am gewünschten aktiven Protein armer Niederschlag. Die Fällung ist abhängig vom pH-Wertbereich und erfolgt im allgemeinen zwischen pH 5,0 und 9,0, vorzugsweise zwischen
pH 5,5 und 8,5. über und unter den angegebenen Grenzwerten geht gefälltes Protein normalerweise wieder in Lösung.
Die Abtrennung des das gewünschte aktive Protein und Polyäthylenimin enthaltenden Niederschlags kann
nach den üblichen Methoden erfolgen. Beispielsweise kann, nach entsprechender Elution dieses Niederschlags (sieh? oben), das Polyäthylenimin am Kationenaustauscher oder umgekehrt das Protein am Anionenauniauscher abgetrennt werden. Weitere Bei-
jo spiele für mögliche Trennungen des aktiven Proteins und Polyäthylenimins in Lösung sind Ammonsulfatfällung, Fällung mit 01 ganischen Lösungsmitteln, Molekularsiebtrennung (insbesondere wenn das verwendete Polyäthylenimin im Vergleich zum gefällten Protein ein sehr großes bzw. sehr geringes Molekulargewicht aufweist) u. dgl.
Eine weitere Reinigungsmöglichkeit besteht in der sogenannten negativen Fällung. Hierbei werden durch die Zugabe des Polyäthylenimins zuerst die Verunreinigungen gefällt, während das gewünschte aktive Protein im überstand verbleibt und beispielsweise nach Abtrennung der ersten Fällung getrennt ausgefällt wird. Beispielsweise können Ballaststoffe, wie solche unten noch näher angegeben werden, bei hohen Ionenkonzentrationen ausfallen, bei denen das gewünschte aktive Prctein löslich bleibt. Wenn anschließend die lonenkonzentration verringert wird, so fällt das aktive Protein aus.
Weiter fällt unter den Begriff der Reinigung die Gesamtausfällung sowohl von Ballaststoffen als auch des gewünschten aktiven Proleins und anschließende selektive Wiederauflösung nur des gewünschten aktiven Proteins, während hierbei die Ballaststoffe ebenso wie gegebenenfalls inaktive Proteine im Niederschlag verbleiben.
Fraktionierung, wie sie hier verstanden werden soll, ist die Abtrennung inaktiver Proteine vom gewünschten aktiven Protein. Unter inaktivem Protein werden ic hierbei auch an sich aktive Proteine verstanden, die jedoch nicht die im speziellen Fall gesuchte bzw. gewünschte Wirksamkeit aufweisen. Die Fraktionierung erfolgt durch Zugabe steigender Mengen an Polyäthylenimin zur Lösung, wobei die verschiedenen Proteine nacheinander mit überraschend guter Trennwirkung ausfallen.
Unter Ballaststoffen, d. h. denjenigen Stoffen, die beim Reinigungsschritt vom aktiven Protein abgetrennt werden, sind Nucleinsäuren, Zellwandbestandteile wie Polyuronsäuren usw. und Plasmabestandteile, ausgenommen die zu gewinnenden aktiven Proteine selbst, zu verstehen.
Wesent'iche Vorteile des Verfahrens sind seine Einfachheit und die sehr gute Trennwirkung. Polyäthylenimin bewirkt eine sehr geringe »Verschmicrung« der einzelnen, nacheinander ausfallenden Proteine und ist hierin bekannten häufig verwendeten Anreicherungsmitteln, wie insbesondere Ammoniumsulfat, klar überlegen.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß nur sehr geringe Mengen an Polyäthylenimin zugesetzt werden müssen, um die gewünschten Trennwirkungen zu erzielen. So genügen bei niedrigen Salzkonzentrationen häufig schon Mengen in der Größenordnung von 0,005 bis 1 Volumprozent einer 10%igen Polyäthyleniminlosung in Wasser, um zum Erfolg zu kommen. Andererseits können zur Ausfällung von Ballaststoffen bei relativ hohen Salzaktivitäten in der Lösung auch erheblich größere Mengen an Polyäthyleniminlösung zugesetzt werden, beispielsweise !5 bis 20 Volumprozent einer 10%igen Lösung oder mehr. Das erfindungsgemäße Verfahren ist außerordentlich schonend und verläuft daher unter denkbar bester Erhaltung der Aktivität der Proteine. Wie die folgenden Beispiele zeigen, können bei negativen Anreicherungsschritten Aktivitätsausbeuten bis 100% erreicht werden, während bei positiven Anreicherungsschritten, also unter Ausfällung des jeweils gewünschten aktiven Proteins, Aktivitätsausbeuten bis zu 90% erzielt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
