DE2216113C2

DE2216113C2 - Verfahren zur Herstellung von Cephalosporinen

Info

Publication number: DE2216113C2
Application number: DE2216113A
Authority: DE
Inventors: Masao Hyogo Isono; Koichi Kobe Kato; Takeshi Takahashi; Yoshio Osaka Yamazaki
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1971-04-02
Filing date: 1972-04-01
Publication date: 1985-05-15
Also published as: FR2132271B1; AU4063072A; JPS5548797B1; AT321460B; GB1385943A; US3816253A; NL7204410A; FR2132271A1; DE2216113A1; SE409457B; AU467202B2; CH592099A5; HU167968B; BE781552A; CA992899A

Description

COOH

in der R ein sechsgliedriger cyclischer Kohlenwasserstoffrest oder ein Thienyl- oder Furylrest ist, wobei die Ringe Hydroxylgruppen, Halogenatome, Alkylreste, Alkoxyreste, Carboxylgruppen, Mercaptogruppen, Cyangruppen, Nitrogruppen, Sulfogruppen, Aminogruppen, Sulfaminogruppen und CarboxyaSkylreste enthalten können und R' für ein Wasserstoffatom oder einen organischen Rest aus der Gruppe Alkoxyreste, Alkylcarbonyloxygruppen, Pyridylthio, Pyridinogruppen, l-Oxidopyrid-2-ylthio, Methylthiocarboxy, Dime-

thyldithiocarbamyi, Trimethyiamino, Azido und Benzyioxicarbonylarnino steht, derrnitdcrnMcthylsrikoh·' lenstoffatom über ein Sauerstoffatom, Schwefelatom oder Stickstoffatom verbunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß man eine e-substituierte ar-Ammosäure der Formel

NH₂

I

R —CH-COOH (ID

in der R die oben genannte Bedeutung hat, oder ein übliches reaktionsfähiges Derivat an ihrer Carboxylkomponente, das a-substituierte-a-Aminosäure (II) ergibt, wenn es in einem wäßrigen Medium mit den nachstehenden Mikroorganismen hydrolysiert wird und eine 7-Aminocephemverbindung der Formel

H₃N-CH-CH CH₂

III

O = C N CCH₂-R' (HD

\ f

•Ό COOH

in der R' die oben genannte Bedeutung hat, der enzymatischen Einwirkung eines Mikroorganismus aus der Gruppe

Mycoplana dimorpha lFO-13213. IFO-13240, „=

Mycoplana bullata IFO-13267, |

Protaminobacter alboflavus IFO-13221. und
Acetobacter sp. IFO-13209 unterwirft,

wobei die Konzentration der 7-Aminocephemverbindung 'm wäßrigen Medium im Bereich von 0,1 bis 10%

(Gewicht/Volumen) und die Konzentration der a-substituierten ar-Am-nosäure oder ihres reaktionsfähigen Derivats im Bereich von 0,1 bis 20% (Gew./Vol.) liegt und bei einer Temperatur von 5 bis 5O⁰C und einem pH-Wert von 4 bis 8 gearbeitet wird.

Die Erfindung betrifft ein neues, großtechnisch vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von Cephalosporinen, wie es durch den Anspruch gekennzeichnet ist,

Bisher erfolgte die Herstellung von Cephalosporinen durch die Kondensationsieaktion zwischen σ-substituierten α-Aminosäuren und 7-Aminocephemverbindungen mit Hilfe chemischer Reaktionen. Bei diesen

bekannten Verfahren ist es jedoch zur Vermeidung unerwünschter Nebenreaktionen erforderlich, entweder die |

Aminogruppe der Aminosäuren vorher zu schützen oder sie vorher in ein Radikal, z. B. die Azidgruppe (N₃) |

umzuwandeln, die wieder in eine Aminogruppe umgewandelt werden kann. Es ist somit nach der Kondensa- I

tionsreaktion notwendig, entweder die Schutzgruppe von der Aminogruppe zu entfernen oder das Radikal wie- |

der in eine Aminogruppe umzuwandein. Diese Nebenstufen des Verfahrens müssen unter milden Bedingungen |

durchgeführt werden, um keine anderen Komponenten als die an diesen Reaktionen beteiligten zu beeinflussen, |

insbesondere um nicht den Cephemkern oder die Säureamidbindung in der Seitenkette an ihrer 7-Stellung |

2 i

abzuspalten. Diese Nebenstufen des Verfahrens führen zwangsläufig zu einer Verschlechterung der Ausbeute an gewünschten Cephalosporine^

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die Herstellung der Cephalosporine (I) aus den Verbindungen IJ und III auch mittels bestimmter Mikroorganismen möglich ist.

