DE2014957C2

DE2014957C2 - Verfahren zur Reinigung von Proteinen des Blutserums oder -plasmas

Info

Publication number: DE2014957C2
Application number: DE2014957A
Authority: DE
Inventors: John William Kalamazoo Mich. Nelson
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1969-04-01
Filing date: 1970-03-28
Publication date: 1982-01-28
Also published as: SE386824B; NL164286C; IL34079A0; GB1253328A; BE748326A; NL164286B; DE2014957A1; NL7004373A; FR2038106B1; DK128147B; CH548776A; FR2038106A1; IL34079A; JPS5515444B1

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung von Proteinen des Blutserums oder Blutplasmas, wobei e^-Diamino^-ethoxyacridinlactat-Monohydrat zur Abtrennung des y-Globulins von den anderen Proteinen verwendet wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man zur Entfernung des 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrates aus einer wäßrigen y-Globulinlösung diese Lösung mit einer für die Adsorption des 6,9- Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrates wirksamen Menge Silikagel, Magnesiumsilikat, Magnesiumtrisilikat, natürlichem Calciummagnesiumsilikat, Talkum, Heulandit, Stilbit, Chabazit, Analcit oder Natrolit in Berührung bringt und das Adsorptionsmittel abtrennt. Von 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat freies y-Globulin aus Serum oder Plasma, insbesondere Immunserum oder -plasma, eignet sich zur Verhinderung der Abstoßung von Gewebe- und Organtransplantaten und zum Austausch von y-Globu-Hn.

6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat (Ethacridinlactat-Monohydrat) ist im Handel erhältlich, z. B. von der Calbiochem. Box 54282, Los Angeles, California 90054; Pierce Chemical Co., Rockford Illinois und den Winthrop Laboratories, 90 Park Avenue, New York, N. Y. 10016. Es wird bei der Blutprotein-Fraktionierung zur Abtrennung der Blutproteine verwendet, insbesondere wegen seiner Eigenschaft, in der Lösung tatsächlich alle y-Globuline zurückzulassen, s. Sagan, Z, Ciin. Chim. Acta 21,225 (1968); Saifer, A. und Lipkin, L E, Proc. Soc. Expl. Biol. Med. 102,220 (1959). Das 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat eignet sich zwar gut für die Trennung der Blutproteine, seine Entfernung, insbesondere aus y-Globulin, ist jedoch mit beträchtlichen Schwierigkeiten verbunden. Zum Beispiel beschreiben M. Matthaeus und D. Matheka in Zentr. BakterioL Parasitenk, Abt. l.Orig 188,6(1963) mCihsamc und nicht erfolgreiche Versuche zur Entfernung des restlichen

6,9-Diamino-2-ethoxyacridinIactat-Monohydrates
durch Fällung mit Salzen. Sutton und Karp in Biochimica Biophysica Acta 107,154 (1965) schlagen die Entfernung des e^-Diamino-i-ethoxyacridinlactat-Monohydrates durch Adsorption an Aktivkohle vor, siehe hierzu auch die US-PS 33 83 227, wo ebenfalls die Verwendung von Aktivkohle beschrieben ist in Abs. 2 der genannten Literaturstelle weisen Sutton und Karp jedoch auf die Schwierigkeiten dieser Arbeitsweise und ihre nicht erfolgreiche Durchführung hin, denn die Verwendung von Aktivkohle zur Entfernung des

ίο 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrates ist mit einem Verlust an gewünschtem Produkt verbunden. Bei der Reinigung von y-Globulin aus Placenta mit Bentonit nach der US-PS 34 49 316 wird anscheinend eine Zersetzung vermieden, jedoch ist hier die Entfernung von 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat nicht beschrieben.

Es wurde nun gefunden, daß bei der Reinigung von Blutproteinen, einschließlich y-Globuiin und insbesondere anti-lymphoidem y-Globulin unter Verwendung von 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat zur Trennung der verschiedenen Blutproteine das 6^-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat aus den wäßrigen Lösungen der gewünschten Proteine, einschließlich ^•Globulin, insbesondere anti-lymphoidem Globulin

