DE2621618A1

DE2621618A1 - Verfahren zur herstellung von beta- lactam-antibiotika

Info

Publication number: DE2621618A1
Application number: DE19762621618
Authority: DE
Inventors: Eiji Kondo; Takashi Mitsugi
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1975-05-14
Filing date: 1976-05-14
Publication date: 1976-11-25
Also published as: FR2310757B1; GB1544844A; JPS51133488A; US4073687A; FR2310757A1; CH629534A5; NL7605138A; CA1049431A

Description

¹¹ Verfahren zur Herstellung von ß-Lactam-Antibiotika ^lf Priorität: 14. Mai 1975, Japan, Nr. 57 844/75

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ß-Lactarn-Antibiotika, d.h. von bestimmten Penicillin- oder Cephalosporin-Derivaten.

Bestimmte Penicilline und Cephalosporine können enzymatisch unter Bildung von a-Aminoacylseitenketten acyliert werden; vgl. SA-PS 62/3870, US-PS 3 152 050, DT-OSen 1 945 607 und 2 050 982, NL-OS 71.17613, FR-PS 2 188 608, BE-PS 808 288 sowie JA-OSen 47-25 383, 48-35 090, 49-13 393 und 49-62 695.

Es wurde nun erfindungsgemäß festgestellt, daß derartige Acylierungen auch unter Beteiligung von Pilzen der Gattung .Aphanocladium oder Cephalosporium stattfindet. Diese Acylierungen sind im Gegensatz zur Acylierung unter Einwirkung von Bakterien irreversibel.

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ORIGINAL INSPECTED

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Penicillin- und Cephalosporin-Derivaten der allgemeinen Formeln I, II oder III

^00M

(Ill)

η
wobei der Rest RC- einen von einer a-Aminosäure, einem N-Ammoniumsalz einer α-Aminosäure oder einer N-(C^-C₁Q) a-aminosäure abgeleiteten Acylrest und der Rest -COOM eine Carboxyl- oder eine Carboxylatsalzgruppe bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Aminoverbindung aus der Gruppe 6-Aminopenicillansäure, 7-Aminocephalosporansäure, 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure und deren Salze mit einem Ester der allgemeinen Formel

₀ RCOOR¹

in der der Rest RC- die vorstehende Bedeutung hat und R einen C^_^Q-Alkylrest bedeutet, enzymatisch in Gegenwart von Myzel oder eines Myzelpräparats eines Mikroorganismus der Gattung Aphanocladium oder Cephalosporium acyliert.

Beispiele für Salze der Aminoverbindungen, die erfindungsgemäß acyliert werden können, sind Salze mit der Carboxylgrup-

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ORIGINAL INSPECTED

pe, wie Alkalimetall-, Erdalkalimetall- und tertiäre Aminsalze, sowie Salze mit der Ami no gruppe, wie Salze mit Mineralsäuren, wie Hydrochloride, Hydrogensulfate und Hydrogencarbonate. Bevorzugt werden Alkalimetallsalze mit der Carboxylgruppe.

Il

Beispiele für Aminosäuren, von denen sich der Rest RC- ableitet, sind Glycin, Phenylglycin, Cyclohexadienylglycin, Cyclohexylglycin, Thienylglycin, Purylglycin, Hydroxyphenylglycin, Chlorphenylglycin, Cyanophenylglycin, Alanin, Phenylalanin, Methionin, Serin, Tryptophan, Valin, Leucin, Threonin, Asparagin, Lysin, a-Aminobuttersäure und andere natürliche oder künstliche Aminosäuren. Diese Aminosäuren können sowohl als D- oder L-Isomere oder Gemische derselben einschließlich razemischer Gemische vorliegen. Bevorzugte Beispiele sind D-a-Phenylglycin, D-a-(1,4-Cyclohexadienyl)-glycin, D-a-(p-Hydroxyphenyl)-glycin, D-a-(2-Thienyl)-glycin und D-a-(3-Thienyl)-glycin.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Ester weisen Alkylreste mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen auf, Bevorzugt sind die Methyl-, Äthyl- und Propylester. Die Ester können als N-Ammoniumsalze der genannten Aminosäuren, beispielsweise als ein Salz mit einer Mineralsäure, vorliegen.