In der vorstehenden Formel (I) ist R ein sechsgliedriger cyclischer KohlenwasserstolTrest oder Thicnyl- udcr > Furylrest. Geeignet als sechsgliedrige cyclische Kohlenwasserstoffreste sind beispielsweise Phenylresic, Cyclohexenylreste (z. B. I-Cyclohexenyl, 2-Cyclohexenyl und 3-Cyclohexenyl), Cyclohexadienylreste (z. B. 1,3-Cyclohexadisnyl, 1,4-Cyclohexadienyl, 1,5-Cyclohexadienyl und 2,5-Cyclohexadienyl) und Cyclohexylreste. Alle diese Kohlenwasserstoffreste und Heterocyclen können einen oder mehrere Substituenten am Ring enthalten. Beispielsweise kommen die folgenden Substituenten in Frage: Hydroxylgruppen, Halogenatome (z. B. Brom und Chlor), Alkylreste (z. B. Methyl, Äthyl, Isopropyl und Octyl), Allyl, Alkoxyreste (z. B. Methoxy, Äthoxy, Isopropoxy und Hexoxy), Allyloxy, Carboxylgruppen, Mercaptogruppen, Cyangruppei, Nitrogruppen, Sulfogruppen, Aminogruppen, Sulfaminogruppen und Carboxyalkylreste (z. B. Carboxymethyl und Carboxyäthyl). In der Formel (I) steht R' für ein Wasserstoffatom oder einen organischen Rest, der mit dem Methylenkohlenstoffatom in der 3-Stellung über ein Sauerstoffatom, Schwefelatom oder Stickstoffatom verbunden ist. Als Beispiele organischer Reste sind zu nennen: Alkoxyreste (z. B. Methoxy, Äthoxy, Isopropoxy und Hexoxy), Alkoxycarbonylgruppen (z. B. Methoxycarbonyl, Äthoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl und Hexoxycarbonyl), Pyndylreste (2-Pyridy! und 3-Pyridyl), Pyridiniogruppen

(z.B. —N > oder — N >—CONH₂),

l-Oxidopyrid-2-yl-thio, Methylthiocarboxy, Dimetbyldithiocarbamyl, Trimethylamino, Azido, Benzyloxycarbonylamino, Allyloxy und Allyloxycarbonyl.

In der Formel (II) steht R für einen der obengenannten Kohlenwasserstoffreste od.er Heterocyclen. Beispiele geeigneter α-substituierter α-Aminosäuren (II) sind Phenylglycin, Cyclohexadienylgiycin, Cyclohexenylglycin, Cyclohexylglycin, 2-Thienylglycin, 2-Furylgiycin, p-Hydroxyphenylglycin, p-Mercaptophenylglycin, p-Carboxyphenylglycin, p-Sulfophenylglycin, p-Aminophenylglycin, m-Aminophenylglycin, p-Nitrophenylglycin, p-Chlorphenylglycin. o-Chlorphenylglycin, p-Bromphenylglycin, p-Methylphenylg'ycin, p-Äthylphenylglycin, p-Methoxyphenylglyun, p-Cyanphenylglycin, m-Cyanophenylglycin und p-Sulfaminophenylglycin. Die a-substituierten α-Aminosäuren (II) -nit 2 ο ^lsr mehr gleichen oder verschiedenen Substituenten an ihren Ringen sind ebenfalls geeignet. Als Substitnenten an den Ringen kommen in diesem Fall beliebige Kombinationen der vorstehend genannten verschiedenen Sv stituenten in Frage. Unter diesen α-substituierten «-Aminosäuren (II) befinden sich einige neue Verbindungen, jedoch können sie leicht beispielsweise durch die Strecker-Reaktion aus Aldehyden, die die entsprechenden Reste R enthalten, hergestellt werden.

Als reaktionsfähige Derivate dieser α-substituierten α-Aminosäuren (II) eignen sich beliebige an ihrer Carboxylkomponente substituierte Derivate, die die α-substituierten α-Aminosäuren (II) ergeben, wenn sie in einem wäßrigen Medium durch die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen hydrolysiert werden. Als typische Beispiele der reaktionsfähigen Derivate sind zu nennen: Alkylester (z. B. Methylester, Äthylester, Isopropylester und Octylester), Aralkylester (z. B. Benzylester und Phenyläthylester), Thioester (z. B. Thioglykol- -to ester). Amide und Dipeptide dieser a-subtituierten Aminosäuren mit einer anderen Aminosäure (z. B. N-[Phenylglycyl]-glycin). Die α-substituierte α-Aminosäure (II) und ihre reaktionsfähigen Derivate werden nachstehend mit dem Sammelbegriff »α-substituierte a-Aminosäureverbindungen« bezeichnet.

Die α-substituierten α-Aminosäureverbindungen können als optische Isomere vorliegen. Vom Standpunkt der antibakteriellen Wirksamkeit der hergestellten Cephalosporine (I) ist es zweckmäßig, die D-Formen oder DL-Formen bezüglich des a-Kohlenstoffatoms dieser Verbindungen zu verwenden.

Die α-substituierten σ-Aminosäureverbindungen können als freie Säuren oder a Js Salze, z. B. als Hydrochlorid, Natriumsalz oder Kaliumsalz, verwendet v/erden.

In der Formel (III) ist R' ein Wasserstoffatom oder einer der oben genannten organischen Re₅Ie. Als typische Beispiele von 7-Aminocephemverbindungen (III) sind zu nennen:

7-Aminocephalosporansäure,

y-AminoO-deacetoxycephalosporansäure, T-'VminoO-methoxymethylO-cephem-'J-carbonsäure,

7-Amino-3-(l-oxidopyrid-2-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure,

N-(7-Amino-3-cephem-3-ylmethyl)pyridinium-4-carboxylat,

N-(7-Amino-3-cephem-3-y !methyl )-4-carboxamidopyridinium-4-carboxylat,

7-Amino-3-rnethylthiocarboxymethyl-3-c<:phem-4-carbonsäure, 7-Afnino-3-tfimethylaminomethyl'3.cephsm4-carbonsäure,

7-Amino-3-dimethyldίthiocarbamylmethyl-3-cephern-4-carbonsäuΓe,

7-Amino-3-azidomethyl-3-cephem-4-carbonsäure und

7-Amino-3-benzyloxycarbonylaminomethyl-3-cephem-4-carbonsäure.

