DE2441637A1

DE2441637A1 - Verfahren zur herstellung von 6aminopenicillansaeure-1-oxid

Info

Publication number: DE2441637A1
Application number: DE2441637A
Authority: DE
Inventors: Eiji Kondo; Takashi Mitsugi; Ryonosuke Muneyuki
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1973-09-21
Filing date: 1974-08-30
Publication date: 1975-03-27
Also published as: US3925155A; FR2244769A1; JPS5535120B2; GB1479174A; DE2441637C2; JPS5058288A; FR2244769B1

Description

¹¹ Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure-i-oxid " Priorität: 21. September 1973, Japan, Nr. 107 299/73

6-Aminopenicillansäure-i-oxid ist bekannt. Die Verbindung wird durch Oxidation von 6-Aminopenicillansäure in wäßriger Lösung und unter Kühlen im Eisbad mit ozonhaltigem Sauerstoff hergestellt; vgl. E.H. Flvnn, Chephalosnorins and Penicillins, Academic Press New York and London (1972), S. 668.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein biotechnisches. .·■ Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure-i-oxid aus Penicillin-1-oxiden unter Verwendung von Mikroorganismen zu schaffen. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschen den Befund, daß Pilze der Gattung Streptomyces .und Mycelpräpa'-rate derselben in der Lage sind,-bevorzugt die Amidbindung in der 6-Stellung des Penicillin-1-oxid-Moleküls anzugreifen.

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Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure-i-oxid, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Pilze der Gattung Streptomyces oder Mycelpräparate derselben, die bevorzugt die Amidbindung in der 6-Stellung des Penicillin-1-oxid-Moleküls angreifen,auf ein Penicillin-1-oxid oder dessen Salz einwirken läßt.

Beispiele für verfahrensgemäß eingesetzte Penicillin-1-oxide sind die 1-Oxide von Penicillin G, Penicillin V und ähnlichen Penicillinen. Als Salze kommen wasserlösliche Salze in Frage, wie die Alkalimetallsalze, beispielsweise die Natrium- oder Kaliumsalze, oder gegebenenfalls alkylierte Ammoniumsalze, die bei der Reaktion nicht stören.

Die verfahrensgemäß eingesetzten Pilze gehören zur Gattung Streptomyces. Diese Pilze besitzen Penicillin-1-oxidamidase-Aktivitat. Diese Amidase ist ein Enzym oder Enzymsystem, das aus einem Penicillin-1-oxid oder dessen Salz das 6-Aminopenicillansäure-1-oxid bildet. Spezielle Beispiele für die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren Pilze sind Streptomyces setonii (Millard und Burr) ;.^raksman ATCC 25497, Streptomyces griseorubiginosus Ryabova und Preobrazhenskaya ATCC 23627,

Streptomyces fimicarius (Duche) Vaksman und Henrici ATCC 25449 und

Streptomyces fasiculatus (Sie) Pittenger und Nelms ATCC 19751 sowie andere Arten dieser Gattung, die Penicillin-i-oxidamidase-Aktivität besitzen.

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Erfindungsgeraäß können auch natürliche und künstliche Mutanten oder Varianten dieser Gattung eingesetzt werden, die Penicillin-1-oxidamidase-Aktivität aufweisen. Die künstlichen, Mutanten können durch übliche mutagene Behandlung, beispielsweise mit Röntgenstrahlen, UV-Licht, oder chemische Mutagene, wie Stickstoff-Lost, hergestellt werden.

Die Pilze können in ein natürliches oder künstliches Nährmedium überinpft und in diesem Nährmedium vermehrt werden. Die Nährmedien können folgende Bestandteile enthalten: Stickstoff- und Kohlenstoffquellen, wie Kohlenhydrate, beispielsweise Glucose, Fructose, Maltose, Rohrzucker, Stärke, Stärkehydrolysate, Sorbit, Honig, Kartoffelmehl, Weizenmehl, Fleischbrühe, Hefeextrakt, Pepton, Maisquellwasser, Fischmehl, Fischmehlextrakt, Caseinhydrolysat, Sojabohnenmehl, Casaminosäure, Reiskleienextrakt, Harnstoff, Ammoniak, Ammoniumsalze, v:ie Ammoniumchlorid, -sulfat, -nitrat, -acetat und bzw. oder -phosphat, Carbonsäuren, wie Essigsäure- oder Milchsäure, anorganische Sa] ze, wie Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Eisensulfate, Manganchlorid, Kupferchlorid und Zinkchlorid, und bzw. oder andere Substanzen, die für das Wachstum der Pilze erforderlich sind, wie Vitamine und Aminosäuren. Die Vermehrung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, beispielsweise durch Schütteln oder statische Kultur oder unter Belüften und Rühren, und vorzugsweise bei einem pK-V,^rert von 5 bis 9 bei Temperaturen von 20 bis 40°C während eines Zeitraumes von 1 bis 5 Tagen durchgeführt. Man erhält das Mycel oder die vermehrten Pilze'. Die Vorkehrung kann in Gegenwart eines Penicillin-1-oxids durchgeführt werden, um die Penicillin-1-oxid-amidase zu induzieren. _,

