DE2661012C2

DE2661012C2 -

Info

Publication number: DE2661012C2
Application number: DE2661012A
Authority: DE
Inventors: Werner Prof. Dr. 5600 Wuppertal De Frommer; Lutz Dipl.-Chem. Dr. 5090 Leverkusen De Mueller; Delf Dipl.-Chem. Dr. Schmidt; Walter Dr. 5600 Wuppertal De Puls; Hans-Peter Dr. 5830 Schwelm De Krause; Ulrich Prof. Dr. 8700 Wuerzburg De Heber
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1976-12-23
Filing date: 1976-12-23
Publication date: 1989-06-15

Description

Es ist bekannt, daß eine Reihe von Actinomyceten, vor allem Actinoplanaceen Inhibitoren für Glykosidhydrolasen, vorzugsweise kohlenhydratspaltender Enzyme des Verdauungstraktes bilden (DT-OS 20 64 092).

Weiterhin weiß man, daß Nojirimycin, ein bakteriostatisch wirkendes Antibioticum aus Stämmen der Gattung Streptomyces, gewisse mikrobielle α-Glucosidaten hemmt (T. Niwa et al., Agr. Biol. Chem., 34, 966v [1970]).

Die Erfindung betrifft Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Inhibitoren für Glucosidhydrolasen, erhalten dadurch, daß man Organismen der Arten Bacillus subtilis, Bacillus subtilis var. niger, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus longisporus oder Bacillus polymyxy in üblichen Nährlösungen bei Temperaturen von etwa 15 bis etwa 80°C etwa 1 bis 8 Tage unter Belüftung in üblichen Fermentationsgefäßen kultiviert, die Zellen abschleudert und die Inhibitoren aus der Kulturbrühe oder den Zellextrakten durch übliche Reinigungsoperationen isoliert.

Zur Auffindung geeigneter Stämme bedient man sich der nachstehend beschriebenen Methoden.

Aus Erdproben isoliert man in bekannter Weise Stämme der Familie Bacillaceae, insbesondere solche der Gattung Bacillus. Mit Abimpfungen dieser Stämme beimpft man Kulturkolben mit Nährlösungen, die das Wachstum dieser Stämme ermöglichen. Man kann z. B. eine Nährlösung verwenden, die 5 g Pepton und 3 g Fleischextrakt pro Liter enthält, jedoch sind grundsätzlich viele andere Typen von Nährlösungen, die geeignete Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Nährsalze enthalten, einsetzbar. Der pH-Wert der Nährlösung kann in weiten Grenzen variieren; bevorzugt wird ein Anfangs-pH der Nährlösung zwischen 6,0 und 8,0 gewählt.

Als Kohlenstofflieferant für die Nährlösung kommen die verschiedenartigsten organischen Substanzen in Frage. Kohlenhydrate, organische Säuren und Alkohole seien beispielhaft genannt.

Als Stickstoffquelle können Hefeextrakt, Sojamehl, Peptone, Fleischextrakt und viele andere organische Substanzen Verwendung finden.

Die Konzentrationen der Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie der Nährsalze, von denen FeSO₄, CaCO₃ und MgSO₄ beispielhaft erwähnt seien, können in weiten Grenzen schwanken. Auf den gesonderten Zusatz von Nährsalzen kann in manchen Fällen ganz verzichtet werden, da sie oftmals in den komplexen Stickstoffquellen als Beimengungen enthalten sind.

Da die Bildung von Inhibitoren oft stark von der Zusammensetzung der Nährböden abhängig ist, empfiehlt es sich, die Stämme zur Optimierung der Produktionsleistung in verschiedenen Nährlösungen zu kultivieren. Entsprechende Vorschläge können den Beispielen entnommen werden.

Von der Nährlösung füllt man z. B. 100-200 ml in einen 1-Liter-Erlenmeyer-Kolben, sterilisiert in bekannter Weise, beimpft mit dem zu untersuchenden Stamm und bebrütet den Kolben bei 15-80°C, vorzugsweise bei 24- 40°C bzw. 50-70°C bei thermophilen Bacillen, auf Schüttelmaschinen. Zeigt die Kultur Wachstum, was im allgemeinen nach 1-10 Tagen, meist nach 1-5 Tagen, sichtbar wird, so entnimmt man eine Probe von z. B. 5 ml und trennt in dieser Probe die Zellen durch Filtration oder Zentrifugation ab. Von den Kulturbrühen werden 1-100 µl in die nachfolgend beschriebenen Tests eingesetzt und die Hemmkapazität pro ml berechnet.

Die Zellen werden zweimal mit je 5 Volumina (bezogen auf das Zellvolumen) Aceton und anschließend einmal mit 5 Volumina Diethylether extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden zur Trockene eingeengt, in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Die Lyophilisate werden in Konzentrationen von 10-1000 µg/ml in die nachfolgend beschriebenen Tests eingesetzt.

Amylasetest

Eine Amylase-Inhibitor-Einheit (1 AIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu 50% inhibiert. Eine Amylaseeinheit (AE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 µ Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die µVal gespaltenen Bindungen werden als µVal gebildeter reduzierender Zucker mit Dinitrosalicylsäure kolorimetrisch bestimmt und mit Hilfe einer Maltoseeichkurve als µVal Maltoseäquivalente angegeben. Zur Durchführung des Testes werden 0,1 ml Amylaselösung (20-22 AE/ml) mit 10-1000 µg Inhibitor oder 1-100 µl der zu testenden Kulturlösung in 0,4 ml 0,02 M Natriumglycerophosphatpuffer/0,001 M CaCl₂ pH 6,9 versetzt und etwa 10-20 Minuten in einem Wasserbad von 35°C äquilibriert. Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer auf 35°C vorgewärmten 1%-Stärkelösung bei 35°C inkubiert und anschließend mit 1 ml Dinitrosalicylsäure-Reagens (nach P. Bernfeld in Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol., Band 1, Seite 149) versetzt. Zur Farbentwicklung wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, dann abgekühlt und mit 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Die Extinktion bei 540 nm wird gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert ohne Amylase gemessen. Zur Auswertung wird aus einer vorher aufgenommenen Amylaseeichkurve die nach Inhibitorzusatz noch wirksame Amylaseaktivität abgelesen und daraus die prozentuale Hemmung der eingesetzten Amylase errechnet. Die prozentuale Hemmung wird als Funktion des Quotienten

aufgetragen, der 50%- Hemmungspunkt aus der Kurve abgelesen und auf AIE/mg Inhibitor umgerechnet.

Saccharasetest

Eine Saccarase-Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Saccharaseeinheiten zu 50 % inhibiert. Eine Saccharaseeinheit (SE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 µMol Saccarose in Glucose und Fructose spaltet. Die µMol gebildete Glucose werden mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Saccharosespaltung durch die Saccharase nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf 0,12 SE eingestellten Saccharaselösung (Solubisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem., 12 [1958], S. 1997. Mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.) mit 1-20 µg Inhibitor oder 1-20 µl der zu testenden Lösung versetzt und mit 0,1 M Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf 0,1 ml aufgefüllt. Es wird 10 Minuten bei 35°C äquilibriert und dann mit 0,1 ml einer auf 35°C vorgewärmten 0,05-m- Saccharoselösung in 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35°C und stoppt die Saccharosereaktion durch Zugabe von 1 ml Glucoseoxidasereagens (Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösen von 2 mg Glucoseoxidase [Fa. Boehringer, Reinheitsgrad I] in 100 ml 0,565 m Tris-HCl-Puffer pH 7,0 und anschließenden Zusatz von 1 ml Detergenslösung [2 g Triton-X-100+8 g 95% Ethanol p.a.], 1 ml Dianisidinlösung [260 mg o-Dianisidin · 2 HCl in 20 ml H₂O] und 0,5 ml 0,1%iger wäßriger Peroxidaselösung [Fa. Boehringer, Lyophilisat, Reinheitsgrad II] hergestellt.) ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35°C. Danach wird 1 ml 50% H₂SO₄ zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen. Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Saccharase berechnet und aus dem 50%-Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf SIE/g bzw. SIE/Liter umgerechnet.