Bevorzugte Ester sind Salze mit Mineralsäuren von Estern der genannten α-Aminosäuren mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen im Alkylrest. Weitere bevorzugte Ester liegen in Form von C, ₅~A1-

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- 4 kansäuresalzen dieser Aminosäuren vor.

Spezielle Beispiele für Carbonsäuresalze sind, wie bereits erwähnt, Alkalimetall-, Erdalkalimetall- und tertiäre Aminsalze. Spezielle Beispiele für N-Ammoniumsalze sind Salze mit Mineralsäuren und C, .jQ-Alkansäuren. Die Produkte können am Stickstoffatom mit Acylresten mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen acyliert sein. Beispiele für Acylreste sind Alkanoyl-, Aroyl-, Carbalkoxy-, Carbaraloxy- oder ähnliche Acylreste.

Bevorzugte Produkte sind Ampicillin, Cefalexin, Epicillin, Cefradin, Amoxycillin, Cefaloglycin oder deren Salze.

Die erfindungsgemäß hergestellten Produkte sind wertvolle Antibiotika zur Behandlung von bakteriellen Infektionen. Einige dieser Produkte werden bereits jetzt klinisch eingesetzt. Die Verbindungen eignen sich weiter zur Desinfektion von Tieren, Pflanzen oder unbelebten Gegenständen. Diese Verbindungen werden nach üblichen Verfahren auf dem Gebiet der Medizin, Tiermedizin, Geflügelzucht, Gartenbau, Botanik oder anderen damit verwandten Gebieten eingesetzt. Ferner sind die erfindungsgemäß hergestellten Produkte auch wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung anderer Antibiotika.

Als Mikroorganismen der Gattung Aphanocladium können im erfindungsgemäßen Verfahren Stämme von Aphanocladium aranearum (Petch) Gams, insbesondere Aphanocladium aranearum MFC-52 (ATCC 20453) eingesetzt werden. Als Mikroorganismen der Gat-

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tung Cephalosporium können Stämme von Cephalosporium coremioides Raillo, insbesondere der Stamm Cephalosporium coremioides Raillo IFO-8579, der der Öffentlichkeit zugänglich ist, eingesetzt werden.

Ferner können alle natürlichen und künstlichen Varianten, Mutanten oder adaptierte Stämme, die sich von Mikroorganismen der Gattung Aphanocladium oder Cephalosporium ableiten und die gewünschte enzymatisch^ Aktivität aufweisen, im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden.

Diese Mikroorganismen werden gezüchtet, indem man sie auf ein . Nährmedium überimpft und unter aeroben Bedingungen züchtet. Dies kann unter Rühren, Schütteln, unter Belüftung oder in stationärer Kultur erfolgen. Es können übliche Nährmedien mit Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verwendet werden. Beispiele dafür sind Bouillon, Hefeextrakt, Pepton, Maisquellflüssigkeit, Zucker, organische Säuren, Aminoverbindungen und Nitrate. Ferner können die Medien anorganische Salze, wie Phosphate, Sulfate oder Metallsalze, und wachstumsfordernde Substanzen, wie Vitamine oder Aminosäuren enthalten. Die Inkubation wird unter aeroben Bedingungen bei pH-Werten von 5 bis 8, vorzugsweise 6 bis 7, in einem Temperaturbereich von etwa 20 bis etwa 4O⁰C 3 Stunden bis 10 Tage durchgeführt. Folgende drei Nährmedien sur Züchtung dieser Mikroorganismen sind als Beispiele genannt. Sie bestehen jeweils aus wäßrigen Lösungen . vom pH-¥ert etwa 7,0 mit einem Gehalt an a) 3,5 % .Glucose 2,0 % Pepton und 0,3 % Maisquellflüssigkeit,

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b) 2,0 % Glucose, 1,0 % Pepton, 0,3 % Bouillon, 0,2 % Hefeextrakt und 0,1 % Natriumchlorid und c) 3,0 % Rohrzucker, 1,5 % "Goldprotein¹¹, 1,5 % Maisquellflüssigkeit, 0,5 % DL-Methionin und 0,15 % Calciumcarbonat.

