DE2604759A1

DE2604759A1 - Verbessertes verfahren zur erhoehung der intravenoesvertraeglichkeit von gammaglobulinen

Info

Publication number: DE2604759A1
Application number: DE19762604759
Authority: DE
Inventors: Waldemar Dr Schneider; Dietrich Dr Wolter
Original assignee: Plasmesco AG
Current assignee: Armour Pharma GmbH
Priority date: 1976-02-07
Filing date: 1976-02-07
Publication date: 1977-09-29
Also published as: GB1577031A; DD132758A6; FI770290A7; FI62624C; AU2190277A; DE2604759C2; HU177708B; BE851151R; JPS6231695B2; FI62624B; CA1087524A; CH629669A5; FR2340738B2; ATA74177A; AU508852B2; IE44591L; YU30577A; MX5356E; ZA77684B; ES455708A2

Description

Anmelder: Dr. Waldemar Schneider und Dr. Dietrich Wolter, 5800 Hagen

Verbessertes Verfahren zur Erhöhung der Intravenösverträglichkeit von Gammaglobulinen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Intravenösverträglichkeit von aus Blut oder Blutprodukten ausgefällten Gammaglobulinen, in dessen Verlauf der Gammaglobulin-Niederschlag in einer wäßrigen Lösung erneut gelöst wird, in der makromolekulare, die Globulin-Moleküle gegeneinander abschirmende und sie aus der Lösung verdrängende Substanzen, vorzugsweise Hydroxyläthylstärke, vorliegen, nach Patent (Patentanmeldung P 25 00 076.4).

Bei dem Verfahren gemäß Stammanmeldung wird der Anteil an unerwünschten Gammaglobulinen dadurch entfernt, daß diese in einer wäßrigen Lösung von insbesondere Hydmyläthy 1 stärke in einer Konzentration von 8 - 10 % erneut aufgenommen werden. Nach Zugabe von Polyäthylenglykol wird das Gemisch zentrifugiert. Der sich absetzende Niederschlag enthält den unerwünschten Gammaglobulin-Anteil, während der erwünschte Anteil in einer weiteren Zentrifugierstufe bei pH 7?2 und 20 % PÄG gewonnen wird.

Wenn auch das gemäß dem beschriebenen Verfahren gewonnene Gammaglobulin allen Anforderungen der medizi-

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nischen Praxis gerecht wird, so hat es sich doch als günstig erwiesen, die Ausbeute zu erhöhen und eine > noch höhere Qualität und Reinheit des gewünschten β

Gammaglobulins zu gewährleisten. Diese Aufgaben wer- ~~ den gemäß der Erfindung durch ein Verfahren gelöst, bei dem die wäßrige, Gammaglobulin enthaltende Lösung zusätzlich mit einer Aufschlämmung von glimmerartigen Schichtsilikaten in einer Konzentration im Bereich von 0,2 ... 10 Gewichtsprozent versetzt wird, wobei nach Verstreichen einer ausreichenden Reaktionszeit und Hinzufügen eines Fällungsmittels wie PoIyäthylenglykol der auszuscheidende Gammaglobulin-Anteil zusammen mit den SchichtSilikaten entfernt wird.

Unter "glimmerartigen Schichtsilikaten" werden Silikate verstanden, deren Zusammensetzung folgende Grenzformeln wiedergeben:

a) Me*? ((M^WA^Fe^WiZrtWi²+)⁶\(ohUSu._xALO)₁₀]

ix-

y™

b) Me*V₀JMl³+)Crfä+Fei+jMgt+Zn²+,Ni*%i*-]P*+(0H)₂(Oi^0₁₀ψ

Die Kationen Me⁺ können gegen andere, auch organische Kationen zeolithisch ausgetauscht werden. Als Que.llungsflüssigkeit Y lassen sich beliebige Molekeln mit Ausnahme von gesättigten Kohlenwasserstoffen einführen.

