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Inhibitoren für -Glucosidasen
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Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Nojirimycin
und davon abgeleiteten Verbindungen, insbesondere l-Desoxynojirimycin und D»Glucono
Slactam, als Inhibitoren für α-Glucosidasen des Verdauungstraktes.
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Es ist bereits bekannt, daß Nojirimycin bakterielle ß-Glucosidasen
sehr stark und pilzliche CC-Glucosidasen deutlich schwächer hemmt [T . NIWA et al.,
Agr. Biol. Chem. 34, 966 (197017.
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l-Desoxynojirimycin hemmt ß-Glucosidasen um vier Zehnerpotenzen schwächer
als Nojirimycin. Über die Wirkung der 1-Desoxyverbindung auf-Glucosidasen ist nichts
bekannt.
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Uberraschenderweise wurde nun gefunden, daß α-Glucosidasen des
Verdauungstraktes, im besonderen Maße Saccharasen, durch Nojirimycin und l-Desoxynojirimycin
sowie davon abgeleiteten Verbindungen wie z. B. D-Glucono- #-lactam wirkungsvoll
gehemmt werden.
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So inhibieren z. B. Nojirimycin und l-Desoxynojirimycin die dL-Glucosidase
des intestinalen Disaccharidasekomplexes aus Schweinedünndarmmucosa 10 bis 20-fach
stärker als ß-Glucosidasen und um vier Zehnerpotenzen stärker als die oben erwähnten
pilzlichen cC-Glucosidasen.
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Die erfindungsgemäß zu verwendenden Verbindungen übertreffen damit
in ihrer Hemmwirkung die aus der DT-OS 23 47 782 bekannten Glykosidhydrolaseninhibitoren.
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Damit stellen diese Substanzen wertvolle Mittel zur Beeinflußung einer
Vielzahl von Stoffwechselvorgängen dar und bereicheren somit den Arzneimittelschatz.
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Nojirimycin kann auf dem Wege über die Fermentation von Organismen
der Gattung Streptomyces hergestellt werden (T. NIDA et al., J. Antibiotics, Ser.
A. 20, 62 (1967)).
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l-Desoxynojirimycin wird durch katalytische Hydrierung von Nojirimycin
erhalten (S. INOYE et al., Tetrahedron 23, 2125 (1968)). Besonders vorteilhaft läßt
sich die l-Desoxyverbindung auch nach einem neuen Verfahren auf mikrobiologischem
Wege dadurch herstellen, daß man geeignete Organismen der Familie Bacillaceae, insbesondere
des Stammes DSM 7, in üblichen Nährlösungen bei Temperaturen von etwa 15 bis etwa
80 0C etwa 1 bis 8 Tage unter Belüftung in üblichen Fermentationsgefäßen kultiviert,
die Zellen abtrennt und den Inhibitor aus der Kulturbrühe oder den Zellextrakten
durch übliche Aufarbeitungsverfahren isoliert. (Deutsche Patentanmeldung (Le A 17
587).
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D-Glucono- r-lactam wird durch Oxidation von Nojirimycin mit Hypojodit
erhalten (S. INOYE et al, Tetrahedron 23, 2125 (1968)).
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Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von kohlenhydrathaltigen
Nahrungsmitteln und Getränken (z.
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B. Getreide-, Kartoffelstärke, Obst, Fruchtsaft, Bier, Schokolade)
Hyperglykämien auftreten, die infolge eines raschen Abbaus der Kohlenhydrate durch
Glycosidhydrolasen (z. B. Speichel- und Pankreasamylasen, Maltasen, Saccharasen)
nach folgendem Schema
Amylase Maltase Stärke bzw. Glycogen
Maltose
Glucose Saccharose Saccharose
Glucose + Fructose bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern besonders
stark und anhaltend ausgeprägt. Bei Adiposen bewirkt die alimentäre Hyperglykänie
oftmals eine besonders starke Sekretion von Insulin, das seinerseits zu vermehrtem
Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt. Im Anschluß an derariige Hyperglykämien
tritt bei stoffwechselgesunden und adipösen Personen infolge der Insulinsekretion
häufig eine Hypoglykämle auf. Bekannt ist, daß sowohl Hypoglykämien als auch im
Magen verweilender Speisebrei die Produktion von Magensaft fördern, der seinerseits
die Entstehung einer Gastritis, eines Ulcus ventriculi oder duodeni auslöst oder
begünstigt.