Maltasetest

Eine Maltase-Inhibitor-Einheit (MIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Maltaseeinheiten zu 50% inhibiert. Eine Maltaseeinheit (ME) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 µMol Maltose in 2 µMol Glucose spaltet. Die µMol gebildete Glucose werden mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Maltosespaltung durch die Maltase nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf 0,060- 0,070 ME eingestellten Maltaselösung (Solubisierte Maltase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand., 12 [1958], Seite 1997. Mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 a.) mit 1-20 µg Inhibitor oder 1-20 µl der zu testenden Lösung versetzt und mit 0,1 M Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf 0,1 ml einer auf 35°C vorgewärmten 0,05 M Maltoselösung in 0,1 M Natriummaleinatpuffer pH 6,0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35°C und stoppt die Maltasereaktion durch Zugabe von 1 ml Glucoseoxidasereagens (Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösen von 2 mg Glucoseoxidase [Fa. Boehringer, Reinheitsgrad I] in 100 ml 0,565 m Tris-HCl-Puffer pH 7,0 und anschließenden Zusatz von 1 ml Detergenslösung [2 g Triton-X-100+8 g 95% Ethanol p.a.], 1 ml Dianisidinlösung [260 mg o-Dianisidin · 2 HCl in 20 ml H₂O] und 0,5 ml 0,1%iger wäßriger Peroxidaselösung [Fa. Boehringer, Lyophilisat, Reinheitsgrad II] hergestellt.) ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35°C.

Danach wird 1 ml 50% H₂SO₄ zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen.

Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Maltase berechnet und aus dem 50%-Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf MIE/g bzw. MIE/Liter umgerechnet.

Die Häufigkeit, mit der nach der angegebenen Methode Stämme gefunden wurden, die sich in den Tests als aktive Inhibitoren erwiesen, lag über 5%. Beispiele besonders wirksamer Stämme werden in Tabelle 1 aufgeführt:

Bacillus-Stämme mit Saccharase-Inhibitor-Wirkung
Art
Stamm-Nr.
B. subtilis
DSM 704
B. subtilis var. niger	DSM 675 (ATCC 9372)
B. amyloliquefaciens	DSM 7 (ATCC 23 350)
B. coagulans	DSM 1 (ATCC 7050)
B. longisporus	DSM 479 (hemmt auch Amylase)
B. polymyxa	DSM 365
B. polymyxa	DSM 372
B. polymyxa	DSM 742
B. polymyxa	DSM 292
B. polymyxa	DSM 356 (ATCC 8523)
B. polymyxa	DSM 36 (ATCC 842)
B. polymyxa	DSM 740
B. polymyxa	DSM 741

Die aufgeführten Stämme sind unter den angegebenen DSM- Nummern bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen (DSM), Göttigen, hinterlegt und von dort zu beziehen.

Die Stämme DSM 704, 740, 741 und 742 werden in Tabelle 2 beschrieben; die restlichen Stämme sind aus der Literatur bekannt und werden im "Catalogue of Strains 1974" der DSM aufgeführt.

Zur Gewinnung der Glycosid-Hydrolasen-Inhibitoren werden die oben aufgeführten Stämme in den oben aufgeführten Stämme in den oben beschriebenen Nährlösungen kultiviert. Dabei ist zu beachten, daß praktisch jeder Stamm zur optimalen Produktion eine andere qualitativ und quantitativ anders zusammengesetzte Nährlösung benötigt.

Nach 1-10tägiger Bebrütung bei 15-80°C, vorzugsweise 24-40°C bzw. bei Thermophilen 50-70°C, in Schüttelkolben oder in Fermentern verschiedener Größe werden die Zellen von der Kulturlösung abgetrennt und je nach dem Auftreten der Inhibitoren das wirksame Prinzip aus der Kulturlösung und/oder aus den Zellen angereichert.

Aus den Kulturbrühen gewinnt man die Inhibitoren durch Lyophilisation oder Fällung mit Salzen oder wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln (wie z. B. niedere Alkohole und Ketone) oder durch Adsorption der Wirkstoffe an Ionenaustauschern.

Aus den Zellen gewinnt man die Inhibitoren durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Alkoholen, Ketonen, Ethern, Estern und Sulfoxiden.

Dazu wird der Fermentationsansatz bei 3000-20 000 UpM, vorzugsweise 6-10 000 UpM, 10-60 Minuten, vorzugsweise 30 Minuten, zentrifugiert oder filtriert, vorzugsweise mit Druck und unter Zuhilfenahme von Filterhilfsmitteln, in Kulturbrühe und Zellrückstand getrennt.

Tabelle 2

Die Stämme DSM 740, DSM 741, DSM 742 und DSM 704 sind aufgrund von Sporenbildung und aerobem Wachstum der Gattung Bacillus zuzuordnen. Die ermittelten morphologischen und physiologischen Merkmale der Stämme DSM 740, DSM 741 und DSM 742 entsprechen denjenigen von Bacillus polymyxa, während der Stamm DSM 704 der Art Bacillus subtilis zuzuordnen ist.

Die Identifizierung erfolgte nach den Angaben von R. E. Gordon, W. C. Haynes, C. Hor-Nay Pong: The Genus Bacillus, Washington, 1973.

Die Isolierung des Inhibitors aus der jeweiligen Kulturbrühe kann auf verschiedene Weise erfolgen:

a) Einengen der Kulturbrühen bei vermindertem Druck (10-50 Torr) bei Bad-Temperaturen von 20-100°C, vorzugsweise 40-80°C, auf ca. 1/5-1/50 des Ausgangsvolumens. Der eingeengte Extrakt wird filtriert oder zentrifugiert und das klare Filtrat (der klare Überstand) evtl. nach vorheriger Entsalzung lyophilisiert.
b) Ausfällung der Inhibitoren aus der Kulturbrühe (oder den nach a) eingeengten Kulturbrühen) durch Zusatz von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Alkoholen oder Ketonen, vorzugsweise Methanol, Ethanol, Aceton, bis zu einem Gehalt von 69-90%. Da bei niederer Konzentration an Lösungsmittel inaktive Begleitsubstanzen gefällt werden, eignet sich dieses Fällungsverfahren besonders gut zur fraktionierenden Fällung zur Abtrennung von unerwünschten Begleitstoffen.
c) Aussalzen der Inhibitoren aus den Extrakten (oder den nach a) eingeengten Extrakten), z. B. mit Ammonsulfat, Kochsalz usw. Der ausfallende Niederschlag wird durch Zentrifugation oder Filtration gesammelt und entweder direkt mit Aceton und Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet oder nach Rücklösen in Wasser dialysiert und lyophilisiert.
d) Adsorption der Inhibitoren an Ionenaustauscher. Dieses Verfahren eignet sich zur Isolierung von solchen Inhibitoren, die auf Grund ihrer chemischen Natur Ladungen tragen. Die Desorption des Inhibitors geschieht durch Änderung der Ionenstärke oder des pH-Wertes des Elutionsmediums.