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Sodann wird das Penicillin-1-oxid oder dessen Salz in Form eines Pulvers, einer Suspension oder einer Lösung in einem· wäßrigen oder hydrophilen organischen Lösungsmittel mit dem Pilz oder dessen Mycelpräparat in wäßrigem Medium zusammenge-• bracht. Der Pilz bzw. das Mycel wird durch Filtrieren oder Zentrifugieren der Kulturbrühe und anschließendes Waschen der Festsubstanz mit Wasser oder einer Pufferlösung zur Abtrennung der Nährlösung und anderer Verunreinigungen erhalten. Erforderlichenfalls kann der Pilz mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, wie Aceton oder Äthanol, getrocknet werden.

Der Ausdruck "Mycelpräparat¹¹ bezeichnet ein Präparat, das die Penicillin-1-oxidamidase-Aktivität des intracellulären oder extracellulären Enzymsystems des Pilzes zur Verfügung stellt. ' Das Präparat kann beispielsweise in Form einer Kulturbrühe des Pilzes, in Form von Mycel oder Pilzen, als Kulturbrühe, aus der die Pilze abgetrennt wurden, oder einer Enzymlösung vorliegen. Die Enzymlösung schließt rohe Enzymlösungen ein, die ein Mycelhomogenat enthalten,' das durch Homogenisieren der Pilze erhalten worden ist. Ferner kommen rohe oder gereinigte Enzyme in Frage, die in an sich bekannter Weise aus dem Mycelhomogenat erhalten wurden, beispielsweise durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Dialyse, Ausfällung, beispielsweise mit Aceton oder Äthanol, Chromatographie, Gelfiltration, Zentrifugieren oder Elektrophorese. Ferner kommen Pilze oder rohe oder gereinigte Enzyme in Frage, die mit einem festen Träger kombiniert sind, wie Cephadex, DEAE-Cellulose, Celite, Aktivkohle, einem Acrylpolymerisat oder Ionenaustauscherharz. Derartige

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Enzyme stellen feste Enzympräparate dar.

Das hydrophile organische Lösungsmittel, wie Äthanol oder Aceton, wird in solcher Konzentration verwendet, daß die Wirkung der Penicillin-1-oxidamldase nicht gehemmt wird. Beispiele für wäßrige Medien sind Pufferlösungen, Salzlösungen, Nährmedien zur Vermehrung der Pilze und destilliertes Wasser. Die Gegenwart von Luft ist nicht von entscheidender Bedeutung, jedoch bevorzugt. Vorzugsweise wird die Umsetzung unter Schütteln und Rühren bei einem pH-Wert von 5 bis 8 bei Temperaturen von 20 bis 4O⁰C und während eines Zeitraums von 5 "bis 50 Stunden. durchgeführt. Die Werte hängen von der Konzentration, der Art des eingesetzten Penicillin-1-oxids bzw. dessen Salz, der Art des eingesetzten Pilzes und der Art der Behandlung ab. Erforderlichenfalls kann mit einer Säure, Base oder einer Pufferlösung der pH-Wert eingestellt werden, wenn sich der pH-Wert des Reaktionsmediums während der Umsetzung ändert. Die bevorzugte Anfangskonzentration des eingesetzten Penicillin-1-oxids im wäßrigen Medium beträgt Ο,Ί bis 5, insbesondere 0,1 bis 2 Gewichtsprozent. ·.