55 Beispiel 1
Trennung von
Albumin und Ribonucleinsäure (RNS) mittels
Polyäthylenimin (PÄI), Molgewicht etwa 50 000
500 mg Serum-Albumin (entspricht 400 mg Protein nach der Biuret-Methode) und 500 mg Ribonucleinsäure werden in 50 ml 0,05 M Phosphat-Puffer, pH = 7,0, gelöst und der pH-Wert mit 2 N-NaOH auf 7,0 nachgestellt. Durch stufenweise Zueabe von PÄI (Molgewicht 50 000; 10%ige Lösung, pH = 7,0) fällt nur RNS, dagegen kein Albumin. Bei Verringerung der Puffer-Molarität durch Verdünnen mit Wasser fällt anschließend das Albumin aus (Tab. 1).
Tabelle 1 im mg RNS V PÄI
RNS- überstand im mg Protein
Volum
prozent		 und Albumin-Trennung mittels 500 überstand
PAl Phosphat 275 400
0 (M) 75 390
3 0,05 50 390
6 0,05 30 380
9 0,05 30 380
12 0,05 5 380
15 0,05 40
3 0,05
0,01*)
*) Der überstand der Fällung mit 15 Volumprozent PÄI wurde mit Wasser entsprechend verdünnt.
Beispiel 2
Isolierung von
Glucose-o-phosphat-Dehydrogenase (G-6-PDH) aus Bäckerhefe
Zu 1 1 entsalztem Wasser, enthaltend 20 g Na2HPO4 · 12H2O, und 370 mg äthylendiamintetraessigsaures Natrium werden 340 g getrocknete Bäckerhefe suspendiert und 4 Stunden bei 38° C inkubiert. Danach wird 1 1 Wasser von +4° C zugesetzt, gerührt und zentrifugiert. Der erhaltene überstand enthält neben anderen Hefe-Bestandteilen G-6-PDH und Hexokinase. Es werden langsam 0,12 Volumen Polyäthylenimin (PÄI), Molgewicht etwa 50000 (10%ige Lösung in H2O), pH = 7,0, zugesetzt. Es entsteht ein Niederschlag, der Nucleinsäuren und Proteasen enthält. Die PÄI-Fällung kann auch direkt im inkubierten Hefegärsaft ohne vorherige Zentrifugation duichgeführt werden. Der PÄI-Niederschlag ist grobflockig und läßt sich zusammen mit aufgeplatzten Hefezellen sehr gut zentrifugieren. Die auf diese Weise vorgereinigte Enzymlösung (Überstand) wird mit festem Ammoniumsulfat auf 3,05 M eingestellt, der auftretende Niederschlag enthält die beiden Enzyme. Nach Zentrifugation wird der Niederschlag mit 2 · 10~2 M MgCI2-Lösung, enthaltend 1 · 10"3 M äthylendiamintetraessigsaures Natrium und 1 · 10"3M Na-Azid, pH = 6,5, aufgenommen und 12 Stunden gegen Leitungswasser dialysiert.
Als weiterer Reinigungsschritt wird das Dialysat (etwa 2,01, 0,01 M Ammoniumsulfat-Gehalt) mit 0,010 bis 0,020 Volumen obiger (10%iger) PÄI-Lösung versetzt, daß gerade noch etwa 5% der G-6-PDH im überstand verbleiben. Es wird zwischen pH = 6,0 bis 7,5, vorzugsweise pH = 7,0, gearbeitet. Der erhaltene überstand wird verworfen.
Der PÄI-Enzym-Niederschlag wird einmal mit 0,01 M Phosphat-Puffer, pH = 7,6, aufsuspendiert und zentrifugiert; das Waschwasser enthält etwa 2% der Enzymaktivität.
Zur Elution wird ein 0,03-M Phosphat-Puffer, pH = 7,6, verwendet, bei Raumtemperatur etwa 15 Minuten gerührt und zentrifugiert. Der überstand enthält etwa 50 bis 60% der G-6-PDH-Aktivität, bezogen auf die Aktivität nach Dialyse. Die G-6-PDH wird bei diesem Schritt 7fach ansereichert (Tab. 2V
Tabelle 2
Positiver PÄI-Schritt beim G-6-PDH-Verfahren
Schritt
Nach Dialyse
PÄI-überstand
Waschung 0,01 M,
pH = 7,6
Eluat 0,03 M, pH = 7,6
E. mg
Protein. %
0,53
3,8
100
<6
1,8
45
E mg '
Protein, %
0,50 100
0,70 2,92 53
Beispiel 3
Isolierung von Hexokinase (HK)
aus Bäckerhefe
Es wird wie im Beispiel 2 beschrieben gearbeitet unter Herstellung eines Dialysats.
Das Dialysat, 0,01 M Ammoniumsulfat-Gehalt, etwa 2,0 1, wird mit 0,009 Volumen Polyäthylenimin (PAI), Molgewicht etwa 50 000, pH = 7,0 (10%ige Lösung in H?O) versetzt, daß noch etwa 10% der HK-Aktivität im überstand verbleiben. Zur Waschung wird der PÄI-HK-Niederschlag einmal mit 0,01 M Phosphat-Puffer, pH = 7,6, aufsuspendiert und zentrifugiert. Das Waschwasser wird verworfen.