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Ferner ist bekannt, daß in der Mundhöhle Kohlenhydrate, besonders
Saccharose, durch Mikroorganismen gespalten werden und dadurch die Kariesbildung
gefördert wird.
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Nalabsorption von Kohlenhydraten, z.B. infolge intestinalen Saccharasemangels,
bewirkt eine Diarrhoe. Geeignete Dosen eines Glucosidase-Inhibitors bewirken eine
künstliche Malabsorption und sind deshalb geeignet, einer Obstipation entgegen zu
wirken.
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Die erfindungsgemäßen Inhibitoren eignen sich deshalb als Therapeutica
für folgende Indikationen: Prädiabetes, Gastritis, Obstipation, Karies, Atheroskelerose
und besonders Adipositas, Diabetes und Hyperlipoprotämie.
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Zur Verbreiterung des Wirkungsspektrums kann es sich empfehlen, Inhibitoren
für Glycosidhydrolasen, die sich gegenseitig in ihrer Wirkung ergänzen,zu kombinieren,
sei es, daß es sich
um Kombinationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren
untereinander oder um Kombinationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren mit bereits
bekannten handelt. So kann es beispielsweise zweckmäßig sein, erfindungsgemäße Saccharase-Tnhibitoren
mit bereits bekannten Amylase-Inhibitoren zu kombinieren.
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VorteIlhaft sind in manchen Fällen auch Kombinationen der erfinduugsgemäßen
Inhibitoren mit bekannten oralen Antidiabetica (ß-cytotrope Sulfonylharnstoffderivate
und/oder blutzuckerwirksame Biguanide) sowie mit blutlipid-senkenden Wirkstoffen
wie z. B. Clofibrat, Nicotinsäure, Cholestyramin und andere.
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Die Verbindungen können ohne Verdünnung, z. B. als Pulver oder in
einer Gelatinehülle oder in Kombination mit einem Trägerstoff in einer pharmazeutischen
Zusammensetzung appliziert werden.
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Pharmazeutische Zubereitungen können eine größere oder kleinere Menge
des Inhibitors enthalten, z. B. 0,1 % bis 99,5 %, in Kombination mit einem pharmazeutisch
verträglichen nichttoxischen, inerten Trägerstoff, wobei der Trägerstoff eine oder
mehrere feste, halbfeste oder flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe und/oder nichttoxisches,
inertes und pharmazeutisch-verträgliches Formulierungshilfsmittel enthalten kann.
Solche pharmazeutischen Zubereitungen liegen vorzugsweise in Form von Dosierungseinheiten
vor, d. h. physikalisch-diskrete, eine bestimmte Menge des Inhibitors enthaltenden
Einheiten, die einem Bruchteil oder einem Vielfachen der Dosis entsprechen, die
zur Herbeiführung der gewünschen Hemmwirkung entsprechen. Die Dosierungseinheiten
können 1, 2, 3, 4 oder mehr Einzeldosen oder 1/2, 1/3 oder 1/4 einer Einzeldosis
enthalten. Eine Einzeldosis enthält vorzugsweise eine genügende Menge Wirkstoff,
um bei einer Applikation gemäß eines vorher bestimmten Dosierungsschemas einer oder
mehrerer Dosierungseinheiten die gewünschte Hemmwirkung zu erzielen, wobei eine
ganze, eine halbe, oder ein Drittel oder ein Viertel der Tagesdosis gewöhnlich zu
allen,
Haupt- und Nebenmahlzeiten am Tage verabreicht wird.
