DE2614393C3 - Aminozucker-Derivate und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Description

ΗΟΗ,Γ

in der n\ und n? für eine Ziffer von 1 bis 7 stehen können, die Summe von m und ßj jedoch imn.
einen Wert von 2 bis 8 besitzt.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin n\ 2 und /72 I ist. zn

3. Verbindung nach Anspruch ! worin n-, 2 und n-_£ 2 ist.

4. Verbindung nach Anspruch 1, worin /Ji 2 und n₂ 3 ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Aminozukker-Derivate und, die diese Aminozucker-Derivate als Wirkstoffe enthalten.

Es ist bekannt, daß eine Reihe von Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales Inhibitoren für Glycosidhydrolasen bilden, wobei man je nach den Züchtungsbe-

CH,Oll

O -^ ^-O
HO HO

IK) OH

HOH₂C

in der

Πι und Π2 für eine Ziffer von 1 bis 7 stehen können, die Summe von n% und nj jedoch stets einen Wert von 2 bis 8 besitzt.

Je nach dem Wert der Summe von iu +112 besitzen diese Aminozucker-Derivate überwiegend amylase- bzw. saccharasehemmende Wirkung. So sind Aminozukker-Derivate, die gezielt zur Hemmung der Amylase eingesetzt werden können, solche mit n, + m = 4 bis 8. insbesondere mit n, + n₂ = 4 und 5. Aminozucker-Derivate, die gezielt /ur Hemmung der Saccharase eingesetzt werden können, sind solche mit n> und n? = 2 bis 3, insbesondere bevorzugt mil n< = 2.

Es wurde weiterhin gefunden, daß überraschenderweise Aminozucker-Derivaie mit H\ + ni = 2 bis 3, insbesondere mit ii\ = 2 in vivo eine starke Hemmung des SlarkeabbäUS zeigen.

Die Herstellung der erfindungsgemüßen Afflinozukker-Derivale erfolgt durch Züchtung von Stämmen der Ordnung Actinomycetales, insbesondere der Familie Actirioplanaceae in an sich bekannter Weise und durch anschließende Auftrennung und Isolierung der einzel· N
H

H₁C

HO

-O

OH

HO

5. Verbindung nach Anspruch 1, worin n\ 2 und 02 4 ist

6. Arzneimittel enthaltend Verbindungen gemäß Anspruch 1.

7. Arzneimittel enthaltend die Verbindung gemäß Anspruch 2.

8. Arzneimittel enthaltend die Verbindung gemäß Anspruch 3.

dingungen Inhibitoren mit überwiegender Amylase- oder Saccharase-Hemmwirkung erhält (s. hierzu die USA-Patentschriften 38 76 766. 38 55 066 und 38 79 546).

Gefunden wurden nun die neuen Aminozucker-Derivate der allgemeinen Formel I

	Il	,C	- O	O ■	HO	(	H2OH
					I
N				OH		^,()
H						\
	I	IO				HO O

nen Verbindungen in ebenfalls an sich bekannter Weise.

Aminozucker-Derivate mit Werten der Summe von

Πι + Hi von 2 bis 4 können weiterhin durch chemische

-,n oder enzymatische Hydrolyse höhermolckularcr Aminozuckerderivate erhalten werden

Als zur Herstellung der erfindungsgemäßen Amino zucker-Dcrivate τη Frage kommende Stämme der Ordnung Actinomycetales seien beispielsweise genannt

v, SE 50 (CBS %l 70). SO 18 (CBS 957.70) und SE 82 (CBS 615.71), sowie Mutanten oder Varianten dieser Stämme. Besonders gut geeignet erwiesen sich dabei im Hinblick auf die Ausbeute an erhaltenen Anunozucker-Dcrivaten die Stämme SE 50/13 (CBS 614 71) und SE 50/110(CBS

Mi 674.73). Beide Slämme entsprechen in ihrer Beschrei bung weitgehend dem ElicrnslaiHm SE 50 (CUS 971.70), aus dem diese Slämmd durch natürliche Selektion ohne Anwendung von Miitügenen gewonnen werden.
Zur Züchtung der Mikroorganismen verwendet man

6¹; feste oder flüssige, insbesondere flüssige, wäßrige Nährboden, die die an srt'h bekannten Ausgangsstoffe für Kohlenstoff und Stickstoff. Salze und Anlischaum millcl in den üblichen Konzenirationcn enthalten.

Als Ausgangsstoffe für Kohlenstoff dienen vorwiegend Kohlenhydrate, insbesondere Stärke, Maltose, Glucose sowie komplexe Stoffgemische wie beispielsweise handelsüblicher Malzextrakt

Als Ausgangsstoffe für Stickstoff kommen die an sich bekannten komplexen Stoffgemische wie beispielsweise Kaseinhydrolysat, Hefeextrakt, Pepton, Fischmehl, Maisquellwasser, Fleischextrakt sowie Mischungen dieser Ausgangsstoffe in Frage, ebenso wie einzelne Aminosäuren und/oder Ammoniumsalze als Stickstoff- to quellen verwenden werden können.

Die Züchtung der Mikroorganismen erfolgt aerob in belüfteten Schüttelkulturen oder in den üblichen Behälterkulturen.

Art und Konzentration der für Kohlenstoff eingesetzten Ausgangsstoffe beeinflußt in Verbindung mit dem jeweiligen zur Fermentation verwendeten Stamm die Art des überwiegend gebildeten Endproduktes.

So werden beispielsweise in Nährlösungen, die Stärke über 2 Gew.-⁰A enthalten, vor allem Verbindungen mit

Π ι η. Λ Kir Q nnk-Mnt Cm. Α',η Un^>-,JI>i»ff A\r*r-nv I T UJ — -r UU \J 51.UIIUV.I. I Ul UtV. 1 11V.I StUtIUlIg lil\.3l.l

Aminozucker-Derivate mit Π\ + n₂ = 4 bis 8 ist der Stamm SE 50/13 (CBS 614.71) besonders gut geeignet.

Enthält die Nährlösung hinreichend Glucose (ca. 3.5 Gew.-%) so reichen jedoch bereits 0,1 bis 3 Gew.-% Stärke, um überwiegend Gemische von Aminozucker-Denvaten mit Πι + nj = 4 bis 8 zu erhalten. Sämtliche dieser so erhaltenen Aminozucker-Derivate können als Ausgangsverbindungen für die Herstellung der niederen Homologen auf dem Wege der chemischen oder jo enzymatischen H 'dcolyse verwendet werden.

Aminozucker-Derivate mit n, + n₂ = 2 bis 4 werden in überwiegendem Maße erhalten, wenn man in stärkefreien Nährlösungen arbeitet. Besonders günstig wirkt sich hierbei die Zugabe .on Maltose zur j-, Nährlösung aus. So erhält man beispielsweise bei Zugabe von Mallose und unter Verwendung des Stammes SE 50(CBS 961.70) Gemische von Aminozukker-Derivaten, mit überwiegend n, + /7? = 2 bis 3. Die Bildung eines Aminozucker mil n\ = 1 wird insbeson- w derc dadurch erreicht, daß man als Ausgangsmaterial für Kohlenstoff nur Glucose verwendet. Zu beachten ist hier jedoch, daß bei einem Überschuß an Glucose bei längerer Fcrmentalionsdauer auch die höhermolekularen Aminozuckerderivatc gebildet werden. 4-,

Verwendet man Nährlösungen, die keine Glucose enthalten und gibt als alleinigen Ausgangsstoff für Kohlenstoff Maltose hinzu, so erhält man überwiegend den Aminozucker mit n\ + η; = 2. In einer technisch vorteilhaften Ausführiingsform kann man dabei die ;o reine Maltose durch ein billigeres Produkt ersetzen, wie τ. B. Malt/in, einen natürlichen handelsüblichen Malzextrakt.

Als besonders geeignet fur die Herstellung von Amino/ucker-Derivalen. die überwiegend solche Deri -,·, vale mn π. t rij - 2 bis 3 enthalten, erwies sich der Stamm Sf 50/110(CBS 674.7 3).

Dieser Stamm ergibt Ausbeulen an niedermolekularen Aminozucker Derivaten, die eiwa zweimal so groß sind wie die mn dem Stamm SI 50/13 (C BS 614.71) _ho erhaltenen.

Die Züchtung der Mikroorganismen erfolgt im allgemeinen bei Bebrülungstempcraturert zwischen 15 bis 45°C. vorzugsweise zwischen 24 bis 32^OC. So erhält man bei Verwendung der Stämme SE 50 (CBS 961.70) oder SE 50/13 (CDS 614.71) Aminozucker-Derivate mit /»ι + lh = 4 bis 8 bei einer höheren Temperatur, z. B. 28°C, während bei niedrigen Temperaturen z. B. 24°C, beispielsweise die die Stämme SE 50 (CBS 961.70) und SE 50/110 (CBS 674.73) in überwiegendem Maße Aminozuckerderivate mit Πι + n₂ = 2 bis 3 bilden.

Die Kulturdauer beträgt im allgemeinen 1 bis 8 Tage, vorzugsweise 2 bis 6 Tage. Eine längere Kulturdauer, insbesondere in Verbindung mit Kohlenhydratüberschuß im Nährmedium, begünstigt die Bildung von Aminozucker-Derivaten mit höheren Werten von πι + n₂.

Der pH-Wert des Kulturmediums variiert im allgemeinen zwischen 5,0 bis 8,5, wobei pH-Werte von 6,0 bis 7,0 bevorzugt werden.

Der Endpunkt der Fermentation erfolgt im allgemeinen durch Bestimmung des Gehaltes an Hemmaktivität i-.Ti enzymatischen Hemmtest sowie durch dünnschichtchromatografische Bestimmung der Zusammensetzung des Fermentationsmediums.

Im Falle der chemischen Hydrolyse höhermolekularer Aminozucker-Derivate zur Herstellung von niedermolekularen wie bereits vorstehend erwähnt, geht man im allgemeinen in der Weise vor, daß man die höhermolekularen Aminozucker-Derivate mit 1 bis 5 normalen wäßrigen ivlineralsäuren bei Temperaturen von 50 bis 100° C. insbesondere von 90 bis 100⁰C 10 bis 180 Minuten behandelt. Die ebenfalls mögliche enzymatische Hydrolyse erfolgt im allgemeinen durch Inkubation mit Ezymen {Hydrolasen), insbesondere mit /?-Amylasen oder nicht hemmbaren <x-Amylasen oder Amyloglucosidasen mikrowellen Ursprungs, wie beispielsweise vAmylasen aus B. subtilis. oder durch Inkubation mit Mikroorganismen, die in Nährlösungen, welche die höhermolekularen Aminozucker-Derivate in Gehalten von 1 bis 10%. vorzugsweise 2 bis 5% als vorzugsweise alleinige Kohlenstoffquelle enthalten, zu wachsen vermögen, beispielsweise Aspergillus niger (ATCC 11J94).

Die Auftrennung und Isolierung der einzelnen erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate geht aus entweder von den mikrobiologischen Kulturbrühcn oder von den Hydrolysaten bzw. Inkubationsgemischen, in denen der enzymatische und/odfc»· mikrobiologische Abbau der höhermolekularen Aminozucker-Denvaie durchgeführt wurde.