Der Enzym-Niederschlag wird mit 0,025-M Phosphat-Puffer, pH = 7,6, aufgenommen, 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, anschließend zentrifugiert. Der überstand enthält etwa 40% der HK-Aktivität, bezogen auf das Dialysat; die Reinigung bei diesem Schritt ist das 4fache (Tab. 3).
Tabelle 3
Positiver PÄI-Schritt bei HK
Schritt
Nach Dialyse
PÄI-überstand
Waschung 0,01 M,
pH = 7,6
Eluat 0,025 M; pH = 7,6
E/mg Protein, %
2,46
0,39
10,5
100
10,8
10,1
33,4
Beispiel 4
Trennung von
Ribonucleinsäure (RNS) und Proteasen (mit Casein als Substrat gemessen sowie Hexokinase und
Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase
durch einen negativen Polyäthylenimin-Schritt
100 ml abzentrifugierter Hefe-Extrakt gemäß Beispiel 2 werden stufenweise mit PAI (Molgewicht etwa 50 000, 10%ige Lösung), pH = 7,0 versetzt. Die MoIarität an Phosphat-Puffer und anderen Salzen war insgesamt 0,08 M (aus gemessenem Leitfähigkeitswert, bezogen auf Phosphat-Puffer, ermitteit). Tas belle 4 zeigt die bei zunehmendem PÄI-Gehalt erzielte Fraktionierung.
Tabelle 4
ίο Fraktionierung von RNS und Proteasen
sowie HK und G-6-PDH
(100 ml Hefeextrakt)
Volum Xm$
RNS		 1 mg
Proteasen		 4,3 HK 1 C
G-6-PDH		 102
prozent
PAI		 185 0,350 4,2 •103 7,8 102
0 45 0,147 4,2 ■103 7,8 IO2
4 6 0,035 4,2 •10J 7,6 102
8 15 0,020 •103 7,6
12
RNS und Proteasen werden also bei 8 bis 12 Volumprozent PÄI fast vollständig ausgefällt, während HK und G-6-PDH praktisch verlustlos im überstand verbleiben.
Beispiel 5
Glucose-Oxydase aus Aspergillus niger
1 kg abgepreßtes Mycel von A. niger werden mit 2 1 vollentsalztem Wasser angerührt und bei 300 bis 400 atü durch Hochdruckdispersion homogenisiert.
Das Homogenisat wird mit 0,2 Volumprozent einer 10%igen PÄl-Lösung (MG 1800) bei pH 7,0 bis 7,5 versetzt und nach etwa 30 Minuten Rühren abfiltriert.
Das blanke Filtrat enthält die Glucose-Oxydase, die Ballaststoffe befinden sich im Niederschlag, der abgetrennt und verworfen wird.
Der salzarme überstand (Leitfähigkeit bei 200C, etwa 2 · ΙΟ3 μ5ίεηιεη8) wird mit 0,1 Volumprozent einer 10%igen PÄI-Lösung (MG 30000—60000) bei pH 7,0 bis 7,5 versetzt. Nach etwa 30 Minuten Rühren verbleiben im blank zentrifugierten überstand weniger als 8% der Aktivität der Glucose-Oxydase.
Der Niederschlag wird mit 0,03 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,6, homogenisiert, 10 Minuten gerührt und blank zentrifugiert. Der inaktive Niederschlag wird verworfen, der überstand eingefroren und lyophilisiert. Tabelle 5 zeigt die in den einzelnen Verfahrensstufen erhaltene Reinigung und die Ausbeute.
Aufarbeitung Tabelle 1 5 E 104 mg Trocken
gewicht*)		 E/mg
Trocken
gewicht		 Ausbeute
Aufschluß und Extraktion Volumen in ml 1
1		 104
103 		2900 5,35 100
1 Abtrennung von Ballaststoffen durch
PÄI (überst.) 		2000 ,78 2240 11,5 90
2. Fällung der Glucose-Oxydase mit
PÄI (überstand) 		1950
1870		 ,6-
,3		 8,1
3.
*) Die Trockengewichtsbestimmungen erfolgten nach erschöpfender Dialyse gegen vollentsalztcs Wasser und anschließender Lyophilisation.
Fortsetzung
Aufarbeitung
4. Extraktion der Glucose-Oxydase
5. Glucose-Oxydase nach
Lyophilisation
Volumen in ml
140
1,15· ΙΟ4
1,22-1O4
mg Trockengewicht·)
250
E mg
Trockengewicht
48,5
Ausbeute
w±
65
68
*) Die Trockengewichtsbestimmungen erfolgten nach erschöpfender Dialyse gegen vollentsalztes Wasser und anschließender Lyophilisation.
Beispiel 6
Glycerokinase aus Candida mycoderma
Vergleich der Enzymisolierungen nach bekannten Verfahren und unter Verwendung von
Polyäthylenimin
A. Isolierung nach dem Stand der Technik
Extraktion des Mycels
60 g des getrockneten Mycels werden in 6OD ml feiner Lösung mit 0,05 M Dikaliumhydrogenphosphat, 10~2 M Glycerin und 10~3 M Äthylendiamintetraessigsäure (ÄDTA) 3 Stunden bei 37°C extrahiert. Dann wird mit 600 ml einer Lösung mit 10"2M Glycerin und 10"3 M ÄDTA verdünnt und vom Mycel abzentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen.
