DE2443119A1

DE2443119A1 - Selektive entfernung von albumin aus blutfluessigkeiten sowie substanzen zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE2443119A1
Application number: DE2443119A
Authority: DE
Inventors: Ralph Prof Pannell; James Prof Travis
Original assignee: Research Corp
Current assignee: Research Corp
Priority date: 1973-09-10
Filing date: 1974-09-09
Publication date: 1975-03-13
Also published as: IL45618A; SE7411373L; CH600782A5; CA1034569A; NL7411909A; JPS5126900A; GB1461528A; IL45618A0; FR2243438A1; IT1021253B

Description

Selektive Entfernung von Albumin aus Blutflüssigkeiten sowie Substanzen zur Durchfünrung des Verfahrens

Die Erfindung betrifft die selektive Fraktionierung von Proteinen in Blutflüssigkeiten.

Bekanntlich enthalten Blutflüssigkeiten, wie Plasma und Serum, viele Proteine, die man gern in reinem Zustand isolieren möchte. Isolierungsverfahren für derartige Proteine sind bekannt, jedoch leiden sie sämtlich unter einem gemeinsamen Nachteil, nämlich der Anwesenheit von Albumin, dem Hauptproteinbestandteil im Plasma. Abgesehen davon, daß es bei den genannten Verfahren eine unerwünschte Verunreinigung ist, mochte man häufig reines Albumin ohne gleichzeitige Verunreinigung durch andere Proteine isolieren.

Weiter ist es bekannt, daß bestimmte Proteine sehr fest an bestimmte reaktionsfähige Farbstoffe gebunden werden. Beispielsweise wird Dextranblau (Blue

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Dextran) fest an Lysozym, Ovalbumin und Hämoglobin gebunden, wenn diese positiv aufgeladen sind, sowie unabhängig von der Ladung an Rinderserumalbumin. Dextranblau ist ein Farbstoff, der allgemein unter der Bezeichnung Procion Blue HBS bekannt ist und in dem das Chloratom des Triazinrestes im Farbstoff durch polymeres Dextran, das über ein Sauerstoffatom an den Triazinrest gebunden ist, ersetzt ist (White and Jencks, Binding of Proteins to Blue Dextran, Nr. 43, Biol., Abstracts, i60th National Meeting, American Chemical Society, September 14, -18, 1970). Jedoch ist Dextranblau wasserlöslich. Daher müßte Dextranblau mit einem festen Substrat gekuppelt werden, von dem das Albumin en*tfernt werden kann.

Weiter ist ein Verfahren zur Proteinreinigung durch Affinitätschromatographie bekannt (J.Biol.Chem. 245, 3059, (1970)). Bei diesem Verfahren werden unlösliche Materialien hergestellt, indem man bestimmte große Moleküle, die Aminogruppen enthalten, an Agarose kuppelt, indem man die Agarose mit Bromcyan aktiviert und die aktivierte Agarose anschließend mit dem aninogruppenhaltigen Rest umsetzt.

Weiter ist es aus J. Chromatogr., 6g, 209, (1972) bekannt, daß das Kondensationsprodukt von Cibacron Blue F3G-A, auch als Procion Blue HBS bekannt, mit Dextran 2000, das auch als Blue Dextran 2000 der Firma Pharmacia, Uppsala, Schweden bekannt ist, eine hohe Affinität gegenüber dem Enzym Phosphofructokinase besitzt. Andererseits zeigte das Kondensationsprodukt von Dextran 2000 mit Cibacron Brilliant Blue FBR-P, einem Farbstoff mit außerordentlich ähnlicher Struktur, keinerlei Affinität gegenüber Phosphofructokinase. Eine Aktivität ergab sich auch nicht, wenn man Blue Dextran mit durch Bromcyan aktivierter Sepharose kuppelte.

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Die Spezifizität von Farbstoffen gegenüber bestimmten Polypeptiden ist daher nicht voraussagbar.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Entwicklung eines Verfahrens, durch das Albumin selektiv aus Blutflüssigkeiten entfernt werden kann, ohne daß gleichzeitig andere Proteine mit entfernt werden, die in sehr geringen Mengen anwesend sein können.

Weiterhin ist Aufgabe der Erfindung die Schaffung eines Verfahrens, gemäß dem das Albumin derart entfernt werden kann, daß die Absorptionskapazität des Substrates keine Einbuße erleidet und das Albumin so wiedergewonnen werden kann, daß es nicht einer Denaturierung unterliegt.

Es wurde gefunden, daß bestimmte reaktionsfähige Farbstoffe nach Kupplung an bestimmte feste Trägerphasen eine Substanz liefern, an die Albumin selektiv aus praktisch zellfreien wäßrigen Flüssigkeiten,_;wie Plasma oder Serum, adsorbiert werden kann. Das adsorbierte Albumin kann in hoher Ausbeute ohne Denaturierung aus diesen Substanzen wieder abgetrennt werden, die ihrerseits ohne Verlust an ihrer adsorptiven Kapazität wiederverwendet werden können. Die Trägerphasen, die zu diesem Zweck verwendet werden können, sind Agarose, insbesondere Sepharose, Polyacrylamide, insbesondere vernetztes Polyacrylamidgel, sowie Acrylharze, insbesondere Anionaustauscherharze, wie Amberlite IRC 45, die eine Aminogruppe enthalten.