Neben dem Inhibitor finden sich in den Kulturbrühen häufig unerwünschte Begleitsubstanzen. Die Abtrennung dieser Begleitstoffe kann auf verschiedene Weise erfolgen, z. B. durch Hitzedenaturierung der Begleitstoffe bei Inhibitoren, die hitzestabil sind oder durch Dialyse durch entsprechende Membranen bei niedermolekularen Inhibitoren, wobei die ungewünschten Begleitstoffe von der Membran zurückgehalten werden oder durch fraktionierende Fällung (vgl. b) oder durch Adsorption der Begleitstoffe an Ionenaustauscher.

Die Gewinnung von Inhibitoren aus den Zellen geschieht durch mehrmalige Extraktion der Zellen mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise zweimaliger 10-20minütiger Extraktion mit 3-5 Vol. Aceton (bezogen auf das Zellfeuchtvolumen) und anschließend einmaliger 5-10minütiger Extraktion mit Ether. Die Aceton- und Ether-Extrakte werden im Vakuum zur Trockne eingeengt, in Wasser aufgenommen und lyophilisiert.

Die neuen Substanzen lösen sich gut in Wasser. Eine Gruppe der Inhibitoren ist bei neutralen pH-Werten hitzestabil, säurestabil (pH 2), alkalistabil (pH 12) und dialysierbar. Diese Inhibitoren werden durch Trypsin und Pepsin nicht inaktiviert, sie hemmen ihrerseits die genannten Enzyme nicht. Sie sind mit den typischen Proteinfärbestoffen nicht anfärbbar. Nach Abschätzungen aus der Gelfiltration liegt das Molekulargewicht dieser Inhibitoren über 100, aber unter 2000.

Die besten Inhibitoren dieser Gruppe zeichnen sich durch eine extrem hohe, auch alle bisher bekannten Saccharase-Inhibitoren übertreffende Hemmaktivität gegenüber Saccharase aus.

Bei Fermentation des Stammes DSM 7 in einer Nährlösung der Zusammensetzung A werden nach viertägiger Fermentation über 400 000 SIE/l, bei einer Kultivierung dieses Stammes in Nährlösung S₃ werden nach sechstägiger Fermentation über 300 000 SIE/l gewonnen.

Durch Adsorption an stark sauren Kationenaustauschern in der H⊕-Form und anschließende Desorption mit wäßriger NH₃-Lösung sowie Einengen und Lyophilisation des Desorbats wird ein Rohinhibitor mit etwa 40 000 SIE/g erhalten. Extraktion des Rohinhibitors mit Methanol, Einengen des Extraktes zur Trockne, Rücklösen in Wasser und Chromatographie der wäßrigen Lösung an schwach sauren Austauschern auf Dextran- oder Cellulose-Basis, insbesondere Carboxymethylcellulose, Desorption mit verdünnten Mineralsäuren, vorzugsweise 10^-3-10^-1 N Salzsäure, Einengen der saccharoseinhibitorisch aktiven Fraktionen und Lyophilisation dieser Fraktionen führt zu einem angereicherten Rohprodukt mit etwa 250 000 SIE/g. Chromatographie des angereicherten Rohproduktes an modifiziertem Dextran (Sephadex® LH 20) in Methanol, Einengen der saccharose-inhibitorisch aktiven Fraktionen und Zusatz von konzentrierten Mineralsäuren, vorzugsweise konzentrierte Salzsäure, bis zu einem pH-Wert von 1-3 liefert ein kristallines Produkt mit 540 000 SIE/g. Diese Substanz ist chromatographisch rein. Als Summenformel wurde C₆H₁₃O₄N bzw. C₆H₁₄O₄NCl für das Hydrochlorid ermittelt. Auf Grund ihrer physikalischen Parameter (IR-, NMR-, UV-Spektren; Schmelzpunkt; spezifischer Drehwert) und den chemischen Eigenschaften (Perjodat- Oxidation, Elementaranalyse) ist sie identisch mit einer von S. Inoye et al. (Tetrahedron. 23, 2125 [1968]) beschriebenen Verbindung der Summenformel C₆H₁₃O₄N bzw. C₆H₁₄O₄NCl für das Hydrochlorid, welcher von den Autoren die Strukturformel

zugeordnet und für die der Name "1-Desoxynojirimycin" vorgeschlagen wurde.

Diese Verbindung wurde von den Autoren auf chemischem Wege durch Hydrierung des Antibioticums Nojirimycin erhalten. Das Ausgangsprodukt Nojirimycin wird nach T. Niida et al. (J. Antibiotics, Ser. A., 20, 62 [1967]) durch Fermentation von Organismen der Gattung Streptomyces erhalten.

Durch die vorliegende Erfindung wird es erstmalig möglich, Desoxynojirimycin in einem Arbeitsgang durch direkte mikrobiologische Synthese mit guten Ausbeuten, ohne Umwege über das relativ instabile und dadurch schwierig zu handhabende Nojirimycin herzustellen.

Es ist außerordentlich überraschend und war nicht vorherzusehen, daß diese Verbindungen von Organismen der Gattung Bacillus produziert werden, da sich diese Mikroorganismen im allgemeinen als Sekundärstoff-Produzenten weniger eignen und allenfalls im wesentlichen peptidartige Sekundärstoffe bilden.

Darüber hinaus werden von einzelnen Stämmen, z. B. DSM 372, Saccharase-Inhibitoren gebildet, die im Gemisch neben Desoxynojirimycin und/oder Nojirimycin noch andere im Dünnschicht-Chromatogramm deutlich unterscheidbare saccharaeinhibitorisch aktive Komponenten produzieren.

Andere Stämme, z. B. DSM 741, bilden Inhibitoren, die im Dünnschicht-Chromatogramm kein Desoxynojirimycin oder Nojirimycin erkennen lassen und die somit chemisch von anderer Struktur sind.

Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von kohlenhydrathaltigen Nahrungsmitteln und Getränken (z. B. Getreide-, Kartoffelstärke, Obst, Fruchtsaft, Bier, Schokolade) Hyperglykämien auftreten, die infolge eines raschen Abbaus der Kohlenhydrate durch Glycosidhydrolysen (z. B. Speichel- und Pankreaseamylasen, Maltasen, Saccharasen) nach folgendem Schema

bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern besonders stark und anhaltend ausgeprägt. Bei Adipösen bewirkt die alimentäre Hyperglykämie oftmals eine besonders starke Sekretion von Insulin, das seinerseits zu vermehrtem Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt. Im Anschluß an derartige Hyperglykämien tritt bei stoffwechselgesunden und adipösen Personen infolge der Insulinsekretion häufig eine Hypoglykämie auf. Bekannt ist, daß sowohl Hypoglykämien als auch im Magen verweilender Speisebrei die Produktion von Magensaft fördern, der seinerseits die Entstehung einer Gastritis, eines Ulcus ventriculi oder duodeni auslöst oder begünstigt.