)e nach den Werten für Πι + n₂ erfolgt die Aufarbeitung in urierschiedlicher Weise. So geht man zur Reindarstellung der Aminozucker Derivate von Π\ + r>i = 2 bis 4 im allgemeinen in der Weise vor. daß man. gegebenenfalls nach vorheriger Abtrennung des Myccls. die betreffende Kulturbrühe oder das Hydroly sat mit Aktivkohle bei neutralem pH behandelt, anschließend die so an die Aktivkohle gebundenen Aminozucker-Derivate durch Behandlung der Aktiv kohle mn wäßrigen Alkoholen oder Aceton. Vorzugs weise 50 bis 80%igem Aceion, desorbiert. Besonders vollständig gelingt dabei die Desorbtion bei sauren pH-Werten im Bereich von pH 1.5 bis 4. vorzugsweise von pH 2 bis 3

Falls die aufzutrennenden Kulturbrühcn bzw. Hydro lysate sehr dunkel gefärbl sind, hai es sich als vorteilhaft erwiesen, sie vor der vorstehend beschriebenen Behandlung mit Aktivkohle bei saurem pH zunächst mit Aktivkohle oder Absorbtionsharzen wie dem handelsüblichen Lewapol® Ca 9221 (0,35 mm Körnung bei pH-Werten von pH 2 bis 6, vorzugsweise 2 bis 3 zu behandeln und so eine Entfärbung zu erreichen. Die Aktivkohle bindet dabei im sauren Bereich bevorzugt nur die Farbstoffe, nicht jedoch die Aminozucker-Dcrivale.

Die Abtrennung der einzelnen erfindungsgemäßen Aminozucker-Derivate aus dem wie vorstehend be schrieben erhaltenen Aktivkohle-Desorbat erfolgt dann im allgemeinen in der Weise, daß man dieses Desorbat über an sich bekannte stark saure Kationenaustauscher wie z. B. Dowex® 50 W leitet (pH 1 bis 8, vorzugsweise pH 2 bis 4; bei niedriger Ionenstärke, entsprechend einer Leitfähigkeit < 10 mS - cm"¹, vorzugsweise < 2mS-cm-'). Die einzelnen Aminozucker-Derivate werden dabei an den Kationenaustauscher gebunden. Besonders vorteilhaft lassen sich dabei die Aminozukker-Derivate aus acetonischer Lösung (50 bis 80% Aceton, pH 1 bis 5, vorzugsweise pH 2 bis 4) an solche Kationenaustauscher binden.

Die selektive Desorption der erfindungsgemäßen Aminozucker-Derivate von diesen Kationenaustauschern erfolgt dann im allgemeinen unter Verwendung von wäßrigen Säuren oder Basen als Elusionsmittel, wobei man vorzugsweise Ammoniak oder Salzsäure in Konzenirationen von 0,0i bis 1 Vai/Liier verwendet.

Aus den einzelnen Desorbaten r/ird dann das fcetreffende Aminozucke --Derivat nach Neutralisierung lies Desorbats mit einem schwach sauren bzw. basischen Austauscher oder nach Entfernen der Base bzw. Säure durch Abziehen im Vakuum im Falle von flüchtigen Basen oder Säuren nach Einengen der Lösung durch Lyophilisation oder Fällung mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise mit Aceton erhalten.

Weiterhin ist es möglich, niedermolekulare Aminofcucker-Derivate von inerten Sacchariden durch Chromatographie an Austauschern auf Cellulosebasis, vorzugsweise Phosphor-Cellulose, abzutrennen. Als Laufmittel werden dabei Puffer, vorzugsweise Phosphatpuffer, von geringer lonenstärke, vorzugsweise 2 bis 100 mM. insbesondere 5 bis 10 mM, im pH-Bereich a von 2,5 bis 8, vorzugsweise 5 bis 6. verwendet. Voraussetzung für eine effektive Fraktionierung sind dabei möglichst geringe Salzgehalte in den zu fraktionierenden Praparationen, deren Farbstot^Te weniger stören.

Zur Reindarstellung der einzelnen Aminozucker-Derivate Chromatographien man dann die vorgereinigten Präparate, über ein geeignetes Molekularsieb, τ. Β. Bio-Gel® P-2 und untersucht die Fraktionen des F.luaiei. dünnschichtchromatographisch. Fraktionen, welche die erfindungsgemäßen Verbindungen rein enthalten, werden vereinigt, rechromatographiert und schließlich nach Einengen lyophilisiert oder mittels organischer Lösungsmittel, wie oben beschrieben, gefällt.

Alle Aminozucker-Derivate sind dadurch gekennzeichnet, daß bei saurer Totalhydrolyse 'Komponente Γ /C13H19O7N7 sowie Glucose gebildet werden. Für 'Komponente Γ wurde nachstehende Strukturformel hergeleitet.

OH

HO

(Komponente I)

OH

H C OH
C'H.,

Die Substanz mit n_x + n₂ = 3 erhält man in zwei isomeren Formen, wobei eine der beiden isomeren Formen überwiegend gebildes wird.

Das in größeren Mengen vorhandene isomere Produkt ist die Verbindung O-(4,6-Bisdesoxy-4-[IS-

(1,4,6/5)-4,5,6-trihydroxy-3-hydroxymethyl-4-O-a-D-gIucopyranosyl-( 1 — 4)-cyc!ohex-2-en-1 -ylamino]-a- D-glycopyranosyl}-(l — 4)-0-a-D-glucopyrar<osyl-(l ->4)-D-glucopyranose der konformativen Formel:

HO
HO

TS

CH₂OH

OH

HO

CH, CH₂OH

(H)

Dieses Isomerr neigt auf Kieselgelfertigplatten unter Verwendung von n->Bu(anol, Äthanol und Wässer im Verhältnis Von 50;30:20 Rciuco^Werte von 0,41 bis 0,46. Die Struktur der Formel II läßt sich nachweisen, indem man die Produkte aus dem hydrierenden Abbau (PalladiumAAktivköhle) analysiert. Es gehören zu diesen

Abbauprodukten: copyranosyI)-(l-»4)-O-»\-D-gIucopyranosyl-(l-*4)-D-

3-Hydroxymethyl-4.5.6 liihydroxy-4-O-i\-D-glucopy- glucopyranose und Glucose.

ranosyl-(1)-hexan. O-(4 amino-4.6-bisdesoxy<vÜ-glu

(H₂OII (IKOIl CM,

CUjOM

CH₂OM

O ! · O O O

HO O jN ()'.·()· -OH

HO OH !HO OH HO OH HO OH HO OH

(H₂OH CIUOII CII., CH₂OH ClI₂OIl

- O > \θ /-0 ^ν> O

PdCH₂ HO -O - ^ν · H₂N ( > -0- < / -O \ ,> OH

HO OH HO OH HO OH HO OH HO OH

ClUOH

^O

HO · > OH

HO OH /

In weiteren Untersuchungen wurde die Verbindung II mit πι + Π2 — 3 nach bekannten Methoden methyliert. hydrolysiert, mit Natriuiiiborhydrid reduziert, acetyliert Ji und gaschromatographisch analysiert. Die Verbindung der Formel II liefert l^j-Tri-O-acetyl^.e-tri-O-methyl-D-glucito! und U-Di-O-acetyl-ZJ^.ö-tetra-O-niethyl-D-glucitol im Molverhältnis von 2:1.

Die Verbindung der Formel II läßt sich von den Isomeren chromatort«phisch an einem sauren Austaubennar/ mil 0,025 π rvai/saure ais Eiuiionsmiuei trennen.

Die höheren Glieder der Reihe, die 4 bis 8 Glucoseeinheilen mit Molgewichten von 969 bis 1617 4-> enthalten, vermögen Saccharase weniger zu hemmen.

Bei der sauren Hydrolyse dieser höheren Glieder lassen sich die jeweils niederen Komponenten als Zwischenprodukte zusammen mit Glucose und Maltose nachweisen.

Dünnschiehtchromatographie unter Verwendung von n-ButanoI. Äthanol. Wasser im Verhältnis 50 : 30 : 20 auf F 1500 Kieseigelplatten ergib! Rr,_iw,_w- Aerte von

ν · "hci'en)-μ·L-.ihei'en): und

0.30-0.34	4f;
021-02!	if,
0.14-0 lh	h(,
0.09 -0.1 '

Wie bc den niederen < ·
totale Sd!.re Hydrolyse Ki
diskreten Mißverhältnisse-
und i : 8. (wobei die GIuOi^-83J<Vr,.8f).5°>. bzw,. 89.1 >o s

Bei der Dünnschicht, hr.
dung mn F 1500 K ic s
Äthanol. Wasser im V-Lösungsmittel werden
dreifachen Fntv.itklung b

ede i dieser Reihe ergibt die

.Tipo'ie Me I und Glucose in -. nar-.iich 1 4. 1 5. 1 : 6. 1 : 7

epr'j/.entsät/e 74 4% "9.7%

nd)

malographie unter Verwen cigeiplatten mit n-Butanol.

hähnis von 45 : 35 : 20 als

•igende Ri-Werte bei der Verhältnis

Glucose .'Komponente I

Standard

Rr-Wert

Glucose	0,77
Maltose	0,65
Maltotriose	0,51
Maltotetraose	0,39
Maltopentäose	0,27
	0,25
Maltohexaose	0,21
	0,18
Maltoheptaose	0,15
	0,13
Maltooctaose	0,11
	0,09
	0,07

f.benfalls zeigt die oben beschriebene katalytische Hydrierung, daß einige aber nicht alle Glucoseeinheiten diener höheren Glieder in 4-Stellung der Cyclohexengruppe gebunden sind.

Da diese Verbindungen lineare Oligoglucosidketten mn 1 — 4 Bindungen enthalten, können sie als Substrate für gewisse Kohlenhydrat-abbauende Enzyme Verwendung finden. Der Bereich der Enzyme ist offenbar auf solche beschränkt, die nicht wesentlich durch die Verbindungen gehemmt werden.

Bakterielle und püzaruge -v-Amylasen können zum Abbau jeder Oligoglucosidkette verwendet werden, die 3 oder mehr Glucoseeinheiten enthalten und niedermolekulare Verbindungen und inerte Saccharidfragmente

wie / B. Maltose und Mallotriose ergeben Dieses Abbaiiverfahrcn ist auf die Verbindungen mit Πι + n> > i anwendbar und stellt einen weik-ien Beweis ftir die \. l-»4 Bindung dar F.rfindiingsgeinhfie Verbindungen mit 4 bis 7-Glticoseeinhc-iten sind .nah teilweise durch /J-Amylase abbaubar. Da /f-Am\liise Maltoseeinheiten von dem nichtreduzierenden \'.\\>\e einer Glticosekellc mit x. I-»4 Bindungen abspültet, liefert sorgfältige Analyse der ,i-Amylaseabbauprnduk tie wertvolle Information übur jeden an der 4-Stelliing #es Cyclohexenrings gebundenen Oligoglucosidsubsti-

!0

luenten. insbesondere über seine Ketienlänge. und die Zahl der Glucosen in der an der Bisdcsoxyglucnse gebundenen Kette, d. h. in dem rcdu/ierenden Finde der Verbindung Die 4Λή.7 iuler 8 Glucosueinheiiert enthaltenden Verbindungen sind jedoch nicht völlig abbaubar durch /J-Amylsise. Der Resistenz eines Teils der Verbindungen isi offensichtlich unzureichenden Struktiirbedinj'iingen fur den ,i Amylaseangnff zuzuschreiben.