Diese Trägerphasen sind, wie bereits erwähnt, an bestimmte reaktionsfähige Farbstoffe CRD gebunden, wobei die Farbstoffe sämtlich im Colorindex enthalten sind.

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Gegenstand der Erfindung sind die in Anspruch 1 gekennzeichneten Substanzen sowie das in Anspruch -4 gekennzeichnete Verfahren.

Die Adsorption des Albumins an die Substanz aus Trägerphase und reaktionsfähigem Farbstoff aus der zu von ihm befreienden Flüssigkeit wird zweckmäßig in einem Puffer mit einer Molarität von mindestens 0,05 und bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 durchgeführt. Zweckmäßig wird die Suspension aus der Substanz aus Trägerphase und reaktionsfähigem Farbstoff auf eine Chromatographiersäule gegeben und die praktisch zellfreie albuminhaltige Flüssigkeit durch die Säule hindurchlaufen gelassen. Das Eluat ist praktisch albuminfrei und kann in jeder gewünschten Weise weiterverarbeitet werden.

Das Albumin wird anschließend von der Verbindung aus Trägerphase und reaktionsfähigem Farbstoff zweckmäßig durch Eluieren, vorzugsweise Eluieren einer Säule entfernt. Die Elutionsmlttel können eine wäßrige Harnstofflösung, eine wäßrig/äthanolische Lösung von Alkaliphosphat, eine wäßrige Lösung von basisch gepufferten Alkancarbonsäuren mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen oder wäßrige Lösungen von Verbindungen aus Kationen von Metallen der Gruppe 2A des Periodensystems und von Kalium mit pharmazeutisch annehmbaren Anlonen bestehen. Die Verwendung irgendeines dieser Elutionsmittel liefert eine Verbindung aus Trägerphase und reaktivem Farbstoff mit erneuerter Aktivität, die zur Entfernung weiterer Albuminmengen aus weiteren Albumin enthaltenden Flüssigkeiten wiederverwendet werden kann. Wenn es jedoch erwünscht ist, reines, nicht denaturiertes Albumin zu isolieren, müssen die beiden zuletztgenannten Gruppen von Lösungsmitteln verwendet werden. Das Albumin kann dann von ihnen etwa durch Lyophilisieren in üblicher Welse isoliert werden.

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~⁵~ 2U3119

In einer Ausführungsform der Erfindung kann als Trägerphase Agarose, vorzugsweise in Form von Sepharose, die in der Form gepackter Sepharose (beispielsweise vom Grad 2B, 4B oder 6B) oder vernetzter Sepharose (beispielsweise vom Grade 2B, 4B oder 6B) vorliegen kann, verwendet werden. Wie oben erwähnt, weisen die reaktionsfähigen Farbstoffe, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, bestimmte gemeinsame Strukturmerkmale auf. Einige dieser Farbstoffe können im einzelnen näher mit Hilfe ihrer allgemeinen Colorindexbezeichnung, ihrer Colorindexnummer oder ihres Handelsnamens Identifiziert werden. Unter diesen Farbstoffen befinden sich die folgendenϊ CI Reactive Orange 2 (CI Constitution No. 17865_ff auch als Cibacron Orange G-E oder Procion Brilliant Orange HGRS bekanni^, CI Reactive Red 4 (CICN 18105, auch als Cibacron Brilliant Red 3B-A oder Procion Brilliant Red H7BS bekannt), CI Reactive Brown 1 (CICN 26440, auch als Cibacron Brown 3GR-A oder Procion Orange Brown HGS bekannt)j ' CI Reactive Red 9 (CICN 17910, auch als Cibacron Scarlet 2G öder Procion Scarlet H3GS bekannt.) Von ähnlicher Struktur ist CI Reactive Red 16, auch als Cibacron Scarlet 4G-B bekannt. Ferner gehören in diese Gruppe die Anthrachinonfarben CI Reactive Blue 2 (CICN 61211, auch als Cibacron Blue F3G-A oder Procion Blue HBS bekannt und CI Reactive Blue 5 (CICN 61210, auch als Cibacron Brilliant Blue FBR-P bekannt«,)

Verfahren zur Herstellung sämtlicher genannter Farbstoffe finden sich in CoLCzech.Chem.Commune., 25» 2783 (1960).

Im Rahmen der Erfindung liegen auch sölcherVerbindungen, in denen die endständige Benzolsulfonsäuregruppe durch einen anderen Substltuenten ersetzt ist, wie beispielsweise eine Alkyl-, Phenyl*-, Alkylphehyl-,

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Alkaxyphenylgruppe, Wasserstoff oder dgl. Ein typischer Vertreter dieser Gruppe ist CI Reactive Red (CICN 18159, vgl. Coloristica Buletin Informativ, 4, (Nr. 11, 1968)
179-200.