Als Myzelpräparate können alle Präparate dieser Mikroorganismen mit einer Penicllin- oder Cephalosporinamidase-Aktivität verwendet werden. Beispielsweise kann Myzel verwendet werden, das durch Filtrieren oder Zentrifugieren aus dem Nährraedium abgetrennt und anschließend mit Wasser oder einer wäßrigen Lösung gewaschen worden ist. Ferner kann ein Myzelhomogenat verwendet werden, das durch Aufbrechen der Myzelzellen gewonnen worden ist. Weitere Beispiele sind rohe oder gereinigte Enzyme, die gegebenenfalls an unlösliches Material gebunden sind, sowie extrazelluläres Enzym aus der Gärflüssigkeit oder entsprechende Enzympräparate. Ferner kann auch das Medium, in dem die Züchtung durchgeführt worden ist, im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden.

Die Substrate können in Form von Pulvern, Suspensionen, Lösungen in hydrophilen organischen Lösungsmitteln oder wäßrigen Lösungen eingesetzt werden. Vorzugsweise werden hydrophile organische Lösungsmittel, wie Alkohol, Aceton oder Glykol, verwendet. Die Lösungsmittel werden in Konzentrationen eingesetzt, die die gewünschte enzymatische Umsetzung nicht hemmen.

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Die Umsetzung wird in wäßriger Lösung durchgeführt. Vorzugsweise werden Lösungen in destilliertem Wasser, Pufferlösungen oder die nach der Züchtung erhaltenen Medien direkt eingesetzt. Die Durchführung der Umsetzung unter aeroben Bedingungen ist nicht wesentlich. Wenn die Mikroorganismen ß-Lactamase enthalten, können Penicilline zugesetzt werden, um die unerwünschte Aktivität zu hemmen. Vorzugsweise wird die Umsetzung etwa 5 bis etwa 50 Stunden bei pH-Werten von etwa 5 bis 8 und Temperaturen von etwa 20 bis etwa 4O⁰C unter Schütteln oder Rühren durchgeführt. Diese Bedingungen hängen von der Art der verwendeten Ausgangsmaterialien, den Konzentrationen, den verwendeten Mikroorganismen, der Art des Nährmediums und den Aufarbeitungsverfahren ab. Gegebenenfalls können Säuren, Basen oder Puffer zugesetzt werden, wenn sich der pH-Wert des Nährmediums während der Umsetzung in ungünstiger Weise verändert.. Die Konzentration des Ausgangsmaterials beträgt etwa 0,1 bis etwa 5 %, vorzugsweise höchstens 2 %,

Nach der Umsetzung wird das Myzel, das Myzelpräparat oder die unlöslichen Bestandteile aus dem Reaktionsgemisch beispielsweise durch Filtration, Zentrifugation, Adsorption und/oder Denaturierung abgetrennt. Die auf diese Weise gebildeten Produkte können nach verschiedenen Verfahren abgetrennt werden, beispielsweise durch Adsorption, fraktionierte Extraktion, Konzentration, Ablagerung und/oder Fällung. Eine Isolation und Reinigung kann nach üblichen Verfahren, beispielsweise durch Umkristallisieren, Adsorption, chromatographische Verfahren, lonenaustauschverfahren, Umfällung, Lyophilisation

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und Gegenstromverteilung, durchgeführt werden. Während des Aufarbeitens kann das Wasserstoffatom in der Carboxylgruppe durch andere Kationen unter Salzbildung ersetzt werden. Ferner kann auch an der Aminogruppe ein Salz gebildet werden, beispielsweise mit Mineralsäuren, Sulfonsäuren mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder anderen Säuren.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

100 ml eines Nährmediums, das aus einer wäßrigen Lösung vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 3,5 % Glucose, 2,0 % Pepton und 0,3 # Maisquellflüssigkeit besteht, wird mit Aphanocladium aranearum ATCC 20453 inoculiert. Das inoculierte Medium wird 3 Tage bei 28⁰C unter Schütteln gezüchtet. Die Gärflüssigkeit wird zur Gewinnung des Myzels durch ein Tuch filtriert. Nach Waschen mit entionisiertem Wasser wird das überschüssige Wasser abgepreßt.