"ϊ durch Kontakt dieser Lösungen mit einer wirksamen Menge Silikagel oder mineralischem Silikatadsorptionsmittel entfernt werden kann. Aufgrund der charakteristischen gelben Farbe der 6,9-Diamino-2-ethoxyacridin-Iacvat-Monohydrat enthaltenden Lösungen kann die Wirksamkeit des Adsorptionsmittels bei der Entfernung des 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrates verhältnismäßig leicht durch das Verschwinden der charakteristischen Farbe aus den Proteinlösungen und ihrem Auftreten im Adsorptionsmittel festgestellt werden. Gegebenenfalls kann die Anwesenheit von 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydi^-at in einem Filtrat oder in einer überstehenden Flüssigkeit nach der Adsorptionsbehandlung durch UV-Absorption bei etwa 362 ιπμ und 268 πιμ ermittelt werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden aus den Proteinlösungen in vorteilhafter Weise gleichzeitig pyrogene Substanzen entfernt. Es ist bekannt, daß pyrogene Substanzen in pharmazeutischen Produkten, insbesondere solchen für die parenteral Verabreichung unerwünschte Verunreinigungen darstellen, und ihre Entfernung manchmal schwierig und unsicher und in einigen Fällen tatsächlich nicht durchführbar ist, vgl. die Veröffentlichung der Baxter Laboratories, Inc, Morton Grove, HL »Bacterial Pyrogens, Particularly Pyrogenic Polysaccharides of Bacterial Origin, An Annotated Bibliography« (1952). Die Entfernung jeglicher möglicherweise vorhandenen Hepatitisviren wird von Bednarik et al, ZbI. f. Bakt. 1. Orig. 200 :1 (1966) beschrieben.
Wie oben erwähnt, fällt ö^-Diamino-^-ethoxyacridinlactat-Monohydrat in wirksamer Weise die Blutproteine aus ihren wäßrigen Lösungen, wobei etwas ^-Globulin und tatsächlich das gesamte y-Globulin gelöst bleiben. Wegen dieser Eigenschaft eignet es sich für die Reinigung von Blutproteinen aus menschlichem und tierischem Blut, z. B. Blut von Pferden, Schafen, Ziegen, Kühen und Kaninchen. Bekanntlich stellen sowohl das nach dem Gerinnen erhaltene Serum als auch das nach der Entfernung geformter Bestandteile erhaltene Plasma Quellen für gereinigtes y-Globulin dar. Es ist auch bekannt, daß aus menschlichem oder tierischem Blut, das klinisch erwünschte Antikörper enthält, wertvolle y-Globulinfraktionen hergestellt werden können. Zum Beispiel ist Serum oder Plasma von

I: ϊ,ί

Menschen, die an Polyomyelitis erkrankt waren, oder die mit nicht-virulentem Polio-Virus geimpft wurden, für die Herstellung von menschlichem y-Globulin wertvoll, das Anti-Polio-Antikörper enthält. Vorteilhaft wird auch Serum oder Plasma aus tierischem Blut hergestellt, insbesondere aus dem Blut von Pferden, die zuvor mit !ymphoidem Gewebe, z. B. menschlichem lymphocytischem Gewebe, einschließlich Thymocyten und MiIz-Lymphocyten geimpft worden sind.

Zur Gewinnung von Lymphocyten, insbesondere Thymocyten, für die Behandlung von Pferden wird zur Trennung der Lymphocyten und Blutplättchen von den Granulocyten und Erythrocyten zentrifugiert. Dann wird zur Trennung der Lymphocyten von den Bluttplättchen eine Sedimentation angewandt. Auf diese Weise werden die Thymocyten in im wesentlichen reiner Form erhalten und können in der üblichen Weise für die Injektion von Pferden zui Herstellung von Anti-Human-Thymocytenserum oder -plasma verwendet werden.

Besonders brauchbare Seren und Plasmen dieser Art sind z. B. Anti-Human-Lymphoidserum und -plasma vom Pferd und vom Schaf sowie ähnliche Seren und Plasmen. Aus diesen Quellen isoliertes gereinigtes ^'-Globulin enthält antilymphoide Gewebe — Antikörper, die als Abwehrreaktionen unterdrückende Substanzen besonders wertvoll sind und z. B. die Verträglichkeit gleichartiger Organ- und Hauttransplantate, z. B. von Nieren, Leber, Herz, Lunge und Haut beim Menschen und von ähnlichen Transplantaten bei Tieren, wie Schimpansen und Ratten, erhöhen.