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Andere therapeutische Mittel können auch eingenommen werden. Obgleich
die Dosierung und das Dosierungsschema in jedem Fall sorgsam abgewogen werden sollte,
unter Anwendung gründlichen fachmännischen Urteils und unter Beachtung des Alters,
des Gewichts und des Zustands des Patiene, dr Art und der Schwere der Erkrankung,
wird die Dosierung gewöhnlich in einem Bereich zwischen etwa 30 bis etwa 3 x 105
AIE/kg und zwischen etwa 1 bis etwa 1 x 104 SIE/kg des Körpergewichtes pro Tag liegen.
In manchen Fällen wird man dabei eine ausreichende therapeutische Wirkung mlt einer
geringeren Dosis erreichen, wahrend in anderen Fällen eine größere Dosis erforderlich
sein wird.
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Orale Applikation kann unter Verwendung fester und flüssiger Dosierungseinheiten
durchgeführt werden, wie z. B. Pulver, Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulate, Suspensionen,
Lösungen und dergleichen.
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Pulver wird durch Zerkleinerung der Substanz in einer geeigneten Größe
und Vermischen mit einem ebenfalls zerkleinerten pharmazeutischen Trägerstoff hergestellt.
Obgleich ein eßbares Kohlenhydrat, wie z. B. Stärke, Lactose, Saccharose oder Glucose
normalerweise zu diesem Zwecke Verwendung findet und auch hier benutzt werden kann,
ist es wünschenswert ein nicht metabolisierbares Kohlenhydrat, wie z. B.
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ein Cellulosederivat zu benutzen.
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Süßmittel, Geschmacks zusätze, Konservierungsstoffe, Dispergiermittel
und Färbemittel können auch mitverwendet werden.
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Die Kapseln können durch Zubereitung der oben beschriebenen Pulvermischung
und durch Füllung bereits gebildeter Gelatinehüllen hergestellt werden. Die Pulvermischung
kann man vor dem Füllvorgang mit Gleitmitteln, wie z. B. Kieselgel, Talkum, Magnesiumstearat,
Calciumstearat oder festem Polyäthylenglykol versetzen. Die Mischung kann man ebenfalls
mit
einem Desintegrator oder Lösungsvermittler, wie z. B.
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Agar-Agar, Calciuncarbonat oder Natriumcarbonat versetzen, um bei
Einnahme der Kapsel die Zugänglichkeit des Inhibitors zu verbessern.
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Die Anfertigung der Tabletten erfolgt zum Beispiel durch Herstellung
einer Pulvermischung, grob oder feinkörnig, und Hinzufügung eines Gleitmittels und
Desintegrators. Aus dieser Mischung formt man Tabletten. Eine Pulvermischung bereitet
man vor durch Mischung der Substanz, welche in geeigneter Weise zerkleinert wurde
und ergänzt ein Verdünnungsmittel oder eine andere Trägersubstanz wie oben beschreiben.
Gegebenenfalls fügt man ein Bindemittel hinzu: z. B. Carboxymethylcellulose, Alginate,
Gelatine oder Polyvinylpyrrolidone, einen Lösungsverzägerer, wie z. B. Paraffin,
einen Resorptionsbeschleuniger, wie z. B. ein quarternäres Salz und/oder ein Adsorptionsmittel,
wie z. B. Bentonit, Kaolin oder Dicalciumphosphat. Die Pulvermischung kann granuliert
werden zusammen mit einem Bindemittel, wie z. B. Syrup, Stärkepaste, Akazienschleim,
oder Lösungen aus Zellulose- oder Polymerenmaterialien. Danach preßt man das Produkt
durch ein grobes Sieb. Als Alternative hierzu kann man die Pulvermischung durch
eine Tablettenmaschine laufen lassen und die sich ergebenden ungleichmäßig geformten
Stücke bis auf Korngröße zerkleinern. Damit die entstandenen Körner nicht in den
tablettenbildenden Düsen stecken bleiben, kann man sie mit einem Gleitmittel versetzen,
wie z. B. Stearinsäure, Stearatsalz, Talkum oder Mineralöl. Diese gleitfähig gemachte
Mischung wird dann in Tablettenform gepreßt. Die Wirkstoffe können auch mit freifließenden
inerten Trägerstoffen vereinigt werden und direkt in Tablettenform gebracht werden
unter Auslassung der Granulat-oder Zerstückelungsschritte. Man kann das Produkt
mit einer klaren oder opaken Schutzhülle versehen, z. B. einem Uberzug aus Schellack,
einem Uberzug aus Zucker oder Polymersubstanzen und einer polierten Hülle aus Wachs.