Auf diese Weise erhält man etwa 9 g feuchtes Myzel, das in 100 ml entionisiertem Wasser mit einem Gehalt an 0,1 g 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure und 0,5 g D-a-Fhenylglycin-methylester-hydrochlorid suspendiert. Die Suspension wird mit einer wäßrigen 1 η Natriumcarbonatlösung auf den pH-Wert 6,0 eingestellt und 16 Stunden bei 30⁰C gerührt. Während dieser Zeit wird der pH-Wert auf 6,0 gehalten. Anschließend wird die Suspension zur Entfernung des Myzels abfiltriert und über Nacht bei O⁰C stehengelassen. Nach dem Ab-

L -J

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filtrieren von auskristallisiertem D-a-Phenylglycin wird das Piltrat mit 1 η Salzsäure auf den pH-Wert 4,0 eingestellt. Das erhaltene Präparat wird über eine mit einem Ionenaustauscherharz (Dowex 5OW χ 8) beschickte 60 ml-Säule, die mit 0,2 m Citronensäurepuffer vom pH-Wert 4,5 behandelt ist, gegeben. Die Säule wird mit 0,2 m Citronensäurepuffer gewaschen. Aus der ersten Fraktion erhält man eine geringe Menge an D-a-Phenylglycin-methylester und 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure. Die nächste antibiotisch aktive Fraktion wird mit 3 Gewichtsprozent Aktivkohle versetzt. Das Geraisch wird 30 Minuten gerührt und anschließend filtriert. Die Aktivkohle wird mit 50prozentigem Methanol eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird mit Methanol und Essigsäureäthylester behandelt. Man erhält 53 g Rohprodukt in Form eines Feststoffs,

Das weiße Pulver wird aus einer Mischung von Methanol und Essigsäureäthylester umkristallisiert. Man erhält 23,8 mg 7ß-(D-a-Phenylglycyl)-aminodesacetoxycephalosporansäure (Cefalexin) in Form des Monohydrats. F. 185 bis 190⁰C (Zersetzung);

IR-Spektrum ν 5^j⁰¹: 1763, 1690, 1590 cm"¹

Beispiel2

Gemäß Beispiel 1 werden 0,1 g 6-Aminopenicillansäure mit 0,5 g D-a-Phenylglycin-methylester-hydrochlorid unter Verwendung von Aphanocladiura aranearum ATCC 20453 umgesetzt. Nach dem Einstellen des pH-Werts des Reaktionsgemisches auf 6,0

^L 609848/1029 ^J

mit einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung wird das Produkt an Aktivkohle adsorbiert. Gemäß Beispiel 1 wird das Produkt von der Aktivkohle eluiert und umkristallisiert. Man erhält 3719 mg Natrium- 6ß- (D-a-phenylglycyl) -aminop enicillanat (Natrium-ampicillin).
F. 221 bis 226°C (Zersetzung);

IR-Spektrum ν JJ^j⁰¹: 1770, 1691, 1600 cm""¹ Beispiel 3

Gemäß Beispiel 1 werden 0,1 g 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure 16 Stunden bei 30⁰C und einem pH-Wert von 6,0 mit D-a-Phenylglycin-methylester-hydrochlorid unter Verwendung von Aphanocladium aranearum ATCC 20453 umgesetzt. Die mikrobiologische Papierscheibenbestimmung des Reaktionsgemisches unter Verwendung von Bacillus subtilus PCI-219, ergibt, daß 0,118 g (Ausbeute 72,8 % d. Th.) Cefalexin gebildet worden sind.

Beispiel 4

Gemäß Beispiel 1 werden 0,25 g 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure 23 Stunden bei 30⁰C und einem pH-¥ert von 6,0 mit D-a-Phenylglycin-hydrochlorid-methylester unter Verwendung von Aphanocladium aranearum ATCC 20453 umgesetzt. Im Reaktionsgemisch werden 0,292 g (Ausbeute 71,9 % d. Th.) Cefalexin gebildet, wie sich mikrobiologisch feststellen läßt.

Beispiel 5

Gemäß Beispiel 1 werden 0,3 g 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure 19 Stunden bei 30°C bei einem pH-Wert von 6,0 mit

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D-a-Phenylglycin-methylester-hydrochlorid unter Verwendung von Aphanocladium aranearum ATCC 20453 umgesetzt. Im Reaktionsgemisch bilden sich 0,338 g (Ausbeute 69,6 % d. Th.) Cefalexin, wie sich durch mikrobiologische Bestimmung feststellen läßt.