Sämtliche der genannten Farbstoffe können mit den Trägerphasensubstraten durch Erhitzen in Wasser bei mäßig erhöhten Temperaturen, zweckmäßig oberhalb eines pH-Wertes von 6,0, gekuppelt werden. Bei einer bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Gemische unter Rühren auf 75 bis 95 ⁰C erhitzt» danach gekühlt und zur Entfernung von freiem Farbstoff gewaschen.

Das Gewichtsverhältnis von Farbstoff zu Trägerphase ist nicht von ausschlaggebender Bedeutung.

Wenn zu wenig Farbstoff verwendet wird, wird die Wirksamkeit des Extrakt!onsverfahrens angesichts der
in zu geringem Maße vorhandenen Adsorptionsstellen verringert. Wird zu viel Farbstoff verwendet, wird das
Verfahren nicht nur unwirtschaftlich, sondern es treten auch sterische Störungen auf, die ebenfalls dazu führen, daß die Zahl der verfügbaren Adsorptionsstellen für das Albumin verringert wird.

Je 4 g Trägerphase können 0,1 bis 5 g Farbstoff verwendet werden. Bevorzugt ist jedoch die Verwendung von 0_t2 bis 1 g Farbstoff je 4 g Trägerphase. Aus praktischen Gesichtspunkten wird die Trägerphase jedoch gewöhnlich nicht gewichtsmäßig bestimmt, sondern durch das Volumen an abgesetzter Trägerphase in wäßriger Suspension. Im Falle von Sepharose als Trägerphase entsprechen 4 g Sepharose praktisch 100 cm abgesetzter Sepharose.

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Natürlich variiert das Verhältnis von Gewicht zu Volumen mit der chemischen Natur der Trägerphase sowie der Korngröße, die durch die Grade 2B, 4B und 6B von Sepharose für die allgemein erhältlichen Trägerphasen repräsentiert wird, doch sind die angegebenen Verhältnisse hinreichend genau, um einen zufriedenstellenden Arbeitsbereich zu erhalten·

In einer bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird für die Kupplung der Farbstoff etwa in einer Menge von 0,1 bis 2 g, vorzugsweise von 0,2 bis 1 g in einer geringen Wassermenge gelöst oder suspendiert (zwischen 10 und 50 ml sind im allgemeinen ausreichend), und zu 100 ml Trägerphase in Wasser (gemessen als gesetzte Trägerphase) hinzugegeben. Die Wassermenge, die zur Suspendierung der Trägerphase verwendet wird, ist nicht von ausschlaggebender Bedeutung? zwischen 100 und 1000 ml haben sich als geeignet erwiesen. Das Gemisch wird leicht gerührt und bis unterhalb des Siedepunktes des Wassers erwärmt. Als befriedigend hat sich ein Temperaturbereich von 75 bis 95 ⁰C erwiesen. Der pH-Wert der Lösung wird leicht oberhalb von 6 gehalten, zweckmäßig zwischen 6 und 8, indem man entweder wäßriges Alkali oder einen Puffer zugibt. Die Umsetzungsdauer hängt von dem Verdünnungsgrad des Farbstoffs, der Temperatur und der Aufrührung der Trägerphase ab. Sie liegt im allgemeinen zwischen etwa 5 bis etwa 60 min. Das Kupplungsprodukt (SP/CRD) wird dann von der wäßrigen Phase - zweckmäßig durch Dekantieren - abgetrennt und zur Entfernung nicht umgesetzten Farbstoffes gewaschen. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, gründlich mit Wasser bei Raumtemperatur und anschließend mit einem geeigneten Salz, wie beispielsweise Guanidinhydrochlorid (5-molar), das jegliche Reste nicht umgesetzten Farbstoffes entfernt, zu waschen. Die Verwendung von Guanidinhydrochloridlösung

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ist jedoch nicht von ausschlaggebender Bedeutung, und es können auch andere Waschflüssigkeiten verwendet werden.

Das auf diese Weise gereinigte Kupplungsprodukt wird anschließend in einem Puffer suspendiert, zweckmäßig einem solchen mit einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5· Die absorptive Kapazität des so erhaltenen Produktes für Albumin hängt natürlich von dem Verhältnis von Farbstoff zu Trägerphase ab. Jedoch besitzen Produkte, die gemäß den beschriebenen Vorschriften hergestellt worden sind, eine absorptive Kapazität in der Größenordnung von 30 mg Albumin je ml abgesetzten Kupplungsproduktes·

Selbstverständlich reagieren unterschiedliche Farbstoffe mit unterschiedlichen Trägerphasen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten· Außerdem muß darauf geachtet werden, daß die Trägerphase nicht physikalisch verändert wird, d.h. während des Kupplung s vor ganges nicht teilweise oder vollständig schmilzt. Beispielsweise reagiert Cibacron Blue F-3GA sehr rasch mit Sepharose bei 80 ⁰C, während andere Farbstoffe bei dieser Temperatur mit gewöhnlicher Sepharose sehr langsam kuppeln. Während die Kupplung bei 90 ⁰C rasch erfolgt, ist das hergestellte Produkt, wenngleich verwendbar, jedoch nicht mit den optimalen physikalischen Eigenschaften versehen. Wenn daher höhere Umsetzungstemperaturen erforderlich sind, ist es zweckmäßig, vernetzte Trägerphasen, wie beispielsweise vernetzte Sepharose, zu verwenden. ·

Beispiele für weitere Trägerphasen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind Polyacrylamidgele und aminogruppenhaltige Acrylharze, wie beispielsweise Amberlite® IRC 45.