Ferner ist bekannt, daß in der Mundhöhle Kohlenhydrate, besonders Saccharose, durch Mikroorganismen gespalten werden und dadurch die Kariesbildung gefördert wird.

Malabsorption von Kohlenhydraten, z. B. infolge intestinalen Saccharasemangels, bewirkt eine Diarrhoe. Geeignete Dosen eines Glucosidase-Inhibitors bewirken eine künstliche Malabsorption und sind deshalb geeignet, einer Obstipation entgegenzuwirken.

Die erfindungsgemäßen Inhibitoren eignen sich deshalb als Therapeutica für folgende Indikationen: Adipositas, Hyperlipoproteinämie, Atherosklerose, Diabetes, Prädiabetes, Gastritis, Obstipation, Karies.

Zur Verbreiterung des Wirkungsspektrums kann es sich empfehlen, Inhibitoren für Glycosidhydrolasen, die sich gegenseitig in ihrer Wirkung ergänzen, zu kombinieren, sei es, daß es sich um Kombinationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren untereinander oder um Kombinationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren mit bereits bekannten handelt. So kann es beispielsweise zweckmäßig sein, erfindungsgemäße Saccharase-Inhibitoren mit bereits bekannten Amylase-Inhibitoren zu kombinieren.

Vorteilhaft sind in manchen Fällen auch Kombinationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren mit bekannten oralen Antidiabetica (β-cytotrope Sulfonylharnstoffderivate und/oder blutzuckerwirksame Biguanide) sowie mit blutlipid- senkenden Wirkstoffen wie z. B. Clofibrat, Nicotinsäure, Cholestyramin und andere.

Die Verbindungen können ohne Verdünnung, z. B. als Pulver oder in einer Gelatinehülle oder in Kombination mit einem Trägerstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung appliziert werden.

Pharmazeutische Zubereitungen können eine größere oder kleinere Menge des Inhibitors enthalten, z. B. 0,1% bis 99,5%, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen nichttoxischen, inerten Trägerstoff, wobei der Trägerstoff eine oder mehrere feste, halbfeste oder flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe und/oder nicht- toxisches, inertes und pharmazeutisch-verträgliches Formulierungshilfsmittel enthalten kann. Solche pharmazeutischen Zubereitungen liegen vorzugsweise in Form von Dosierungseinheiten vor, d. h. physikalisch-diskrete, eine bestimmte Menge des Inhibitors enthaltenden Einheiten, die einem Bruchteil oder einem Vielfachen der Dosis entsprechen, die zur Herbeiführung der gewünschten Hemmwirkung führen. Die Dosierungseinheiten können 1, 2, 3, 4 oder mehr Einzeldosen oder 1/2, 1/3 oder 1/4 einer Einzeldosis enthalten. Eine Einzeldosis enthält vorzugsweise eine genügende Menge Wirkstoff, um bei einer Applikation gemäß eines vorher bestimmten Dosierungsschemas einer oder mehrerer Dosierungseinheiten die gewünschte Hemmwirkung zu erzielen, wobei eine ganze, eine halbe oder ein Drittel oder ein Viertel der Tagesdosis gewöhnlich einmal, zweimal, dreimal oder viermal am Tage verabreicht wird. Andere therapeutische Mittel können auch eingenommen werden. Obgleich die Dosierung und das Dosierungsschema in jedem Fall sorgsam abgewogen werden sollte, unter Anwendung gründlichen fachmännischen Urteils und unter Beachtung des Alters, des Gewichts und des Zustands des Patienten, der Art und der Schwere der Erkrankung, wird die Dosierung gewöhnlich in einem Bereich zwischen etwa 30 bis etwa 3×10⁵ AIE/kg und zwischen etwa 1 bis etwa 1×10⁴ SIE/kg des Körpergewichts pro Tag liegen. In manchen Fällen wird man dabei eine ausreichende therapeutische Wirkung mit einer geringeren Dosis erreichen, während in anderen Fällen eine größere Dosis erforderlich sein wird.

Orale Applikation kann unter Verwendung fester und flüssiger Dosierungseinheiten durchgeführt werden, wie z. B. Pulver, Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulate, Suspensionen, Lösungen und dergleichen.

Pulver wird durch Zerkleinerung der Substanz in einer geeigneten Größe und Vermischen mit einem ebenfalls zerkleinerten pharmazeutischen Trägerstoff hergestellt. Obgleich ein eßbares Kohlenhydrat, wie z. B. Stärke, Lactose, Saccharose oder Glucose, normalerweise zu diesem Zwecke Verwendung findet und auch hier benutzt werden kann, ist es wünschenswert, ein nicht metabolisierbares Kohlenhydrat, wie z. B. ein Cellulosederivat, zu benutzen.

Süßmittel, Geschmackszusätze, Konservierungsstoffe, Dispergiermittel und Färbemittel können auch mitverwendet werden.

Die Kapseln können durch Zubereitung der oben beschriebenen Pulvermischung und durch Füllung bereits gebildeter Gelatinehüllen hergestellt werden. Die Pulvermischung kann man vor dem Füllvorgang mit Gleitmitteln, wie z. B. Kieselgel, Talkum, Magnesiumstearat, Calciumstearat oder festem Polyethylenglykol versetzen. Die Mischung kann man ebenfalls mit einem Desintegrator oder Lösungsvermittler, wie z. B. Agar-Agar, Calciumcarbonat oder Natriumcarbonat versetzen, um bei der Einnahme der Kapsel die Zugänglichkeit des Inhibitors zu verbessern.

Die Anfertigung der Tabletten erfolgt z. B. durch Herstellung einer Pulvermischung, grob oder feinkörnig, und Hinzufügung eines Gleitmittels und Desintegrators. Aus dieser Mischung formt man Tabletten. Eine Pulvermischung bereitet man vor durch Mischung der Substanz, welche in geeigneter Weise zerkleinert wurde und ergänzt durch ein Verdünnungsmittel oder eine andere Trägersubstanz wie oben beschrieben. Gegebenenfalls fügt man ein Bindemittel hinzu: z. B. Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine oder Polyvinylpyrrolidone, einen Lösungsverzögerer, wie z. B. Paraffin, einen Resorptionsbeschleuniger, wie z. B. ein quarternäres Salz und/oder ein Adsorptionsmittel, wie z. B. Bentonit, Kaolin oder Dicalciumphosphat. Die Pulvermischung kann granuliert werden zusammen mit einem Bindemittel, wie z. B. Syrup, Stärkepaste, Akazienschleim, oder Lösungen aus Zellulose- oder Polymerenmaterialien. Danach preßt man das Produkt durch ein grobes Sieb. Als Alternative hierzu kann man die Pulvermischung durch eine Tablettenmaschine laufen lassen und die sich ergebenden ungleichmäßig geformten Stücke bis auf Korngröße zerkleinern. Damit die entstandenen Körner nicht in den tablettenbildenden Düsen stecken bleiben, kann man sie mit einem Gleitmittel versetzen, wie z. B. Stearinsäure, Stearatsalz, Talkum oder Mineralöl. Diese gleitfähig gemachte Mischung wird dann in Tablettenform gepreßt. Die Wirkstoffe können auch mit freifließenden inerten Trägerstoffen vereinigt werden und direkt in Tablettenform gebracht werden unter Auslassung der Granulat- oder Zerstückelungsschritte. Man kann das Produkt mit einer klaren oder opaken Schutzhülle versehen, z. B. einem Überzug aus Schellack, einem Überzug aus Zucker oder Polymersubstanzen und einer polierten Hülle aus Wachs. Farbstoffe können diesen Überzügen beigefügt werden, damit zwischen den verschiedenen Dosierungseinheiten unterschieden werden kann.