Gewöhnlich besteht die Lösung, auf die das Adsorptionsmittel zur Entfernung der Spuren an ö.g-Diamino^-ethoxyacridinlactatMonohydrat angewandt wird, aus einer wäßrigen Lösung von gereinigtem y-Globulin aus den zuvor genannten Quellen, die z. B. Natriumchlorid als Elektrolyt enthält, insbesondere von gereinigtem y-Globulin aus Anti-Human-Lymphoidserum oder -plasma vom Pferd. Wie oben erwähnt kann die Entfernung des 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrates aus der wäßrigen Lösung aufgrund des Verschwindens der gelben Farbe verfolgt werden, die für das 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat charakteristisch ist. Außerdem kann die Gegenwart von 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat in wäßrigen Lösungen von gereinigtem y-Globulin, aus denen das 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat entfernt wurde, durch UV-Absorptionsmessungen bei 362 mp. (a=38,4) und 268 mμ (a = 138) festgestellt werden. Die im erfindungsgemäßen Verfahren angewandten Silikagel-Adsorptionsmittel sind bekannt und werden im allgemeinen für die Anwendung in der präparativen und analytischen Chromatographie verkauft. Ein geeignetes Gel ist z. B. das von der Firma E. Merck AG, Darmstadt, erhältliche. Es besteht im wesentlichen aus Teilchen mit einem Durchmesser von 0,05 bis 0,12 mm (0,044 bis 0,21 mm lichte Maschenweite). Andere Adsorptionsmittel sind Magnesiumsilikat, Magnesiumtrisilikat, natürliches Calciummagnesiumsilikat, Talkum und ein Zeolith, wie Heulandit, Stilbit, Chabazit, Analcit und Natrolit (Infra-Inorganic Chemistry, Latimer-Hildebrand, MacMillan, 1940). Das Adsorptionsmittel wird in solcher Menge verwendet, daß die in den wäßrigen Lösungen von gereinigtem y-Globulin zurückbleibenden Spuren von 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat wirksam entfernt werden.

Erfindungsgemäß kann beispielsweise tierisches Blutserum oder -plasma, das mit menschlichem lymphoiden Gewebe behandelt wurde, wie Blutserum oder -plasma eines Pferdes, das mit menschlichen Thymocyten behandelt wurde, oder menschliches Blutserum oder -plasma verwendet werden.

Es wird eine wäßrige 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat-Lösung, die etwa 0,1 bis etwa 5 und insbesondere etwa 0,4 Gew.-% 6,9-Diamino-2-ethoxyacridin'actat-Monohydrat enthält, langsam unter Rühren zu dem Serum oder Plasma gegeben, um die anderen Blutproteine außer y-GIobulin, insbesondere die ix- und /J-Globuline, auszufällen. Das Plasma oder Serum hat dabei seinen normalen pH-Wert von etwa 7 bis etwa 8, obgleich es durch die Zugabe eines geeigneten Reagenses, wie Natriumhydroxid oder Natriumbicarbonat, auf pH etwa 7,6 eingestellt werden kann. Die Fällung wird gewöhnlich bei etwa 25° C durchgeführt, obgleich auch niedrigere Temperaturen möglich sind. Je Volumenteil Plasma oder Serum werden 3,5 bis 5, insbesondere etwa 4 Volumenteile der 0,4%igen 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat-Lösung verwendet Man läßt die Fällung vollständig vor sich gehen, wobei das Ausfällen und das Absetzen der Fällung zweckmäßig bei etwa 4° C während eines etwa 15 Minuten langen Stehens bis zu einem Stehen über Nacht und länger erfolgt Die Fällung wird vom löslichen Anteil z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt. Im löslichen Anteil ist das teilweise gereinigte y-Globulin enthalten. Nach der Einstellung des pH-Wertes auf etwa 7,2 mit 0,8 molarem Acetatpuffer wird das y-Globulin durch Zugabe von Aceton oder einem niederen Alkanol, z. B. Isopropanol oder Ethanol, aus dem löslichen Anteil gefällt Zum Beispiel kann man Isopropanol tropfenweise unter Rühren bei 0 bis 6^JC bis zu einer Konzentration von etwa 25% Isopropanol VolWol. zugeben. Hierdurch wird das y-Globulin ausgefällt, und nach einer geeigneten Absetzzeit bei etwa 0°C, z. B. von mehreren Stunden oder über Nacht, wird es durch Filtrieren oder Zentrifugieren gewonnen. Die Fällung aus teilweise gereinigtem y-Globulin, die, wie die gelbe Farbe zeigt, gewöhnlich etwas o^-Diamino^-ethoxyacridinlactat-Monohydrat und manchmal pyrogene Substanzen enthält, wird im kleinstmöglichen Volumen eines geeigneten wäßrigen Lösungsmittels, z. B. 0,9%igem NaCI oder 2,25%igem Glycin, gelöst