Die Ergebnisse des β Ainjlaseabbaus können folgendermaßen zusammengefaßt werden.

Zahl der Glucose- cinheiten im Aus* gangsmaterial	Zahl der Glucose einheiten in Ab- bau|)foduktion	Entfernte Maltoseeinheilen
4	4 2	C 1
5	5 3	0 1
6	6 4 2	SJ-O
8	8 6 4 2	O I 2 3
7	7 5 3	O 1 2

Gegebenenfalls wird ein Teil des Ausgangsmaterials •riedergewonnen.

Bezüglich des /J'-amylolytischen Abbaus soll nochmals ietont werden, daß /?-Amylase nur Maltoseeinheiten zu 4» fntfernen vermag und diese auch nur von dem •icht-reduzierenden Ende eines Ologosaccharids. Es soll termieden werden, daß irgendeine Theorie zu einer tinschränkung führt. Obwohl die genaue Struktur dieser iöheren Verbindungen nicht völlig geklärt ist, ist nach α^γ> •feigen Befunden zu folgern, daß zu den Verbindungen •lit 4, 5, 6, 7 und 8 Glucoseeinheiten Derivate der •federen Verbindung mit der Formel HI A gehören, •reiche Ketten mit 2, 3, 4, 5 und 6 Glucoseeinheiten fnthalten, die cc, 1-»4 miteinander verbunden sind, •robei die Oligosaccharidkette in Ä-Konformation mit 4er4-StelIung des Cyclohexenringes verbunden ist.

Methylierung der Verbindungen mit Methyljodid/Natriumhydrid in Dimethylsulfoxid. totale Hydrolyse. Derivatisierung und anschließende gaschromatographi- v, sehe Analyse ergibt das 2,3,6-TrimethyIglucoscdcrivat, so daß die Glucoseeinheiten notwendigerweise I—4 in einer ausschließlich linearen Struktur verbunden sind.

Ein zweites Methylierungsprodukt, welches in Abhängigkeit von der methylierten Verbindung in verschiedenem Maße oder unter Umständen gar nicht vorhanden ist, ist das 2,3,4,6-TetramethyIderivat. Das Vorkommen dieses Derivats und sein Molverhältnis zu dem Trimethylderivat ist abhängig von dem an dem Gyclohexenring gebundenen Substituenten.

Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von kohlenhydrathaltigen Nahrungsmitteln und Getränken (z. B. Getreide-, Kartoffelstärke, Obst. Fruchtsaft, Bier, Schokolade) Hyperglykämien auftreten, die infolge eines raschen Abbaus der Kohlenhydrate durch Glykosidhydrolasen (z. B. Speichel- und Pankreasamylasen, Maltasen, Saccharasen) nach folgendem Schema

Amylase Multasc

Stärke bzw. Glykogen ♦ Mallose · Glucose

Sacchara.se
Saccharose - Glucose +■ F-ruklosc.

bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern besonders stark und anhaltend ausgeprägt. Bei Adipösen bewirkt die aiimentäre Hyperglykämie oftmals eine besonders starke Sekretion von Insulin, das seinerseits zu vermehrtem Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt. Im Anschluß an derartige Hyperglykämien tritt bei stoffwechselgesunden und adipösen Personen infolge der Insulinsekretion häufig eine Hypoglykämie auf. Bekannt ist, daß sowohl Hypoglykämien als auch im Magen verweilender

Speisebrei die Produktion von Magenwft fördern, der seinerseits die Entstehung einer Gastritis, eines tllcus ventriculi oder duodeni auslöst oder begünstigt.

Fs wurde nun gefunden, daß die erfindungsgemäßen Amino/uckerderivate die aliiiientäre Hyperglykilmie. Hyperinsulinämie und Hypoglykämie erheblich vermin dem.

Ferner ist bekannt, daß in der Mundhöhle Kohlenhy drate, besonders Saccharose, durch Mikroorganismen gespülten werden und dadurch die Kariesbildting gefördert wird.

Die erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate kön nen /ur Verhinderung bzw. Verminderung einer solchen Karicsbildung eingesetzt werden.

In vitro ■ Amylasetest

weitere Saccharosespallung durch die Saccharase nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer au! 0,12 SE eingestellten Saccharaselösung ') mit 0—20 (ig Inhibitor oder 0 — 20 μI der ^u testenden Lösung versetzt und mit 0.1 m Natriummaleinatpuffer pH 6.0 auf 0.1 ml aufgefüllt. Es wird 10 Minuten bei 35"C iiquilibrierl und dann mit 0,1 ml einer auf 35 C vorgewärmten 0.05 m Saccharoselösung in 0,1 m Nntriummaleinatpuffer pH 6,0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35"C und stoppt die Saecharasereaktion durch Zugabe von I ml Glucoseoxidasereagcns ^!) ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35"C. Danach wird I ml 50% H2SO4 zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen. Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzter¹ Saccharase berechnet und aus dem 50% Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf SI E/g bzw.

..MIW ,WI₁MIL₁W IIIIIILMCWI L. 11 ■ I IW I 1 V

als die Menge Inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu 30% inhibiert. Eine Amylaseeinheit (AE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Teslbedingungen 1 μ Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die μνβΙ gespaltenen Bindungen werden als μνβΙ gebildeter reduzierender Zucker mit Dinitrosalicylsäure kolorime-Irisch bestimmt und mit Hilfe einer Maltoseeichkurve als μ VaI Maltoseäquivalente angegeben. Zur Durchführung des Testes werden 0,1 ml Amylaselösung (20—22 AE/ml) mit 0— 10 μg Inhibitor oder 0—20 μΙ der zu lcstenden Lösung in 0,4 ml 0.02 m Natriumglycerophos- jo phatpuffer/O.OOI m CaCb pH 6,9 versetzt und etwa 10 — 20 Minuten in einem Wasserbad von 35°C äquilibriert. Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer auf 35"C vorgewärmten 1% Stärkelösung (Stärke, löslich, der Firma Merck. Darmstadt. Nr. 1252) bei 35°C inkubiert und anschließend mit I ml Dinitrosalicylsäure-Reagens (nach P. Bernfeld in Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol., Band 1, Seite 149) versetzt. Zur Farbentwickking wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, dann abgekühlt und mit 10 ml destilliertem Wasser versalzt. Die Extinktion bei 540 nm wird gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert ohne Amylase gemessen. Zur Auswertung wird aus einer vorher aufgenommenen Amylaseeichkurve die nach Inhibitorzusatz noch wirksame Amylaseaktivität abgelesen und daraus die prozentuale Hemmung der eingesetzten Amylase errechnet Die prozentuale Hemmung wird als Funktion des Quotienten

Λ 1 Π\ ΐρ( rlnf»»tinr.i QIF/I itPT iimcfprpr*hn*>t

;ig Inhibitor*) AE**)

*) Bezogen auf Trockensubstanz.
**) AE im nicht inhibierlen Ansalz der gleichen Serie.

aufgetragen, der 50% Hemmungspunkt aus der Kurve abgelesen und auf AI E/mg Inhibitor umgerechnet.

In vitro — Saccharasetest

Eine Saccharase-Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Saccharaseeinheiten zu 50% inhibiert Eine Saccharaseeinheit (SE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen I μΜοΙ Saccharose in Glucose und Fructose spaltet. Die μΜοΙ gebildete Glucose werden mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine

Maltasetest

Eine Maltase-Inhibitor-Einheit (MIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Maltaseeinheiten zu 50% inhibiert. Eine Maltaseeinheit (ME) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen I μΜοΙ Maltose in 2 μΜοΙ Glucose spaltet. Die μΜοΙ gebildete Glucose werden mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Maltosespaltung durch die Maltase nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf 0.060—0.070 ME eingestellten Maltaselösung ') mit 0—20 μg Inhibitor oder 0— 20 μΙ der zu testenden Lösung versetzt und mit 0.1 m Natriummaleinatpuffer pH 6.0 auf 0.1 ml aufgefüllt. Es wird 10 Minuten bei 35°C äquilibriert und dann mit 0.1 ml einer auf 35°C vorgewärmten 0.05 m Maltoselösung in 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6.0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35°C und stoppt die Maltasereaktion durch Zugabe von 1 ml Glucoseoxidasereagens ²) ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35°C. Danach wird 1 ml 50% H2SO4 zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen.

Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Maltase berechnet und aus dem 50% Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf MIE/g bzw. MI E/Liter umgerechnet.

Die Ergebnisse der in vitro Enzymhemmtests für einzelne der erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate sind in nachstehender Tabelle I zusammengefaßt:

60

') Solubilisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström. A. Dahiquist, Acta Chem. Scand. 12, (1958). Seite 1997. Mit 0.1 m Natriummaleinatpuffer pH 6.0 auf entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.

²) Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösen von 2 mg Glucoseoxidase (Fa. Boehringer Nr. 15423) in 100 ml 0.565 m Tris-HCl-Puffer pH 7.0 und anschließenden Zusatz von 1 ml Detergenslösung(2g Triton X 100 + 8 g 95% Äthanol p. a.), 1 ml Dianisidinlösung (260 mg o-Dianisidin · 2 HCI in 20 ml H₂O) und 0,5 ml 0.1 %iger wäßriger Peroxidaselösung (Fa. Boehringer Nr. 15302) hergestellt

·) Solubilisierte Maltase aus Schweinedünndarmmucosa nach

B. Borgström. A. DahlquisL Acta Chem. Scand. 12. (1958).

Seite 1997. Mit 0.1 m Natriummaleinatpuffer pH 6.0 auf

entsprechenden ME-Gehalt verdünnt.
-) Bereitung des Glucoseoxidasereagens: wie beim Sacchara seiest. S. 30. Fußnote 2), beschrieben.

	13	26 14 393	Saccharase- Inhibition	14	Mallase- Inhibition
Tabelle 1			SIF./g		MlF./g
Formel	Zahl der Olueose- einheiten	ίτ-Amylase Inhibition	21000	5000
		AIF/g	8 500	-
II	3	1 400 000	2 500	_
	4-6	17 500 000
	5-7	30 000 000

Wie dus der Tabelle ersichtlich, steigt die spcz. in vitro Hemmaktivität gegenüber Pankreas-a-Amylase mit iunehniendem Molekulargewicht der Reihe stark an: so isigen die Verbindungen mit 5—7 Glucoseeinheiten •ine 20fach stärkere Enzymhemmung in vitro als die Verbindung II.

In v'vo läuft die Wirksamkeit in der Saccharasehem-Hiung der in vitro gefundenen spez. Hemmaktivität in etwa parallel. Dagegen wurde überraschenderweise beim Stärkebelastungstest in vivo für die Verbindungen mit 2 oder 3 Glucoseeinheiten eine im Vergleich zur Amylasehemmung in vitro 10—40fach gesteigerte Wirksamkeit gefunden.