Die Isolierung und Reinigung des entstandenen 6-Aminopenicil- · lansäure-1-oxids ode,r dessen Salzes kann in an sich bekannter Weise durchgeführt werden. Beispielsweise werden, die Pilze, das Mycelpräparat oder unlösliche Stoffe aus dem Reak-tionsgemisch abfiltriert, abgeschleudert, absorbiert oder denaturiert» Es kann auch eine Kombination dieser Verfahren angewendet werden. Danach wird das 6-Aminopenicillansäure-f-oxid beispielsweise durch Absorption, fraktionierte Extraktion, Konzentrie-'

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ren, Abtrennung oder Ausfällung isoliert. Die Reinigung kann durch Umkristallisation, Absorption, Chromatographie oder Behandlung mit Ionenaustauschern erfolgen. Das 6-Aminopenicillan-. säure-1-oxid kann als Salz an der Carboxylgruppe, beispielsweise als Natrium-, Kalium-, Magnesium- oder Aminsalz, oder als Salz an der Aminogruppe, beispielsweise als p-Toluolsulfonat, Rhodanid, Hydrochlorid, Sulfat oder Nitrat, isoliert werden.

Das entstandene 6-Aminopenicillansäure-1-oxid oder dessen Salz oder Ester kann durch Acylierung in die entsprechenden Penicillin-1-oxide oder ihre Salze oder Ester überführt werden. Diese Verbindungen sind wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung von Penicillinen und Cephalosporinen. Zur Acylierung können die freien Säuren oder ihre Anhydride, die reaktionsfähigen Ester,, reaktionsfähige Amide, Halogenide oder andere reaktionsfähige Derivate der Säure mit der entsprechenden Acylgruppe eingesetzt werden. Die Umsetzung erfolgt in an sich bekannter Weise. Gegebenenfalls kann ein Kondensationsmittel oder ein Säureacceptor, beispielsweise ein Carbodiimid, wie Dicyclohexylcarbodiimid, oder eine organische Base, wie Triäthylamin, verwendet werden.

Übliche Salze des 6-Aminopenicillansäure-i-oxids sind Alkalimetallsalze und die Salze organischer Basen. Übliche Ester sind _f der Trimethylsilylester, Trimethylzinnester, Phenacylester und Acyloxyraethylester, die leicht in vitro oder in vivo abgespalten werden können. .

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Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 '.

Streptomyces setonii ATCC 25^97 wird in 200 ml eines sterilisierten Nährmediums überimpft, d.h. einer wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert von 7,0, die 1 Prozent Glucose,; 0*5 Prozent Pepton, 0,5 Prozent Hefeextrakt und 0,3 Prozent Natriumchlorid enthält. Der Stamm wird 2 Tage bei 28⁰C unter Schütteln gezüchtet. Sodann wird das Mycel abfiltriert und mit volientsalztem Wasser- gewaschen. ■

Das gewaschene Mycel wird in 200 ml vollentsalztem V/asser suspendiert, das 400 mg Penicillin V-1-oxid..in Form des Natriumsalzes enthält. Das Salz wurde durch Neutralisation mit wäßriger Natriumcarbonatlösung hergestellt. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 28⁰C geschüttelt. Sodann wird das Reaktionsgemisch abfiltriert, das Filtrat mit 4 η Schwefelsäure auf einen pH-Vfert von 2,6 eingestellt und dreimal mit Äthyl'acetat extrahiert. Der .Xthylacetatextrakt wird unter vermindertem Druck eingedampft. Ausbeute 145 mg Phenoxyessigsäure vom F. 98°C. IR-Absorptionsspektrum ν ™5£^affino1 1735, 1707, 1594 und 1585 cm"

max
-1

Die wäßrige Lösung wird mit Bariumhydroxid auf einen pH-vfert von 7,0 eingestellt, von festen Stoffen abgeschleudert und der Überstand bei 38 bis 40⁰C eingedampft. Ausbeute 275 mg rohes 6-Aminopenicillansäure-i-oxid als Pulver. IR-Absorptionsspektrum ν Jn|£^affino1 1775, 1025 und 1010 cm""¹.