Beispiel 6

Gemäß Beispiel 1 wird 6-Aminopenicillansäure mit D-a-Phenylglycin-methylester-hydrochlorid unter den in folgender Tabelle angegebenen Bedingungen unter Verwendung von Aphanocladium aranearum ATCC 20453 umgesetzt. Das im Reaktionsgemisch gebildete Natriumsalz von Ampicillin wird mikrobiologisch bestimmt. Die Ausbeuteangaben sind ebenfalls in nachstehender Tabelle enthalten.

Menge an Substrat (g/dl)

6-APA¹ ' PGM² '

Umsetzungszeit (Std.)

Ampicillin-Ausbeute (g/dl) (%)

0,1 0,2 0,3

1,0 2,0 3,0

17 16 15

0,1304
0,2380
0,4460

75,9 69,3 86,6

(3O⁰C, pH-Wert 6,0)

1) 6-Aminopenicillansäure

2) D-a-Phenylglycin-methylester-hydrochlorid

Beispiel 7

Gemäß Beispiel 1 werden 0,1 g 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure 22 Stunden bei 30⁰C und einem pH-Wert von 6,0 mit D-α-(1,4-Cyclohexadienyl)-glycin-methylester-hydrochlorid unter Verwendung von Aphanocladium aranearum ATCC 20453 umge-

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setzt. Durch mikrobiologische Bestimmung lassen sich im Reaktionsgemisch -0,109 g (Ausbeute 67,3 % d. Th.) 7ß-D-a-(1,4-Cyclohexadienyl) -glycylaminodesace toxycephalosporansäure (Cephradin, R^: 0,35; berechnet als Cef alexin) nachweisen.

Beispiel 8

Gemäß Beispiel 7 werden 0,1 g 6-Aminopenicillansäure 22 Stunden bei 30°C und einem pH-Wert von 6,0 mit D-a-(1,4-Cyclohexadienyl)-glycin-methylester-hydrochlorid unter Verwendung von Aphanocladium aranearum ATCC 20453 umgesetzt. Im Reaktionsgemisch lassen sich durch mikrobiologische Bestimmung 0,064 g (Ausbeute 37,4 % d. Th. \ berechnet als Ampicillin) 6ß-D-a-(1,4-Cyclohexadienyl)-glycylaminopenicillansäure (Epicillin) nachweisen.

Beispiel 9

Gemäß Beispiel 1 werden 0,1 g 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure 18 Stunden bei 28°C mit den in nachstehender Tabelle angegebenen Aminosäurederivaten unter Verwendung von Aphanocladium aranearum ATCC 20453 umgesetzt. Dabei werden die entsprechenden 7ß- (a-Aminoacyl)-aminodesacetoxycephalosporansäure-Derivate gebildet. Die R_£ -Werte der jeweiligen Produkte bei DUnnschichtchromatographie an Kieselgel sind ebenfalls in nachstehender Tabelle angegeben. Als Laufmittel wird dabei ein Gemisch aus Essigsäureäthylester, Essigsäure und Wasser im Volumverhältnis von 3 J 1 J 1 verwendet.

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- 13 -

Als Ausgangsprodukte verwendete Amino	R^-Werte der Pro-
säurederivate	¹ dukte
DL-Methi onin-methylester	0,57
DL-Alanin-methylester
DL-Phenylalanin-methylester
DL-Serin-methylester	_r
DL-Tryptophan-methylester	0,39
DL-Valin-methylester
DL-ct-Aminobuttersäure-methylester
a-N-Benzoyl-DL-alanin-methylester	0,84
oc-N-Carbobenzoxy-D-phenylglycin-methyl- ester	0,53

Beispiel 10

Gemäß Beispiel 9 werden 0,1 g 6-Aminopenicillansäure 18 Stunden bei 28⁰C mit den in nachstehender Tabelle aufgeführten Aminosäurederivaten unter Verwendung von Aphanocladium aranearum ATCC 20453 umgesetzt. Man erhält die entsprechenden eß-Ca-AminoacylJ-aminopenicillansäure-Derivate. Die R^-Werte der Produkte bei Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus n-Butanol, Äthanol und Wasser im Volumverhältnis von 4 : 1 : 1 und die mikrobiologisch bestimmten Ausbeuten sind ebenfalls in nachstehender Tabelle angegeben.