Zur Erzeugung einer alimentären Hyperglykämie und Hyperinsulinämie erhielten Gruppen mit jeweils 6 nüchternen Ratten

a) 2,5 Saccharose,

b) 2,5 g Maltose oder

c) 1 g gekochte Stärke

j>. os in wäßriger Lösung oder als Suspension appliziert. • andere Ratten erhalten die genannten Kohlenhydrate in der gleichen Menge und zusätzlich einen Glucosidhytf roseinhibitor in der angegebenen Dosierung.

Weiterhin erhalten 6 andere Ratten eine entsprechende Menge Salzlösung.

Blutglucose und Seruminsulin wurden in kurzen teitlichen Abständen im Blut aus dem retroorbitalen Venenplexus gemessen. Die Blutglucosebestimmungen werden im Auto-Analyzer (Technicon ® nach 1 loffman: J. biol. Chem. 120, 51 (1937) oder enzymatisch mit Glucoseoxydase und o-Dianisidinhydrochlorid), die

Seruminsulinbestimmungen nach der Methode von

Haies und Rändle: Biochem. J. 88,137 (1963)) ausgeführt.

Die Ergebnisse der in vivo Saccharaseinhibition

(Saccharoseverabreichung) in der nüchternen Ratte gibt die folgende Tabelle III:

Tabelle III

Formel

Dosis (SIEl

Blutalucose in mc % (Mittelwert + Abw.)

Min. 30 Min. 45 Min.

Λ0 Min.

II 3 Salzlösung 66 ± 4,6 73 ± 4,3 76 ± 3,9

Saccharose (Kontrolle) 122 ± 6,6 125 ± 16,0 128 ± 14,8

Saccharose + 25 SIE 88 + 11,4**) 101 ± 12,0*) 104 ± 7,4**)

Saccharose - 50 SIE 91 ± 9,4**) 106 ± 7,0*) 94 ± 9,0***)

Saccharose + 100 SIE 81 ±7,2**) 90 ± 8,0***) 97 ± 1,6***)

4-6 Salzlösung 58 ± 2.9 49 ± 3,3 54 ± 4,8 63 ± 5,0

Saccharose (Kontrolle) 107 ± 11 121 ± 6,0 132 ± 16 132 ± 6,7

Saccharose + 25 SIE 109 ± 6,4 105 ± 10**) 112 ± 9,1*) 108 ± 8,1***)

Saccharose + 50 SIE 103 ± 4,1 107 ± 15**) 102 ± 7,7**) 101 ± 9,2***)

Saccharose + 100 SIE 85 ±8,1**) 94 ± 9,9***) 95 + 8.5***) 85+6,4***)

5-7 Salzlösung 58 ± 2,9 49 ± 3,3 54 ± 4,8 63+5,0

Saccharose (Kontrolle) 107 ± 11 121 ± 6,0 132 ± 16 132 ±6.7

Saccharose + 75 SIE 102 + 11 108 ± 9,6*) 109 ± 7,5**) 101 ± 7,9**)

Saccharose + 150 SIE 92 + 7,0*) 100 ± 8.3***) 109 ± 3,7**) 102 ± 6,3***)

Saccharose + 300 SIE 95 ±8,1*) 84 ± 8,7***) 93 ± 9,0***) 91 ±4,5***)

*) = Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Saccharose = 0,05 **) = Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Saccharose = 0,01 ***) = Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Saccharose = 0,001

16

Wie aus obigen Daten ersichtlich läuft die in vivo Aktivität in der Saccharase-Inhibition der in vitro gefundenen Hemraaktivität parallel. So steigt die ED»,

wahrend die Saccharaseinhibitionsejnhejten pro mg abnehmen- Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle IV zusammengefaßt:

Tabelle	IV	Glucose- einheiten	Saccharaseinhibition in vitro in vivo SIE/mg (ED30 mg/kg)	2,65 ~ 15,30 -52,00
Formel	(3) (4-6) (5-7)	21 8.5 2,5
II

Überraschenderweise ist die in-vivo-Inhibition des nicht dem erwarteten Muster. Die folgende Tabelle V

Stärkeabbaus durch die Verbindung der Formel II viel gibt die wie oben ermittelten in vivo Daten für die

höher, als anhand der in \ um gefundenen Daten tür die nüchterne Ratte nach Verabreichung der Stärke wieder:

Amylasehemmung erv nrtet hätte und entspricht also ;..

Tabelle V

Formel Glucose- Dc s s (AlF) Blutglucose in mg % (Mittelwert ± Abw.)
einhciten

5 Min.

IO Min.

15 Min.

20 Mm.

30 Min.

45 Min.

82 ± 6.5

70 ± 6,9

93 ±7,3 133 ±12 127 ±9.3 152 ± 15 156 ±15 124 ± 7,7
86 ± 8,5 107 ±5.0***) 117 ±8.7*) 121 ± 12**) 126 ± II***) 114 ± 3.6**)

Salzlösung 52 ± 2,3 75 ± 7.9 57 ± 3.7 78 ± 9.1

Stärke

(Kontrolle)

Starke + 750 AIE

Stärke+ 77 ± 14*) 92 ± 9,6***) 94 ± 9.5***) 113 ± 9.⁷***) 112 ± 8.8***) 111 ± 4.2**)

1500 AIE

Stärke + 65 ± 5.6***) 101 ± 3.3***) 82 ± II***) 112 ± 4.5***) 109 ± 6.4***) 104 ± 2.5**)

3000 All·.

4-6

S-7

Salzlösung

Stärke

Kontrolle

Starke + 6(XK) All

Starke + 12(H)O All-Starke + 24(K)O All

Salzlösung

Starke

(Kontrolle)

Starke + 6(H)O All

Starke ♦ 12000 All Starke ♦ 241)00 ΛII

55 ± 4.8 63 ± 5.9 67 ± 5.8 72 ± 4,7 66 ± 5.0 103 ±11 117 ± X.(, 118 ± 8.5 128 ± 8.9 109 ± 11 99 ± 4.5 118 ± 5.8 104 ±8.1*) 123 ±11 107 ± 7.3 90 ±5.2*) 98 ± 8.2**) 99 ±4.1***) 117 ± 6.7*) 104 + 8.2 74 ± 5.5***) 82 ± 2.9***) 83 ± 3.7***) 96 ± 6.6***) 85 ± 6.4*)

55 ± 4.8 63 ± 5.9 67 ± 5.8 72 ± 4.7 66 ± 5.0 103+11 117 ±8.6 118 ±8.5 128 + 8.9 109+11 95 ± 4.3 107 ± 3.3*) 102 ± 5.5**) Il I ± 3.0**) 102 ± 6.7 87 ± 8.6*) 94 + 8.8**) 89 + 8.5***) 98 ± 8.3***) 91+4 74 ± 8.9***) 84 + 7.2***) 84 ± 6.U***) 8* +■ 6.5***) 85 t 4

*> ' Wahfschcinliclikeil gegen Kontrolle mit Stärke = <0.05. **) ' Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Stärke = <0.0I ***) - Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Stiirkc = <0.00l

Aus obigen Daten ist ersichtlich, daß. während sich ,,·, abhängig vom Molekulargewicht ist. während in vivo der Gnul der Saccharaseiiihibition sowohl in vitro als die Inhibition des Slärkealibaiis mit dem fallenden auch in vivo als einr deutliche Funktion des Molekular- Molekulargewicht nicht annimmt, sondern überrn gewichtes erweist, die Amylflseinhibiiion nur in vitro si hendeiwcise konstant bleibt

Ο3Ο2Μ/27Π

Obwohl also die in vivo Amylasehemmaktivität mit dem Molgewicht abnimmt, sind die EDso-Werte der Stärkeverdauungshemmung für alle erfindungsgemäßen Verbindungen im wesentlichen gleich. Dies ist in der folgenden Tabelle VI zusammengefaßt:

Tabelle	VI	Glucose- einheiten	e-Amylase- inhibition in vitro Al E/mg	Stärke verdauungs inhibition in vivo (ED50 mg/kg)
Formel	(3) (4-6) (5-7)	1400 17 500 30000	1,61 1,42 1,00
II

Zahl der Glucose- a-Amylasc-lnhibitmn cinhcitcn

AIt-Vg

Saccharase-Inhibilinn

SIFVg

6 "OOOO(X)
57000 000
42 000 000
24 000 000
SOOOOOO

7 000

1500

1200

60

10

10

?n

Es ist also überraschenderweise möglich mit der Verbindung II eine Hemmung der Saccharose- und Starkeverdauung gleichzeitig zu erreichen, und zwar bei einer präzisen, vorhersehbaren und cnarakteristischen Dosis.

Reinigung des Gemisches der höheren Glieder dieser Reihe und Anwendung in reiner Form führt unerwarteterweise zu noch höherer Aktivität und Spezifität. Dies IaBt sich durch einen Vergleich der in Tabelle I jo angegebenen α-Amylase- und Saccharase-in vitro-Hemmdatep mit den in folgender Tabelle VII angegebenen .')aten tür die reinen Verbindungen belegen:

Tabelle VII r.

Die vorhergehenden Ergebnisse /eigen die hohe Aktivität der Verbindung mit 4 Glucosceinhcitcn in der Rolle eines vAmylaseinhibiiors. Auch die Verbindun gen mit 5 und 6 Einheilen /eigen wesentlich höhere spc/iliSLhe Inhibitoraklivitäl als bei bisher bekannten Präparaten gefunden wurde. Eine Abn&hme der Inhibitoraktivität tritt mit zunehmendem Molekulargc wicht auf. wie bei den Verbindungen mit 7 und 8 Glucosceinhcilen /u sehen ist. obgleich diese noch erhebliche Hemmaklivität /eigen In vitro Sacchara seinhibition scheint in umgekehrter Abhängigkeit von dem Molekulargewicht zu stehen. Die Verbindung mit 4 Glucosccinheilefi weist etwa '/to der spezifischen Aktivität auf, die die Verbindung mit 2 Glucosceinhcilen aufweist, wohingegen die llemmaküvität der Verbindung mit 8 Glucoseeinheitcn nur geringfügig ist.

Die Verbindungen können ohne Verdünnung, /.. ti. als Pulver oder in einer Gelatinehüllc oder in Kombination mit einem Trägerstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung appli/iert werden.

Arzneimittel können eine größere oder kleinere Menge des Inhibitors enthalten, z. B. 0,1% bis 99,5%, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen nichtloxischen, inerten Trägerstoff, wobei der Trägerstoff eine oder mehrere feste, halbfeste oder flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe und/oder nichttoxisches, inertes und pharmazeutisch-verträgliches Formulierungshilfsmittel enthalten kann. Solche Arzneimittel liegen vorzugsweise in Form von Dosierungseinheiten vor. d. h. physikalisch-diskrete, eine bestimmte Menge des Inhibitors enthaltenden Einheiten, die einem Bruchteil oder einem Vielfachen der Dosis entsprechen, die zur Herbeiführung der gewünschten Henimwirkung entsprechen. Die Dosierungseinheiten können 1, 2, 3, 4 oder mehr Einzeldosen oder '/>, '/j oder '/··. einer Einzeldosis enthalten. Eine Einzeldosis enthält vorzugsweise eine genügende Menge Wirkstoff, um bei einer Applikation gemäß eines vorher bestimmten Dosierungsschemas einer oder mehrerer Dosierungseinheiten die gewünschfe Hemmwirkung zu erzielen, wobei eine ganze, eine halbe, oder ein Drittel oder ein Viertel der Tagesdosis gewöhnlich einmal, zweimal, dreimal oder viermal am Tage verabreicht wird. Obgleich die Dosierung und das Dosierungsschema in jedem Fall sorgsam abgewogen werden sollte, unter Anwendung gründlichen fachmännischen Urteils und unter Beachtung des Alters, des Gewichts und des /ustands des Patienten, der Art und der Schwere der Erkrankung, wird die Dosierung gewöhnlich in einem Bereich zwischen etwa 30 bis etwa 3 χ 10"· AI E/kg und zwischen etwa I bis etwa 1 < I0⁴ SIF./kg des Körpergewichtes pro Tag liegen. In manchen I allen wird man dabei eine ausreichende therapeutic he Wirkung nut einer gerin gcrefi Dosis erreichen, wahrend in anderen Fällen cmc größere Dosis erforderlich sein wird.