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Beispiel2

Eine gemäß Beispiel 1 hergestellte Pilzkulturbrühe von Streptomyces setonii ATCC 25497 wird zentrifugiert. 100 ml des Uberstandes werden mit 200 mg Penicillin V-1-oxid versetzt. Danach wird der pH-Wert der Lösung auf 7,0 eingestellt und das Gemisch 45 Stunden bei 28°C geschüttelt. Die Dünnschichtchromatographie an Kieselgel mit einem Gemisch von Aceton, Essigsäure und Wasser (85 : 6 : 8) als Entwicklungslösungsmit-. tel zeigt kein Ausgangsmaterial, sondern große Mengen an o-Aminopenicillansäure-i-oxid. Die kolorimetrische Bestimmung des Flecks auf dem Dünnschichtehromatogramm zeigt eine Ausbeute von 75 Prozent, bezogen auf eingesetztes Pencillin V-1-oxid.

Beispiel 3

Streptomyces griseorubiginosus ATCC 23627 wird in 100 ml eines sterilisierten Nährmediums überimpft, d.h. einer wäßrigen Lösung mit einem pH~V.^Tert von 7,0, die 1 Prozent Glucose, 0,5 Prozent Pepton, 0,5 Prozent Hefeextrakt und 0,3 Prozent Natriumchlorid enthält. Der Stamm wird 2 Tage bei 28⁰C unter Schütteln gezüchtet. Sodann wird das Mycel abgeschleudert, mit Wasser ausgewaschen und in 100 ml einer 1/30 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 suspendiert, die 200 mg Penicillin V-1-oxid enthält. Die Suspension wird 24 Stunden bei 28⁰C geschüttelt. Die Dünnschichtchromatographie des Reaktionsgemisches zeigt dann die Gegenwart von 6-Aminopenicillansüure-i-oxid in ähnlicher Menge an, wie in Beispiel 2. Das eingesetzte Penicillin V-1-oxidsalz ist verschwunden.

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Beispiel4

Beispiel 3 wird unter Verwendung von Streptomyces fimicarius ATCC 25449 wiederholt. Es wird 6-Aminopenicillansäure-i-oxid in ähnlicher Ausbeute erhalten wie in Beispiel 2.

Beispiel5

Beispiel 3 wird unter Verwendung von Streptomyces fasiculatus ATCC 19751 wiederholt. Es wird 6-Aminopenicillansäure-i-oxid in ähnlicher Ausbeute wie in Beispiel 2 erhalten.

Beispiel6

Beispiel 3 wird unter Verwendung von Phenoxyäthylpenicillin-1-oxid wiederholt. Es wird β-Aminopenicillansäure-i-oxid erhalten.

Beispiel?

Streptomyces griseorubiginosus ATCC 23627 wird in 100 ml eines sterilisierten Nährmediums überimpft, d.h. einer wäßrigen Lö- - sung rait einem pH-Wert von 7,0, die 1 Prozent Glucose, 0,5 Prozent Pepton, 0,5 Prozent Hefeextrakt und_0,3 Prozent Natriumchlorid enthält; Der Stamm wird 2 Tage bei 28⁰C unter Schütteln gezüchtet. Sodann wird die Kulturbrühe zu einer Lösung von'. 200 mg Penicillin V-1-oxid in 50 ml Wasser gegeben, die mit .. . v/äßriger Natriumcarbonatlösung neutralisiert wurde. Das Gemisch wird 2 Tage bei 28⁰C geschüttelt. "Sodann zeigt die Dünnschi.chtchromatographie des Reaktionsgemisches die Gegenwart von ö-Aminopenicillansäure-i-oxid. Die kolorimetrische Bestimmung· des Flecks auf dem Dünnschichtchromatogramm ergibt eine Ausbeu te von 65 Prozent, bezogen auf eingesetztes Penicillin V-1-oxid.

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Nachstehend wird die Herstellung von Penicillin-1-oxiden aus dem erfindungsgemäß hergestellten 6-Aminopeniclllansäure-loxid erläutert.