Diese 7-Aminocephemverbindungen sind bekannt und können nach bekannten Verfahren hergestellt werden, z. B. nach den Verfahren, die in »Advances in Applied Microbiology« 13 (1970), Seite 163 bis 236, herausgegeben von Academic Press, Inc., New York und London, beschrieben werden. Alle diese 7-Aminocephemverbindungen (III) können in Form der freien Säure oder als Salz, z. B. als Hydrochlorid, Natrium- oder Kaliumsalz, verwendet werden.

Erfindungsgemäß werden folgende aus der Natur isolierte Stämme verwendet: Mycoplana dimorpha IFO-13213, IFO-13240, Mycoplana bullata IFO-13267, Protaminobacter alborflavus IFO-13221 und Acetobacter sp. IFO-13209.

Die Kultivierung der Mikroorganismen kann unter Belüftung und Bewegung, unter Schütteln oder ohne Bewegung durchgeführt werden. Im allgemeinen ist die Kultivierung unter aeroben Bedingungen vorteilhaft. Geeignet sind Nährmedien, die Fleischextrakt, Hefeextrakt, Pepton, Caseinhydrolysate, Maisquellv/asser allein oder in Kombination und andere natürliche Substanzen enthalten, die im allgemeinen für die Kultivierung verwendst werden. Diese Medien können wahlweise durch Kohlenstoffquellen, z. B. Zucker, organische Säuren, η-Paraffine, anorganische oder organische Stickstoffverbindungen, die Aminostickstoff und/oder Nitratstickstoff enthalten, Phosphate, Mangansalze, Natriumchlorid, andere ionische Metalle und/oder Vitamine ergänzt werden. Diese Medien werden vorzugsweise auf einen p_H-Wert von 6 bis 8 eingestellt. Vorteilhaft sind Kultivierungstemperaturen von 20° bis 40⁰C, insbesondere von 28° bis 37°C. Die Kultivierungszeit variiert mit der Fermentationsvorrichtung, der Zusammensetzung des Nährmediums und der Kultivierungstemperatur, jedoch ist es zweckmäßig, die Kultivierung zwischen der spaten Stufe der logarithmischen Wachstumsphase und der frühen Stufe der stationären Phase zu dem Zeitpunkt abzubrechen, zu dem die Aktivität zur Bildung der Cephalosporine das Maximum erreicht. Im allgemeinen werden mit einer Kultivierungsdauer von 8 bis 30 Stunden gute Ergebnisse erhalten.

Die in dieser Weise erhaltenen Fermentationsmedien oder ihre verarbeiteten Materialien eignen sich für die enzymatische Synthese der Cephalosporine (I) beim Verfahren gemäß der Erfindung. Der hier gebrauchte Ausdruck »verarbeitete Materialien der Ferrnentationsmedien« bezeichnet alle Materialien, die «· nalten werden, wenn die Fermentationsmedien einer oder -.iehreren geeigneten Behandlungen unterworfen werden, durch die die Aktivität für die Bildung von Cephalosporin gesteigert und die Fermentationsmedien in eine für die enzymatische Reaktion vorteilhafte Form überführt werden. Wenn beispielsweise die Aktivität zur Synthetisierung der Cephalosporine intrazellulär vorliegt, sind beispielsweise die folgenden verarbeiteten Materialien geeignet:

Die vom Fermentationsmedium abgetrennten Zellen, der zellenfreie Extrakt, der durch Behandlung der Zellen nach einem bekannten Verfahren erhältlich ist, ein teilweise oder vollständig gereinigtes Enzympräparat, das die Cephalosporine zu bilden vermag und durch eine in bekannter Weise durchgeführte Reinigung des zellenfreien Extrakts erhältlich ist, und das durch Kombination des teilweise oder vollständig gereinigten Enzyms zu einer wasserunlöslichen, hochmolekularen Substanz auf physikalischem oder chemischem Wege erhaltene Material, das die Cephalosporine zu bilden vermag. Wenn die Aktivität zur Synthetisierung der Cephalosporine extrazellulär vorliegt, kommen als verarbeitete Materialien beispielsweise die überstehende Flüssigkeit, die durch Entfernung der Zellen vom Fermentationsmedium erhältlich ist, das teilweise oder vollständig gereinigte Enzym, das die Aktivität zur Synthetisierung der Cephalosporine besitzt und durch Behandlung der überstehenden Flüssigkeit nach einem bekannten Enzymreinigungsverfahren erhältlich ist, und das die Aktivität zurSynthetisierung von Cephalosporinen aufweisende Material, das durch Kombination des teilweise oder vollständig gereinigten Enzyms zu einer wasserunlöslichen hochmolekularen Substanz auf physikalischem oder chemischem Wege erhältlich ist, in Frage.