Orale Applikation kann unter Verwendung fester und flüssiger Dosierungseiiiheitcn durchgeführt werden, wie z. B. Pulver. Tabletten. Dragees. Kapseln. Granulate. Suspensionen. Losungen und dergleichen.

Pulver wird durch Zerkleinerung der Substanz in einer geeigneten Große und Vermischen mn einem ebenfalls /erkleinerien pharmazeutischen Iraj»erstoff hergestellt Obgleich 'in eßbares Kohlenhydrat, wie z. B. Stärke. Lactose, -»accharosc oder Glucose nor malerwcise /u diesem /wecke Verwendung findet und auch hier benui/i werden kann, ist es wünschenswert cm nicht mctabnlisierbares Kohlcnhydral. wie / B. ein Cellulosederivat /u benutzen

SüUmittcl. Gesi hmacks/iisai/e Konscrvierungssinl fe. Dispergiermittel und färbemittel können .weh milvcrwcndet werden

Die Kapseln können durch /Übereilung der oben beschriebenen Piilvcrmisihung und durch I tillung bereits gebildeter Gelaliiiehiitlcn hergestellt werden Die PulvermischiiM>r kann man vordem I üllvorgang mit Glcilnvlieln. wie / B Kicsclgel Talkum. Magnesium stearat. (jlciiimslear.il oder festem Polyäthylenglykol versetzen Die Mischung kann man ebenfalls mit einem Desintegrator oder !.cisiingsvcrmitilcr. wie / B Agar Agar, Calciumcarbomit oder Natriumcarbonat versetzen, um bei Einnahme der Kapsel die Ziigiihglichkcit des Inhibitors zu verbessern.

Die Anfertigung der Tabletten erfolgt zum Beispiel durch Herstellung einer Pulvermischung, grob oder feinkörnig, und Hinzufügung eines Gleitmittels und Desintegrators. Aus dieser Mischung formt man Tabletten. Eine Pulvermischung bereitet man vor durch Mischung der Substanz, welche in geeigneter Weise

zerkleinert wurde und ergänzt ein Verdünnungsmittel oder eine anderen Trägersubstanz wie oben beschrieben. Gegebenenfalls fügt man eine Bindemittel hinzu: z. B. Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine oder Polyvinylpyrrolidone, einen Lösungsverzögerer, wie z. B. Paraffin, einen Resorptionsbeschleuniger, wie z. B. ein quarternäres Salz und/oder ein Adsorptionsmittel, wie z. B. Bentonit, Kaolin oder Dicalciumphosphat. Die Pulvermischung kann granuliert werden zusammen mit einem Bindemittel, wie ζ B. Syrup, Stärkepaste, Akazienschleim, oder Lösungen aus Zellulose- oder Polymerenmaterialien. Danach preßt man das Produkt durch ein grobes Sieb. Als Alternative hierzu kann man die Pulvermischung durch eine Tablettenmaschine laufen lassen und die sich ergebenden ungleichmäßig geformten Stücke bis auf Korngröße zerkleinern. Damit die entstandenen Körner nicht in den tablettbildenden Düsen stecken bleiben, kann man sie mit einem Gleitmittel versetze,, wiez. B.Stearinsäure,Stearatsalz. Talkum oder Mineralöl. Diese g!eitfäh?g gemachte Mischung wird dann in Tablettenform gepreßt. Die Wirkstoffe können auch mit freifließenden inerten Trägerstoffen vereinigt werden und direkt in Tablettenform gebracht werden unter Auslassung der Granulat- oder Zerstückelungsschritte. Man kann das Produkt mit einer klaren oder opaken Schut/hülie versehen. /. B. einem Überzug aus Schellack, einem Überzug aus Zucker oder Polymersiibsianzen unJ einer polierten Hülle aus Wachs. Farbstoffe können diesen Überzügen beigefügt werden, d.-.mit zwischen den verschiedenen Dosierungseinheiten unterschieden werden kann.

Die oral zu verabreichenden Zubvreitungsformcn. wie /. B. Lösungen. Syrup und Elixiere, lassen sich in DosiLTiingseinheiten herstellen, so daß t-ne bes'immte Menge Präparat eine bestimmte Menge Wirkstoff enthalt. Syrup kann so hergestellt werden, daß der Wirkstoff in einer wäßrigen Lösung, welche geeignete Cieschmacksstoffe enthält, gelost wird; Elixire werden unter Verwendung nichttoxischer, alkoholischer Tragerstoffe erhalten. Suspensionen kann man durch Dispergieren der Verbindung in einem nicht toxischen Tragcrsioff darstellen. Lösungsvcrmittler und Mmiilgier muteI. wie ζ B. äthoxyliertc Isostearylalkoholc und Polyoxyälhvlensorbilesler. Konservierungsmittel, gc sdimacksvrrbessernde Zusätze wie /. B. Pfeffcrniinzol oder Saccharin und dergl können auch zugegeben werden.

Dosierurgsvorschriften können auf der Kapsel angegeben werden. Überdies kann die Dosierung so abgesichert sein, daß der Wirkstoff verzögert abgege bcn wird. ζ B. durch Hinhalten des Wirkstoffes in PolymcrenMibstaiizen. Wachse oder dergl

Die loxizität dieser Verbindungen ist sehr gering Auih ohne Endreinigung wird beispielsweise (las Rohprodukt aus dem Beispiel h mit einer Aktivität von 8.500 SI[7g ohne Auftreten von Nebenwirkungen vertragen Dies trifft bei den hierin beschriebenen Verbindungen der vorliegenden Erfindung ni. die in einer Dosierung von 540000 SIE/kg Maus und Ratte p. os ohne Nebenwirkungen vertragen worden sind. Auch¹ bei intravenöser Injektion tolerieren Mäuse 10.000 SlE/kgohne Nebenwirkungen.

Zusätzlich zu den oben erwähnten Arzneimitteln lassen sich auch diese Wirkstoffe enthaltende Lebensmittel herstellen; beispielsweise Zucker, Brot, Kartoffelprodukte, Fruchtsaft, Bier, Schokolade und andere Konfeklartikel. und Konserven, wie ι. B. Marmelade, wobei zu diesen Produkten eine therapeutisch-wirksa

me Menge mindestens eines der erfindungsgemäßen Inhibitoren gegeben wurde.

Erläuterung einiger verwendeter Reagentien und Hilfsmittel:

Als Ionenaustauscher können z. B. die im Handel befindlichen Produkte Amberlite® IRA 410 CI (Anionenaustauscher); Amberlite® IRC '20 (H+-Form) (stark saurer Kationenaustauscher): Amberlite® (HCOj'-Form) (Anionenaustauscher); Amberlite® IRA 410 OH" (stark basischer Anionenaustauscher); Amberlite® IRC 5OH* (schwach saurer Kationenaustausdier) [Warenzeichen der Firma Rohm and Haas Company] sowie Dowex·³ 50 WX 4H⁺ (stark saurer Kationenaustauscher) [Warenzeichen der Firma Dow Chemical Co. Midland, Michigan, USA] verwendet werden.
Als Anionenaustauscher auf Cellulosebasis kann z. B. DEAE-Zellulose der Schleicher Schlecher und Schüll verwendet werden.

Als Polyacrylamid-Gel kann z.B. Bio-GeI"-P-2 [Warenzeichen der Firma Bio-Rad Laboratories, Richmond.California, USA] verwendet werden.
Maltzin® ist ein natürliches Malzextrakt der Firma Diamalt AG. München (BRD).
Lewapol® ist ein unspezifisches Adsorpiionsharz der Firma Bayer AG. Leverkusen (BRD).
ClarceP ist ein Filterhilfsmittel der Firma CECA. Velizy Villacoublay, Frankreich.
SE 30 ist ein Silico.i Elastomer der F"irma Hewlett Packard.

Die im folgenden verwendeten Mikroorganismen sind bei American Type Culture Collection unter den folgenden Nummern hinterlegt worden:

Slamm

SE 50(CBS961.70)
SE 18 (CBS 957.70)
SE 82 (CBSbI 5.71)
SE 50/1i(CBS614.71)
SE 50/110(CBS 67473)

Beispiel I

ATCC-Nr.

310 Al
31041
31045
31043
31044

Man beimpft einen Glasfermentcr mn 8 Liter Nährlösung der Zusammensetzung 5,0% Stärke. 1,0% Hefeextrakt. 0.2% K>HPO₄ nut einem 3 Tage alten Schültelkolben des Stammes SE 50/13 (CBS 614.71) und bebrütet unter intensiver Rührung und Belüftung 3 Tage bei 28"C und erhält eine Kulturbrühc mit 105.000 AI E/ml.

6 Liter dieser Fcrmcnlationsbrühe werden nach dem Abkühlen auf 20"C mit halbkonzentrierier HNOi auf pH 2,5 eingestellt, mit 30 g Aktivkohle versetzt und 10 Minuten gerührt. Anschließend wird 15 Minuten bei 10.000 Upm zentrifugiert und der klare, hellgelbe Überstand nach Neutralisation mit NIU auf 500ml eingeengt. Die 500 ml Konzentrat wurden 45 Minuten mit 200 g Amberlite® IRA 410 Cl gerührt, abgenutschl und mit 4/5 Vol. = 400 ml Methanol versetzt, um die Hauptmenge der höhermofekularen Stärkeabbauprodukte (zusammen mit noch vorhandenen Aklivkolileresien) auszufällen. Es wird 5 Minuten bei 5.000 Upm zentrifugiert. Die 850 ml Überstand werden unter intensivem Rühren in 4 Lir. Trockensprit eingetropft. Die weiße, flockige Fällung wird abgenutscht, 3mal mit Trockensprit nd 2mal mit Äther gewaschen und im

Vakuum bei 50⁰C getrocknet. Ausbeute: 36 g eines weißen Pulvers mit 10 χ 10⁶ AFE/G. In einigen der folgenden Beispiele wird diese Zubereitung verwendet.

Enzymhemmung auf Dünnschichtplatten

Zur Beurteilung des Endproduktes von Fermentationen und der Zusammensetzung von Präparaten mittels Dünnschichtchromatographie trägt man 1 μ! der Fermeniationsbrühen oder 1 μg der Präparate auf Kieselgelfertigfolien auf und entwickelt 2mal in n-Butanol/ÄthanoI/Wasser = 50/30/20.