Farbstoffe
können diesen Überzügen beigefügt werden, damit zwischen
den verschiedenen Dosierungseinheiten unterschieden werden kann.
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Die oral zu verabreichenden Zubereitungsformen, wie z. B. Lösungen,
Syrup und Elixire, lassen sich in Dosierungseinheiten herstellen, so daß eine bestimmte
Menge Präparat eine bestimmte Menge Wirkstoff enthält. Syrup kann so hergestellt
werden, daß der Wirkstoff in einer wäßrigen Lösung, welche geeignete Geschmacksstoffe
enthält, gelöst wird; Elixire werden unter Verwendung nichttoxischer, alkoholischer
Trägerstoffe erhalten. Suspensionen kann man durch Dispergieren der Verbindung in
einem nicht toxischen Trägerstoff darstellen. Lösungsvermittler und Emulgiermittel,
wie z. B. äthoxylierte Isostearylalkohole und Polyoxyäthylensorbitester, Konservierungsmittel,
geschmacksverbessernde Zusätze wie z. B. Pfefferminzöl oder Saccharin und dergl.
können auch zugegeben werden.
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Dosierungsvorschriften können auf der Kapsel angegeben werden.
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Überdies kann die Dosierung so abgesichert sein, daß der Wirkstoff
verzögert abgegeben wird, z. B. durch Einhalten des Wirkstoffes in Polymerensubstanzen,
Wachse oder dergl.
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Zusätzlich zu den oben erwähnten pharmazeutischen Zusammensetzungen
lassen sich auch diese Wirkstoffe enthaltende Lebensmittel hergestellt werden; beispielsweise
Zucker, Brot, Kartoffelprodukte, Fruchtsaft, Bier, Schokolade und andere Konfektartikel,
und Konserven, wie z. B. Marmelade, wobei zu diesen Produkten eine therapeutisch-wirksame
Menge mindestens eines der erfindungsgemäßen Inhibitoren gegeben gurde.
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Die erfindungsgemäßen Inhibitoren weisen weiterhin die Eigenschaft
auf, in Tieren das Verhältnis des Anteiles an unerwünschtem Fett zum Anteil des
erwünschten fettarmen Fleisches (mageres Fleisch) zugunsten des mageren Fleisches
in hohem
Maße zu beeinflussen. Dies ist von besonderer Bedeutung
für die Aufzucht und Haltung von landwirtschaftlichen Nutztieren, z.
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B. in der Schweinemast, aber auch von erheblicher Bedeutung für die
Aufzucht und Haltung von sonstigen Nutztieren und Ziertieren. Die Verwendung der
Inhibitoren kann weiterhin zu einer erheblichen Rationalisierung der Fütterung der
Tieren führen, sowohl zeitlich, mengenmäßig wie auch qualitätsmäßig. Da sie eine
gewisse--Verzögerung der Verdauung bewirken, wird die Verweildauer der Nährstoffe
im Verdauungstrakt verlängert, wodurch eine mit weniger Aufwand verbundene ad libitum-Fütterung
ermöglicht wird. Weiterhin ergibt sich bei der Verwendung der erfindungsgemäßen
Inhibitoren in vielen Fällen eine erhebliche Einsparung von wertvollem Proteinfutter.
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Die IZrirkstoffe können somit praktisch in allen Bereichen der Tierernährung
als Mittel zur Reduzierung des Fettansatzes sowie der Einsparung von Futtereiweiß
verwendet werden.