Eine wäßrige 0,01 oder 0,02 molare Natriumphosphatlösung mit einem pH-Wert von etwa 6,7 ergibt, wie nachstehend beschrieben, eine Lösung, die sich in zufriedenstellender Weise für die Chromatographie eignet. Danach wird die Lösung des y-Globulins auf eine kleine Adsorptionsmittelsäule oder eine Adsorptionsmittelschicht auf einer geeigneten Unterlage, z. B. einem rauhen Glastrichter, aufgebracht. Gelegentlich kann eine weitere Adsorptionsmittelbehandlung erforderlich sein. Hinsichtlich der geeigneten Verhältnisse von Adsorptionsmittel zu gereinigtem y-Globulin wurde festgestellt, daß ein zufriedenstellender Bereich bei 1 g Adsorptionsmittel zu etwa 0,5 bis etwa 5 g y-Globulin liegt und z. B. völlig zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden, wenn man etwa 4 g Silikagel in Form einer Filterschicht zur Entfernung von 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat aus etwa 2 g gereinigtem y-Globulin in etwa 50 ml Wasser verwendet Die so gewonnene gereinigte y-Globulinlösung erwies sich als frei von 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat und Pyrogenen. Sie wird gefrierkonserviert oder partiell konzentriert, insbesondere durch Entfernung von

Lösungsmittel aus einer gefrorenen Lösung und dann konserviert bis zur Verwendung als kalte Lösung oder als gefriergetrocknetes Produkt

Die Adsorptionsmittelbehandlunj? kann mit anderen Reinigungsverfahren oder Folgen von Reinigungsverfahren kombiniert werden, z. B. bei lymphoidem Anti-Human-Globulin vom Pferd für die Behandlung von Menschen zur Unterdrückung von Abwehrreaktionen, z. B. um der Empfängerreaktion, Organtransplantete abzustoßen, entgegenzuwirken. Zum Beispiel sind nach der Immunisierung von Tieren, z. B. Pferden mit menschlichen Thymocyten im tierischem Serum oder Plasma gewöhnlich Anti-Erythrocyten-Antikörper vorhanden. Diese durch Antigene erzeugten Antikörper werden durch Adsorption an gemischte menschliche rote Blutzellen (A, B, AB, 0 und Rh⁺) entfernt. Daher wird die an y-Globulin reiche Lösung, die nach der

6^-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat-Behandlung zurückbleibt, mit etwa 1/20 bis 1/5, insbesondere 1/10 des Volumens an gewaschenen menschlichen Erythrocyten oder Stroma behandelt und die erhaltene Suspension 1 bis 3 Stunden bei 25° C oder einer niedrigeren Temperatur langsam gerührt. Die Erythrocyten oder das Stroma werden durch geeignete Maßnahmen entfernt, z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren. Es wird also die an y-Globulin reiche Lösung zur Entfernung der Anti-Erythrocyten-Antikörper mit menschlichem Erythrocytenstroma behandelt. Menschliches Erythrocytenstroma, das von Serumproteinen frei ist, wird mit Digitonin hergestellt. Digitonin (0,5 ml einer 5 mg/ml Suspension in 0,9%igt.Ti NaCI) wird zu 10 ml einer gekühlten 10°/oigen Suspension roter Zellen gegeben. Es tritt sofort ein Zellabbau ein, und das Stroma ballt sich zusammen. Die Sedimentation wird bei 34 000 g innerhalb 30 Minuten bei etwa 5°C bewirkt Zur Entfernung von Hämoglobin- und Digitoninspuren wird mit Salzlösung gewaschen. Das Stroma wird als wäßrige Dispersion verwendet, z. B. in 0,9°/oiger wäßriger NaCl-Lösung, gewöhnlich im Verhältnis Erythrocytenäquivalent von 4—5 ml in 1 ml der endgültigen wäßrigen Salzdispersion. Der Anti-Erythrocyten-Titer einer überstehenden, Globulin enthaltenden Flüssigkeit wird durch übliche immunologische Agglutinationsmethoden ermittelt, und, falls erforderlich, werden zusätzliche Adsorptionen durchgeführt. Danach wird die so behandelte Globulinlösung mit Aceton oder dem niederen Alkanol, wie oben beschrieben, gefällt. Das Globulin wird in wäßriger Lösung aufgenommen, die zur Entfernung des 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrales und der Pyrogene mit dem Siliciumdioxid enthaltenden Adsorptionsmittel behandelt wird. Eine weitere Reinigungsstufe umfaßt die Behandlung der y-GIobulinlösung mit einem Anionenaustauscher, z. B. einer Säule aus dem Diethylaminoethylether der Cellulose, der in der Technik als Diethylaminoethylcellulose (DEAE-CeIIuIose) bekannt ist. Die Säule wird zuvor mit dem Lösungsmittel ins Gleichgewicht gebracht, das zur Herstellung der y-Globulinlösung verwendet wurde, insbesondere mit 0,01 bis 0,02 molarem Natriumphosphat vom pH etwa 6,7. Nach dem Aufbringen der y-Globulinlösung auf die Säule wird mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert, und die Elution wird durch Ermittlung der Proteinabsorption bei 280 ηιμ verfolgt. Die Dimensionen der Säule sind 5 bis 10 cm Durchmesser und bis zu 80 cm Höhe bei Fließgeschwindigkeiten von etwa 120 bis 480 ml je Stunde. Diejenigen Fraktionen, die wesentliche Absorptionen zeigen, werden unter Anwendung bekannter immunologischer oder elektrophoretischer Untersuchungsmethoden auf ihren Gehalt an y-Globulin untersucht Das y-Globulin tritt normalerweise als erstes Protein aus der Säule aus, während das Transferrin fester gebunden wird Das y-Globulin wird gewonnen, z. B. durch Fällung mit Aceton oder einem niederen Alkanol, wie oben angegeben, und die Fällung wird abgetrennt. Die weitere Behandlung umfaßt das Trocknen im Vakuum