Zur Saccharaseinhibitionsfärbung besprüht man die entwickelte und gut getrocknete Platte mit Enzymgel (20 ml/20 χ 20 cm Platte) und läßt das Gel erstarren. Dann wird für 5' in einer feuchten Kammer bei R'dumtemperatur vorinkubiert und anschließend satt mit Substratgel besprüht. Nach dem Erstarren dieser 2. Gelschicht bringt man die Platte in eine feuchte Kammer ein und inkubiert bei 40^cC. Die Inhibitionsfärbung (helle Flecken, rotbrauner Hinter£ -und) entwickelt M sich in 60—90'. Zum Zeitpunkt der optimalen Farbentwicklung wird abgebrochen und die Platte mit den darauf befindlichen Agarschichten am Föhn mit Warmluft getrocknet.

Bereitung der Gele

finzymgel: 1,5 g Agarose (!.'Industrie Biologique Francais) wird in 100 ml 0.2 m Na-Maleinatpuffer pH 6.0 suspendiert und anschließend durch Aufkochen gelöst. Die klare Agaroselösung wird auf 50^rC abgekühlt und in mti 250 μΙ Triton X-100 Lösung (2 g Triton® X-100 + 8g Äthanol p.a.) und 0.5m! Dianisidinlösung (20 mg Dianisidin/I ml Aceton) unter Umschwenken versetzt. Direkt vor Gebrauch des Gels werden I ml GOD/POD-Reagens (12.5 mg Glucoseoxidase. Rein- η heitsgrad I. Fa. Boehringer. Best. Nr. 15423 und 2 5 mg Peroxidase. Reinheitsgrad 11. Fa. Boehringer. Best. Nr 15302 gelöst in 5 ml Maleinatpuffer) und 4 — 5 Einheiten Saecharase aus Schweinedünndarm zugesetzt. Das Gel muß bis /um Versprühen auf 50^r C gehalten werden. da 4n es sonst beim Sprühvorgar.g in den Düsen erstarrt. Substratgel: 0.5 g Agarose wird in IOD ml Na-Maleinat puffer pH 6.0 suspendiert und unter Kochen gelöst Man kühl' anschl-eOend auf 50"( ab. vcrsct/t mit 100 μΙ Triton (2 g Triton® X 100 + 8g Äthanol pa.) und gibt t~, ] f/ Saccharose /u. Nach dem Lösen der Saccharose ist das Cicl gebrauchsfertig.

Zur AmylaseiriHibitionsfärbung besprüht man die entwickelte und getrocknete fX'-Platte mil einem Amvlasegel (2OmI' 20 χ 20cm Platte) und läßt '>" erstarren. Nach 5' Vorinkubation bei Raumtemperatur bringt man die Platte mit der Gclschicht in eine 0.5°/iigc StärkelöMinj (1 g Stärke in 200 ml 0.2 m Glycerophos phatpuffer OOImC'aC'b pH 0.9 unter Kochen gelöst) ein lind belaßt sie dort für 2' bei 40 C unter Umschwenken ·"> lier Losung. Danach wird die Platte mit deM Wasser gut «bgespült und /ur Anfärbung d„-r nicht abgebauten Stärke in eine verdünnte |,· Losung (4 ml );-Stamnlr> Sung auf 500 ml HjO, Jj-Summlösung: 2.2 g Jj + 4.4 g KJ in 100 ml H₂O gelöst) eingefaucht. Nach ca, 1 Minute ist die Färbung optimal. Man photographiert sofort, da die blauen Flecken schnell verblassen.

Bereitung des Amylascgcls

1 g Agarose wird in 100 ml 0.2 m NaCriumglycero- ^h'-< phosphat/0,01 m ft ι CaCJi- Puffer pH 6.9 bet 100⁰C gelöst, nach dem Abkühlen auf 50⁰C werden ΙΟΟμΙ Triton» XlOO (2 ι Triton X-100 + 8g Äthanol p.a.) zugesetzt. Direkt vor dem Besprühen setzt man 100 μΐ einer Amylasekristallsulspension (10 mg Schweinepakreasamylase/ml ges.NHt-Sulfatlösung, Fa. Boehringer. Nr. 15017) zu.

Beispiel 2

Beimpft man I-Ltr-Erlenmeyerkolben mit 120 ml einer Nährlösung bestehend aus 4% Stärke, 2.4% Glucose, 0,9% Kaseinhydrolysat und 0,9% Hefeextrakt, pH mit NaOH auf 7,6 eingestellt, mit 0,4% CaCO₃ versetzt und 30 min bei 121⁰C sterilisiert, mit 3 ml einer Vorkultur des Stammes SE 82 (CBS 615.71), angewachsen in einer Nährlösung bestehend aus 2% Stärke, 1% Glucose, 0,5% Kaseinhydrolysat und 1% Hefeextrakt, pH mit NaOH auf 7,2 eingestellt, mit 0,4% CaCO₃ versetzt und 30 min bei 121⁰C sterilisiert, und bebrütet 5 Tage bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so erhält man eine Kulturlösung m** 122.000 AIE/ml. Zu,-Aufarbeitung trennt man das Myce! von den vereinigten Kulturlösungen durch Zentrifugation bei 12.000 Upm ab. bringt 300 ml des Kulturfiltrates mit halbconc. HNO) auf pH 2.5 und rührt fur 10 min mit 2,5 g Α-Kohle p.A. Nach Abtrennung der Kohle bei 12.000 Upm wird die mittels 10 N KOH auf pH 6 neutralisierte Lösung mit 300 ml Methanol versetzt, kurz stehen gelassen und bei 12.000 Upm vom Niederschlag befreit. Tropft man nun den Überstand in 3 Ltr Äthanol, isoliert die Fällung nach kurzem Stehenlassen durch Zentrifugation bei 12.000 Upm, wäscht den Niederschlag zweimal mit abs. Äthanol und einmal mit Äther und trocknet im Vakuum, so erhält man 2.23g eines Produktes mit 7.45 χ \0^b AIF/g. das zu über 95% Verbindungen mit Πι + η; = 4 und mehr Glucoseeinheiten enthält.

Beispiel 3

Beimpft man 1-L-F.rlenmeyerkolben mit 120 ml einer Nährlosung der Zusammensetzung 3.5% Glucose. 2% Stärke. 0.5% Kaseinhydrolysat. 1.3% Hefeextrakt. 0.3% Ca(O, und 0.3% K₂HPO₁ vor Sterilisation auf 7.K eingestellt. Sterilisation 307121C. mit 6 ml einer Vorkultur des Stammes SF. 50/110 in t.ner Nährlösung bestehend aus 3% So|„mchl. J¹V. Glycer.n und 0.2"/n CaCOi und bebrütet 3 — 4 lage auf einer Rundschüttelmaschine bei 24 C. so erhält man eine Kuliurlnsting. die 153 00OAIIVmI und 12 200 SIL. I.(r enthält.

I Ltr. Kuhiirlosung wurde mit HNOi auf pH 2.5 eingestellt, mit 5 g Aktivkohle 10' gerührt und anschließend 30 bei 5000 Upm zentrifugiert. Anschließend wurde durch /usat/ von 25 g Amberlilc* iRA 410 (OH Form) neutralisiert. Der neutrale Überstand wurde auf 100 ml cinrotiert. mit K)OmI Methanol versetzt und filtriert. Das Filtrat wurde in 2 Ltr. Tro« kcnsprit eingerührt, der ausfalleni/e Niederschlag abgenutschl und nach 3 χ Waschen mit Aceton und Äthrr im Vakuum getrocknet.

Ausbeute 14 g eines weißen Pulvers mit ^Γ> χ 10^f AIF./g. das überwiegend Verbindungen mit mindestens /j, + D₂ =, 4 ülucöseeinheiten enthalt

Beispiel 4

Beimpft nii-n 1 L F.rlenmeyerkolben mit je 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 5% Stärke. 1% Hefeextrakt. 0.2% K₂HPO₄ mit je 2 ml einer Vorkultur nach Beispiel 3, so erhält man nach 3tägigcr Bebrülung bei 28"C Kulturlösungen mit folgender Ausbeute an Amvlase Inhibitor:

Stamm

AI E/ml

SE 50(CBS 861.70) 37 000

SE 50/13 (CBS 614.71) 109 000

SE 50/110(CBS 674.73) 53 500

die vorwiegend aus einer Mischung der Verbindungen mit 4 oder mehr Glucoseeinheiten.

Beispiel 5

Beimpft man 1-L-ErlenmeyerkoIben mit je 120 ml Nährlösung der Zusammensetzung 1.3% Maltose, 3.5% Glucose. 0.5% Kaseinhydrolysat, 1.3% Hefeextrakt. 0.3% CaCO₃, 0.3% K₂HPO₄ mit je 2 ml einer Vorkultur nach Beispiel 3. so erhält man nach 4tägiger Bebrütung

i bei 24'
Stämmen folgende Ausbeuten:

10

15

SIE/ml AlE/ml

SE50(CBS961.70) 25 580

SE50/13(CBS6r4.71) 14.8 1460

SE 50/110(CBS 674.73) 57.9 755

20

25

die vorwiegend aus einer Mischung der Verbindungen mit 4 oder weniger Glucoseeinheiten.

Beispiel 6

Beimpft man einen Fermenter mit 100 L Nährlösung der Zusammensetzung 33% Glucose, 23% Maltzin®. 03% Kaseinhydrolysat. 13% Hefeextrakt, 03% CaCO₃. 03% K₂HPO₄ und 0.1% Antischaummittel mit 5 Leiner Vorkultur nach Beispiel 3 und bebrütet unter Rührung und Belüftung 5 Tage bei 24°C. so erhält man eine Kulturlösung mit 73 000 SIE/L die vorwiegend die erfindungsgemäße Verbindung mit /7| + n₂ = 2 enthält.

90 Ltr. Fermentationsansatz wurden mit Mycel am pH-Meter mit konz. HNO₃ auf pH 23 eingestellt und unter Rühren mit 900 g (= 1%) Aktivkohle zur Adsorption der Hauptmenge der gebildeten Farbstoffe versetzt. Man rührte für 15 Min„ trennte über eine Zentrifuge bei 3000 Upm vom Mycel und der Hauptmenge der Kohle ab und filtriert den Überstand schließlich unter Zusatz von 3 kg Clarcel über eine Drucknutsche. Man erhielt 61 Ltr. gelbbraunen, klaren Filtrats mit einem SIF.-Gehalt von 60 000 SIE/Ltr.

Das Filtrat wurde mit konz. NH₃ auf pH 7 eingestellt und zur Adsorption des Wirkstoffs mit 1300 g (2%) Aktivkohle für 30' gerührt Man filtriert über eine Drucknutsche und wusch das Aktivkohlesediment 3 χ mit 10 Ltr. destilliertem Wasser. Anschließend wurde die Kohle gut trocken gedrückt und in 3 χ 4 Litern 50% Aceton bei pH 23 für jeweils 15' gerührt, um den Wirkstoff von der Kohle zu desorbieren. Die acetonischen Desorbate wurden — nach Abtrennen von der Kohle durch Filtration — vereinigt. Man engte das vereinigte Desorbat am Rotationsverdampfer auf 250 ml ein. versetzte mit einem gleichen Volumen (250 ml) Methanol und filtrierte durch ein Faltenfilter. Das Filtrat (480 ml) wurde in 5 Ltr. Aceton unter kräftigem Rühren eingetropft. Der ausfallende Niederschlag wurde abgenutscht und 3 χ mit Aceton und Äther gewaschen. Anschließend wurde im Vakuum bei 35" C getrocknet. Ausbeute 230 g mit 8500 SIE/g.