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Die wirksamkeit der Wirkstoffe ist hierbei weitgehend unabhängig von
der Art und dem Geschlecht der Tiere. Besonders wertvoll erweisen sich die Wirkstoffe
bei Tierarten, die überhaupt oder in bestimmten Lebensabschnitten zu stärkerer Fetteinlagerung
neigen.
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Als Tiere, bei denen die Inhibitoren zur Reduzierung des Fettansatzes
und/oder zur Einsparung von Futtereiweiß eingesetzt werden können, seien beispielsweise
folgende Nutz- und Ziertiere genannt: Warmblüter wie Rinder, Schweine, Pferde, Schafe,
Ziegen, Katzen, Hunde, Kaninchen, Pelztiere, z. B.
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Nerze, Chinchilla, andere Ziertiere, z. B. Meerschweinchen und Hamster,
Labor- und Zootiere, z. B. Ratten, Mäuse, Affen usw. Geflügel, z. B. Broiler, Hühner,
Gänse, Enten, Truthähne, Tauben, Papageien und Kanarienvögel und Kaltblüter, wie
Fische, z. B. Karpfen und Reptilien, z. B. Schlangen.
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Die Menge der Wirkstoffe, die den Tieren zur Erreichung des gewünschten
Effektes verabreicht wird, kann wegen der günstigen Eigenschaften der Wirkstoffe
weitgehend variiert werden. Sie liegt vorzugsweise bei etwa 0,5 mg bis 2,5 g, insbesondere
10 bis 100 mg/kg Futter pro Tag. Die Dauer der Verabreichung kann von wenigen Stunden
oder Tagen bis zu mehreren Jahren betragen. Die passende Menge Wirkstoff sowie die
passende Dauer der Verabreichung stehen in engem Zusammenhang mit dem Fütterungsziel.
Sie hängen insbesondere von der Art, dem Alter, dem Geschlecht, dem Gesundheitszustand
und der Art der Haltung der Tiere ab und sind durch jeden Fachmann leicht zu ermitteln.
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Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe werden den Tieren nach den üblichen
Methoden verabreicht. Die Art der Verabreichung hängt insbesondere von der Art,
dem Verhalten und dem Allgemeinzustand der Tiere ab. So kann die Verabreichung einmal
oder mehrmals täglich, in regelmäßigen oder unregelmäßigen Abstan den,oral erfolgen.
Aus Zweckmäßigkeitsgründen ist in den meisten Fällen eine orale Verabreichung, insbesondere
im Rhythmus der Nahrungs- und/oder Getränkeaufnahme der Tiere, vorzuziehen.
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Die Wirkstoffe können als reine Stoffe oder in formulierter Form verabreicht
werden, wobei die formulierte Form sowohl als Premix, also in Mischung mit nichttoxischen
inerten Trägerstoffen beliebiger Art, als auch als Teil einer Gesamtration in Form
eines Beifutters bzw. als Mischungsbestandteil eines alleinigen Mischfutters zu
verstehen ist. Mit eingeschlossen ist auch die Applikation geeigneter Zubereitungen
über das Trinkwasser.
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Die Wirkstoffe können gegebenenfalls in formulierter Form auch zusammen
mit anderen Nähr- und Wirkstoffen, z. B. Mineralsalzen, Spurenelementen, Vitaminen,
Eiweißstoffen, Energieträgern
(z. B. Stärke, Zucker, Fette), Farbstoffen
und/oder Geschmacksstoffen oder anderen Futterzusatzstoffen, wie z. B.
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Wachstumsförderern, in geeigneter Form verabreicht werden. Die Wirstoffe
können den Tieren vor, während oder nach der Nahrungsaufnahme gegeben werden.
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Empfehlenswert ist die orale Verabreichung zusammen mit dem Futter
und/oder Trinkwasser, wobei åe nach Bedarf die Wirkstoffe der Gesamtmenge oder nur
Teilen des Futters und/oder Trinkwassers zugegeben werden.