ίο oder die Gefriertrocknung. Das y-Globulin kann aber auch in einem wäßrigen Träger für die parenterale Verabreichung, z. B. 0,3 molarem Glycerin, gelöst, durch Filtration sterilisiert und bei 0 bis 4° C aufbewahrt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise so durchgeführt werden, daß man

(a) Plasma oder Serum bei pH 7 bis 8 mit etwa 3,5 bis etwa 5 Volumenieilen 0,4%iger wäßriger 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat-Lösung versetzt und den löslichen Anteil vom unlöslichen Anteil trennt,

(b) den löslichen Anteil bei pH etwa 7 bis etwa 8 mit menschlichem Erythrocytenstroma oder Erythrocyten vermischt und den löslichen Anteil gewinnt,

(c) aus dem löslichen Anteil bei pH etwa 7 bis etwa 8 durch Zugabe von Aceton oder einem niederen Alkanol bis zu einer Konzentration des Acetons oder des niedrigen Alkanols von etwa 20 bis etwa

j» 30% Vol./Vol. das y-Globulin ausfällt und die Fällung gewinnt,

(d) das ausgefällte y-Globulin in Phosphatpuffer vom pH etwa 6,5 bis etwa 7,5 löst, die erhaltene Lösung mit Silikagel behandelt und den löslichen Anteil

r> gewinnt.

(e) den löslichen Anteil über Diethylaminoethylcellulose führt, die mit Phosphatpuffer vom pH etwa 6,7 ins Gleichgewicht gebracht worden ist, und die Diethylaminoethylcellulose mit Phosphatpuffer

■ii vom pH etwa 6,7 eluiert und

(f) aus dem Eluat durch Feststellung der Absorption bei 280 ιημ y-Globulin gewinnt.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung des . erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beispiel 1
y-Globulin aus normalem Pferdeserum

Zu 100 ml normalem Pferdeserum werden unter Rühren innerhalb von etwa 30 Minuten tropfenweise 400 ml 0,4%iges wäßriges e^-Diamino-S-ethoxyacridinlactat-Monohydrat zugesetzt. Man läßt dann das Gemisch bei etwa 4°C etwa 4 Stunden absitzen. Die ·> Filtration ergibt einen unlöslichen Anteil, der verworfen wird, und einen löslichen Anteil, zu dem tropfenweise 167 ml Isopropanol (Temperatur —20⁰C) gegeben werden. Die Temperatur des Gemischs bleibt bei etwa 0⁰C. Man läßt das Gemisch bei etwa 0⁰C 4 Stunden absitzen. Nach dieser Periode des Absetzens und Ausflockens wird das Gemisch 10 Minuten bei 2000 UpM zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird abgegossen und verworfen. Zum Lösen des mit 25% Isopropanol ausgefällten Niederschlages werden 30 ml 2,25%iges wäßriges Glycin verwendet. Diese Lösung wird durch eine Schicht aus mit Wasser cingeschlämmtem Silikagel filtriert (Durchmesser 2 cm, Höhe 2,7 cm). Das unlösliche Material wird auf dem

Filter mil 5 ml weiterer Glycinlösung und 10 ml Wasser gewaschen. Das Filtrat wird gefroren und in gefrorenem Zustand getrocknet. Die Trockenausbeute betrug 2,53 g, von denen etwa 788 mg als Glycin errechnet wurden. Der Rest von 1,74 g bestand aus y-Globulin. Dieses ■> y-Globulin erwies sich als frei von pyrogenen Substanzen, wenn es nach dem Test der Food and Drug Administration 141 A.3. auf Pyrogene untersucht wird.

10

Beispiel 2 Behandlung mit Silikagel

4000 ml einer Globulinlösung in 0,01 molarem wäßrigem Phosphatpuffer vom pH 6,7 werden mit Silikagel behandelt. Zur Herstellung einer 10 cm χ 14 cm Säule werden 500 g Silikagel, aufgeschlämmt in Wasser, verwendet. Die wäßrige y-Globulinlösung wird durch die Säule geführt, und die Säule wird mit weiterem Puffer gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen, 6600 ml, sind frei von 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat. Bei dem verwendeten Globulin handelte es sich um Anti-Human-Thymocytenglobulin vom Pferd.