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Ebenfalls verwendbar sind die Dextranderivate von Cibacron Blue F3GA und Cibacron Brilliant Blue FBR-P. Bei diesen Farbstoffen ist die Chlorgruppe des Triazinrestes durch eine Sauerstoffbindung zu einem Dextranmolekül ersetzt· Der zuerst genannte Farbstoff liefert mit Dextran 2000 das Produkt Blue Dextran 2000®.

Die genannten Verfahren zur Herstellung der Kupplungsprodukte beruhen auf der Umsetzung einer . Halogengruppe am Triazynrest mit einer labilen Gruppe der Trägerphase. Eine derartige Umsetzung ist nicht durchführbar, wenn diese Gruppe durch eine -0-Dextranbindung ersetzt worden ist. Dessen ungeachtet kann die Kupplung in den Fällen, in denen der Farbstoff eine labile Aminogruppe, wie beispielsweise die primäre Aminogruppe an dem Anthrachinon Rest von Cibacron Blue F3GA und Cibacron Brilliant Blue FBR-P besitzt, mit Hilfe der oben erwähnten Bromcyanmethode durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren wird die Trägerphase durch Behandlung mit wäßrig-alkalischem Bromcyan aktiviert und die in geeigneter Weise gepufferte Trägerphase mit dem Farbstoff umgesetzt. Bei diesem Verfahren wird, dann das Produkt aus Dextran und Farbstoff in einen ahnlichen Puffer der aktivierten Trägerphase zugesetzt und die Kupplung ablaufen gelassen. Die Kupplungsreaktion kann bei Temperaturen zwischen 0 ⁰C und Raumtemperatur stattfinden, jedoch wird sie vorzugsweise etwa 24 Stunden lang bei etwa 4 ⁰C durchgeführt. Nach Ablauf dieser Zeit wird das Kupplungsprodukt nacheinander mit wäßrigem Natriumbicarbonat vom pH-Wert von etwa 9»5, konzentriertem wäßrigem Harnstoff (etwa 6-molar), Wasser und einem Puffer von hoher Ionenkonzentration und einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 gewaschen. Vorzugsweise wird ein Tris-HCl/wäßriges Natriumchlorid-Buffer verwendet. Das Produkt aus Sepharose, Dextran und Farbstoff wird

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dann in frischem Puffer suspendiert und kann bis zu seiner Verwendung bei etwa 4 ⁰C aufbewahrt werden.

Bei der praktisohen Durchführung der Albuminentfernung hat es sich als zweckmäßig erwiesen, das Kupplungsprodukt in einen Puffer von hoher Ionenkonzentration in einer Säule einzubringen. Als besonders zweckmäßig hat sich hierfür der oben erwähnte Tris-HCl/Natriumchlorid-Puffer erwiesen. Die hohe Ionenkonzentration des Puffersystems ist für die Durchführung des Verfahrens ausschlaggebend, da sie verhindert, daß das Kupplungsprodukt als Kationenaustauscher wirkt. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, etwa 2 ml albuminhaltiges Plasma auf etwa 10 ml abgesetztes Kupplungsprodukt zu verwenden. Das Plasma wird anschließend durch die Säule laufengelassen und die Säule mit dem genannten Puffer gewaschen. Die Eluierung wurde durch uv Adsorption des Eluats verfolgt.

Wie oben erwähnt, ist der ausschlaggebende Faktor bei diesem Verfahren Ionenkonzentration des Puffersystems. Um wirksam zu sein, muß der Puffer mindestens eine 0,05-molare Ionenkonzentration bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 und vorzugsweise etwa 8,0 besitzen, wobei keine Obergrenze einzuhalten ist.

Das auf diese Weise erhaltene Eluat ist praktisch frei von Albumin, und die restlichen Proteine können aus ihm in bekannter Weise isoliert werden. Untersuchung und Vergleich des Anfangsplasmas und des Eluates zeigten, daß außer dem Albumin lediglich geringe Mengen der anderen Proteine, hauptsächlich Lipoproteine, entfernt werden.

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Die Säule kann durch Aufbrechen der Bindung zwi- ' sehen dem Albumin und dem Kupplungsprodukt regeneriert werden. In den Fällen, in denen die Erhaltung des Albumins nicht erforderlich ist, hat sich eine wäßrige Harnstofflösung als hierfür zweckmäßig erwiesen. Die Harnstofflösung muß mindestens einmolar sein, dreimolare Lösungen sind bereits verwendet worden, und jede Konzentration bis zur Sättigung (bei etwa 8 Mol/l) ist zufriedenstellend. Ein Säulenvolumen an Harnstofflösung reicht aus, um die Bindungen zu lösen, jedoch werden normalerweise 1 bis 3 Säulenvolumina verwendet.

