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"Verfahren zur automatischen Bestimmung
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intra- und/oder extra- cellulärer Stoffe unter Verwendung eines automatischen
Aufschluß-Systems und einer integrierten Zentrifugal stufe und Vorrichtung zur Durchführung"
Die
Kontrolle, Optimierung und Steuerung biotechnologischer Prozesse, insbesondere solche,
die mit dem mikrobiellen Wachstum verknüpft sind, erfordern die laufende Messung
der Konzentrationen intra- und extrazellulärer organischer und anorganischer Substrate,
Produkte und Intermediärmetaboliten.
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Soweit nach dem Stand der Technik Vorrichtungen zur Bestimmung intra-
und extrazellulärer Stoffe bekannt sind, bedürfen diese eines manuellen Probetransfers
vom Reaktor zum Analysensystem und zur Bestimmung intrazellulärer Stoffe zusätzlicher
Manipulationen wie einen Zellaufschluß und einer Abtrennung der extrahierten Organismen
in einer Zentrifuge.
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Diese Vorrichtungen haben den Nachteil, daß vor der sterilen Probenahme
bis nach der Zentrifugation zeitaufwendige, arbeitsintensive, längere und schwierig
reproduzierbare Arbeitsschritte notwendig sind.
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Es wird dadurch die Analysenfrequenz und die Reproduzierbarkeit verringert,
besonders für Metaboliten mit hohen Umsatzraten in der Zelle, die bei manueller
Probenahme und Probeaufbereitung stärkere Konzentrationsänderung erleiden.
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Durch das Verfahren der Erfindung werden diese Nachteile vermieden.
Das Verfahren der Erfin-
dung bestimmt dagegen intra- und extrazellulärer
Stoffe voll automatisch durch sterile Probenahme am Bioreaktor, Probetransport,
Zellaufschluß und Test/Flüssigtrennung.
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Es wurde nun ein Verfahren zur automatischen Bestimmung intra-und/oder
extracellulärer Stoffe unter Verwendung eines automatischen Aufschluss-Systems und
einer integrierten Zentrifugierstufe gefunden, welches durch folgende Verfahrensstufen
gekennzeichnet ist: (1). aus einer Zellsuspension wird eine homogene Probe über
ein Dreiwegventil in den unsterilen Bereich gefördert, entflockuliert und entgast
und gegebenenfalls größere Teilchen abgetrennt, (2). danach erfolgt in bekannter
Weise momentan eine Inaktivierung sämtlicher oder bestimmter Enzyme der Probe, (3).'
danach werden die zu bestimmenden Inhaltsstoffe mechanisch,oder thermisch oder chemisch,
oder physikalisch in Lösung gebracht, (4). danach wird die Suspension mittels einer
periodisch betriebenen zonalen Zentrifuge einer fest-flüssig Trennung unterworfen,
wobei die folgenden Stufen durchlaufen werden: (4.1).Beschicken der Zentrifuge,
(4.2).Zentrifugation, (4.3).Entnahme der flüssigen Phase nach Stillstand der Zentrifuge,
(4.4).Resuspension
der festen Phasen durch Aufspritzen einer flüssigen Phase bei verringerter Drehzahl
der Zentrifuge und Austragen dieser Phase nach Stillstand, (5).danach der in Stufe
(4.3) in Lösung erhaltene Stoff in bekannter Weise quantitativ bestimmt wird.
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Weiter wurde ein Verfahren zur automatischen Bestimmung intraund/
oder extra-cellulärer Stoffe unter Verwendung eines automatischen Aufschluß-Systems
und einer integrierten Zentrifugierstufe, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß
zur Bestimmung extracellulärer Stoffe die Stufen((l), gegebenenfalls (2), danach
die Stufen (4) und (5) nach dem Verfahren nach Anspruch 1 durchlaufen werden. Ferner
wurde ein Verfahren zur automatischen Bestimmung intra-und/oder extracellulärer
Stoffe unter Verwendung eines automatischen Aufschluß-Systems und einer integrierten
Zentrifugierstufe, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß zur Bestimmung intracellulärer
Stoffe, die eine vorhergehende Abtrennung störender extracellulärer Stoffe erfordert,
die Stufen (1), gegebenenfalls (2), danach die Stufen (4) und (3) und nochmals die
Stufe (4) und danach die Stufe (5) nach dem Verfahren nach Anspruch 1 durchlaufen
werden.