Versuch 1

Eine Lösung von 270 mg rohem 6-Aminopenicillansäure-1-oxid in 10 ml vollentsalztem Wasser wird mit I55 mg Natriumbicarbonat versetzt. Hierauf wird die Lösung unter Eiskühlung und Rühren tropfenweise mit einer Lösung von I8I mg Phenoxyacetylchlorid (Kp. 132-135°C/35 Torr) in 3 ml Dioxan versetzt. Nach 45minütigem Rühren wird das Reaktionsgemisch, mit weiteren 50 mg Natriumbicarbonat sowie mit einer Lösung von 60 mg Phenoxyacetylchlorid in 1 ml Dioxan versetzt und noch 15 Minuten gerührt.. Danach" wird das Reaktionsgemisch mit 2 g'Eis und 2 ml einer 5prozentigen wäßrigen Lösung von Natriumbicarbonat versetzt und mit 5Ö ml Diäthyläther extrahiert. Die wäßrige Lösung wird mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt. Die entstandenen Kristalle werden abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 360 mg (85 % d. Th.) Penicillin V 1-oxid, P. 170°C (Zersetzung). Die Verbindung ist mit einer authentischen Probe identisch.

Versuch 2

Eine Lösung von I80 mg 6-Aminopenicillansäure-1-oxid und 0,09 ml Triäthylamln in 5 ml Chloroform wird bei -JO⁰C mit

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einer Lösung von 170 mg Phenylchlorcarbonylketen in 2 ml Chloroform versetzt und 1 Stunde gerührt. Danach wird das Reaktionsgemisch eingedampft. Der Rückstand wird in Methyläthylketon gelöst, die Lösung mit Wasser verdünnt und mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,6 angesäuert. Die wäßrige Lösung wird sodann auf einen pH-Wert von 2 angesäuert· und mit Methyläthylketon extrahiert. Der Methyläthylketonextrakt wird mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft. Es hihterbleibt das Carbenicillin- 1 -oxid.

IR-Absorptionsspektrum _v ^Paraffino1 1786, IGJO und 1015 cm"¹.

max

NMR-Spektrum: +102, +126 Hz (aus CH,OHj in D₃O; 60 MHzj als

Natriumsalz).

Versuch J>

Eine Lösung von 6-Trimethylsilylaminopenicillansäure-trimethylsilylester-1-oxid in Methylenchlorid (hergestellt aus 110 mg 6-Aminopenicillansäure-1-oxid und Trimethylchlorsilan) wird mit 80 mg Phenylacetylchlorid versetzt und 1 Stunde gerührt. Danach wird das Reaktionsgemisch mit Wasser gewaschen, getrocknet und mit einer Lösung von Natrium-2-Ä'thylhexanoat in Isopropänol versetzt. Die entstandenen Kristalle werden abfiltriert. Man erhält das Penicillin G 1-oxid als Natriumsalz.

IR-Absorptionsspektrum: v^_ov I785» I050 und 1015 cm"

max

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Das erhaltene Penicillin-1-oxid kann in an sich bekannter Weise mit üblichen Reduktionsmitteln, wie Phosphortrihalogeniden, zu den entsprechenden Penicillinen reduziert werden.

Weiterhin werden aus 6-Aminopenicillansäure-l-oxid in an sich bekannter Weise durch übliche Acylierung und Ringerweiterung die entsprechenden 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure-Derivate erhalten, die wertvolle Antibiotika darstellen.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure-ioxid, dadur. ch gekennzeichnet, daß man Pilze der Gattung Streptomyces oder Mycelpräparate derselben, die bevorzugt die Amidbindung in 6-Stellung des Penicillin-1-oxidmoleküls angreifen, auf ein Penicillin-1-oxid oder dessen Salz einwirken läßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in vollentsalztem Wasser, Phosphatpufferlösung oder einer Kulturflüssigkeit durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung bei einem pH-Wert von 5 bis" 8 durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung bei Temperaturen von 20 bis 40⁰C durchführt.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ausgangskonzentration des eingesetzten Penicillin-i-oxids oder dessen Salz im wäßrigen Medium auf einen Wert von 0,1 bis·' 2 Gewichtsprozent einstellt. .

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Penicillin-1-oxid Phenoxymethylpenicillin-1-oxid einsetzt.'

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7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Penicillin-1-oxidsalz ein Alkalimetallsalz von Phenoxymethylpenicillin-1-oxid einsetzt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mycelpräparat ein gewaschenes Mycel einsetzt.

9· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces setonii (Millard und Burr) Vaksman ATCC 25497, Streptomyces griseorubiginosus Ryabova und Preobrazhenskaya ATCC 23627, Streptomyces fimicarius, (Duche) Waksman und Henriei ATCC 25449 oder Streptomyces fasiculatus (Sie) Pittenger und Nelms ATCC 19751 einsetzt.

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