In den Fällen, in denen es erwünscht ist, das Albumin zu schützen, wird eine wäßrig-äthanolisehe Lösung eines Alkaliphosphats, zweckmäßig von Natriumphosphat, verwendet. Das bevorzugte Volumenvefchältnis beträgt 1 % 1, und die Phosphatlösung ist bei einem pH-Wert von 2,0 bis 3 0,05- bis 0,1-molar und zweckmäßiger· weise bei einem pH-Wert von 2,4 0,075-molar, gemessen vor dem Vermischen.

Es wurde auch gefunden, daß Albumin in hoher Reinheit eluiert werden kann, wenn man eine wäßrige Lösung eines Erdalkalikations und eines pharmazeutisch annehmbaren Anions verwendet. Besonders zweckmäßige Kationen sind Ca"*"¹" und Mg⁺⁺. Ebenfalls kann K⁺, jedoch nicht Na⁺ verwendet werden. Als Anion kann jedes starke pharmazeutisch annehmbare Anion, zweckmäßig das Chloridion, dienen. Die Ionenkonzentration dieser ELuierungsmittel sollte vorzugsweise mindestens 0,05«molar sein. Niedrigere Konzentrattonen verursachen eine Schwanzbildung· Höhere Konzentrationen bis zu etwa 0,1 mol/l führen zu einer schnelleren Elulerung und sind annehmbar, die genannten Obergrenzen sollen jedoch nicht als limitierend angesehen werden.

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Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, das Eluierungsmlttel zu puffern, zweckmäßig auf einen pH-Wert zwischen 6,0 und 9 und vorzugsweise von etwa 8. Dies wird dadurch erzielt, daß man dem Eluierungsmittel einen Puffer, wie Natriumbicarbonat oder Trischlorwasserstoff, zusetzt. Eine Ionenkonzentration von etwa 0,05 "bis 0,1 Mol/l Tris-Chlorwasserstoff in dem Eluierungsmittel hat sich als geeignet erwiesen.

Weiter wurde gefunden, daß als Eluierungsmittel basisch gepufferte Alkancarbonsäuren geeignet sind. Säuren mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen können verwendet werden, bevorzugt sind jedoch solche mit 8 bis 10 Kohlenstoffatomen. Octancarbonsäure ist besonders geeignet, da es das Stabilisierungsmittel der Wahl für Albumin 1st. Bei der Verwendung von Alkancarbonsäuren, insbesondere von Octancarbonsäure, als Eluierungsmittel,wird eine stabilisierte Lösung aus reinem Albumin erhalten, die gewünschtenfalls unter vermindertem Druck konzentriert oder lyophilisiert werden kann, wonach ein reines gepuffertes Albumin erhalten wird.

Jeder Puffer kann verwendet werden, der den pH-Wert der Lösung auf mindestens 6,5 erhöht, wobei der Bereich von 7,5 bis 9 als Arbeitsbereich angesehen werden kann und ein pH-Wert von etwa 8,0 bevorzugt ist. Besonders geeignet als Puffer ist Tris(Chlorwasserstoff/ wäßriges Natriumchlorid).

Die Löslichkeit der Cg - C^q Alkancarbonsäuren in Wasser 1st nicht hoch. Octancarbonsäure .besitzt eine Löslichkeit von der Größenordnung von 4 millimol. Daher ist die bevorzugte Arbeitsweise zur Herstellung des Eluierungsmittels die, daß man zunächst einen Puffer, wie beispielsweise Tris-Chlorwasserstoff (0,05-bis 0,2-molar) zweckmäßig mit 0,05- bis 0,5-molarem wäßrigem Natriumchlorid bereitet und ihn mit so viel Alkan-

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carbonsäure zersetzt, wie sich in ihm löst. Die erhaltene Lösung muß wiederum auf einen pH-Wert von mindestens 6,5 gepuffert werden, wobei 7,5 der Arbeits-pH-Bereich ist und einen pH-Wert von etwa 8,0 bevorzugt ist. Unabhängig von der Art der Säulenregenerierung können die Säulen ohne Verlust der Absorptionskraft wiederholt verwendet werden.

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Verwendbare Farbstoffe

Color-

Index-Bezeichnungen Handelsbezeichnung

17865 CI Reactive Cibacron Orange Orange G-E; Procion Brilliant Orange HGRS

61210 CI Reactive Cibacron

Blue 5 Brilliant Blue PBR-P

61211 CI Reactive Cibacron Blue Blue 2 P3G-A; Procion Blue HBS

Strukturformel HO

-N=N-

SO₃Na

SO₃Na NaO₃S

Cl

ΪΨζ,

OjH

Cl /*

N N

SO

O₃H

SO₃H

NH-CO-NH,

18105 CI Reactive
Red 4

Cibacron
Brilliant Red 3B-A; Procion Brilliant Red H7BS

Verwendbare Farbstoffe

Color-Index-Bezeichnungen Handelsbezeichnung

— -_

26440 CI Reactive Brown

Cibacron Brown 3GR-A; Procion Orange Brown HGS SO₃Na

Strukturformel N

NH- f V-NH-(^N SO,Na NN

17910 CI Reactive Red

CI Reactive Red

18156 CI Reactive Red

Cibacron Scarlet 2G; Procion Scarlet H3GS

Cibacron Scarlet 4G-P

Cibacron Brilliant Red B-A

CH₃ · CO ·

S0,Na

⁵ HO
-N=N- f^r

NaO₃S¹

S0,Na

³ HO..