Die oral zu verabreichenden Zubereitungsformen, wie z. B. Lösungen, Syrup und Elixire, lassen sich in Dosierungseinheiten herstellen, so daß eine bestimmte Menge Präparat eine bestimmte Menge Wirkstoff enthält. Syrup kann so hergestellt werden, daß der Wirkstoff in einer wäßrigen Lösung, welche geeignete Geschmacksstoffe enthält, gelöst wird; Elixiere werden unter Verwendung nicht toxischer, alkoholischer Trägerstoffe erhalten. Suspensionen kann man durch Dispergieren der Verbindung in einem nichttoxischen Trägerstoff darstellen. Lösungsvermittler und Emulgiermittel, wie z. B. ethoxilierte Isostearylalkohole und Polyoxyethalensorbitester, Konservierungsmittel, geschmacksverbessernde Zusätze, wie z. B. Pfefferminzöl oder Saccharin und dergleichen, können auch zugegeben werden.

Dosierungsvorschriften können auf der Kapsel angegeben werden. Überdies kann die Dosierung so abgesichert sein, daß der Wirkstoff verzögert abgegeben wird, z. B. durch Einhalten des Wirkstoffes in Polymerensubstanzen, Wachse oder dergleichen.

Zusätzlich zu den obenerwähnten pharmazeutischen Zusammensetzungen lassen sich auch diese Wirkstoffe enthaltende Lebensmittel herstellen; beispielsweise Zucker, Brot, Kartoffelprodukte, Fruchtsaft, Bier, Schokolade und andere Konfektartikel, und Konserven, wie z. B. Marmelade, wobei zu diesen Produkten eine therapeutisch- wirksame Menge mindestens eines der erfindungsgemäßen Inhibitoren gegeben wurde.

Die erfindungsgemäßen Inhibitoren weisen weiterhin die Eigenschaft auf, in Tieren das Verhältnis des Anteiles an unerwünschtem Fett zum Anteil des erwünschten fettarmen Fleisches (mageres Fleisch) zugunsten des mageren Fleisches in hohem Maße zu beeinflussen. Dies ist von besonderer Bedeutung für die Aufzucht und Haltung von landwirtschaftlichen Nutztieren, z. B. in der Schweinemast, aber auch von erheblicher Bedeutung für die Aufzucht und Haltung von sonstigen Nutztieren und Ziertieren. Die Verwendung der Inhibitoren kann weiterhin zu einer erheblichen Rationalisierung der Fütterung der Tiere führen, sowohl zeitlich, mengenmäßig wie auch qualitätsmäßig. Da sie eine gewisse Verzögerung der Verdauung bewirken, wird die Verweildauer der Nährstoffe im Verdauungstrakt verlängert, wodurch eine mit weniger Aufwand verbundene ad libitum-Fütterung ermöglicht wird. Weiterhin ergibt sich bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Inhibitoren in vielen Fällen eine erhebliche Einsparung von wertvollem Proteinfutter.

Die Wirkstoffe können somit praktisch in allen Bereichen der Tierernährung als Mittel zur Reduzierung des Fettansatzes sowie der Einsparung von Futtereiweiß verwendet werden.

Die Wirksamkeit der Wirkstoffe ist hierbei weitgehend unabhängig von der Art und dem Geschlecht der Tiere. Besonders wertvoll erweisen sich die Wirkstoffe bei Tierarten, die überhaupt oder in bestimmten Lebensabschnitten zu stärkerer Fetteinlagerung neigen.

Als Tiere, bei denen die Inhibitoren zur Reduzierung des Fettansatzes und/oder zur Einsparung von Futtereiweiß eingesetzt werden können, seien beispielsweise folgende Nutz- und Ziertiere genannt: Warmblüter wie Rinder, Schweine, Pferde, Schafe, Ziegen, Katzen, Hunde, Kaninchen, Pelztiere, z. B. Nerze, Chinchilla, andere Ziertiere, z. B. Meerschweinchen und Hamster, Labor- und Zootiere, z. B. Ratten, Mäuse, Affen usw., Geflügel, z. B. Broiler, Hühner, Gänse, Enten, Truthähne, Tauben, Papageien und Kanarienvögel, und Kaltblüter, wie Fische, z. B. Karpfen, und Reptilien, z. B. Schlangen.

Die Menge der Wirkstoffe, die den Tieren zur Erreichung des gewünschten Effektes verabreicht wird, kann wegen der günstigen Eigenschaften der Wirkstoffe weitgehend variiert werden. Sie liegt vorzugsweise bei etwa 0,5 mg bis 2,5 g, insbesondere 10 bis 100 mg/kg Futter. Die Dauer der Verabreichung kann von wenigen Stunden oder Tagen bis zu mehreren Jahren betragen. Die passende Menge Wirkstoff sowie die passende Dauer der Verabreichung stehen in engem Zusammenhang mit dem Fütterungsziel. Sie hängen insbesondere von der Art, dem Alter, dem Geschlecht, dem Gesundheitszustand und der Art der Haltung der Tiere ab und sind durch jeden Fachmann leicht zu ermitteln.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe werden den Tieren nach den üblichen Methoden verabreicht. Die Art der Verabreichung hängt insbesondere von der Art, dem Verhalten und dem Allgemeinzustand der Tiere ab. So kann die Verabreichung einmal oder mehrmals täglich, in regelmäßigen oder unregelmäßigen Abständen, oral erfolgen. Aus Zweckmäßigkeitsgründen ist in den meisten Fällen eine orale Verabreichung, insbesondere im Rhythmus der Nahrungs- und/oder Getränkeaufnahme der Tiere, vorzuziehen.

Die Wirkstoffe können als reine Stoffe oder in formulierter Form verabreicht werden, wobei die formulierte Form sowohl als Premix, also in Mischung mit nichttoxischen inerten Trägerstoffen beliebiger Art, als auch als Teil einer Gesamtration in Form eines Beifutters bzw. als Mischungsbestandteil eines alleinigen Mischfutters zu verstehen ist. Mit eingeschlossen ist auch die Applikation geeigneter Zubereitungen über das Trinkwasser.

Die Wirkstoffe können gegebenenfalls in formulierter Form auch zusammen mit anderen Nähr- und Wirkstoffen, z. B. Mineralsalzen, Spurenelementen, Vitaminen, Eiweißstoffen, Energieträgern (z. B. Stärke, Zucker, Fette) Farbstoffen und/oder Geschmacksstoffen, oder anderen Futterzusatzstoffen, z. B. Wachstumsförderern, in geeigneter Form verabreicht werden. Die Wirkstoffe können den Tieren vor, während oder nach der Nahrungsaufnahme gegeben werden.

Empfehlenswert ist die orale Verabreichung zusammen mit dem Futter und/oder Trinkwasser, wobei je nach Bedarf die Wirkstoffe der Gesamtmenge oder nur Teilen des Futters und/oder Trinkwassers zugegeben werden.

Die Wirkstoffe können nach übliche Methoden durch einfaches Mischen als reine Stoffe, vorzugsweise in fein verteilter Form oder in formulierter Form in Mischung mit eßbaren, nichttoxischen Trägerstoffen, gegebenenfalls auch in Form eines Premix oder eines Futterkonzentrates, dem Futter und/oder dem Trinkwasser beigefügt werden.