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Die Wirkstoffe können nach üblichen Methoden durch einfaches Mischen
als reine Stoffe, vorzugsweise in fein verteilter Form oder in formulierter Form
in Mischung mit eßbaren, nichttoxischen Trägerstoffen, gegebenenfalls auch in Form
eines Premix oder eines Futterkonzentrates, dem Futter und/oder dem Trinkwasser
beigefügt werden.
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Das Futter und/oder Trinkwasser kann beispielsweise die erfindungsgemäßen
Wirkstoffe in einer Konzentration von etwa 0,001 bis 5,0 %, insbesondere 0,02 bis
2,0 (Gewicht) enthalten. Die optimale Höhe der Konzentration des Wirkstoffs im Futter
und/oder Trinkwasser ist insbesondere abhängig von der Menge der Futter- und /oder
Trinkwasseraufnahme der Tiere und kann durch jeden Fachmann leicht ermittelt werden.
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Die Art des Futters und seine Zusammensetzung ist hierbei ohne Belang.
Es können alle gebräuchlichen, handelsüblichen oder speziellen Futterzusammensetzungen
verwendet werden, die vorzugsweise das übliche, für eine ausgewogene Ernährung notwendige
Gleichgewicht aus Energie- und Eiweißstoffen, einschließlich Vitaminen und Mineralstoffen
enthalten. Das Futter kann sich beispielsweise zusammensetzen aus pflanzlichen Stoffen,
z. B. Ölkuchenschroten, Getreideschroten, Getreidenebenprodukten, aber auch aus
Heu, Gärfutter, Rüben und anderen Futterpflanzen,
aus tierischen
Stoffe, z. B. Fleisch- und Fischprodukte, Knochenmehl, Fette, Vitamine, z. B. A,
D, E, K und B-Komplex sowie spezielle Proteinquellen, z. B. Hefen sowie bestimmte
Aminosäuren und Mineralstoffen und Spurenelementen, wie z. B. Phosphor und Eisen,
Zink, Mangan, Kupfer, Kobalt, Jod usw.
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Premixe können vorzugsweise etwa 0,1 bis 50 96, insbesondere 0,5 bis
5,0 % (Gewicht) z. B. Nojirimycin oder l-Desoxynojirimycin neben beliebigen eßbaren
Trägerstoffen und/oder Mineralsalzen, z. Bo kohlensaurem Futterkalk enthalten und
werden nach den üblichen Mischmethoden hergestellt.
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Mischfutter enthalten vorzugsweise 0,001 bis 5,0 46, insbesondere
0,02 bis 2,0 % (Gewicht) beispielsweise an l-Desoxynojirimycin neben den üblichen
Rohstoffkomponenten eines Mischfutters, z. B. Getreideschrote oder nebenprodukte,
Ö1-kuchenschrote, tierisches Eiweiß, Mineralien, Spurenelemente und Vitamine. Sie
können nach den üblichen Mischmethoden hergestellt werden.
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Vorzugsweise in Premixen und Mischfuttermitteln können die Wirkstoffe
gegebenenfalls auch durch ihre Oberfläche bedeckenden geeigneten Mittel, z. Bo mit
nichttoxischen Wachsen oder Gelatine vor Luft, Licht und/oder Feuchtigkeit geschützt
werden.
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Beispiel für die Zusammensetzung eines fertigen Mischfütters, für
Geflügel, das einen erfindungsgemäßen Wirkstoff enthält: 200 g Weizen, 340 g Mais,
360,3 g Sojaschrot, 60 g Rindertalg, 15 g Dicalciumphosphat, 10 g Calciumcarbonat,
4 g jodiertes Kochsalz, 7,5 g Vitamin-Mineral-Mischung und 3,2 g Wirkstoff-Premix
ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.
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Die Vitamin-Mineral-Mischung besteht aus: 6000 I.E. Vitamin A, 1000
I.E. Vitamin D3, 10 mg Vitamin E, 1 mg Vitamin K3, 3 mg Riboflavin, 2 mg Pyridoxin,
20 mcg Vitamin B12, 5 mg Calciumpantothenat, 30 mg Nikotinsäure, 200 mg Cholinchlorid,
200 mg Mn S04 x H20, 140 mg Zn S04 x 7H20, 100 mg Fe S04 x 7H20 und 20 mg Cu SO4
x 5H20.