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Die Menge der Quellungsflüssigkeit kann in weiten Grenzen geändert werden. Da auch die Menge χ der einwertigen Kationen pro (Si, Al)^O* -Baueinheit, d.h. die Schichtladung, variiert, ergibt sich eine außerordentliche Mannigfaltigkeit.

Die intensive Forschung hat sich insbesondere des Montmorillonits angenommen (vergleiche hierzu Bibliographie in "Organische Derivate der glimmerartigen Schichtsilikate" von WEISS; angewandte Chemie 1963; S. 113 ff.). Montmorillonit besteht aus zweidimensional unendlichen Makro-Anionen, welche über die dazwischenliegenden Kationen elektrostatisch vernetzt sind. Die Energie zur Quellung, d.h. zur Vergrößerung des Schichtabstandes unter Entfernung der positiven und negativen Ladungen voneinander, liefert die Hydratation oder Solvatation der Kationen und der Anionenschichten. Da die Solvatationsenergie im allgemeinen wesentlich kleiner ist als die Hydratationsenergie, können nur Molekelarten mit hohen Dielektrizitätskonstanten oder mit der Befähigung zur Bildung von Wasserstoffbrücken eingelagert werden.

Auch Aminosäuren, Peptide und Proteine können in glimmerartige Schichtsilicate eingelagert werden. Proteine werden bei niedrigem pH-Wert nahezu quantitativ eingetauscht. Mit steigendem pH-Wert sinkt die Zahl der kationischen Positionen in den Proteinen und der Aus-

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tausch wird unvollständig.

Albumine, Globuline und Prolamine werden ebenfalls gebunden. Mit Serumglobulinen scheint die Reaktion vom Bande der Silicatkristalle aus nur etwa 20 bis 30 S ins Innere fortzuschreiten. Albumine werden zwischen den Silicatschichten gespreitet. Der Schichtabstand von 14,5 bis 15 j O 2. zeigt, daß für das gespreitete Protein eine Schichtdicke von maximal 5,5 bis 6 2. zur Verfügung steht.

Da sich in der aufgenommenen Gammaglobulin-Menge sowohl unbeschädigte als auch beschädigte Moleküle befinden, muß es das Bestreben sein, die beschädigten möglichst in irgendeiner Weise zu binden und damit von den physiologisch einwandfreien Molekülen chemisch unterscheidbar zu machen. Die beschädigten Moleküle sind in der Lage, Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden. Sie werden daher verstärkt innerhalb der Silicat-Schichten eingelagert und gebunden, während die unbeschädigten Gammaglobulin-Moleküle in der Lösung verbleiben. Gebunden in den Schichten des Schichtsilicates lassen sich anschließend die beschädigten Gammaglobulin-Moleküle leicht, z.B. durch Zentrifugieren, entfernen.

Das im Sinne der Erfindung erwünschte Kationenaustauschvermögen zeigen nach HOi¹MAKN" (Z.Eristallogr. (A)

98 (1937) 31; Chemie 55 (1942)283) auch Kaolin und 709839/0025

diesem verwandte Stoffe (z.B. Halloysit, Al₂O,.

und gewisse glimmerartige Mineralien, die hinsichtlich ihres Gitteraufbaus verwandt sind.

Hierunter zählen auch Vermiculit und das diesem verwandte Batavit (= eisenfreies Vermiculit). Die Strukturformel des Batavits ergibt sich nach WEÄSS und HOF MANN (Z. Naturf.,6b,405) wie folgt:

+MgJ^⁺²'^34Η2°*

|)vvtyoc

Es wurde gefunden, daß dieses W wie der Montmorillonit innerkristallines Quellvermögen und hohes Kationenaustauschvermögen besitzt. Die Untersuchungen (a.a.O.) zeigten, daß Batavit bis zu 5Gew.% Humanalbumin aufnimmt, wobei das Eiweiß zwischen die Silicatschichten eingelagert wurde. Auch Vermiculit, angenäherte Strukturformel

* [Mg₃,Al₂,FeJE,Fe₂ )(0H)₂ fcij.35Al^₆₅O₁J] ^Ο'⁶⁵"+Ο,65Μ+ zeigt die erwünschten Eigenschaften bezüilich der

Schichtenbildung und Quellfähigkeit. Vermiculit entspricht einem trioktaedrischen Montmorillonit, doch sind seine Kristalle viel größer und das Gitter ist regelmäßiger ausgebildet.