Die Kondensationsreaktion zwischen der a-substituierten or-Aminosäureverbindung und der 7-Aminocephemverbindung zur Bildung eines entsprechenden Cephalosporins (I) verläuft glatt durch Zusammenführen dieser beiden Verbindungen mit dem oben genannten Fermeiitationsmedium oder seinem verarbeiteten Material in einem wäßrigen Medium. Unter dem hier gebrauchten Ausdruck »wäßriges Medium« ist ein hauptsächlich aus Wasser bestehendes Medium zu verstehen. Das wäßrige Medium kann somit ein mit W?sser mischbares organisches Lösungsmittel, z. B. einen niederen Alkohol, beispielsweise Methanol, Äthanol oder Isopropanol oder Aceton enthalten. Die Konzentration dieses organischen Lösungsmittels beträgt vorzugsweise wenigsr als etwa 40 Vcl.-%, insbesondere weniger als etwa 20 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen des endgültigen Mediums. Es ist im allgemeinen zweckmäßig, das wäßrige Medium auf einen p_H-Wert von etwa 4 bis 8, vorzugsweise etwa 5 bis 7 einzustellen. Die Reaktionszeit ist verschieden in Abhängigkeit von der Subtratkonzentration, dem Grad der Aktivität des Fermentationsmediums oder des verwendeten verarbeiteten Materials zur Synthetisierung der Cephalosporine und der Reaktionstemperatur, jedoch liegt sie im allgemeinen im Bereich von etwa 10 bis 300 Minuten. Die Reaktionstemperatur liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 5° bis 50⁰C. Besonders bevorzugt wird eine Temperatur von etwa 20° bis 40⁰C. Die Substratkonzentration wird hauptsächlich in Abhängigkeit vom Grad der Aktivität für die Synthetisierung der Cephalosporine gewählt. Im allgemeinen liegt die Konzentration der 7-Aminocephemverbindung (III) im Bereich vn etwa 0,1 bis 10% (Gew./Vol.), bezogen auf das gesamte wäßrige Medium, während die Konzentration der a-substituie-*en α-Aminosäureverblndung «us einem Bereich von etwa 0,1 bis 20% (Gew./Vol.) gewählt wird. Vorteilhaft wird die a-substituierte cr-Aminosäureverbindung in einer wenigstens äquimolaren Konzentration von zweckmäßig nicht weniger als 2 Mol, bezogen auf die verwendete 7-Aminr.cephemverbindung, verwendet.

Wenn ein wasserunlösliches verarbeitetes Material des Fermentationsr.iediums verwendet wird, kann die Reaktion in Suspension durchgerührt werden, oder man kann eine wäßrige Lösung, die die σ-substituierte a-Aminosäureverbindung und die 7-Aminocephemverbindung (III) enthält, durch eine Kolonne führen, die mit dem in Wasser unlöslichen Material, das die Aktivität zur Synthctisicrung der Cephalosporine aufweist, gefüllt ist.

Bei der vorstehend beschriebenen enzymatischen Reaktion wird das Cephalosporin (I) im Reaktionsgemisch gebildet. Wenn dia »-substituierte »-Aminosäureverbindung in der DL-Form Verwendet wird, ist im allgemeinen die Neigung festzustellen, daß die D-Form der »-substituierten a-Aminosäureverbindung überwiegend in das Cephalosporin (1) eingeführt wird. Die Bezeichnung der Cephalosporine (I) als D- oder L-Cephalosporin bedeutet die D-Form bzw. L-Form in bezug auf das »-Kohlenstoffatom in der Seitenkette an der 7-Stellung dieser Verbindungen (1).

Das in der beschriebenen Weise gebildete Cephalosporin (I) läßt sich nach bekannten Verfahren aus dem Reaktionsgemisch isolieren und unter milden Bedingungen reinigen, z. B. durch Chromatographie oder mit Hilfe einer organischen Säure, die ein wasserunlösliches Salz mit dem Cephalosporin (I) zu bilden vermag. Unter den in der beschriebenen Weise hergestellten Cephalosporinen (I) befinden sich einige neue Verbindungen. Hierbei handelt es sich um die Cephalosporine, in deren Formel (I) der Rest Rein Cyclohexenylrest (1-Cyclohexenyl, 2-Cyclohexenyl oder 3-CycIohexenyl) ist, z. B. 7-(a"Amino-r-cyclohexenyl-acetamido)-3-deacetoxy-cephalosporansiiurc, 7-(ir-Amino-r-cyclohexcnyl-acctamido)-cephalosponmsiiurc und 7-(«-Amino-Γ-cydohexcnylacclamido)-3-melhoxymclhyl-3-ccphcm-4-carbonsäuro. Diese neuen Cephalosporine zeichnen sich durch ihre ausgezeichnete antibakterielle Wirkung sowie ihre Stabilität aus.

Die Cephalosporine (I) haben eine starke antibakterielle Wirkung gegen grampositive Bakterien und gramnegative Bakterien. Sie werden bei oraler Verabreichung leicht vom Dünndarm resorbiert. Sie durchdringen bei parenteraler Verabreichung schnell die Gewebe und haben eine gute Affinität zu den Geweben. Die Cephalosporine (I) sind daher wertvolle antibakterielle Mittel.