Der erhaltene Extrakt wird 60 Minuten auf 60° C erhitzt, auf 100C abgekühlt und vom denaturierten Protein abzentrifugiert.
Der überstand der Erhitzung wird mit Ammoniumsulfat bis 3,2 M gesättigt und die ausgefällte Glycerokinase abzentrifugiert. Der inaktive überstand wird verworfen. Im Niederschlag wird die Glycerokinase mit 0,05 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7.6, 10"2 M Glycerin und 10"3 M ÄDTA aufgenommen und bei O0C insgesamt 14 Stunden gegen denselben Puffer dialysiert.
B. Erfindungsgemäße Isolierung der Glycerokinase ( unter Verwendung von Polyäthylenimin
60 g des getrockneten Mycels werden wie unter A beschrieben extrahiert, verdünnt und zentrifugiert.
Der blanke Extrakt wird mit 0,3 Volumprozent einer 10%igen PÄI-Lösung (MG 30000—60000) bei pH 7,0 bis 7,5 versetzt. Nach etwa 30 Minuten Rühren verbleibt im blank zentrifugierten Überstand die Aktivität der Glycerokinase.
1 Teil des Uberstands wird nun mit 1 Teil kalter 10"2 M Glycerin enthaltender 10"3 M ÄDTA-Lösung verdünnt. Dann werden 2,75 Volumprozent der obigen 10%igen PÄI-Lösung bei pH 7,0 bis 7,5 zugesetzt. Der überstand wird abzentrifugiert und verworfen.
Der Niederschlag wird mit 0,05 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, extrahiert und zentrifugiert. Der abzentrifugierte Niederschlag wird verworfen. Im überstand wird die Glycerokinase mit Ammoniumsulfat bis 3,2 M ausgefällt. Der Niederschlag wird konzentriert in 0,05-M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,0, der 10"2 M Glycerin und 10~3 ÄDTA enthält, aufgenommen und 14 Stunden bei O0C gegen denselben Puffer dialysiert.
Die nachstehende Tabelle 6 zeigt die nach dem bekannten und die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Ergebnisse und läßt die überlegene Ausbeute und Reinigung bei erfindungsgemäßem Arbeiten klar erkennen. So wird nach der Erfindung bei 57% Ausbeute eine mehr als 12fache Anreicherung erzielt, während das bekannte Verfahren bei 22% Ausbeute nur 4,5fache Anreicherung ergibt.
Tabelle
Aufarbeitung
Volumen
in rnl
Summe,
Einheiten
Summe, mg
Protein
Spez. Aktivität
in Einheiten
mg Prolein
Ausbeute
in %
1. Isolierung der Glycerokinase nach dem bekannten Verfahren (deutsche Auslegeschrift 1 238 422)
1.1 Extraktion des Mycels
1.2 Erhitzung des Extraktes
1.3 Ammoniumsulfatfällung und
Dialyse
10S5
1030
50
7,7 · IO3
4,1 · IO3
2,1 · 103
3720
246
236
1,98
16,6
8,9
100
53,3
22,3
2. Isolierung der GIycerokinas;e unter Verwendung von Polyäthylenimin
2.1 Extraktion des Mycels
2.2 Abtrennung von Ballaststoffen
durch Polyäthylenimin
2.3 Fällung der Glycerokinase mit
Polyäthylenimin.
Gelöster Niederschlag
2.4 Ammoniumsulfatfällung und
Dialyse
1035 7,7 · 103 3720 1,98 100
1000 8,0 ■ 103 2130 3,74 104
42 6,36- 103 328 19,4 81.5
28 4,39 · 103 180 24.2 57.5
Beispiel 7
Diaphorase aus Schweineherz
Nach Zerkleinerung von 1 kg gefrorenen Schweineherzen, Auspressen des Fleischbreies, Extraktion des festen Rückstands, Hitzebehandlung des so erhaltenen Extraktes, Amrnonsulfat-Fraktionierung bis 3,2 M und Pialyse erhält man eine, bezogen auf das Protein, weitestgehend angereicherte Diaphorase, die jedoch poch erhebliche Mengen Ballaststoffe enthält, die nicht als Protein nachweisbar sind. Zur Entfernung djeser Pallaststoffe erfolgt der Polyätbylenimin-Schritl.
Das Dialysat wird 1:1 mit 0,01 M KaHumphosphatpuffer, pfi 7,0, verdünnt. Dann werden 0,5 Volumprozent einer 10%igen PÄJ-UJsung(MG 1800; pH mit 2 N-Natronlauge auf 7,0 eingestellt) zugesetzt, wobei die Pallaststoffe ausfallen. Per inaktive Niederschlag
wird abzentrifugiert und die Diaphorase im überstand eingefroren und lyophilisiert.
Tabelle 7 zeigt die erhaltenen Werte bezüglich Ausbeute und Anreicherung.
Tabelle 7
Spez. Aktivität
Aufarbeitung Aktivität in Einheilen/
in Einheiten/ mg Lyo-
mg Protein philisal
Niederschlag
3,2 M Ammo
niumsulfat 0,70 —
Dialyse 0,86 0,384
Pberstand nach
PÄI-Fällung .. 0,9 0,657
100
97