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Ferner wurde ein Verfahren zur automatischen Bestimmung intra- und/oder
extra-cellulärer Stoffe gefunden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß aus Proben
unter sterilen Be-
dingungen arbeitenden Reaktoren das Dreiwegventil
mit geringem Totvolumen in geschlossenem Zustand zur sterilen Probeentnahmestrecke
von einer desinfizierenden und reinigenden Flüssigkeit durchströmt wird.
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Weiter wurde ein Verfahren gefunden, welches dadurch gekennzeichnet
ist, daß die homogene Probe innerhalb von 0,1 bis 10 sec vom Zeitpunkt des Eintritts'in
die Probeentnahmestrecke bis zum Inaktivierungsschritt entnommen wird.
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Ferner wurde ein Verfahren gefunden, welches dadurch gekennzeichnet
ist, daß zur Bestimmung von Metaboliten die Inaktivierung von Enzymen durch thermische
Denaturierung durch Erhöhung der Temperatur innerhalb von 0,2 bis 5 sec auf 60d
bis 95° C erfolgt und daß bei thermolabilen Stoffen die Inaktivierung der Enzyme
durch Zusatz von chemischen Agentien erfolgt und dadurch, daß in Stufe (4.4) zur
Resuspendierung Wasser oder ein wässriges Puffersystem, gegebenenfalls unter Zusatz
oberflächenaktiver Stoffe, verwendet werden.
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Ferner wurde ein Verfahren gefunden, welches dadurch gekennzeichnet
ist, daß die Probe durch ein axiales Innenrohr eines Doppelmantelrohres eingeführt
und durch dieses die flüssige Phase bzw. die resuspendierte feste Phase ausgeführt
und im kürzeren Außenrohr die zur Resuspendierung verwendete flüssige Phase eingeführt
wird und daß zur Steigerung der Frequenz der zu bestimmenden Stoffe die Stufen (1),
(2), (3) durchlaufen, danach die Stufe (4) mit zwei oder mehreren zonalen Zentrifugen
betrieben und danach die Stufe (5) durchlaufen wird.
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Es wurde auch eine Vorrichtung zur Durchführung
des
Verfahrens zur automatischen Bestimmung intra- und /oder extra-cellulärer Stoffe
unter Verwendung eines automatischen Aufschluß-Systems und einer integrierten Zentrifugierstufe
gefunden, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Kaskadenkapillarrohr (1) bestehend
aus einem Rohr mit einer sinusförmigen Innenwand (2) mit 3- 10 Amplituden auf einer
Länge von 2- 10 cm mit einem kleinsten Innendurchmesser (3l,2...n) von 0,1 bis 0,5
mm und einem größten Innendurchmesser (41,2...n) von 0,8 bis 5 mm zur Entflockulierung
der durchströmenden Probe verwendet wird und dadurch daß die obere und untere Innenwand
(5) des Rotors (6) der zonalen Zentrifuge (7) einen Winkel zwischen 20 und 500 zur
Drehachse (8) aufweist und der Innendurchmesser (9) maximal 15 cm beträgt, wobei
die Spitzen (10) der Winkel gerundet sind und die Winkel gegebenenfalls eine rauhe
oder gerippte Oberfläche aufweisen und die Ablauffläche glatt ist.
