DE60112604T2

DE60112604T2 - Schrittweiser prozess zur wiederherstellung oder beseitigung biologischer substanzen durch flotation aus einem zugrundeliegenden kolloidalen medium

Info

Publication number: DE60112604T2
Application number: DE60112604T
Authority: DE
Inventors: Hakan Pertoft; Borje Norling
Original assignee: Amersham Bioscience AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 2000-11-22
Filing date: 2001-11-21
Publication date: 2006-06-08
Anticipated expiration: 2021-11-22
Also published as: US20040038356A1; ATE301830T1; ES2249494T3; CA2428041A1; DE60112604D1; AU2002223035A1; CA2428041C; EP1336088B1; JP2004514548A; WO2002042767A2; WO2002042767A3; EP1336088A2; JP4684533B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur diskontinuierlichen Dichtegradientenzentrifugation zum Trennen eines Minimums von zwei Substanzen in einer Probe. In dem Verfahren wird von einem kolloidalen Dichtemedium und Niedrig-Dichte-Lösungen Gebrauch gemacht.
Hintergrund der Erfindunq
Die Trennung von Zellen und zellulären Komponenten ist ein wichtiges Werkzeug innerhalb der Grundlagenforschung, wie auch diagnostischen und klinischen Anwendungen. Zum Beispiel ist es oft nötig, Zellen und Mikroorganismen voneinander und von verschiedenen Arten von Proben (z.B. klinische, industrielle, Nahrungsmittel-, Umwelt-, und forensische Proben) auf eine derartige Weise zu trennen, dass sie zum Beispiel für Kultivierung, Impfen, Zellfusion, klinische Therapie und biochemische Analyse verwendet werden können, ohne Interferenz von inhibierenden Aktivitäten der Probe oder inhibierenden Aktivitäten, die während des Trennungsprozesses zugegeben wurden. Diese inhibierenden Aktivitäten können zum Beispiel endogene Antikörper, Proteasen, Nukleasen, Endotoxine und Antibiotika sein. Mikroorganismen, wie Bakterien und Virus, umfassen Gensequenzen, die zu eukariotischen Gensequenzen analog sind, und dies kann zu einem fehlerhaften Ergebnis führen, falls beide von diesen gleichzeitig in einer Probe vorhanden sind.
Um die oben erwähnten Trennprobleme zu lösen, wurde von differenzieller Zentrifugation, Filtration, Affinitätsreinigung und selektiven Kultivierungsmedien Gebrauch gemacht. Dichtemedien, sowohl vom Typ des niedrigen Molekulargewichts (Nycodenz etc.) als auch des kolloidalen Typs (BactX-tractor, Percoll, PureSperm) wurden verwendet. In der Mehrzahl der bekannten Prozesse basiert das Trennen auf der Dichte der inhärenten Komponenten in den verwendeten Dichtemedien nach der Zentrifugation in einem kontinuierlichen Dichtegradienten. Diese Prozesse besitzen den Nachteil, dass unerwünschte Substanzen über den gesamten Gradienten verteilt werden und daher auch in der erwünschten Fraktion.