Zusammengefaßt kann demnach gefolgert werden, daß sich für das Heiligungsverfahren Minerale eignen, die eine Schichtstruktur zeigen, die Kationen zwischen

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den Silicatschichten aufweist und zur Quellung neigen. Fach der experimentellen Erfahrung werden durch derartige Mineralien die defekten Gammaglobulin-Moleküle gehalten - offenbar aufgrund ihrer starken Kationen-Aktivierung - und die unbeschädigten nicht gebunden. Hierbei ist erforderlich, bestimmte Grenzen der Konzentration und des pH-Wertes einzuhalten.

Erfindungsgemäß werden insbesondere die Mineralien Montmorillonit, Batavit oder Vermiculit verwendet. Je nach der gelösten Menge von Gammaglobulin bei der Wiederauflösung werden 0,2 bis etwa 5Gew.% Silicate beigefügt. Nach experimenteller Erfahrung findet die Reaktion im Rahmen einer Temperatur von 4 bis 20° C statt und es wird bei einem pH-Wert zwischen 4,0 und 7,6 gearbeitet. Die Reaktionszeit sollte zwischen 3 und 10 Stunden betragen. Hierbei wird vorzugsweise über Nacht gearbeitet, da die Reaktion relativ langsam verläuft und ein längerer Zeitraum die Ergebnisse verbessert. Das Austragen der Silicate wird vorzugsweise durch Zentrifugieren vorgenommen. Es können jedoch auch andere, aus der allgemeinen Verfahrenstechnik bekannte Methoden verwendet werden, beispielsweise eine Schwemmfiltrierung.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung: Beispiel 1

a) Abtrennen des Gammaglobulins:

Es wird ausgegangen von einem gesammelten Plasma, 709839/0025

das mit 8% Äthanol versetzt wird und bei einem pH-Wert von 7i2 bei minus 3° C ausgefällt wurde. Hierbei wird die Fraktion I ausgeschieden. Die aufstehende Flüssigkeit wird anschließend bei minus 5° C und einem pH-Wert von 5>8 mit 19 % Äthanol versetzt. Hierbei wird die Fraktion II-III ausgeschieden, die aus Gamma-Globulinen besteht. Der Niederschlag wird wieder aufgelöst und bei pH 5 und 8% Äthanol erneut gefällt. Der verbleibende Überstand wird dann mit 25 % Äthanol bei pH 7,2 erneut gefällt. Der hierbei entstehende Niederschlag (= Fraktion II) besteht aus mindestens 90 % Gammaglobulin.

b) Herabsetzung der antikomplementären Wirksamkeit: Der G-ammaglobulin-Niederschlag wird in einer gepufferten, wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert 7₅O in einer Konzentration von etwa 6 % aufgenommen, wobei der wäßrigen Lösung etwa 10 % HÄS beigefügt sind. Der Lösung wird weiterhin eine wäßrige Aufschlemmung von Bentonit SF (Hauptkomponente: Montmorillonit; Körnung kleiner als 80 yU/·, Hersteller: SERVA Feinbiochemika, Heidelberg) beigefügt. Die Lösung enthält anschließend 2,5 Gew.% Bentonit und wird gut gerührt. Anschließend wird die Lösung 6 Stunden bei einer Temperatur von 15°G + 2° stehengelassen. Dann wird das Bentonit zusammen mit den unerwünschten Bestandteilen nach Zugabe von 10 % Polyathylenglykol durch Zentrifugieren entfernt.