25 g des obigen rohen Produkts wurden in 1 Ltr. H₂O gelöst und mit 300 g Dowex ® 50 WX 4 H⁺ (200-400 mesh) 30' gerührt. Man filtrierte das Harz ab und wusch 3 χ mit 2 Llr. 0.001 η HCI nach. Das gewaschene Dowex wurde anschließend in 500 ml H₂O suspendiert und die Suspension am pH-Meter durch Zugabe von 25% NHj auf pH 9.0 eingestellt. Anschließend wurde noch 2 χ mit je 500 ml 0.6% NH₃ desorbiert, die Desorbate vereinigt und am Rotationsverdampfer auf 100 ml eingeengt. Zur Entfärbung dieses Konzentrats wurde es mit 2 g DEAE-Zellulose. 0.6 mVal/g) für 5 min. gerührt, dann zentrifugiert. Der hellgelbe Überstand wurde mit einem gleichen Volumen (100 ml) Methanol versetzt und dann in 2 Ltr. Aceton unter intensivem Rühren eingetropft. Der Niederschlag wurde abgenutscht. mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum bei 35"C getrocknet.

Zur weiteren Fcmicmiguug wuiucn die 4.0 g ίπίϊίυίίΐίί"

in 0.5 g Portionen über Biogel ® P-2 gplfiltriert. Dazu wurden jeweils 0.5 g des Präparats in 10 ml H₂O gelöst und auf eine Biogel ® P-2-Säule (200-400 mesh) vom Durchmesser 5 cm und der Länge 95 cm aufgetragen. Man entwickelte in Wasser bei einer Fließrate von 80 ml/h. Es wurden 12 ml Fraktionen gesammelt. Von allen Fraktionen wurde der Gesamtkohlenhydratgehalt (in Form des Anthrontest als Extinktion bei E6₂o) sowie der Gehalt: aSaccharase-Inhibitorund Amylase-Inhibitor ermittelt. Außerdem wurden die Fraktionen dünnschichtchromatographisch (Enzym-Inhibitionsfärbung nach Beispiel 1) geprüft.

Die Fraktionen, die die Verbinungen mit 4 — 6 Glucoseeinheiten enthalten, wurden vereinigt, im Vakuum auf 10 ml eingeengt und durch Eintropfen in 200 ml Trockenspritz gefällt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert. mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet: Ausbeute aus 4.0 g Rohinhibitor:0,2 g der Verbindungen mit 4—6 Glucoseeinheiten mit 173 χ 10⁶ AIE/g und 8.500 SIE/g. Die die Verbindung mit 3 Einheiten enthaltenden Fraktionen wurden in gleicher Weise aufgearbeitet, wobei die Fällung mit 200 ml Aceton erfolgte: Ausbeute aus 4.0 g Rohinhibitor: 0.2 g der Verbindung mit Πι + n₂ = 3 mit 1.4 χ 10⁶ AIE/g und 21.000 SIE/g. Aus den die Verbindung mit n\ + n₂ = 2 enthaltenden Fraktionen (Fällung mit Aceton) wurden 0,9 g der Verbindung mit πι + n₂ = 2 Einheiten mit 0.3 χ 10⁶ AIE/g und 68.000 SIE/g isoliert.

Beispiel 7

Beimpft man 3 Kleinfermenter mit je 8 L d. r Nährlösung 7.5% Maltzin®. 0,3% Kaseinhydrolysat. 0.7% Hefeextrakt. 0.3% CaCO₃. 03% K₂HPO₄ mit 5% einer Vorkultur des Stammes SE 50/110 (CBS 674.73) (gewonnen nach Beispiel 3), so erhält man nach 5tägiger Bebrütung bei 24°C eine Kulturbrühe mit 73 SIE/ml. die vorwiegend die Verbindung mit r>\ + n₂ = 2 enthalten. Nach Zentrifugation (30', 3000 Upm) zur Abtrennung des Mycels erhielt man 203 Ltr. einer tiefbraunen Kulturlösung mit 67 000 SIE/L Man stellte mit HNO₅ auf pH 33 ein und setzte zur Entfärbung 60 g Lewapol (035 mm Körnung)/L = 1.23 kg Lewapol® zu. Nach 20' Rühren wurde über ein Seitz K 3-Filter abgenutscht. Die entfärbte Kulturlösung wurde mit NH₃ neutralisiert (183 L, 67 000 SIE/L). Man rührte anschließend zur Adsorption des Wirkstoffs 20 g Aktiv-Kohie/L = 370 g ein und ließ 30' rühren. Anschließend wurde über ein Seitz K 3-Filter, das mit einer Schicht aus dem Filterhilfsmittel Clarcel® beschickt war, abfiltriert. Das Filtrat (173 I, 3600 SIE/L) wurde verworfen. Der

26

Kohleriicksland wurde 3 χ mil 2 I dest. MjO gewaschen. Zur Desorption des Wirkstoffs von der Kohle wurde diese > χ nacheinander mit jeweils I L 80°/oig. Aceton für 15' gerührt, wobei das pH mit konz. HCI auf pH 2.5 eingestellt wurde. Die Desorbate wurden vereinigt (2,4 L. 371.000 SIE/L). In dieses Desorbal «ν-den 20 g Dowex® H <7L (Dowex® 50W X 4. H+ -Form, = 46 g Dowex eingetragen und 20' gerührt. Anschließend wurde das Harz abfiltriert (Dowex®-fraktion I) und mit etwas 75%igem Acetor. 'lachgewaschen, in Das Filtrat und Waschflüssigkeit (3L = 215 000 SIE/L) wurden mit 60g Amberlite® IRA 410 (OII-Form)/L gerührt, bis pH 7 erreicht war. Anschließend wurde •bfiltriert und das Filtrat (2,8 L, 219 000 SIE/L) mit 72 g Dowex® H⁺ versetzt und 20' gerührt. Das pH wurde dabei durch Einhängen eines mit Amberlite® IRA 410 OH - gefüllten porösen Nylonbeutels auf 3-.0 gehalten. AnsrhlipRpnd wurde vom Dnwex ahfiltrierl (Dnwexfraktion II), das Filtrat (2,6 L, 27 000 SIE/L) wurde verworfen.

Dowex®-Fraktion I und Il wurden jede für sich 3 χ mit 75% Aceton bei pH 3,5 gewaschen und anschließend je 3 χ mit je 100 ml (Dowex®-Fraktion I) bzw. 150 ml (Dowex®-Fraktion II) 0.6% NHj desorbiert. Bei der 1. Desorption, bei der die Amnioniakmenge zur Neutralisation des Dowex®-Harzes nicht ausreichte, wurde durch Zugabe von konz. NHj am pH-Meter auf pH 9 eingestellt. Die 3 Desorbate von Dowex®-Fraktion I und Il wurden für sieh vereinigt, am Rotationsverdampfer fast zur Trockne eingeengt, in 50 ml H2O aufgenommen, am pH-Meter mit HCI auf pH 3-4 eingestellt und mit 50 ml Methanol versetzt. Die Lösungen wurden in 1.5 L absolutes Aceton unter Rühren eingetropft, der fallende Niederschlag abgenutscht und 3 χ mit Aceton sowie 1 χ mit Äther gewaschen. Man trocknete im Vakuum.

Ausbeute: Fraktion I 6.5 g 25 000SIE/g
Fraktion Il 12.3 g 36O0OSIE/g

Fraktion I und Il enthalten als hemmaktive Restiinrlleile hauptsächlich die erfindungsgemäße Verbindung mi'. n\ + 02 = 2 neben geringen Anteilen der Verbindung mit fli + /J2 = 3.

Die folgende Tabelle gibt die Sacchärase-Hemmaktivitälen des Präparats in aufeinanderfolgenden Stufen wieder:

Ausbeute

	Volumen (L)	SIE/L	SIE gesamt	SIE Ausbeute %
1) Kulturlösung	20,5	67 000	1 373 500	100
2) Nach Lewapol® Entfärbung	19,5	67 000	i 306 500	95
3) Nach Aktivkohleadsorption	18,5	3 600	66 600	(4,8 Verworfen)
4) 1. Desorbat	0,7	742 000	519400	37,8 I
5) 2. Desorbat	0,9	329 000	296 100	883 500 21,6 1 64,4
6) 3. Desorbat	0,8	85 000	68000	5,0J
7) Mischdesorbat (4-6)	2,4	371000	890400	64,8
2λ Nach ! Dc.vsx® sdscnticr:	1 η	T[5 nnn	645 000
9) Nach Neutralisat mit IRA CH"	2,8	219 000	613 200
10) Nach 2. Dowex®-adsorption	2,5	27 000	67 500	(4,9 verworfen)
11) Vereinigte NH3 Desorbate von Dowexa-Fraktion I	0,29	682 000	197 780	14,4 I Lo,9
12) Vereinigte NH3 Desorbate von Dowex®-Fraktion II	0,45	1419000	638 550	46,5 j
13) Fällung Fraktion I	6,5 g	25 000/g	162 500	"'8Wo
Fällung Fraktion II	12,3 g	36000/g	442 800	32,2 I44'0
Beispiel 8		mil 7 I 7flOAiiTAm		t*t Qi-^m lii Rl ir*h elf irrt ti

200 g einer Zubereitung wie in Beispiel 1 beschrieben wurden in 940 ml destillierem Wasser und 60 ml konz. H^SO₄ gelöst und ¹M Stunde unter Rückfluß erwärmt (Innentemperatur: 98-100⁰C; Ölbadtemperatur: !40^cC). Die abgekühlte, schwarzbraune Lösung wurde mit 10 g Aktivkohle versetzt und 1 Stunde gerührt. Danach wurde die Aktivkohle abgesaugt, mit Wasser gewaschen und das Filtrat mit ca. 250 ml 10 η KOH auf pH = 7 bis 8 eingestellt. Die Lösung wurde 1 Stunde mit 50 g Aktivkohle ausgerührt. Die Kohle wurde abgesaugt, mit 21 Wasser gewaschen und das Filtrat verworfen. Zur Desorption wurde die Kohle über Nacht man die Kohle ab und engte die alkoholische Lösung am Rotationsdampfer ein. Rückstand: 8,0 g.

Der Rückstand wurde in 15 ml H2O aufgenommen und auf eine mit 50 g Amberlite® IR 120 (H+-Form) gefüllte Säule (Höhe: 20 cm, 0 2,4 cm) aufgetragen. Man ließ mit 3 Tropfen/Minute einziehen und wusch mit Wasser nach (12 Tropfen/Mrnute), bis alle nicht basischen Bestandteile entfernt waren. Dann wurden die basischen Produkte mit 0,5%igem NH3 von der Säule eluiert (12 Tropfen/Minute) und die wäßrige Lösung am Rotationsverdampfer zur Trockne gebracht. Rückstand: 4,1g.

tn

2 g dieses Rückstandes wurden in wenig Wasser gelöst und auf eine mit Sephadex® G-15 gefüllte Säule (Höhe: 200 cm; 0: 3,0 cm) aufgetragen. Es wurde mit Wasser eluiert. Bei einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/Stunde wurden Fraktionen von jeweils 2 ml abgenommen. Die einzelnen Fraktionen wurden dünnschichlchromatographisch geprüft. Die Fraktionen 85-94 lieferten 280 mg der Verbindung mit «ι + /I₂ = 2 mit einer spcz. Aktivität von 50 000SIE/g.