Beispiel 3 Behandlung mit Silikagel

2000 ml einer Lösung von y-Globulin in 0,01 molarem wäßrigem Phosphatpuffer vom pH 6,7 werden mit 500 g Silikagel behandelt, das als wäßrige Aufschlämmung zur Bildung einer 10 cm χ 14 cm Säule verwendet wird. Das Gel wird mit weiterem Puffer gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen, 2800 ml. sind frei von J5 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat. Das Globulin war ein Anti-Human-Thymocytenglobulin vom Pferd.

Beispiel 4 Behandlung mit Silikagel

Wie in den Beispielen 2 und 3 werden 3000 ml wäßrige y-Globulinlösung mit 600 g Silikagel behandelt. Das Filtrat und die Waschlösungen sind frei von 6.9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat.

B e i s ρ i e I 5 in

Behandlung mit Silicagel nach Vorbehandlung mit o^-Diamino^-ethoxyacridinlactat-

Monohydrat und Stroma

5675 ml Anti-Human-Thymocytenplasma vom Pferd werden mit 350 m! 0,9 molarem Natriumbicarbonat auf pH 7,6 eingestellt. Das Bicarbonat wird langsam unter Rühren zugesetzt. Dann werden langsam unter Rühren 24 100 ml 0,4%ige wäßrige 6.9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat-Lösung dem Plasma zugesetzt. Das Gemisch wird über Nacht in einem Kühlschrank bei etwa 4°C stehengelassen. Nach dieser Periode des Stehens ist die Fällung gut ausgeflockt, und das Gemisch läßt sich leicht in einen unlöslichen und einen löslichen Teil trennen. Das Filtrat wird mit 0.8 molarem Acetatpuffer auf pH 72 eingestellt. Dann werden 113.5 ml einer wäßrigen Stromaaufschlämmung in einer 0.9%igen wäßrigen Natriumchloridlösung zugegeben und das Ganze wird etwa 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch läßt man über Nacht in einem Kühlschrank stehen und filtriert es dann. Der Rückstand wird verworfen, und das Filtrat wird nochmals mit 113,5 ml wäßriger Stromaaufschlämmung in 0,9%igem Natriumchlorid behandelt. Es wird wieder filtriert, und der Hämagglutinationstiter an diesem Punkt beträgt 1-2.

Nach dem gleichen Verfahren werden 1875 ml Anti-Human-Thymocytenplasma vom Pferd mit 87 ml 0,9 molarem Natriumbicarbonat auf pH 7,6 eingestellt. Danach werden langsam unter Rühren 7848 ml 0,4%iger wäßriger 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat-Lösung zugegeben, und das Gemisch wird stehengelassen. Nach vollständiger Ausflockung wird filtriert und der Rückstand verworfen. Das Filtrat wird mit 0,8 molarem Acetatpuffer auf pH 7,2 eingestellt. Für die erste Adsorption unerwünschter Antikörper werden 37,5 ml Stromaaufschlämmung verwendet, und nach dem Filtrieren wird die Stromabehandlung mit weiteren 37,5 ml Stromaaufschlämmung wiederholt. Zu diesem Zeitpunkt beträgt der Hämagglutinationstiter 1 —2.

Die so gewonnenen und vereinigten mit 6,9-Diamirio-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat und Stroma vorbehandelten Filtrate niederen Titers werden zur Fällung von gereinigtem y-Globulin mit 12 666 ml vorgekühltem Isopropanol, Temperatur etwa — 20°C, versetzt. Die Temperatur des Fällungsgemisches wird langsam auf — 5°C verringert. Die Konzentration des Isopropanols in der Mischung beträgt dann 25% Vol./Vol. Nach dem Stehen über Nacht bei — 5°C wird durch 10 Minuten langes Zentrifugieren bei 2000 UpM die y-Globulin-Fäll'ing von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt. Die Flüssigkeit wird verworfen. Die Fällung wird mit dem kleinstmöglichen Volumen an 0,01 molarem Phosphatpuffer vom pH 6,7 ausgezogen, und die Lösung wird etwa 10 Minuten bei 2000 UpM zentrifugiert. Der Rückstand wird verworfen und das Filtrat für die nachfolgende Behandlung mit Silikagel zur Entfernung von Spuren von 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat und Pyrogenen verwendet.