Die Cephalosporine (I) sowie ihre pharmazeutisch unbedenklichen Säureadditionssalze (z. B. die Natrium- und Kaliumsalze) sowie ihre Hydrate können oral oder parenteral als solche oder in geeigneten Formen, z. B. als Pulver, Granulat, Tabletten oder Injektionslösungen in Mischung mit pharmazeutisch unbedenklichen Trägern, Verdünnungsmitteln oder Adjuvantien verabreicht werden. Sie sind wirksam gegen fast die gleichen Krankheiten, die durch a-Aminobenzylpenicillin geheilt werden können, sowie gegen Krankheiten, die durch Escherichia coli verursacht werden.

Die zu verabreichende Dosis der Verbindungen (I) ist verschieden in Abhängigkeit von der Art der Verbindung und der Schwere der Krankheit, jedoch liegt sie im allgemeinen im Bereich von 5 bis 500 mg, vorzugsweise 10 bis 200 mg/kg/Tag.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden in den folgenden Beispielen beschrieben. Unter der Überschrift »Versuche« werden die typischen Verfahren zur Herstellung des l-Cyclohexenylglycinmethylesters, einer neuen Verbindung, die als eine der in den Beispielen verwendeten σ-substituierten ar-Aminosäureverbindungen verwendet wird, beschrieben.

In den Beispielen beziehen sich die Prozentsätze auf Gewicht/Volumen, d. h. sie bedeuten g/dl, falls nicht anders angegeben.

In allen Beispielen wurden die Aufnahme des Bioautogramms sowie der Biotest der hergestellten Cephalosporine nach der für Cephalosporine üblichen Methode unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 durchgeführt, wie in »Journal of Bacteriology« 50, 701-709 (1945) beschrieben. Der Enzymtest der hergestellten Cephalosporine wurde durchgeführt, indem das Reaktionsgemisch, das das gewünschte Cephalosporin enthielt, der Einwirkung der durch Aerobacter cloaceae gebildeten jß-Lactamase ausgesetzt (dieses Enzym spaltet das Lactam von Cephalosporinen (I), vermag jedoch nicht das Lactam der eingesetzten 7-Aminocephemverbindungen zu spalten) und der Unterschied zwischen den Extinktionswerten bei 260 m.u vor und nach der Enzymbehandlung bestimmt wurde.

Die bei den in den Beispielen beschriebenen Versuchen verwendeten Medien I bis IV hatten die folgende Zusammensetzung:

Medium I:	Ph 7.0	0,8%
Nährmedium »Bacto-Nutrient I		1,0%
		0,5%
iroth«, dehydratisiert
(im Handel erhältlich, Hersteller Difco
Laboratories, USA)		0,5%
Glucose		0,3%
NaCl		0,2%
	Ph 7,3	0,05%
Medium II:		0,05%
Mononatriumglutamat		0,1%
Phenylessigsäure
Harnstoff
Kaliumdihydrogenphosphat		0,2%
Dikaliumhydrogenphosphat		0,2%
MgSO₄ · 7H₂O		0,5%
		0,2%
Medium III:		0.1%
Mononatriumglutamat		0,01%
Hefeextrakt		2,0%
Pepton
Dikaliumhydrogenphosphat
Magnesiumchlorid
FeSO₄ ■ 7H₂O
Saccharose

40 45

55 60 65

PH 7,2

Medium IV: |

Fleischextraki 1,0% |

Pepton 1,0%

NaCl 0,5%

P₁₁ 7,0

Versuche
Herstellung von DL-l-Cyclohexenylglycin \

Eine Lösung von 4,4 g 1 -Cyclohexen-1 -aldehyd in 8 g Methanol wird zu einer Lösung von 2 g Natriumcyanid und 2,36 g Ammoniumchlorid in 8 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf 20 ml Wasser zugesetzt werden. Die erhaltene Aminonitrilverbindung wird mit 20 ml Benzol extrahiert. Die Benzolschicht wird dreimal mit je 10 ml 6n-Salzsäure extrahiert. Die wäßrige Schicht wird

2 Stunden am Rückfluß erhitzt. Das harzartige Material wird mit Aktivkohle entfernt. Das Filtrat wird auf etwa m 15 ml eingeengt und mit konzentriertem wäßrigem Ammoniak (28%ig) auf einen p_H-Wert von etwa 5,0 einge- |

stellt, wobei sich rohe Kristalle von DL-l-Cyclohexenylglycin abscheiden. Die Kristalle werden abfiltriert und in §

einer wäßrigen 1 n-Natriumhydroxydlösung gelöst. Zur Lösung wird Aktivkohle gegeben. Das Gemisch wird filtriert. Dem Fiitrat wird Äthanoi in einer dem halben Volumen des Fiitrats entsprechenden Menge zugeseUi. Das Gemisch wird gekocht und mit Salzsäure auf einen p_H-Wert von etwa 5,0 eingestellt, wobei 1,1g DL-I-Cyclohexenylglycin in Form von farblosen Flocken vom Schmelzpunkt 242 bis 243⁰C erhalten werden.