Beispiel 9

Inkubiert man 2 g einer Zubereitung wie in Beispiel 1 beschrieben in 30 ml 20 mM Acetatpuffer vom pH 4,8 mit 1,25 mg /?-Amylase aus sweet potato (BOEHRIN- \-, GER 15471) unter stetigem Rühren für 120 std bei 37°C, erhitzt schließlich für 5 min auf 100°C und zentrifugiert !•ei 4000 Uⁿni vom IJrmplÖs'pn ab. ?O prhält man nnrh Lyophilisation der Lösung 1,5 g eines Produktes mit l800SIE/g und 3,8 χ 10⁵AIE/g. Prüft man dieses Produkt mittels Dünnschichtchromatographie und Saccharase-Inhibitionsfärbung wie in Beispie! 1 beschrieben, so zeigt sich, daß an hemmaktiven Verbindungen im wesentlichen die erfindungsgemäßen Verbindungen mit πι +./J₂ = 2 und 3.

Beispiel 10

Beimpft man einen 200-ml-Erlenmeyerkolben, der

25 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 0.1% jn K₂HPO, 0.2% (NH₄)₂SO₄, 0.5% MgSO₄, 0.05% KCl. 0.01% FeSO₄, 2% einer Zubereitung wie in Beispiel 1 beschrieben mit einer Sporensuspension des Stammes Aspergillusniger ATCC 11394 und bebrütet bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so sinkt nach 6 Tagen der jj AIE-Titer von 210000 AIE/ml auf 53 000AIE/ml und nach 10 Tagen auf 21 300 AIE/ml. Gleichzeitig nimmt der SIE/ml Gehalt von 7.0 auf 72 SlE/ml zu.

20 ml einer 10 Tage mit der Sporensuspension inkubierten Lösung wurden zur Abtrennung des Mycels 30' bei 3000 Upm zentrifugiert. Die 15 ml Überstand (72 000S1H/L) wurden durch 30minütiges Rühren mit 2 g Amberlite® IRC 50 H + und 1 g Amberlite® IRA 410 OH- entsalzt (Leitfähigkeit kleiner als 2 m S · cm-'). Man filtrierte ab und ließ das Filtrat mit 5 ml/h durch eine mit Dowex®H⁺ in 0.001 η HCI äquilibrierte Säule (0 1 cm χ 10 cm) laufen. Anschließend wurde mit 200 ml 0.001 η HCI nachgewaschen. Zur Desorption wurde 0,6% NHj-Lösung durch die Säule gepumpt (10 ml/h) und 5 ml Fraktionen aufgefangen. Die die saccharaseinhibitorische Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, auf 2 ml am Rotationsverdampfer einrotiert und mit 2 ml Methanol versetzt. Man stellte diese Lösung auf pH 3—4 ein und brachte sie durch Eintropfen in 100 ml Aceton zur Fällung. Der Niederschlag wurde abgenutscht, mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute:

26 mg mit 28 000SIE/g, bestehend aus Verbindungen mit πι + Π2 = 2 und 3. Die Gewinnung der reinen Verbindung mit Πι + /J₂ = 2 aus diesem Produkt erfolgt wie in Beispiel 8 beschrieben durch Gelfiltration über eine Säule mit Bio-Gel® P-Z Man erhält 7 mg der Verbindung mit Πι + H₂ = 2 von 60.000 SI E/g.

Beispiel 11

Zur Gewinnung der Aminozuckerderivate mit 5 — 7 Glucoseeinheiten geht man z. B. von einer Zubereitung, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurde, aus.

Dazu wurden 30 g der Zubereitung nach Beispiel 1 in 250 ml H₂O gelöst. Die Leitfähigkeit dieser Lösung beträgt 10 mS · cm-',das pH 5.5. Zur Entsalzung wurde die Lösung mit 60 g Amberlite® IRC 5OH* (schwach saurer Kationenaustauscher, der die Aminozuckerderivüle aus wäßriger Lösung nur spurenweise bindet) und 20 g Amberlite® IRA 410 OH" versetzt und 20'gerührt. Das Filtrat (Leitfähigkeit 0.5 mS · cm-', pH 3.5) wurde mit 1 η HCI auf pH 3.0 eingestellt (Leitfähigkeit 0.6 mS · cm '). Diese Lösung wurde mit 42 ml/h durch eine mit Dowex® 50 W (H ♦) gefüllte Säule (0 2.5 cm, Höhe 40 cm, äquilibriert in 0.001 η HCI) gepumpt und anschließend nut 2 L 0.001 η HCI nachgewaschen. Nach dem Waschen der Säule eluierte man mit 1.2% wäßrigem Ammoniak und sammelte 10 ml Fraktionen. Die inhibitorisch aktiven Fraktionen wurden vereinigt, d2S Ammoniak im Vakuum ahcrp7nupn und Hip !.ösunp anschließend im Vakuum auf 30 ml eingeengt. Man fällte durch Eintropfen in 600 ml Trockensprit, nutschte den Niederschlag ab und trocknete im Vakuum nach Waschen mit Alkohol und Äther. Ausbeute 4.4 g mit 26,5 χ 10⁶AI E/g.

Jeweils 0,5 g wurden zur Feinreinigung auf eine präparative Biogel® P-2 Säule, wie in Beispiel 6 beschrieben, aufgetragen und entwickelt. Die Fraktionen, die nach DC (Amylaseinhibitionsfärbung) Verbindungen mit /Ji + n₂ = 5-7 enthalten, wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt und wie oben beschrieben mit Trockensprit gefällt. Ausbeute aus 0,5 g Rohprodukt: 0.2 g Aminozuckerderivate mit rt\ + n₂ = 5 —7 mit 30 χ IO⁶ AIE/g und 2.500 SlE/g.

Beispiel 12

Dieses Beispiel zeigt, wie die erfindungsgemäßen Verbindungen aus dem Kationenaustauscher unter sauren Bedingungen eluiert werden können.

Man füllt eine Säule vom Durchmesser 1,5 cm mit 30 g (Feuchtgewicht) Dowex® 50 W χ 4, (H ⁺ ) 200-400 mesh in 0.001 η HCI.

Anschließend pumpt man 500 ml Mischdesorbat (400 000 SIE/L, pH 2,5, 60% Aceton), erhalten nach Beispiel 9 (Tabelle, laufende Nr. 7) in ca. 1 Stunde durch die Säule und wäscht anschließend mit 500 ml 0.001 η HCl nach. Unter diesen Bedingungen wird nur spurenweise Aktivität eluiert. Daran anschließend wurde mit 0.0125 η HCI desorbiert, wobei die Leitfähigkeit oder das Brechungsindex des Säuleneluats registriert wurde. Außerdem wurde der SIE-Gehalt des Eluats getestet. Die aktiven Fraktionen 74—100 werden vereinigt und durch Zugabe von Amberlite® IRA 410 OH" neutralisiert, dann eingeengt auf 5 ml, mit 5 ml Methanol reagiert und durch Eintropfen in 200 ml Aceton gefällt. Nach Waschen mit Aceton und Äther wurde im Vakuum getrocknet.

Ausbeute 1 g der Verbindung mit m + 112 = 2 mit 65 000SIEZg.

Aus den aktiven Vorfraktionen können die Verbindungen mit πι + /7₂ = 3 und 4 Glucoseeinheiten gewonnen werden.

Dieses Verfahren der sauren Desorption ermöglicht also im Gegensatz zur alkalischen Desorption eine Fraktionierung der einzelnen Aminozuckerderivate dieser Reihe.

Wenn man dem wie oben beschriebenen zubereiteten Stoff mit 4 bis 8 Glucoseeinheiten diesem Verfahren unterwirft, wobei die neutralisierten Eluate lediglich

/Jl+/72 = Πι + /72 =

lyophilisiert werden, erhält man die folgenden einzelnen höheren Fraktionen:

4 = 67.000 AI E/mg

5 = 57.000 AI E/mg

6 = 42.000 AI E/mg

7 = 24.000 AI E/mg

8 = 5.000 AI E/mg

Beispiel 13

Das oben beschriebene j3-Amylase-Abbauverfahren wird folgendermaßen durchgeführt.

100 mg Verbindung wurden in 1,9 ml 20 mM Nalriumacetatpuffer (pH 4,75) gelöst und mit 0,1 ml jS-Amylase »us sweet potato (BOEHRiNGER Nr. 15471; 5 mg/ml; 500 E/mg) Vcrscizi. Die Mischung würde 48 Siunden bei 37°C gehalten Und für 5 Minuten auf 100°C erhitzt und anschließend bei 4500 Upm zentrifugiert, um ausgefälltes Eiweiß und andere Verunreinigungen zu entfernen. Die ganze Mischung wurde dann auf eine Säule mit Bio^Gel P 2 (Durchmesser 22 mm; 100 cm lang; bei 65°C thermostatisiert) aufgetragen und mit Wasser bei einer Fließgeschwindigkeit von 25 ml/Std. eluiert. D'as Eluat wird durch ein Konduktometer und ein hochempfindliches Refraktometer mit Durchflußküvetten geleitet. Fraktionen von jeweils 2,5 ml wurden aufgefangen. Die Fraktionen können auf Am.ylase- oder Saccharasehemmaktivität oder mittels des Anthrontests auf Kohlenhydratgehalt geprüft werden. Die aus dem Puffer stammenden Elektrotypen und das Enzympräparat werden mit dem Leervolumen um¹ die Abbauprodukte nach abnehmendem Molekulargewicht eluiert.

Vollständige Abtrennung der Verbindungen, deren Molekulargewichte sich wenig unterscheiden, wird durch recycling chromatography unter den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Fraktionen, die zu isolierende Produkte enthalten, werden vereinigt

ίο und lyophilisiert.

Beispiel 14

Zur Trennung der isomeren Verbindungen mit drei Glucoseeinheiten wurden IO g einer in Wasser gelösten Isomerenmischung auf eine mit Dowex®50 W χ 4(H⁺) gefüllte Säule mit Wasser gewaschen, bis das Elual neuira! war, und dann niii 0,025 Π Salzsäure eiuieri. Fraktionen von jeweils 3 ml würden aufgefangen und dünnsäiichtchromatographisch geprüft. Dünn-Schichtchromatographie wurde auf silanisierten Kieselgelplatten mit 100:60:40:2 Äthylacetat + Methanol + Wasser 4- 25% Ammoniak mit dreifacher Entwicklung durchgeführt. Die 6 g Isomeres mit der Formel Il enthaltenden Fraktionen 215 bis 272 wurden vereinigt, mit Amberlite® IRA-410 (OH-) neutralisiert und eingeengt.

Die in vitro Saccharase-Hemmaktivität des durch dieses Verfahren isolierten Isomeren der Formel IV ist 19.000 SI U/g.

Claims (1)

1. Patentansprüche: 1. Arninozuckerderivaie der allgemeinen Formel

   H-

   HO

   HO

   OH