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Als Ausgangsprodukte eingesetzte Aminosäurederivate	Ausbeute (y/ml) berechnet als Ampicillin	Rx.-Werte ^xder Produkte
DL-Methionin-methylester	13	0,27
DL-Alanin-methylester	31
DL-Phenylalanin-methylester	+
DL-Serin-methylester	25	0,32
DL-Tryptophan-methylester	16
DL-Valin-methylester	36
DL-a-Arainobuttersäure-methylester	63	0,13
a-N-Benzoyl-DL-alanin-methylester	108	0,35
a-N-Carbobenzoxy-D-phenylglycin- methylester	22	0_:48

Beispiel 11

Gemäß Beispiel 1 werden 0,1 g 6-Aminopenicillansäure 23 Stunden bei 30⁰C und einem pH-Wert von 6,0 mit 1 g D-α-(p-Hydroxyphenyl)-glycin-methylester-hydr ο chlor id unter Verwendung von Aphanocladium aranearum ATCC 20453 umgesetzt. Bei der Dünnschichtchromatographie des Reaktionsgemisches erhält man einen Flecken, der 6ß-D-a-(p-Hydroxyphenyl)-glycinamidopenicillansäure (Amoxycillin) entspricht.

Beispiel 12

Das Myzel von Aphanocladium aranearum ATCC 20453 wird unter Verwendung von 1,5 Gewichtsteilen Aluminiumoxid homogenisiert, mit 1/15 m-Phosphatpuffer vom pH-Y/ert 5,0, 6,0 bzw. 7,0 verdünnt und zentrifugiert. Sodann wird der Überstand bis zu einer Konzentration von 60 % mit Ammoniumsulfat versetzt. Dabei ergibt sich eine Aussalzung der Enzymfraktion. Der Nie-

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_i

derschlag wird in der vorerwähnten Pufferlösung gelöst und über Nacht dialysiert. Man erhält eine rohe Enzymlösung. Dieses Verfahren wird bei Temperaturen von 0 bis 4°C durchgeführt.

1 ml der Enzymlösung wird bei 37⁰C zur Umsetzung von 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure mit D-a-Phenylglycin-methylesterhydrochlorid verwendet. Die Menge des im Reakti ons gemisch gebildeten Cefalexins (mikrobiologisch bestimmt) ist in nachstehender Tabelle angegeben.

Menge an Substrat (mg/ml)	2)	Konzentration des Enzym proteins {mg/ml)	pH-Wert ies Mediums	Ausbeute an Cefalexin (y/ml)	3 Std.
7-adcaI)	2,5 2,5 2,5 . 5,0 7,5 2,5 5,0	5,0 5,0 5,0 5,0 2,0 2,0 2,0	5,0 6,0 7,0 7,0 6,0 6,0 6,0	1 Std.	69 500 145 170 643 282 429
1,0 1,0 1,0 1,0 3,0 1,0 1,0	82 316 177 180 393 205 247

1) 7-Aminodesacetoxycepnalosporansäure

Z) Dra-Phenylglycin-aethylester-hydrochlorid.

Beispiel 13

1 ml der gemäß Beispiel. 12 erhaltenen rohen Enzymlösung wird bei 37°C zur Umsetzung von 6-Aminopenicillansäure und D-a-Phenylglycin-methylester-hydrochlorid verwendet. Die Menge des im Reaktionsgemisch gebildeten Ampicillins wird mikrobiologisch bestimmt. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle zusammengestellt.

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ι Menge an Substrat	PGM² ^	Konzentration	pH-Wert	Ausbeute	an	3 Std.
(ms/ml)	2,5	des Enzym	des	Ampicillin (y/ml)	126
6-APA^1;	2,5	proteins (ms/ml)	Mediums	1 Std.	540
1,0	2,5	5,0	5,0	126	255
1,0	5,0	5,0	6,0	465	221
1,0	2,5	5,0	7,0	224	264
1,0	7,5	5,0	7,0	210	1370
0,5	2,5	2,0	6,0	191	475
3,0	5,0	2,0	6,0	890	695
1,0	2,0	6,0	300
1,0	2,0	6,0	379

1) 6-Aminopenicillansäure

2) D-a-Phenylglycin-methylester-hydrochlorid

Beispiel 14

Gemäß Beispiel 1 werden 0,25 g 7-Aminocephalosporansäure 23 Stunden bei 30⁰C und einem pH-Wert von 6,0 mit 2,5 g D-a-Phenylglycin-methylester-hydrochlorid unter Verwendung von Aphanocladium aranearum ATCC 20453 umgesetzt. Dünnschicht chromatographisch lassen sich Flecken von Cephaloglycin und Desacetylcephaloglycin nachweisen. Die mikrobiologisch bestimmte Ausbeute an Cephaloglycin beträgt 0,072 g.