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten aktiven Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß der Lösung ein wasserlösliches Polyäthylenimir. zugesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyäthylenimin in Form einer verdünnten wäßrigen Lösung zugesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polyäthylenimin mit einem mittleren Molekulargewicht zwischen 600 und 100 000 verwendet wird.
DE2001902A 1970-01-16 1970-01-16 Verfahren zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten aktiven Proteinen Expired DE2001902C3 (de)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2001902A DE2001902C3 (de) 1970-01-16 1970-01-16 Verfahren zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten aktiven Proteinen
AT888770A AT307447B (de) 1970-01-16 1970-10-01 Verfahren zur Anreicherung und Reinigung von gelösten Proteinen
JP45092317A JPS4939836B1 (de) 1970-01-16 1970-10-20
IL35497A IL35497A (en) 1970-01-16 1970-10-20 Process for the enrichment of dissolved proteins and product obtained thereby
ZA707605A ZA707605B (en) 1970-01-16 1970-11-10 Process for concentrating proteins
NLAANVRAGE7017514,A NL168267C (nl) 1970-01-16 1970-12-01 Werkwijze voor het zuiveren en fractioneren van een in een waterig medium opgelost biologisch actief proteine.
FR7047458A FR2075149A5 (de) 1970-01-16 1970-12-31
SE00227/71A SE368408B (de) 1970-01-16 1971-01-11
CH49171A CH560723A5 (de) 1970-01-16 1971-01-13
GB0828/71A GB1298431A (en) 1970-01-16 1971-01-14 Process for the enrichment of proteins
DK17071A DK145601C (da) 1970-01-16 1971-01-15 Fremgangsmaade til rensning og fraktionering af vandoploeste, fortrinsvis enzymatisk aktive proteiner
US00306124A US3794562A (en) 1970-01-16 1972-11-13 Process for the enrichment of proteins using polyethylene-imine