In der herkömmlichen diskontinuierlichen Dichtegradientenzentrifugation wird die Probe auf die Dichtemedien geladen und die erwünschte Fraktion wird vom unteren Teil der resultierenden unteren Phase wiedergewonnen. Die Zentrifugation wird in einer Winkelzentrifuge ausgeführt, und dies bedeutet, dass die Bakterien oder andere erwünschte Zellen oder Fraktionen, wenn sie auf die Wand des Zentrifugenröhrchens während der Sedimentation treffen, bis auf ihr Dichte-Niveau geschädigt werden können und dies kann zum Tod der Bakterien und dem Freisetzen ihres DNA-RNA-Inhaltes führen. Wenn die Probe auf das kolloidale Medium geladen wird, gibt es ein Risiko der Kontamination der darunterliegenden Phasen. Diese Kontamination beruht teilweise auf Wandeffekten, d.h. die Probe fließt entlang der Röhrchenwand herunter und kann mit darunterliegenden Phasen gemischt werden und zum Teil aufgrund eines zu schnellen, insbesondere anfänglichen Ladens der Probe zu einer Durchmischung mit darunterliegenden Phasen führen. Ungeachtet, ob die gesuchte Fraktion nach der Zentrifugation dadurch wiedergewonnen wird, dass sie durch die obere Phase hindurch angesaugt wird (durch eine Pasteurpipette oder eine Kanüle) oder falls sie wiedergewonnen wird, nachdem die obere Phase weggesaugt worden ist, führt diese Prozedur zu einer Rekontaminierung der erwünschten Fraktion. In dem ersten Fall wird eine mikroskopische Menge Material von der oberen Phase zur unteren Phase durch die Pasteurpipette/Kanüle gebracht. Im letzteren Fall tritt Kontamination auf, weil das Material in der oberen Phase nicht vollständig entfernt werden kann, da es in der Flüssigkeit existiert, die an den inneren Wänden des Röhrchens zurückgehalten wird. Diese Flüssigkeit wird abwärts laufen, wenn die obere Phase angesaugt wird, und wenn die obere Phase entfernt wird, wird diese Flüssigkeit die untere Phase kontaminieren. Ein anderer Nachteil mit diesem Typ der Sedimentationstrennung ist, dass die Ausbeute von Proben, die Material enthalten, die einen Pfropfen (physikalische Barriere) in der Grenzfläche zwischen der oberen und der unteren Phase bilden, nachteilig beeinflusst wird, weil Zellen/Bakterien davon abgehalten werden, nach unten zu sedimentieren. Ein anderer Nachteil mehrerer Dichtegradientenmedien ist ihre inhärente Toxizität, die in vielen Anwendungen hoch unerwünscht ist.
FR 2 561 256 beschreibt ein Verfahren der Reinigung von biologischen Teilchen, wie Antigen-Kernteilchen, unter Verwenden einer Flotations-Ultrazentrifugation auf einem Dichtegradienten. Spezieller wird die Probe oben auf einem vorgeformten Dichtegradienten angeordnet, der dann zentrifugiert wird, um das Sammeln der Probe in der oberen Schicht zu ermöglichen, während Kontaminanten etc. zu den unteren Schichten des Gradienten gewandert sind. Vor diesem Reinigungsprozess muss die Probe konzentriert und vorgereinigt werden. Der Dichtegradient wird durch eine niedrigmolekulare Verbindung bereitgestellt, nämlich Cäsiumchlorid. Die g-Kraft, die während der Zentrifugation in diesem Prozess erforderlich ist, beträgt mindestens 20 000 × g. Diese hohe g-Kraft resultiert aus der Natur des Gradienten, bei dem die Sedimentation der Gradientenlösung durch Diffusion gelöster Moleküle in der Richtung entgegensetzt zu jener der Sedimentation ausgeglichen wird, die durch Diffusion von Salz gebildet wird. Es wurde gezeigt, dass Salzgradienten weniger leicht auf exakte Werte als andere Gradienten eingestellt werden können, wie kolloidales Siliciumdioxid. Daher wird der in FR 2 561 256 vorgeschlagene Gradient über die Zeit nicht stabil sein. Außerdem kann der durch derartig kleine Moleküle wie CsCl verursachte osmotische Druck für bestimmte Materialien schädlich sein und auch mit biologischen Materialien wechselwirken und die nativen Eigenschaften der Probe beeinflussen. Demgemäß wird diese Art von Verfahren zur Trennung empfindlicherer biologischer Strukturen, wie Zellen, nicht geeignet sein.
US A 5 437 987 bezieht sich auf einen Tripel-Gradienten-Prozess mit Schwenken von Antikörpern, um als Keim wirkende fötale Zellen aus Mutterblut wiederzugewinnen. Diese Dokument lehrt die Verwendung von mehrfachen Schichten eines Dichtegradientenmediums.