Cl

SO₃Na

N=

Cl

NaOjSr^^^ SO₃Na

18159 CI Reactive Red Cl

SO,Na HD // V-- N-N -λ

νηΠνη-

HaO,ff "^^eo^te

Verwendbare Farbstoffe

Color-

Index-Bezeichnungen Handelsbezeichnung

Blue Dextran

Strukturformel

O-Dextran - NH-Q.*::C.'.'.^S03^H/

σ co oo

O NH₂

O-Dextran

Beispiel I

100 ml abgesetzte vernetzte Sepharose '4B der Pharmacia Fine Chemicals, Inc. wurde in 250 ml Wasser suspendiert. 1 g Cibacroir^ Brilliant Blue FBR-P wurde in 25 ml Wasser gelöst und die Lösung der Sepharosesuspension zugesetzt. Das Gemisch wurde leicht gerührt und 45 min. lang auf 80 ⁰C erhitzt. Der pH-Wert wurde bei mindestens 6 gehalten, indem man Natriumbicarbonat oder Tris-Chlorwasserstoff zusetzte· Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, die überstehende Flüssigkeit dekantiert und die feste Phase gründlich zunächst mit Wasser (3 1), anschließend mit wäßrigem Guanidinhydrochlorid (5-molar_t 2 1) gewaschen und schließlich in einem gemischten Puffer aus wäßrigen Tris-Chlorwasserstoff (0,05-molar) und wäßrigem Natriumchlorid (0,5-molar) vom pH-Wert 8,0 suspendiert, worauf man ein Kupplungsprodukt von Sepharose 4B und Cibacron Brilliant Blue FBR-P erhielt.

Bei dem erwähnten Verfahren können auch abgesetztes Sepharose-Polyacrylamidgel und Amberlite^ IRC 45 verwendet werden, um zu analogen Kupplungsprodukten zu gelangen.

Nach der obigen Vorschrift, jedoch unter Verwendung von Procion Brilliant Orange HGRS, Procion Blue HBS, Procion Brilliant Red H7B5, Procion Orange Brown HGS, Procion Scarlet H3GS, Cibacron Scarlet 4GP und Cibacron Brilliant Red B-A als Farbstoffe sowie von vernetzter Sepharose, Polyacrylamidgel oder einem aminogruppenhaltigen Polyacrylharz als Trägerphase wurden analoge Kupplungsprodukte erhalten, sofern man die Umsetzungstemperatur auf 90 bis 95 ⁰C erhöhte.

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Beispiel II
Herstellung von Sepharose/Dextranblau-Kupplungsprodukt

100 ml abgesetzte Sepharose 4B der Pharmacia Fine Chemicals Inc. wurde mit einer wäßrigen Lösung von 16 g Bromcyan fünf Stunden lang bei einem pH-Wert von 11,0 und einer Temperatur von 10 ⁰C umgesetzt· Nach Beendigung der Umsetzung wurde die überstehende Flüssigkeit durch Dekantieren entfernt und die Sepharose mit 0,1 molarem Natriumbicarbonatpuffer vom pH 9,5 verrührt. Die überstehende Flüssigkeit wurde wiederum durch Dekantieren entfernt und 1 g Dextranblau in 100 ml wäßrigem o,1 molarem Natriumbicarbonat vom pH 9,5 zugesetzt. Die Reaktionsteilnehmer wurden 24 Stunden lang bei 4 ⁰C stehengelassen. Die überstehende Flüssigkeit wurde dann durch Dekantieren entfernt und das Produkt nacheinander mit 4 1 0,1-molarem wäßrigem Natriumbicarbonat vom pH 9,5, 4 1 6-molarem wäßrigem Harnstoff, 4 1 Wasser sowie 4 1 eines gemischten Puffers aus 0,05-molarem wäßrigem Tris-Chlorwasserstoff und 0,5-molarem wäßrigem Natriumchlorid vom pH 8,0 gewaschen. Nach Entfernung der überstehenden Waschflüssigkeit des zuletztgenannten Puffers wurde das auf diese Weise gewonnene Kupplungsprodukt in einer ähnlichen Lösung suspendiert und bei 4 ⁰C aufbewahrt.