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Der Wirkstoff-Premix enthält z. B. l-Desoxynojirimycin in der gewünschten
Menge, z. B. 1600 mg und zusätzlich 1 g DL-Methionin sowie so viel Sojabohnenmehl,
daß 3,2 g Premix entstehen.
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Beispiel für die Zusammensetzung eines Schweinemischfutters, das einen
Wirkstoff der Formel I enthält: 630 g Futtergetreideschrot (zusammengesetzt aus
200 g Mais-, 150 g Gerste-, 150 g Hafer - und 130 g Weizenschrot), 80 g Fischmehl,
60 g Sojaschrot, 58,8 g Tapiokamehl, 38 g Bierhefe, 50 g Vitamin-Mineral-Misc.hung
für Schweine (Zusammensetzung, z. B. wie beim Kükenfutter) 30 g Leinkuchenmehl,
30 g Maiskleberfutter, 10 g Sojaöl, 10 g Zuckerrohrmelasse und 2 g Wirkstoff-Premix
(Zusammensetzung z. B. beim Kükenfutter) ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg
Futter.
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Die angegebenen Futtergemische sind vorzugsweise zur Aufzucht und
Mast von Küken bzw. Schweinen abgestimmt, sie können jedoch in gleicher oder ähnlicher
Zusammensetzung auch zur Aufzucht und Mast anderer Tiere verwendet werden.
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Die Inhibitoren können einzeln oder aber auch in beliebigen Mischungen
untereinander verwendet werden.
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Beispiel 1 Eine Saccharaseeinheit (SE) ist die Menge an Enzym, die
in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 /uMol Saccharose in
Glucose und Fructose spaltet9 Die /uMol gebildete Glucose werden mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion
quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Saccharosespaltung
durch die Saccharase nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden
0,05 ml einer auf 0,12 SE eingestellten Saccharaselösung 1) mit O - 20/ug Inhibitor
und mit 0g1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf 0,1 ml aufgefüllt Es wird 10 Minuten
bei 350C äquilibriert und dann mit 091 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 versetzt.
Man inkubiert 20 Minuten bei 35 0C und stoppt die Saccharasereaktion durch Zugabe
von 1 ml Glucoseoxidasereagens ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 350C. Danach
wird 1 ml 50 % H2S04 zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert
gemessen. Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Saccharase
berechnet und der 50 % Hemmpunkt grafisch bestimmt.
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1) Solubilisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström,
A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12, (1958), Seite 1997. Mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer
pH-,O auf entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.
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2) Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösen von 2 mg Glucoseoxidase
(Fa. Boehringer, Reinheitsgrad I) in 100 ml 0,565 m Tris-HCl-Puffer pH 7,0 und anschließenden
Zusatz von 1 ml Detergenslösung (2 g Triton X-100 + 8 g 95 % Äthanol p. a.), 1 ml
Dianisidinlösung (260 mg o-Dianisidin 2 2 HC1 in 20 ml H O) und 0,5 ml 0,1 96Bier
wäßriger Peroxidaselösung (Fa. Boghringer, Lyophilisat, Reinheitsgrad I) hergestellt.
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Hemmung verschiedener Glucosidasen durch Nojirimycin und Desoxynojirimycin
(Konzentrationen, bei denen die Enzyme zu 50 % gehemmt werden)
| dc-Glucosidasen B-Glucosi- |
| dasen |
| Saccharase Glucoamy- Takadi- Emulsin |
| lase 1) astase 1 1) |
| Nojirimycin 1.5 x 10-7 3.2 x 10-5 ca.10-2M 7.9 x 10-6M |
| M |
| Desoxynojiri- 1.75x 10-7 nicht ge- nicht ge- 2.5 x 10-2M |
| mycin testet testet |
1) aus T. Niwa et al., Agr.Biol.Chem. 34, 966 (1970)