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Unter automatischen Aufschlußsystem versteht der Fachmann, daß aus
Organismen (Bakterien, Hefen, Pilzen, pflanzliche und tierische Zellen) in Submerskulturen
intrazelluläre Stoffe, gegebenenfalls nach Austausch oder Verdünnung des sie umgebenden
wässrigen oder nichtwässrigen Mediums durch bekannte Verfahren wie Ultraschall,
erhöhte Schubspannungen, erhöhte Temperaturen, enzymatisch oder chemisch vollständig
oder teilweise, jedoch in reproduzierbaren Anteilen in das Medium in Lösung oder
Suspension gebracht werden.
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Unter homogener Probe nach dem Verfahren der Erfindung Stufe (l) wird
ein repräsentatives Teilvolumen einer Zellsuspension beispielsweise aus
einem
Reaktor verstanden.
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Die Abtrennung größerer Teilchen nach Stufe (1) des Verfahrens der
Erfindung wird im allgemeinen durch ein rückgesptiltes Filter mit kleinem Totvolumen
erreicht. Die Entflockulierung erfolgt beispielsweise durch ein Kaskadenkapillarrohr,
so daß die durch eine Pumpe durch die Kapillaren geförderte Probe Schubspannungen
einer bestimmten Größe unterworfen wird, die die flockulierten Bakterien und Hefen
reversibel homogenisiert und praktisch den Aggregationszustand soweit herabsetzt,
daß repräsentative TeilstrÖmez für die weitere Analyse gewonnen werden können.
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Weiterhin läßt sich in geeigneten Photometern mit Durchflußküvette
in diesem Teilstrom in bekannter Weise die Trübung der Suspension messen, ohne daß
durch Flockenbildung das Signal stark verrauscht ist und eine reproduzierbare Beziehung
zum Feststoffanteil nicht mehr gegeben ist.
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Nach dem Verfahren der Erfindung werden in den Stufen (1) bis (5)
sowohl intra- wie auch extrazelluläre Stoffe in der flüssigen Phase aus der (Stufe
4.3) bestimmt. Wenn hierbei intra- und extrazellulärer Stoff identisch sind, wird
deren Summe bestimmt, sind diese qualitativ verschieden, so werden diese durch verschiedene
Analysensysteme getrennt bestimmt.
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Das Verfahren der Erfindung wird beispielsweise an der quantitativen
Bestimmung intrazellulären Adenosintriphosphats wie folgt beschrieben und durch
die Figuren 1 bis 3 erläutert.
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Aus einem Bioreaktor wird eine Probe entnommen, bestehend aus einer
Suspension von dem Bakterium Methylomonas sp. DSM 580 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen,
Göttingen), einer anorganischen Nährsalzlösung in Wasser und Methanol (0,2 bis 5
% g/v) und Luft. Die Probe wird über ein 3-Wege-Magnetventil (V) aus dei sterilen
Bereich des Reaktors in den unsterilen Bereich mittels einer peristaltischen Pumpe
mit den Kanälen (1) und (K2) gefördert.
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Das 3-Wege-Magnetventil (VB) wird über einen Zeitschalter in Arbeits-
und Pausenzeiten elektrisch gesteuert. Während der Pausenzeit ist das 3-Wege-Magnetventil
(V) zum Bioreaktor hin geschlossen und über den freien Weg wird zum Analysensystem
aus einer Vorlage eine wässrige Desinfektionslösung mit denselben Kanälen (K1) und
(K2) der Schlauchpumpe gefördert, wodurch in der Arbeitszeit die Probe in einem
weitgehend sterilen Bereich ohne Wandbewuchs eintritt.
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Nach dem Ventil (V) durchströmt die Probe zur Entflockulierung ein
Kaskadenkapillarrohr (CCT 0.4) mit einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/Min.
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Danach wird der Probestrom in einem kombinierten Luftabscheider, bestehend
aus den Fittings (C5) (Firma Technicon, Bad Vilbel) entgast, indem durch den Kanal
(K1) ein Teilstrom gefördert wird.