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2001902A DE2001902C3 (de) 1970-01-16 1970-01-16 Verfahren zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten aktiven Proteinen

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE2001902A1 DE2001902A1 (de) 1971-08-12
DE2001902B2 true DE2001902B2 (de) 1974-01-03
DE2001902C3 DE2001902C3 (de) 1978-10-12

Family

ID=5759811

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2001902A Expired DE2001902C3 (de) 1970-01-16 1970-01-16 Verfahren zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten aktiven Proteinen

Country Status (12)

Country Link
US (1) US3794562A (de)
JP (1) JPS4939836B1 (de)
AT (1) AT307447B (de)
CH (1) CH560723A5 (de)
DE (1) DE2001902C3 (de)
DK (1) DK145601C (de)
FR (1) FR2075149A5 (de)
GB (1) GB1298431A (de)
IL (1) IL35497A (de)
NL (1) NL168267C (de)
SE (1) SE368408B (de)
ZA (1) ZA707605B (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0035616B1 (de) * 1980-02-14 1984-10-17 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Herstellung von Immunoglobulin mit hohem Monomer-Anteil

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4055469A (en) * 1976-12-10 1977-10-25 Eastman Kodak Company Purification of microbial enzyme extracts using synthetic polyelectrolytes
DE3326888A1 (de) * 1983-07-26 1985-02-14 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Sarcosin-oxidase
US4663288A (en) * 1985-05-22 1987-05-05 Nabisco Brands, Inc. Process for purification of enzymes
US5047511A (en) * 1989-08-28 1991-09-10 Pitman-Moore, Inc. Method for recovering recombinant proteins
US5622822A (en) * 1994-09-13 1997-04-22 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using polyethyleneimine and an anionic phosphate ester surfactant and amplification of same
US6165758A (en) * 1996-08-12 2000-12-26 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Purifying cephalosporin C acylase and regenerating a carrier immobilizing cephalosporin C acylase
JP7020614B2 (ja) * 2018-03-30 2022-02-16 三井化学株式会社 ニトリルヒドラターゼを含む菌体処理物の製造方法及びアミド化合物の製造方法
WO2022060685A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Dow Global Technologies Llc Low odor polyurethane adhesives