Das Futter und/oder Trinkwasser kann beispielsweise die erfindungsgemäßen Wirkstoffe in einer Konzentration von etwa 0,001 bis 5,0%, insbesondere 0,02 bis 2,0% (Gewicht) enthalten. Die optimale Höhe der Konzentration des Wirkstoffs im Futter und/oder Trinkwasser ist insbesondere abhängig von der Menge der Futter- und/oder Trinkwasseraufnahme der Tiere und kann durch jeden Fachmann leicht ermittelt werden.

Die Art des Futters und seine Zusammensetzung ist hierbei ohne Belang. Es können alle gebräuchlichen, handelsüblichen oder speziellen Futterzusammensetzungen verwendet werden, die vorzugsweise das übliche, für eine ausgewogene Ernährung notwendige Gleichgewicht aus Energie- und Eiweißstoffen, einschließlich Vitaminen und Mineralstoffen enthalten. Das Futter kann sich beispielsweise zusammensetzen aus pflanzlichen Stoffen, z. B. Ölkuchenschroten, Getreideschroten, Getreidenebenprodukten, aber auch aus Heu, Gärfutter, Rüben und anderen Futterpflanzen, aus tierischen Stoffen, z. B. Fleisch- und Fischprodukten, Knochenmehl, Fetten, Vitaminen, z. B. A, D, E, K und B-Komplex, sowie speziellen Proteinquellen, z. B. Hefen, sowie bestimmten Aminosäuren und Mineralstoffen und Spurenelementen, wie z. B. Phosphor und Eisen, Zink, Mangan, Kupfer, Kobalt, Jod usw.

Premixe können vorzugsweise etwa 0,1 bis 50%, insbesondere 0,5 bis 5,0% (Gewicht), der Wirkstoffe der Formel I neben beliebigen eßbaren Trägerstoffen und/oder Mineralsalzen, z. B. kohlensaurem Futterkalk, enthalten und werden nach den üblichen Mischmethoden hergestellt.

Mischfutter enthalten vorzugsweise 0,001 bis 5,0%, insbesondere 0,02 bis 2,0% (Gewicht), der Wirkstoffe der Formel I neben den üblichen Rohstoffkomponenten eines Mischfutters, z. B. Getreideschrote oder -nebenprodukte, Ölkuchenschrote, tierisches Eiweiß, Mineralien, Spurenelemente und Vitamine. Sie können nach den üblichen Mischmethoden hergestellt werden.

Vorzugsweise in Premixen und Mischfuttermitteln können die Wirkstoffe gegebenenfalls auch durch ihre Oberfläche bedeckende geeignete Mittel, z. B. mit nichttoxischen Wachsen oder Gelatine, vor Luft, Licht und/oder Feuchtigkeit geschützt werden.

Beispiel für die Zusammensetzung eines fertigen Mischfutters für Geflügel, das einen erfindungsgemäßen Wirkstoff enthält:
200 g Weizen, 340 g Mais, 360,3 g Sojaschrot, 60 g Rindertalg, 15 g Dicalciumphosphat, 10 g Calciumcarbonat, 4 g jodiertes Kochsalz, 7,5 g Vitamin-Mineral-Mischung und 3,2 g Wirkstoff-Premix ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.

Die Vitamin-Mineralmischung besteht aus:
6000 I.E. Vitamin A, 1000 I.E. Vitamin D₃, 10 mg Vitamine E, 1 mg Vitamin K₃, 3 mg Riboflavin, 2 mg Pyridoxin, 20 mcg Vitamin B₁₂, 5 mg Calciumpantothenat, 30 mg Nikotinsäure, 200 mg Cholinchlorid, 200 mg MnSO₄ ×H₂O, 140 mg ZnSO₄×7 H₂O, 100 mg FeSO₄×7 H₂O und 20 mg CuSO₄×5 H₂O. Der Wirkstoff-Premix enthält z. B. 1-Desoxynojirimycin in der gewünschten Menge, z. B. 1600 mg und zusätzliche 1 g DL-Methionin sowie so viel Sojabohnenmehl, daß 3,2 g Premix entstehen.

Beispiel für die Zusammensetzung eines Schweinemischfutters, das einen Wirkstoff der Formel I enthält:
630 g Futtergetreideschrot (zusammengesetzt aus 200 g Mais-, 150 g Gerste-, 150 g Hafer- und 130 g Weizenschrot), 80 g Fischmehl, 60 g Sojaschrot, 58,8 g Tapiokamehl, 38 g Bierhefe, 50 g Vitamin-Mineral-Mischung für Schweine (Zusammensetzung z. B. wie beim Kükenfutter), 30 g Leinkuchenmehl, 30 g Maiskleberfutter, 10 g Sojaöl, 10 g Zuckerrohrmelasse und 2 g Wirkstoff-Premix (Zusammensetzung z. B. wie beim Kükenfutter) ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.

Die angegebenen Futtergemische sind vorzugsweise zur Aufzucht und Mast von Küken bzw. Schweinen abgestimmt, sie können jedoch in gleicher oder ähnlicher Zusammensetzung auch zur Aufzucht und Mast anderer Tiere verwendet werden.

Wie bereits erwähnt, können die Inhibitoren einzeln oder aber auch in beliebigen Mischungen untereinander verwendet werden, wobei sowohl die reinen Wirkstoffe als auch die bei der Herstellung erhaltenen rohen Wirkstoffe gegebenenfalls nach einer Grobreinigung eingesetzt werden.

Beispiel 1

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung

2,0% Maisstärke
1,0% Glucose
0,5% Kaseinhydrolysat
1,0% Hefeextrakt
pH mit NaCO₃ auf 7,2 eingestellt + 0,4% CaCO₃, Sterilisation 30′ bei 121°C

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 704 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 70 SIE/ml.

Beispiel 2

7,5% Malzextrakt
0,3% Kaseinhydrolysat
0,7% Hefeextrakt
0,3% CaCO₃
0,3% K₂HPO₄
Leitungswasser, Sterilisation 30′ bei 121°C pH nach der Sterilisation auf 6,6-6,8 mit K₂CO₃ eingestellt

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 704 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 197 SIE/ml.

Beispiel 3

Beimpft man einen 140-l-Fermenter, der 100 l Nährlösung der Zusammensetzung

7,5% Malzextrakt
0,3% Kaseinhydrolysat
0,7% Hefeextrakt
0,3% CaCO₃
0,3% K₂HPO₄
Leitungswasser, Sterilisation 30′ bei 121°C, pH nach der Sterilisation auf 6,6-6,8 mit K₂CO₃ eingestellt

enthält, mit 1,2 l Vorkultur, gewonnen durch Bebrütung von 10 1-l-Erlenmeyerschüttelkolben mit je 120 ml Nährlösung derselben Zusammensetzung, beimpft mit dem Stamm DSM 704 und bebrütet unter Rührung und Belüftung 5 Tage bei 28°C, so erhält man eine Kulturbrühe, die 260 SIE/ml enthält.

Beispiel 4

3,0% Sojamehl
3,0% Glycerin
0,2% CaCO₃
Leitungswasser, Sterilisation 30′ bei 121°C

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 437 SIE/ml.