Beispiel 6

Behandlung mit Silicagel nach 6,9-Diamino-

2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat-Fällung und

Stromabehandlung

4300 ml Anti-Human-Thymocytenplasma vom Pferd werden mit 128 ml 0,9 molarem Natriumbicarbonat auf pH 7.6 eingestellt. Unter Rühren werden 17 712 ml 0.4%ige wäßrige e.g-Diamino^-ethoxyacridinlactat-Monohydrat-Losung zugegeben, und das Gemisch wiru 8 Stunden bei etwa 4°C stehengelassen. Danach läßt sich durch Filtrieren der Rückstand leicht entfernen. Er wird verworfen. Das Filtrat wird mit 0,8 molarem Acetatpuffer auf pH 72 eingestellt. Zur Entfernung von Erythrocyten-Antikörpern werden 86 ml Stroma von roten Blutzellen zugefügt Nach dem Filtrieren wird die Stromabehandlung mit 108 ml Stromaufschlämmung wiederholt. Nach der Filtration beträgt der Hämagglutinationstiter 0. Die Lösung wird auf O⁰C gekühlt und der pH-Wert mit Acetatpuffer auf 72 eingestellt. Wie in anderen Beispielen wird Isopropanol. hier in einer Menge von 7 033 ml, zur Fällung von gereinigtem y-Globulin zugesetzt. Dieses wird für die weitere Behandlung mit Silikagel und Diethylaminoethylcellulose in 2 1 0,01 molarem Phosphatpuffer vom pH 6,7 gelöst

Beispiel 7
y-Globulin aus Anti-Rauenserum der Ziege

Zu 210 ml Anti-Rattenserum von Ziegen werden bei pH 7,65 innerhalb von etwa 30 Minuten tropfenweise 840 ml 0,4%ige wäßrige e^-Diamino^-ethoxyacridinlactat-Monohydrat-Lösung zugesetzt. Das Gemisch läßt man dann bei etwa 4⁰C etwa 4 Stunden absitzen. Die Zentrifugation ergibt einen unlöslichen Anteil, der verworfen wird, und einen löslichen Anteil, der auf 0°C gekühlt, tropfenweise mit 350 ml Isopropanol von -20°C versetzt wird. Die Temperatur bleibt bei etwa 0 bis 5°C. Das Gemisch läßt man über Nacht bei etwa 0⁰C stehen. Nach dieser Periode des Ausflockens wird das Gemisch 10 Minuten bei 2000 UpM und etwa 5⁰C zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird abgegossen und verworfen. Der unlösliche Teil wird mit 0,15 molarer Natriumchloridlösung ausgezogen, um das mit 25% Isopropanol ausgefällte Material zu lösen. Diese Lösung wird durch eine 12ml-Schicht aus Silikagel filtriert, die in 0,15 molarer Natriumchloridlösung auf einen 15 ml rauhen gesinterten Glastrichter geschlämmt worden war. Nach dem Filtrieren de^r Lösung wird das Silikagel auf dem Trichter mit 5 ml 0,15 molarer Natriumchloridlösung gewaschen. Das Gesamtvolumen an Filtrat und Waschlösungen beträgt 52,5 ml. Die y-Globulinfraktion macht 2,625 g aus, ermittelt durch O.D. bei 280 mm. Sie ist frei von 6,9-Diamino-2-ethoxyacridiniactat-Monohydrat.

Beispiel 8
Behandlung mit Magnesiumsilikat

Nach dem Verfahren des Beispiels 2, jedoch unter Verwendung von 500 g Magnesiumsilikat anstelle von 500 g Silikagel wurde eine ebenso gute Entfernung des 6,9- Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrates erreicht.

Beispiel 9
Behandlung mit Magnesiumtrisilikat

Nach dem Verfahren des Beispiels 3 wurde bei Verwendung von 500 g Magnesiumtrisilikat anstelle von 500 g Silikagel ebenfalls eine gute Entfernung von 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat erzielt.

Beispiel 10
Behandlung mit Calciummagnesiumsilikat

Bei Anwendung des Verfahrens nach Beispiel 4, jedoch unter Verwendung von 600 g natürlichem Calciummagnesiumsilikat anstelle von 600 g Silikagel war die Entfernung des 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinIactat-Monohydrates gleichfalls zufriedenstellend.

Beispiel 11
Behandlung mit Magnesiumsilikat

Ein ebenso gutes Ergebnis erzielte man, wenn man beim Verfahren des Beispiels 7 das Silikagel durch Magnesiumsilikat ersetzte.

Beispiel 12
Behandlung mit Silikagel

2000 ml menschliches Plasma (frei von hämophylem Faktor) vom pH 7,3 werden durch Zugabe von 33 ml 0,8

molarem NaHCOj auf pH 7,6 eingestellt. Unter Rühren werden darauf 8 I 0,4%ige wäßrige 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat-Lösung zugegeben. Dann wird das Gemisch über Nacht in einen Küh'schrank gestellt. Die überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert. Volumen 9680 ml; Gesamtfeststoffe 307,8 g, Naßgewicht. Sie wird in zwei gleiche Teile von je 840 ml geteilt.