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c) Überführung in eine physiologische Kochsalzlösung: Der bei dem Zentrifugieren erhaltene Überstand enthält die erwünschten als Lösung vorliegenden Gammaglobulin-Bestandteile. Der Überstand wird mit 0,1 NaOH auf pH 7,2 gebracht und mit 20Gew.% PlG versetzt. Dabei scheidet sich ein Niederschlag aus
reinem Gammaglobulin ab. Der Niederschlag wird
durch Zentrifugieren gewonnen und in einer physiologischen Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 5,2 % Eiweiß gebracht und anschließend sterilfiltriert. Hiernach steht er zur therapeutischen Anwendung bereit.

Beispiel 2

Die Schritte a) und c) sind gleich denen des Beispieles 1. Schritt b) wird wie folgt abgewandelt:

Der Gammaglobulin-Niederschlag wird in einer gepufferten, wäßrigen Lösung mit einem pH von 7>4 in einer Konzentration von etwa 4Gew.% aufgenommen, wobei der wäßrigen Lösung etwa 8 % HlS b.eigefügt sind. Der Lösung wird weiterhin eine wäßrige Aufschlämmung von
feinvermahlenem (Teilchengröße kleiner 80 Ay) Vermiculit bis zu einem Anteil von 5 Gew.% beigefügt. Das ganze wird kräftig verrührt. Anschließend wird die
Lösung 8 Stunden bei einer Temperatur von 15° +2⁰C stehengelassen. Der Lösung wird danach etwa 10 Gew.% HÄS zugegeben. Anschließend wird das Vermiculit zu-

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sammen mit den unerwünschten Bestandteilen durch Zentrifugieren entfernt.

Hieran schließt sich der Schritt c) an.

Zusammenfassung:

Aus Berechnungen und Messungen an Immun-Elektrophorese-Diagrammen ist zu ermitteln, daß die Ausbeute an reinem Gammaglobulin erhöht wird, wenn das erfindungsgemäße Verfahren angewandt wird. Das gewonnene Gammaglobulin ist nicht modifiziert oder chemisch verändert. Es ist absolut intravenösverträglich und hat praktisch keine antikomplementären Eigenschaften. Darüberhinaus zeigt es eine hohe Stabilität, wie durch Lagerversuche nachgewiesen werden konnte.

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ORIGINAL INSPEQI fcO

Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Erhöhung der Intravenösverträglichkeit von aus Blut oder Blutprodukten ausgefällten Gammaglobulinen, in dessen Verlauf der Gammaglobulin-Niederschlag in einer wäßrigen Lösung erneut gelöst wird, in der makromolekulare, die Globulin-Moleküle gegeneinander abschirmende und sie aus der Lösung verdrängende Substanzen, vorzugsweise Hydroxyläthylstärke, vorliegen, nach Patent (Patentanmeldung P 25 OO 076.4), dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige, Gammaglobulin enthaltende Lösung zusätzlich mit einer Aufschlämmung von glimmerartigen Schichtsilicaten in einer Konzentration im Bereich von 0,2 ... 10 Gew.% versetzt wird, und daß nach Verstreichen einer ausreichenden Reaktionszeit und Hinzufügung eines Fällungsmediums, wie PoIyäthyIenglykol, der auszuscheidende Gammaglobulin-Anteil zusammen mit den Schichtsilioaten entfernt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Schichtsilicat Bentonit mit der Hauptkompo nente Montmorillonit verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Schichtsilicate die Mineralien Bataivit oder Vermiculit verwendet werden.

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4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß 0,2 ... 5 Gew.% Silicate beigefügt werden.
5· "Verfahren nach Anspruch Λ bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einer Temperatur von +4 20⁰C stattfindet.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion mit den Schxchtsxlxcaten bei einem pH-Wert der Lösung von 4,0 7,6 stattfindet.

7· Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionszeit zwischen 3 und 10 Stunden beträgt.

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