Beispiel III Entfernung von Albumin aus Plasma

Eine Chromatographiersäule (1,0 χ 20 cm) wurde mit etwa 10 ml des gemäß Beispiel II hergestellten Kupplungsproduktes, das in dem oben erwähnten TrIs-Chlorwasserstoff/Natriumchlorid-Puffer suspendiert war, beschickt. Auf die Säule wurden 2 ml Plasma gegeben und mit Puffer eluiert, bis kein weiteres Pro-

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tein mehr eluiert wurde. Dies wurde durch Untersuchung des Eluats im ultravioletten Licht überprüft, worin ^A280 ^weniS^{er als 0}»⁰²⁰ betrug. Das Eluat wurde anschließend diaflowing unter Verwendung einer Amicon-UM1O Membran auf ein Volumen von 2 ml eingeengt.

Das Verfahren wurde kontrolliert, indem man Vergleichsproben durch eine Sepharose 4B-Säule laufen ließ, die nicht das Kupplungsprodukt mit Dextranblau enthielt. Das dem Diaflowing unterzogene Eluat wurde anschließend mittels Celluloseacetatmembran-Elektrophorese analysiert, wobei die in der folgenden Tabelle I angegebenen Ergebnisse erzielt wurden·

	Segharο s e^Dex	tranblau	0,16	% des Kontroll- Wertes
Tabelle I	Kontroll- Plasma	Hit dem Kupplungs produkt aus Sepharose und Dextranblau behandeltes Plasma	0,16
	(Gramm/100 ml)	0,60	4
Gewinnung von Plasmaproteinfraktionen nach Kontak	4,10	0,65	94
tierung mit	0,17	0,93	84
Fraktion	0,72	2,50	96
	0,67		98
Albumin	0,95	38
Alpha-1	Gesamtprotein 6,61
Alpha-2
Beta
Gamma

Die Fraktionen wurden nach der Celluloseacetatmembran-Elektrophorese quantitativ analysiert, wie im Text beschrieben. Das Gesamtprotein wurde nach der Methode von Lowry et al (J. Biol. Chem. Vj£, 265 (1951) bestimmt.

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Beispiel IV Entfernung von Albumin aus Plasma

Eine Chromatographlersäule (1,0 χ 20 cm) wurde mit etwa 10 ml des Kupplungsproduktes beschickt, das gemäß Beispiel I unter Verwendung von vernetzter Sepharose 4B als Trägerphase und Procion Brilliant Red H7BS als Farbstoff, suspendiert in der oben erwähnten Iris (Chlorwasserstoff /Natriumchlorid) -Pufferlösung, hergestellt worden war· 2 ml Plasma wurden auf die Säule gegeben und mit Puffer eluiert, bis kein weiteres Protein eluiert wurde. Dies wurde durch Untersuchung des Eluats mit ultraviolettem Licht überprüft, wobei A₂₈Q weniger als 0,020 betrug. Als Eluat wird dann der oben erwähnte Tris-Natriumchloridpuffer erhalten.

Beispiel V Säulenregenerierung ohne Albumingewinnung

Die Säule gemäß Beispiel IV wurde regeneriert, indem man zwei Säulenvolumen 6-molaren wäßrigen Harnstoffs durch die Säule laufen ließ, gefolgt von dem oben erwähnten Trls-Natriumchloridpuffer. Dieses Verfahren der Säulenregenerierung denaturiert das Albumin, wenngleich es für die Wiedergewinnung der Säule völlig zufriedenstellend 1st.

Beispiel VI Regenerierung der Säule unter Albumingewinnung

Die albuminhaltige Säule gemäß Beispiel III wurde mit zwei Säulenvolumina 0,075-molaren wäßrigem Natriumphosphat vom pH-Wert 2,4 und Äthanol gewaschen, wobei das Verhältnis von Äthanol zu wäßrigem Natriumphosphat 1:1 betrug. Das Eluat wurde anschließend dem DIaflowing unter Verwendung einer Anicon UM-10-Membran unterzogen, wobei reines, nicht denaturiertes Albumin in einer Menge von 65 mg (etwa 80% Gewinnung) erhalten wurde. 50 9811/106 2

Beispiel VII - ■ - '

Regenerierung^ der Säule unter MboMngewinnung

Di© Albumin enthaltende Säule gemäß Beispiel III wird© mit zwei Säulenvolumina ©ines Gemisches aus 4°-molarer Octansäurelösung, 0,05-molareii Tris-Chlorwasserstoff und O₉05-smolare® wäßrigem Natriumchlorid bei® pBhWsrt 8 gewaschen«, Das Eluat maräe lyophilisiert, wonach r®±n@8> stabilisiertes Albumin erhalten wurde.

g JL A Jj,

Re^enerierting der Säule _r unter _i Mbumlagewinnung

Die Albumin enthaltende Säule gemäß Beispiel IV i^arä® mit zwei Säulemralumina eine® Gemisches gewaschen j das O₉O5»ra©lar ®n Calciumchlorid und 0,05-raolar aa Trie-Chlorwasseretoff beim pH 8,0 war« Das Eluat wurde dana d©» Diaflowing unter Verwendung einer 1D-»lfeabFan unterzogen» - wonach reines, nicht erhalten wurde*

IMrä® das CimlelomchloFid durch lüagneaiumchlorid

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Claims

Patentansprüche

·; Verbindung der allgemeinen Formel

0 NH

JAgaroseJ-

O-Dextran

worin R¹ = H, R²

SO₃H

oder R¹ - SO₃H, R* = H und χ ein Gewichtsverhältnis von 0,8 bis 40 bedeutet.

2. Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß χ 4 bis 20 bedeutet·

3. Verbindung gemäß Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet, daß die Agarose in der physikalischen Form von Sepharose vorliegt.

4· Verfahren zur Entfernung von Albumin aus im wesentlichen zellfreien wäßrigen Flüssigkeiten, gekennzeichnet-,durch

a) Suspendieren eine^der allgemeinen Formel Q3?| — JCRlJJ, worin CRD ein reaktionsfähiger Farbstoff der allgemeinen Formel

R₁O₃S —L

5.0 9 8 Γ1 / 1 0 6 2 i.

NH η

in der

R₃ einen Alkyl-, Phenyl-, Alkoxyphenyl-, Alkylphenyl-

rest, einen Rest der Formel J⁼\- ^3¹¹I oder Wasser-

AW/

stoff bedeutet, wobei R₁ Wasserstoff, ein Alkalimetall oder ein Erdalkalimetall und R₂ Halogen oder -0-Dextran

Z₁ J~-h] ₂ oder -CH=CH-CH=CH- bedeutet,

Z₂ eine Stickstoff-Stickstoffbindung oder ein an das dargestellte Stickstoffatom gebundenes Wasserstoffatom ist,

Q eine substituierte oder unsuhstltuierte Arylgruppe bedeutet, wenn Z₂ Wasserstoff ist, oder eine substituierte oder unsubstltulerte Aryl-N» -Gruppe bedeutet, wenn Z₂ eine Doppelbindung 1st, mit der Maßgabe, daß die genannten Substituentengruppen keine Halogengruppen oder Schwermetallgruppen sind, wobei unter Schwermetall ein Metall verstanden wird, das in andere Gruppen des Periodensystems als die Gruppen 1 oder 2A fällt, und SP eine feste .Trägerphase bedeutet, die aus Agarose, Polyacrylamid oder amlnogruppenhaltlgen Acrylharzen besteht, und χ ein Gewichtsverhältnis zwischen 0,8 und 40 bedeutet, in einem Puffer von einer Molarität von mindestens 0,05 bei einem pH-Wert von zwischen 6,5 und 8,5,

b) Inbertihrungbringen dieser Suspension mit der albuminhaltigen Flüssigkeit unter Herstellung einer Suspension mit an der festen Phase adsorbiertem Albumin und

c) Abtrennung der festen Phase mit dem adsorbierten Albumin aus der wäßrigen Phase.

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5. Verfahren gemäß Anspruch 4,

dadurch gekennzeichnet, daß man als Kupplungsprodukt eine Substanz der Formel

verwendet, worin x, Q, Z₁, angegebene Bedeutung besitzen

Z₂ und

die in Anspruch 4

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kupplungsprodukt der in Anspruch 5 angegebenen Formel verwendet, worin SP Sepharose, ein Poly- -acrylamidgel oder ein aminogruppenhaltiges Acrylharz bedeutet.

7. Verfahren gemäß Anspruch 4 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kupplungsprodukt eine Substanz der allgemeinen Formel

"O- Dextran

verwendet, worin χ und R₁ die in Anspruch 4 angegebene Bedeutung besitzen.

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8. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,,

daß man ein Kupplungsprodukt aus Polyacrylamidgel und Procion Blue HBS, Cibacron Brilliant Blue FBR-P, Procion Orange Brown HGS, Procion Brilliant Red H7BS, Procion Scarlet H3GS oder Procion Brilliant Orange HGRS verwendet.

9. Verfahren gemäß Anspruch 4, · dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem die feste Phase mit dem daran adsorbierten Albumin mit einem Eluierungsmittel behandelt, das aus wäßrigem Harnstoff, wäßrig-äthanolischem Alkaliphosphat, einer Basis gepufferten Alkancarbonsäure mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen oder einer wäßrigen Lösung von Kationen der Gruppe 2A des Periodensystems und Kalium sowie pharmazeutisch annehmbaren Anionen und einem basischen Puffer besteht, unter Abspaltung des Albumins von der festen Phase behandelt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9_t dadurch gekennzeichnet,

daß man als Eluierungsmittel eine Alkancarbonsäure mit 8 bis 10 Kohlenstoffatomen, die auf einen pH-Wert von 7,5 bis 9 gepuffert ist, verwendet.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet,. daß man als Alkancarbonsäure Octansäure verwendet«

12. Verfahren gemäß Anspruch 9_f dadurch gekennzeichnet,

daß man als Eluierungsmittel eine wäßrige Lösung von Metallionen der Gruppe 2A des Periodensystem oder Kalium und von pharmazeutisch annehmbaren Anionen und einem basischen Puffer verwendet, wobei das Metalllon

eine 0,05-bis 0,5-molare Konzentration besitzt.

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13· Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem die von Albumin freie feste Phase von der flüssigen Phase trennt, die albuminfreie feste Phase in Stufe a) von Anspruch 4 wiederverwendet·

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