Infrarotspektrum (KBr, cm '): 3160, 2960, 1605, 1490, 1400, 1345, 1274, 1145, 720. '

NMR (Lösungsmittel: In-NaOD):

1,5 - 2,4 (Multiplett, 8H)

3,81 (Singlett, IH, -CH - COOH) I

5,84 (Multiplen, IH,-CH = C-) I

Herstellung von DL-l-Cyclohexenylglycinmethylester ***

10 g DL-l-Cyclohexenylglycin werden in 100 ml Methanol suspendiert. Während die erhaltene Suspension auf etwa - 15⁰C gekühlt wird, werden 80 g Thionylchlorid zugetropft. Nach erfolgtem Zusatz wird das Gemisch

3 Tage bei 4°C stehen gelassen. Es wird dann unter vermindertem Druck eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird aus 20 ml eines Gemisches von Methanol und Diäthyläther (Volumenverhältnis 1:1) kristallisiert, wobei etwa 10 g DL-l-Cyclohexenylglycinmethylester erhalten werden.

NMR {in D₂O), «5{rnmp>: i,7^B (4 Protonen an den C-4- und C-S-KchienstciTatcmeri des Ringes), 2,Q5^B (4 Protonen an den C-2- und C-6-Kohlenstoffatomen des Ringes), 3.92^s (3 Protonen des Methylrestes), 4,64^s (I Proton am ff-Kohlenstoffatom), 6,21^B (1 Proton am olefinischen Kohlenstoffatom des Ringes).

S- Singlett; B = breit

Herstellung von D-l-Cyclohexenylglycinmethylester

Zu einer mit 2n-Natriumhydroxyd auf P₁₁7,2 eingestellten Lösung von 10 g DL-l-Cyclohexenylglycinmethylesterhydrochlorid in 1000 ml Wasser wird 1 g handelsübliches Chymotrypsin (»^-Chymotrypsin«) Chymotrypsin-Aktivität 50 Einheiten/mg) gegeben. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 23⁰C bebrütet, wobei der pn-Wert durch Zusatz von ln-Natriumhydroxyd bei 7,2 gehalten wird.

Nach Einstellung auf p_H 8,0 durch Zusatz von 5n-Natriumhydroxyd wird das Reaktionsgemisch fünfmal mit je

1300 ml Diäthyläther extrahiert. Die erhaltene Diäthylätherschicht wird bei 25°C unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei ein brauner öliger Rückstand erhalten wird. Zu diesem Rückstand werden 100 ml Methanol, das mit HCl gesättigt ist, gegeben. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck eingeengt. Dem erhaltenen Rückstand werden 30 ml Diäthyläther zugetropft. Das Gemisch wird eingeengt, wobei 3,5 ml D-I-

Cyclohexenylglycinmethylester erhalten werden. Dieser Ester hat eine spezifische Drehung von [cß^J = -115° (C = 0,5,0,In-HCl). Sein kernmagnetisches Resonanzspektrum ist identisch mit dem des DL-l-Cyclohexenylglycinmethylesters.

Beispiel 1

Dreitage-Schrägkulturen der in Tabelle 1 genannten Mikroorganismen wurden in 3 Kolben geimpft, die je 30 ml des Mediums I enthielten, und 20 Stunden unter Schütteln bei 28°C kultiviert. Nach dieser Zeit wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt. Die Zellen wurden mit 30 ml einer 0,05molaren Phosphatpufferlösung von Pn 6,0 gewaschen und in 3 ml dieser Pufferlösung suspendiert. Zu jeder Suspension wurden 3 ml einer wäßrigen 0,1 n-K,HPO₄-Lösung gegeben, die 4% Phenylglycinmethylester (1) und 2% 7-Aminocephalosporansäure (a) oder 7-Arnino-3-ueacetoxycephaiosporansäure (b) oder 7-Arnino-3-methoxyrnethy!-3-cspheni-4-carbonsäure (c) enthielt und mit 2n-HCl auf p_H 6,0 eingestellt war. Jedes Gemisch wurde 40 Minuten unter Schütteln bei 37°C bebrütet Das in jedem Reaktionsgemisch angehäufte Cephalosporin wurde durch Bioautographie identifiziert und durch den Biotest bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 genannt

Tabelle 1

IFO-13213	2,1	1,8	1,5
110-13267	0,0	0,1	0,2
IFO-13221	6,5	2,3	3,6

Mikroorganismus Menge des angehäuften

Cephalosporins, mg/ml

Mycoplana dimorpha

Mycoplana bullala

Protaminobacter alboflavus IFO-13221 6,5 2,3 3,6 ^lü

A = 7-(ff-Aminopheny!acctaniido)cephalosporansüure. gebildet aus (1) und (al B = 7-(ff-Aminophenyhicetamido)-3-deacetoxycephalosporansiiurc, gebildet aus (Ii und (b).

C = 7-(a-Aminophcnylaeelarnido)-3-mcth.oxymethyl-3-cephem-4-carbonsiiurc, gebildel aus

(I) und (C).

Beispiel 2

Dreitage-Schrägkulturen des in Tabelle 4 genannten Mikroorganismus wurden in 3 Koiben geimpft, die je ml des Mediums I enthielten, und 20 Stunden bei 28°C unter Schütteln bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 30 ml einer 0,05molaren PhosphatpufTerlösung von p₍₁6,0 gewaschen und in 3 ml dieser Pufferlösung suspendiert. Zu den Suspensionen wurden je 3 ml einer wäßrigen 0,ln-K₂HPOj-Lösung gegeben, die4%4-Hydroxyphenylglycinmethylester (3) und 2% 7-Aminocephalosporansäure (a) oder7-Amino-3-deacetoxycephalospQransäure (b) oder 7-Amino-3-methoxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure (c) enthielt und mit 2n-HCl aufpu 6,0 eingestellt war. Jedes Gemisch wurde 30 Minuten bei 37°C unter Schütteln bebrütet. Das in jedem Reaktionsgemisch angehäufte Cephalosporin wurde durch Bioaulographie identifiziert und durch den Biotest bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 4 genannt.