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0035616B1 (de) * 1980-02-14 1984-10-17 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Herstellung von Immunoglobulin mit hohem Monomer-Anteil

Also Published As

Publication number Publication date
SE368408B (de) 1974-07-01
NL7017514A (en) 1971-07-20
IL35497A0 (en) 1970-12-24
US3794562A (en) 1974-02-26
IL35497A (en) 1974-01-14
ZA707605B (en) 1971-08-25
NL168267B (nl) 1981-10-16
JPS4939836B1 (de) 1974-10-29
DE2001902A1 (de) 1971-08-12
DK145601C (da) 1983-06-06
DK145601B (da) 1982-12-20
GB1298431A (en) 1972-12-06
AT307447B (de) 1973-05-25
DE2001902C3 (de) 1978-10-12
CH560723A5 (de) 1975-04-15
FR2075149A5 (de) 1971-10-08
NL168267C (nl) 1982-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2843351C3 (de) Neue Pectinesterase, Verfahren zu deren Herstellung und die Verwendung zur Herstellung von demethoxiliertem Pectin
DE2265121B2 (de) Enzympräparat zur Bestimmung von Cholesterin und Verfahren zu seiner Herstellung
DE2500565A1 (de) Verfahren zur herstellung von hefeproteinisolat mit herabgesetztem nucleinsaeuregehalt
DE2001902C3 (de) Verfahren zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten aktiven Proteinen
DE2519382A1 (de) Verfahren zur gewinnung einer gereinigten alpha-galactosidase aus einer alpha-galactosidase enthaltenden fluessigkeit
DE2832843C2 (de)
DE3806423C2 (de) Verfahren zur Herstellung von Pectin
EP0065286B1 (de) Verfahren zum Reinigen bzw. Anreichern von biologisch aktiven Proteinen und hierzu geeignetes Mittel
DE2153232A1 (de) Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Amylase
DE2308013A1 (de) Katalasearme glucoseoxidase und verfahren zu ihrer gewinnung
DD149532A5 (de) Verfahren zur herstellung von organextrakten mit hohem heparingehalt
EP0180859B1 (de) Verfahren zur Reinigung sowie Pasteurisierung von Urokinase
DE2735877A1 (de) Verfahren zur extraktion von proteinen aus hefezellen
DE69917598T2 (de) D-galactosezusammensetzung und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE2133572A1 (de) Verfahren zur herstellung von pektinen
DE2559588C3 (de) Verfahren zur Reinigung von Kallidinogenase
DE1946137B2 (de) Verfahren zur Gewinnung von Glycerinkinase aus Mikroorganismen
DE2342662A1 (de) Verfahren zur herstellung von reinem, beta-trypsin vom schwein und nach diesem verfahren erhaltenes beta-trypsin
DE2418978A1 (de) Steroid-delta-isomerase
DE2239210C3 (de) Verfahren zur Herstellung von a- Galactosidase, die eine starke a- Galactosidase-Aktivität und eine äußerst geringe Invertase-Aktivität aufweist, und deren Verwendung zur Zerlegung von Raffinose
DE1050703B (de) Verfahren zur Verbesserung der Backfähigkeit von Mehl oder Teig
DE2424118B2 (de) Verfahren zur herstellung von hochreinem kallikrein
AT162643B (de) Verfahren zur Gewinnung von Zucker
DE1916723B2 (de) Verfahren zur Reinigung von L Asparaginase
DE933165C (de) Verfahren zur Herstellung von Adrenocorticotrophin-Praeparaten mit verlaengerter Wirkungsdauer und hoher Aktivitaet

Legal Events

Date Code Title Description
C3 Grant after two publication steps (3rd publication)