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In einer weiteren Verfahrensstufe wird die entgaste und entflQckulierte
Probe über den Fitting (A 10) und ein weiteres 3-Wegeventil (V1) durch eine mit
Preßluft angetriebene Pi-
pette (PIP) gefördert. Durch die Pipette
(PIP) wird die Probe anschließend über das 3-Wegeventil (V2) und einen Röhrenwärmeaustauscher
(5t) befördert, in dem die Probe innerhalb 1 sec auf 900C erhitzt wird. Dadurch
werden sämtliche Enzyme rasch inaktiviert. In der 3. Verfahrensstufe wird zur Extraktion
des Adenosintriphophats aus den Zellen die Probe in einem Gefäß (20 ml), welches
auf 95°C temperiert ist, gesammelt. Zur vollständigen Extraktion werden über Umschaltung
des 3-Wegeventils (V1) durch die Pipette (PIP) auf demselben Wege eine Pufferlösung
(2 x 5 ml) in das Extraktionsgefäß (hef) mit der Probe vereinigt. Dadurch wird ein
konstantes Verdünnungsverhältnis von 1,00 : 2,00 (Probe/Pufferlösung) erreicht.
Die Pufferlösung ist 0,02 M Trishydroxymethyl -(aminomethan)-hydrochlorid, 0,02
M Magnesium-sulfat, pH 7.4 in Wasser. Zum Vorspülen der Pipette fördert diese 3
Kolben Volumina Probe und verwirft diese über 3-Wegeventil (V2).
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In der 4. Verfahrensstufe wird die extrahierte Probe über die beiden
3-Wegeventile (V3) und (V4j und Kanal (K3) der peristaltischen Pumpe durch das axiale
Innenrohr (11) eines Doppelmantelrohrs {12) in den Rotor (6) der Zentrifuge ( )
überführt und 5 min bei 8000 g zentrifugiert.
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Nach Stillstand der Zentrifuge (Z) wird das Ventil (V4) zur Zentrifuge
hin geschlossen und Ventil (V3) umgeschaltet, so daß der Kanal (K3) der Pumpe Luft
fördert. Die 3-Wegeventile (V 5) und (V 6) werden so geschaltet, daß der klare Oberstand
aus der Zentrifuge (Z) durch das innere Rohr (11) uber
Kanal (K4)
der Schlauchpumpe zum analytischen System der Verfahrensstufe ( 5) gefördert wird.
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Nach Entnahme der flüssigen Phase (klarer Uberstand) aus dem Rotor
(6) wird über das Ventil (V8) durch zwei Düsen (14) des Doppelmantelrohres (12)
Wasser (20 ml) in die Winkel (10) des Rotors (6) auf die in den Winkeln (10) haltende
feste Phase gespritzt, während die Zentrifuge (Z) mit verringerter Drehzahl (600
UpM) dreht.
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Dadurch wird die feste Phase resuspendiert und wird nach Stillstand
des Rotors, Umschalten des Ventils (V5) verworfen. Während dieser Zeit wird durch
Umschalten des Ventils (V6) über Kanal (K4) der Schlauchpumpe Luft gefördert.
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In der Verfahrensstufe 5 wird in bekannter Weise mittels der Luciferin-Luciferase
Methode der Gehalt der Probe an Adenosintriphosphat quantitativ bestimmt.
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Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren der Erfindung können mit
den offenbarten Verfahrensstufen in geänderter Reihenfolge extrazelluläre Stoffe
wie z. B. Antibiotika oder Enzyme rund intrazelluläre Stoffe wie z. B. Metaboliten,
Enzyme, Nucleinsäuren und anorganische Stoffe bestimmt werden.
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Das Verfahren der Erfindung bietet die technischen Vorteile, daß vollautomatisiert
eine schnelle Probeentnahme und Probeaufbereitung mit hoher Genauigkeit durchgeführt
werden kann. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß mittels des Verfahrens
eine
Prozeßanalytik durchgeführt werden kann, die bei der Prozeßoptimierung eine Steuerung
des Wachstums und der Produktbildung gestattet.
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Es wird dadurch möglich, durch Variation der äußeren Parameter direkt
in den Energie- und Zell stoffwechsel regelnd einzugreifen.
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