Tabelle 4

Mikroorganismus Angehäuftes Cephalosporin,

mg/ml

DEF

Mycoplana dimorpha IFO-13240 0,9 0,5 0,8

D = 7-[u-Amino-ff-(4-hydroxyphenyI)acetamido]cephalospofansüure, gebildet aus (3) und (a). E = y-ta-Amino-o-M-hydroxyphenyllacetamidolO-deacetoxvccphalosporunsa'ure. gebildet aus

(3) und (b).
F = 7-[a-Amino-ß-(4-hydroxyphenyl)acetamido]-3-methoxymethyl-3-cephem-4-earbonsäure, gebildet air· (3) und (c).

Beispiel 3

Dreitage-Schrägkulturen des in Tabelle 5 genannten Mikroorganismus wurden in 3 Kolben geimpft, die je ml des Mediums I enthielten, und 20 Stunden bei 28°C unter Schütteln bebrütet. Nach dieser Zeit wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt, mit je 30 ml einer 0,05molaren PhosphatpufTerlösung von p_u 6,0 gewaschen und in 3 ml dieser Pufferlösung suspendiert. Zu jeder Suspension wurden 3 ml einer wäßrigen 0,ln-K₂HPO_rLösung gegeben, die 4% S^-DichloM-hydroxyphenylglycinmethylester (4) und 2% 7-Aminocephalosporansäure (a) oder 7-Amino-3-deacetoxycephalosporansäure (b) oder T-AminoO-methoxymethyW-cephem-4-carbonsäure (c) enthielt und mit 2n-HCI auf p_M 6,0 eingestellt war. Jedes Gemisch wurde40 Minuten bei 37°C unter Schütteln bebrütet. Das in jedem Reaktionsgemisch angehäufte Cephalosporin wurde durch ³°. Bioautographie identifiziert und durch den Biotest bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 5 genannt.

Tabelle 5

55

Mikroorganismus Angehäuftes Cephalosporin,

mg/ml

G H I

60 Mycoplana dimorpha IFO-13240 0,1 0,1 0,1

G = 7-[a-Amino-£r-(3,5-dichlor-4-hydroxyphenyl)-acetamido]cephalosporansäure, gebildet aus

{4> und (a).
H = 7-[c-Amino-£r-(3,5-dichior-4-hydri>.^-:yphenyr)-acetam;do]-3-deacetoxycephalosporansäure, gebildet aus (4) und (b).

I = 7-[a-Amino-a-(3,5-dichlor-4-hydroxyphenyI)-acetamido]-3-methoxymethyI-3-cephcm-4-carbonsäure, gebildet aus (4) und (c).

Beispiel 4

Dreitage-Schrägkulturen des nachstehend in Tabelle 6 genannten Mikroorganismus wurden in 3 Koiben geimpft, die je 30 ml des Mediums 1 enthielten, und 20 Stunder, bei 28°C unter Schütteln bebrütet. Nach dieser Zeit wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 30 ml einerO,05molaren Phosphatpuffenösung von P_n 6,0 gewaschen und in 3 ml einer wäßrigen 0,ln-K₂HPO₄-Lösung suspendiert, die 4% l-Cyclohexenylglycinmethylester (5) und 2% 7-Aminocephalo3poransäure (a) oder 7-Amino-3-deacetoxycephalosporansäure (b) oder 7-Amino-3-methoxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure (c) enthielt und mit 2n-HCl auf p_M 6,0 eingestellt war. Jedes Gemisch wurde 30 Minuten bei 37°C unter Schütteln bebrütet. Das in jedem Reaktionsgemisch angehäufte Cephalosporin wurde durch Bioautographie identifiziert und durch den Biotest bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 6 genannt.

Tabelle 6

Mikroorganismus Angehäuftes Cephalosporin,

mg/ml

J K L

Mycoplana dimorpha IFO-13213 1,4 2,0 1,2

J = 7-(a-Amino-r-cyclohexenylacetamido)cephalosporansäure, gebildet aus (5) und (a).
K = 7-(a-Aniino-l'-cyclohexenylacetamido)-3-deacetoxycephalosporansäure, gebildet aus (5)

und (b).
L= 7-(a-Amino-r-cycIohexenylacetamido)-3-methoxymethy!-3-cephem-4-carbonsäure,gebil-

det aus (5) und (c).

Beispiel 5

Die Dreitage-Schrägkulturen des nachstehend in Tabelle 9 genannten Mikroorganismus wurden in 3 Kolben geimpft, die je 30 ml des Mediums I enthielten, und 20 Stunden bei 28⁰C unter Schütteln bebrütet. Nach dieser Zeit wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 3G ml einer0,05molaren Phosphatpufferlösung von Pn 6,0 gewaschen und in 3 ml einer wäßrigen OJn-KjHPC^-Losung suspendiert, die 4% Cyclohexylglycinäthylester (7) und 2% 7-Aminocephalosporansäure (a) oder 7-Amino-3-deacetoxycephalosporansäure (b) oder 7-Amino-3-methoxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure (c) enthielt und mit 2n-HCl auf p_H 6,0 eingestellt war. Die Gemische wurden 30 Minuten bei 37°C unter Schütteln bebrütet. Das in jedem Reaktionsgemisch angehäufte Cephalosporin wurde durch Bioautographie identifiziert und durch den Biotest bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 9 genannt.