Beispiel 15

100 ml eines sterilisierten Mediums, das aus einer wäßrigen Lösung vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 3,5 % Glucose, 2,0 % Pepton und 0,3 % Maisquellflüssigkeit besteht, wird mit Cephalosporin coremioides IFO-8579 inoculiert und 3 Tage bei 28°C unter Schütteln gezüchtet. Die Gärbrühe wird zur Ge-

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winnung des Myzels zentrifugiert. Das Myzel wird mit entionisiertera Wasser gewaschen.

Das auf diese Weise erhaltene feuchte Myzel wird in I/30
Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0, der 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure und 0,4 g D-a-Phenylglycin-methylester-hydrochlorid enthält, 24 Stunden bei 28⁰C suspendiert. Die mikrobiologisch bestimmte Menge an Cephalexin im Reaktionsgemisch beträgt 0,095 g.

Beispiel 16

Gemäß Beispiel 15 wird 6-Aminopenicillansäure mit D-a-Phenylglycin-methylester-hydrochlorid unter Verwendung des gemäß
Beispiel 15 erhaltenen Myzels umgesetzt. Die mikrobiologisch bestimmte Ausbeute an Ampicillin beträgt 0,08 g.

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Claims

- 18 Patentansprüche

t )
1/ Verfahren zur Herstellung von Penicillin- und Cephalosporin-Derivaten der allgemeinen Formeln I, II oder III

RCNH.

S^ CH

—τ r^cH

___JL_J

COOM

(D

(HI)

COOM

Il

wobei der Rest RC- einen von einer α-Aminosäure, einem N-Ammoniumsalz einer α-Aminosäure oder einer N-(C^-C^^) aminosäure abgeleiteten Acylrest und der Rest -COOM eine Carboxyl- oder Carboxylatsalzgruppe bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Aminoverbindung aus der Gruppe 6-Aminopenicillansäure, 7-Aminocephalosporansäure, 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure und deren Salzen mit einem Ester der allgemeinen Formel

Il A

RCOR 0

It A

in der der Rest RC- die vorstehende Bedeutung hat und R einen C^Q-Alkylrest bedeutet, enzymatisch in Gegenwart von Myzel oder eines Myzelpräparats eines Mikroorganismus der Gattung Aphanocladium oder Cephalosporium acyliert.

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r ""
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Amine in Form ihrer Alkalimetallsalze verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Ester einsetzt, der sich von einer Aminosäure aus der Gruppe Glycin, Phenylglycin, Cyclohexadienylglycin, Cyclohexylglycin, Thienylglycin, Furylglycin, Hydroxyphenylglycin, Chlorphenylglycin, Cyanophenylglycin, Alanin, Phenylalanin, Methionin, Serin, Tryptophan, Valin, Leucin, Threonin, Asparagin, Lysin, a-Aminobuttersäure und deren N-Benzoyl- oder N-Carbobenzoxyderivaten ableitet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Ester verwendet, der sich von einer α-Aminosäure aus der Gruppe D-a-Phenylglycin, D-a-(1,4-Cyclohexadienyl)-glycin, D-α-(p-Hydroxyphenyl)-glycin, D-a-(2-Thienyl)-glycin und D-α-(3-Thienyl)-glycin ableitet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen C₁ c-Alkylester eines Salzes mit einer Mineralsäure einer α-Aminosäure verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Aphanocladium aranearum (Petch) Garns., ATCC 20453 verwendet.

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7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Cephalosporium coremioides Raillo. IFO-8579 verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Myzelpräparat gewaschenes Myzel verwendet.
9· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Myzelpräparat rohes oder gereinigtes Enzym verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in einem pH-Bereich von 5,0 bis 8,0 durchführt.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Ampicillin, Epicillin, Amoxycillin, Cefalexin, Cefradin oder Cefaloglycin oder deren Salze herstellt.

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