Beispiel 5

nach Beispiel 1

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 162 SIE/ml.

Beispiel 6

1,0% Glucose
1,0% Stärke lösl.
0,5% Kaseinhydrolysat
0,75% Fleischextrakt
0,75% Peptone
0,5% Hefe-Extrakt
0,1% K₂HPO₄
0,3% NaCl
0,1% MgSO₄ · 7 H₂O
Leitungswasser, pH mit Na₂CO₃ auf 7,2 eingestellt, Sterilisation 30′ bei 121°C

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 36,4 SIE/ml.

Beispiel 7

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 200 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 3

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 6 Tagen eine Aktivität von 224 SIE/ml.

Beispiel 8

Beimpft man einen 140-l-Fermenter, der 100- l-Nährlösung

nach Beispiel 4

enthält, mit 1,2 l Vorkultur, gewonnen durch Bebrütung von 10 1-l-Erlenmeyerschüttelkolben mit je 120 ml Nährlösung derselben Zusammensetzung, beimpft mit dem Stamm DSM 7 und bebrütet unter Rührung und Belüftung 5 Tage bei 28°C, so erhält man eine Kulturbrühe, die 286 SIE/ml enthält.

Beispiel 9

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 2

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 1 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 6 Tagen eine Aktivität von 28,4 SIE/ml.

Beispiel 10

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 1

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 365 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 15,6 SIE/ml.

Beispiel 11

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 2

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 365 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 25,8 SIE/ml.

Beispiel 12

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 4

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 3,2 SIE/ml.

Beispiel 13

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 1

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 26,4 SIE/ml.

Beispiel 14

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 2

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 24,0 SIE/ml.

Beispiel 15

2,0% Maisstärke
0,5% Glucose
0,3% Kaseinhydrolysat
pH mit Na₂CO₃ auf 7,2 eingestellt + 0,4% CaCO₃, Sterilisation 30′ bei 121°C

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 2 Tagen eine Aktivität von 81,7 SIE/ml und nach 3 Tagen eine Aktivität von 121 SIE/ml.

Beispiel 16

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 4

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 675 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 8,6 SIE/ml.

Beispiel 17

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 1

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 675 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 53,0 SIE/ml.

Beispiel 18

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 2

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 675 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 17,8 SIE/ml.

Beispiel 19

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 4

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 6,0 SIE/ml.

Beispiel 20

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 1

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 21,6 SIE/ml.

Beispiel 21

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 200 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 2

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 26,8 SIE/ml.

Beispiel 22

2,0% Maisstärke
1,0% Glucose
0,5% Kaseinhydrolysat
0,5% Hefe-Extrakt
pH mit Na₂CO₃ auf 7,2 eingestellt + 0,4% CaCO₃, Sterilisation 30′ bei 121°C

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 26,5 SIE/ml.

Beispiel 23

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 22

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 479 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 7,9 SIE/ml.

Beispiel 24

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 6

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 479 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 5,4 SIE/ml.

Beispiel 25

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 2

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 36 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 5,4 SIE/ml.

Beispiel 26

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 2

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 356 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 8,8 SIE/ml.

Beispiel 27

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 1

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 292 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 9,0 SIE/ml.

Beispiel 28

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 2

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 292 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 9,2 SIE/ml.

Beispiel 29

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 2

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 742 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 9,8 SIE/ml.

Beispiel 30

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung

nach Beispiel 1

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 740 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 5,7 SIE/ml.

Beispiel 31

Die Fermentationsbrühe aus einem 100-l-Fermenter

nach Beispiel 3

wurde mit halbkonzentrierter HCl auf pH 3,0-3,5 eingestellt und die Bakterienmassen nach dem Ausflocken abzentrifugiert. Man erhielt 70 l tiefbraune Kulturlösung mit einem SIE-Gehalt von 220 000 SIE/l. Diese Lösung wurde mit einer Fließrate von 20 l/h über eine mit 12 kg Lewatit® SC 104 in der H⁺-Form gepackte Säule von ⌀ 30 cm gegeben. Der Durchlauf hatte praktisch keine saccharaseinhibitorische Aktivität und wurde verworfen. Die Säule wurde mit 50 l dest. H₂O (Waschwasser I) 20 l 0,01 n HCl und anschließend nochmals 20 l dest. H₂O (Waschwasser II) gewaschen. Zur Desorption der Aktivität wurde nun 2,5% Ammoniak angeschlossen. Parallel mit dem Anstieg der Leitfähigkeit des Eluats und der Zunahme der Braunfärbung wird die saccharaseinhibitorische Aktivität eluiert. Der Vorlauf (20 l) bis zum Anstieg der Leitfähigkeit wird verworfen, die die Aktivität enthaltende Fraktion (35 l) im Rotationsverdampfer eingeengt und in wenig Wasser rückgelöst (Konzentrat 3 l). Das Konzentrat wurde lyophilisiert. Man erhielt 288 g tiefbraunes Rohprodukt I mit 38 000 SIE/g.

Beispiel 32

Die Fermentationsbrühe aus einem 100-l-Fermenter

nach Beispiel 3

wurde mit halbkonzentrierter HCl auf pH 3,0-3,5 eingestellt und die Bakterienmassen nach dem Ausflocken abzentrifugiert. Man erhielt 60 l tiefbraune Kulturlösung mit einem SIE-Gehalt von 240 000 SIE/l. Diese Lösung wurde mit einer Fließrate von 20 l/h über eine mit 12 kg Dowex 50 W×4 in der H⁺-Form gepackte Säule von ⌀ 30 cm gegeben. Der Durchlauf hatte praktisch keine saccharaseinhibitorische Aktivität und wurde verworfen. Die Säule wurde mit 50 l dest. H₂O (Waschwasser I) 20 l 0,01 n HCl und anschließend nochmals 20 l dest. H₂O (Waschwasser II) gewaschen. Zur Desorption der Aktivität wurde nun 2,5% Ammoniak angeschlossen. Parallel mit dem Anstieg der Leitfähigkeit des Eluats und der Zunahme der Braunfärbung wird die saccharaseinhibitorische Aktivität eluiert. Der Vorlauf (20 l) bis zum Anstieg der Leitfähigkeit wird verworfen, die die Aktivität enthaltende Fraktion (35 l) im Rotationsverdampfer eingeengt und in wenig Wasser rückgelöst (Konzentrat 3 l). Das Konzentrat wurde lyophilisiert. Man erhielt 360 g tiefbraunes Rohprodukt I mit 24 000 SIE/g.