Tabelle 9

Mikroorganismus Angehäuftes Cephalosporin,

mg/ml

MNO

Mycoplana dimorpha IFO-13213 1,0 0,3 0,8

M = 7-(£r-Aminocyclohexylacetamido)cephalosporansäure, gebildet aus (7) und (a).

N = 7-{a^r-Aminocyciohexylacetamido)-3-de2cetoxycephaIosporansäure, gebildet aus (7) und

O = 7-{ff-Aminocyc!ohexylacetamido)-3-methoxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure, gebildet
aus (7) und (c).

Beispiel 6

Eine Impfnadelmenge der Dreitage-Schrägkulturen der in Tabelle 12 genannten Mikroorganismen wurde in 30 ml des Mediums I geimpft und 20 Stunden bei 28°C unter Schütteln bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 500 ml einer 0,05molaren Phosphatpufferlösung von p_H 6,0 gewaschen und in 15 ml dieser Pufferlösung suspendiert. Zu den Suspensionen wurden je 15 ml einer wäßrigen 0,ln-K₂HPO₄-Lösung gegeben, die mit 2n-HCl auf p_H 6,0 eingestellt war und 4% Phenylglycinmethylester (1) und 2% 7-Amino-3-(loxidopyrid-2-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure (d) enthielt. Die Gemische wurden 30 Minuten bei 37°C unter Schütteln bebrütet Die in den Reaktionsgemischen angehäufte 7-(ar-Aminophenylacetamido)-3-(loxidopyrid^-yithiomethyU-S-cephcrn^-carbonsäure (P) wurde durch Bioautographie identifiziert und durch den Biolcst bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 12 genannt.

Tabeile 12

Mikroorganismus Angehäufte Menge

von P. mg/ml s

Protaminobacter IFO-I3221 5,5
alboflavus

Mycoplana IFO-13213 2,1

dimorpha to

Beispiel 7

Eine Impfnadelmenge der Dreitage-Schrägkulturen von Protaminobacter alboflavus IFO-I3221 wurde in 20 ml des Mediums I geimpft und einen Tag bei 28⁰C unter Schütteln bebrütet Die erhaltenen Kulturen wurden in 15 je 500 ml des Mediums I geimpft und 20 Stunden bei 28°C unter Schütteln bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 500 ml einer 0,05molaren PhosphatpufTerlösung von p_tI 6,0 gewaschen und in je 50 ml dieser Pufferlösung suspendiert. Zu den Suspensionen wurden je 50 ml einer mit 2n-HCl auf p_H 6,0 eingestellten wäßrigen 0,In-K₂HPOj-Lösung gegeben, die 2% Phenylglycinmethylester (1) und 4% 7-Amino-3-(loxidopyrid-2-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure (d) enthielt. Die Gemische wurden 3G Minuten bei 37°C 20 unter Schütteln bebrütet. Die in den Reaktionsgemischen angehäufte 7-(a-Aminophenyl-acetamido)-3-(loxidopyrid-2-yIthiomethyI)-3-cephem-4-carbonsäure (P) wurde durch Bioautographie identifiziert und durch den Biotest bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 13 genannt.

Tabelle 13 25

ρ

Mikroorganismus Angehäufte Menge

von P. mg/ml

Protaminobacter IFO-13221 6,0 1

alboflavus i

\\ Beispiel 8 I

Acctobacter sp. IFO-13209 wurde in 200 ml des Mediums IV geimpft und 22 Stunden bei 28°C unter Schütteln |

bebrütet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt und in 20 ml einer 0,1 molaren Phosphatpuffer- |j

lösung von ρ,, 6,0 suspendiert. Die Suspension wurde in 8 Teile geteilt. Zu jedem Teil der Suspension wurden j

2,5 ml einer 0,2molaren Phosphatpufferlösung von pn 6,0 gegeben, die 75 mg des in Tabelle 16 genannten Phe- I

nylglycinderivats und 25 mg 7-Amino-3-deacetoxycephalosporansäure (b) enthielt. Die Gemische wurden AO I

1 Stunde bei 37°C unter Schütteln bebrütet. Die in den Reaktionsgemischen angehäufte 7-(ff-AminophenyI- |

acetamidoJ-S-deacetoxycephalosporansäure (B) wurde durch das Bioautogramm identifiziert und durch den j

Biotest bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 16 genannt, k

Tabelle 16 45 »

Tabelle 16	Angehäufte Menge von B,
Verwendetes Phenylglycin-	mg/ml
derivat	6,0
Methylester	6,0
Äthylester	4,6
n-Propylester	2,2
Isopropylester	0,2
tert.-Butylester	4,2
Benzylester	0,2
Phenylglycinamid	0,2
N-(Phenylglycyl)glycin

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Cephalosporinen der Formel
S NH₂ S ,

R—CH-CONH—CH-CH CH₂

O=C N CCH₂—R' (D

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