Behandlung des Teils I

Der Teil I wird langsam durch eine Schicht aus etwa 200 g Silikagel auf einem Glasfritten-Filter geführt und mit Wasser gewaschen.

Gesamtvolumen 5050 ml. Er ist frei von 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat. Dann wird auf 0⁰C gekühlt, der pH-Wert beträgt 6,9. Er wird mit 0,8 molarer NaHCC^-Lösung auf 7,2 eingestellt. Anschließend werden 1802,5 ml 95%iges Ethanol zugefügt, und das Gemisch wird über Nacht bei -5°C in einem Kühlschrank gehalten. Die klare überstehende Flüssigkeit wird abgegossen und verworfen. Die zurückbleibende Suspension wird in der Kälte zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit verworfen. Die Fällung wird in 100 ml 0,3 molarem Glycin aufgenommen, der pH-Wert

2-> wird durch Zugabe von 0,1 molarer Essigsäure auf 6,8 eingestellt. Der Niederschlag löst sich vollständig. Das Gesamtvolumen beträgt 161 ml. Die Lösung wird gefriergetrocknet und ergibt 8,87 g Feststoffe, die aus 6,62 g menschlichem y-Globulin und 2,25 g Glycin

i<> bestehen.

Behandlung des Teils Il

Der Teil II, pH 7,75, wird mit 0,1 molarer Essigsäure

Ji auf pH 7,2 eingestellt. Dann werden langsam unter Rühren 1727,5 ml kaltes Ethanol zugegeben. Das Gemisch wird über Nacht bei — 5°C in einem Kühlschrank gehalten. Die klare überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert und verworfen. Die zurückbleibende Suspension wird zentrifugiert und die übersiehende Flüssigkeit verworfen. Die Fällung wird zur Entfernung restlichen Ethanols unter Vakuum gehalten und dann in 600 ml 0,01 molarem Kaliumphosphatpuffer vom pH 6,8 aufgenommen. Die erhaltene Lösung wird durch eine Schicht von 450 ml Diethylaminoethylcellulose und dann durch eine Schicht von etwa 200 g Silikagel geführt. Das Gesamtvolumen, einschließlich der Waschwässer, beträgt 1500 ml. Es ist frei von 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat. Protein (OD₂Zs), 6,375 g, der pH-Wert beträgt 7,2. Es wird auf 0°C gekühlt und mit 535 ml 95%igem Ethanol versetzt. Nach uerii Sieben über Nacni im rvüniSCnrariK wird das Gemisch zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit verworfen. Die Fällung wird in 100 ml 0,3 molarem Glycin gelöst. Der pH-Wert wird mit 0,1 molarer Essigsäure auf 6,8 eingestellt. Das Gemisch wird zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit gefriergetrocknet. Man erhält 8,27 g Feststoffe, die aus 6,02 g menschlichem y-Globulin und 2,25 g Glycin

bo bestehen.

Beispiel 13
Behandlung mit anderen Adsorptionsmitteln

Ebenso gute Ergebnisse bei der Entfernung von 6.9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat werden erhalten, wenn man in den obigen Beispielen gleiche Mengen an Talkum oder eines Zeolhhs, wie Heulandit,

Stilbit, Chabazit, Analcit oder Natrolit verwendet, bei denen es sich um mineralische Silikate handelt, die auf S. 305 des Reference Book of Inorganic Chemistry, W. M. Lattimer und J. H. Hildebrand, Revised Edition, The MacMillan Company, 1940, aufgeführt sind.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Reinigung von Proteinen des Blutserums oder Blutplasmas, wobei 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrat zur Abtrennung des y-Globulins von den anderen Proteinen verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Entfernung des 6,9-Diamino-2-ethoxyacridinlactat-Monohydrates aus einer wäßrigen y-GIobulinlösung diese Lösung mit einer für die Adsorption des e^-Diamino^-ethoxyacridinlactat-Monohydrates wirksamen Menge Silikagel, Magnesiumsilikat, Magnesiumtrisilikat, natürlichem Calciummagnesiumsilikat, Talkum, Heulandit, Stilbit, Chabazid, Analcit oder Natrolit in Berührung bringt und das Adsorptionsmittel abtrennt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adsorptionsmittel Silikagel verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adsorptionsmittel Silikagel-Teilchen mit einem Durchmesser von 0,05—0,12 mm in Mengen von 1 g pro 0,5 bis 5 g y-Globulin verwendet.