Beispiel 33

50 g Rohprodukt I aus Beispiel 31 wurden fein zermörsert und anschließend 3× mit je 300 ml techn. Methanol extrahiert. Dazu wurde der Ansatz zunächst 2 Min. im Ultraturraxhomogenisator homogenisiert, dann in ein 40-50°C warmes Wasserbad eingebracht und 20′ gerührt. Nach jeder Extraktion wurde durch ein Faltenfilter abfiltriert. Der nach der 3. Extraktion im Faltenfilter verbleibende Rückstand wurde im Vakuum getrocknet (28,4 g). Da die Testung nur eine geringe spezifische Aktivität dieses Rückstandes ergab, wurde er anschließend verworfen. Die methanolischen Extrakte wurden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der im Kolben verbleibende aktive Rückstand wurde in 750 ml H₂O gelöst (l= 2,8 mS, pH=7,2) und mit einer Fließrate von 500 ml/h über eine 5×50-cm-Säule, gefüllt mit CM-Cellulose in der H⁺-Form (CH-Cellulose der Fa. Whatman, Typ C 52), gegeben. Man wusch mit 5 l Wasser nach und schloß dann zur Elution 20 l 0,002 n HCl an. Durchlauf, Waschwasser und Eluat wurden in ca. 0,5-l-Portionen fraktioniert aufgefangen. Die saccharaseinhibitorische Aktivität wurde bestimmt und alle Fraktionen, die mehr als 30 000 SIE/l enthielten, vereinigt: Im Durchlauf die tiefbraun gefärbten Fraktionen 2-4 und im hellgelben Eluat die Fraktionen 16-35. Die vereinigten Fraktionen wurden eingeengt und lyophilisiert. Man erhielt 18,2 g der Durchlauffraktion 2-4 mit einer spezifischen Aktivität von 4000 SIE/g (verworfen) sowie 3,1 g des sogenannten Rohprodukts II mit 250 000 SIE/g (ca. 50-60% rein). Das Rohprodukt II ist stark hygroskopisch und zerfließt an der Luft in kurzer Zeit zu einer klebrigen Masse.

Beispiel 34

2,5 g des Rohprodukts II aus Beispiel 33 werden zur Abtrennung der Hauptmenge der begleitenden Peptide in 15 ml Methanol gelöst und über eine 5×90 cm mit Sephadex LH 20 in Methanol gefüllte Säule chromatographiert. Bei einer Fließrate von 100 ml/h und einer Temperatur von 4-5°C sammelt man 10 ml-Fraktionen. 10 µl dieser Fraktionen werden auf einer Kieselgelplatte (Fa. Merck) aufgetragen und dünnschichtchromatographisch im System Ethanol/25% NH₃/H₂O = 80/10/10 untersucht. Die nach DC Inhibitor enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, auf 5-10 ml eingeengt und über die gleiche Säule rechromatographiert. Man analysierte die Fraktionen in der DC und vereinigte die inhibitorhaltigen Fraktionen, wobei nur ein sehr enger Bereich geschnitten wurde. Man engt zur Trockene ein. Derart LH 20-gereinigter Inhibitor ist ca. 90% rein. Zur Abtrennung der letzten verbliebenen Peptidverunreinigungen nimmt man die nach dem Einrotieren als Rückstand verbleibende Substanz in 2-3 ml Methanol auf und versetzt die gelbe methanolische Lösung mit 50 µl konzentrierter HCl. Nach kurzer Zeit, evtl. auch erst nach mehrstündigem Stehen, kristallisiert der Inhibitor in Form leicht gelblicher Würfel oder Quader aus. Die Peptide bleiben in der Mutterlauge. Man zentrifugiert die Kristalle ab, wäscht 1× mit eiskaltem Methanol und löst den gewaschenen Niederschlag anschließend unter Erhitzen in 2 ml Methanol wieder aus. Man setzt 4 ml Butanol hinzu und stellt über Nacht bei 4°C ab. Die am nächsten Morgen ausgefallenen farblosen Kristalle werden abzentrifugiert, 1× mit eiskaltem Methanol, 1× mit Aceton und 1× mit Ether gewaschen und anschließend im Vakuum getrocknet. Ausbeute 460 mg des Inhibitors als Hydrochlorid mit 540 000 SIE/g.

Beispiel 35

Zum Nachweis saccharaseinhibitorischer Komponenten in Kulturlösung oder Rohprodukt wurde auch folgendes dünnschichtchromatographisches Verfahren mit anschließender Enzymreaktion auf der Platte benutzt, welches den Nachweis inhibitorischer Komponenten direkt auf der Platte gestattet. In dieser Dünnschichtchromatographie trägt man 1-5 µl der Fermentationsbrühen oder 1-5 µg der Präparate auf Kieselgelfertigplatten (Fa. Merck, Typ KG 60 F 254) auf und entwickelt in Ethanol/NH₃/H₂O = 8/1/1. Zur direkten Sichtbarmachung der saccharaseinhibitorischen Komponenten besprayt man die entwickelte und gut getrocknete Platte mit Enzymgel (20 ml/20×20-cm- Platte) und läßt das Gel erstarren. Dann wird für 5′ in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur vorinkubiert und anschließend satt mit Substratgel besprayt. Nach dem Erstarren dieser 2. Gelschicht bringt man die Platte in eine feuchte Kammer ein und inkubiert bei 40°C. Die Inhibitionsfärbung (helle Flecken, rotbrauner Hintergrund) entwickelt sich in 60-90′. Zum Zeitpunkt der optimalen Farbentwicklung wird abgebrochen und die Platte mit den darauf befindlichen Agarschichten am Föhn mit Warmluft getrocknet.

Bereitung der Gele

Enzymgel: 1,5 g Agarose (L'Industrie Biologique Francaise) wird in 100 ml 0,2 m Na-Maleinatpuffer pH 6,0 suspendiert und anschließend durch Aufkochen gelöst. Die klare Agaroselösung wird auf 50°C abgekühlt und mit 250 µl Triton-X-100-Lösung (2 g Triton X-100 + 8 g Ethanol p.a.)und 0,5 ml Dianisidinlösung (20 mg Dianisidin/1 ml Aceton) unter Umschwenken versetzt. Direkt vor Gebrauch des Gels werden 1 ml GOD/POD-Reagens (12,5 mg Glucoseoxidase, Reinheitsgrad I, Fa. Boehringer, Best.-Nr. 15 423, und 2,5 mg Peroxidase, Reinheitsgrad II, Fa. Boehringer, Best.-Nr. 15 302, gelöst in 5 ml Maleinatpuffer) und 4-5 Einheiten Saccharase aus Schweinedünndarm (Solubisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem., 12, [1958], S. 1997. Mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.) zugesetzt. Das Gel muß bis zum Versprayen auf 50°C gehalten werden, da es sonst beim Sprayvorgang in den Düsen erstarrt.

Substratgel: 0,5 g Agarose wird in 100 ml Na-Maleinatpuffer pH 6,0 suspendiert und unter Kochen gelöst. Man kühlt anschließend auf 50°C ab, versetzt mit 100 µl Triton (2 g Triton-X-100 + 8 g Ethanol p.a.) und gibt 1 g Saccharose (Serva Nr. 35 579) zu. Nach dem Lösen der Saccharose ist das Gel gebrauchsfertig.

Die Untersuchung der Kulturlösungen der Stämme mit dieser Methode ergaben saccharaseinhibitorische Komponenten mit folgenden R_f-Werten:

Stämme
R_f-Werte
DSM 7
0,25
DSM 741	0,25, 0,41, 0,50, 0,59, 0,71
DSM 704	0,25
DSM 372	0,25, 0,51, 0,60, 0,71

Claims

Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Inhibitoren für Glycosidhydrolasen, erhalten dadurch, daß man Organismen der Arten Bacillus subtilis, Bacillus subtilis var. niger, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus longisporus oder Bacillus polymyxa in üblichen Nährlösungen bei Temperaturen von etwa 15 bis etwa 80°C etwa 1 bis 8 Tage unter Belüftung in üblichen Fermentationsgefäßen kultiviert, die Zellen abschleudert und die Inhibitoren aus der Kulturbrühe oder den Zellextrakten durch übliche Reinigungsoperationen isoliert.