US A 4 927 750 bezieht sich auf einen Zelltrennungsprozess, der Zentrifugation beinhaltet. Diese Dokument beschreibt die Trennung von Zellen aus verschiedenen biologischen Proben und betrifft nicht die Flotation einer oder mehrerer erwünschter Substanzen zu einer obersten Lösung einer niedrigen Dichte.
US A 5 962 237 bezieht sich auf ein Verfahren zum Anreichern seltener Zellen unter Verwenden von Zentrifugation. Die Zentrifugationsschritte können für Anreicherungszwecke wiederholt werden, d.h. während derselben Zeit und derselben g-Kraft. Dieses Dokument lehrt nicht die Flotation verschiedener erwünschter Substanzen.
WO 91 04318A bezieht sich auf eine Trennung verschiedener lebender Zellen unter Verwenden von niedrigmolekularen Lösungen, die ineinander diffundieren und einen kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Gradienten bilden werden.
US A 4 971 801 bezieht sich auf einen Modifizierer einer biologischen Respons umfassend natürliche Membranvesikel und Ribosomen in einem suspendierenden Puffer. Produktisolierung wird beschrieben unter Verwenden von Gradientenzentrifugation. Die erwünschte Fraktion wird pelletiert, d.h. auf dem Boden des Zentrifugenröhrchens gesammelt.
Schließlich wurden auch nicht-ionische Gradientenmedien, z.B. Saccharose-Gradienten auch für die Trennung vorgeschlagen. Jedoch ist die Natur von Zuckern, wie Saccharose, den oben diskutierten Salzen ähnlich, und demgemäß werden diese Verfahren dieselbe Art von Nachteilen wie oben erwähnt mit sich bringen, d.h. instabile Gradienten, bei denen die Grenzen mit der Zeit mehr und mehr diffundieren und ein osmotischer Druck, der Mikroorganismen, Zellen, etc. schädigen kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen oder mehrere der oben genannten Nachteile zu vermeiden, durch Bereitstellen eines neuen Verfahrens zur diskontinuierlichen Dichtegradientenzentrifugation, die auf einem neuen Prinzip beruht, nämlich dem Ermöglichen den erwünschten Substanzen, nach einem oder mehreren Zentrifugationsschritten zu flotieren.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur diskontinuierlichen Dichtegradientenzentrifugation bereitzustellen, das ein geringeres Risiko der Kontamination der erwünschten Substanz(en) umfasst, als Verfahren des Stands der Technik. Dies wird durch ein schrittweises Verfahren erreicht, bei dem ein unterer Teil einer zentrifugierten Probe in einen oder mehrere nachfolgende Schritte übergeht, unter Wiederholen derselben Runde von Mischen und Zentrifugation wie in Anspruch 1 definiert, aber bei unterschiedlichen Dichten und bei unterschiedlichen g-Kräften. Da der untere Teil weiter verarbeitet wird, erfordert die tatsächliche Probe kein Pipettieren zwischen Schritten, was einen üblichen Weg der Kontamination eliminiert. Zusätzlich stellt das neuartige schrittweise Verfahren eine überlegende Flexibilität im Vergleich zum Stand der Technik bereit, da eine Reihe von Runden gestaltet werden kann, wobei jede Runde unter Bedingungen ausgeführt wird, die spezifisch Substanzen trennen, die bekannt sind oder die in Verdacht stehen, in der Probe vorhanden zu sein.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1. stellt eine schematische Ansicht des Arbeitsprinzips des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung bereit, unter Nutzen von vier Zentrifugationsschritten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Daher stellt in einem ersten Aspekt der Erfindung ein Verfahren der diskontinuierlichen Dichtegradientenzentrifugation zum Trennen eines Minimums von zwei Substanzen voneinander in einer Probe bereit. Das Verfahren ist durch die nachfolgenden Schritte gekennzeichnet:

(i) Mischen der Probe mit einem hochdichten Medium, um eine spezifische Dichte der Mischung zu erhalten;
(ii) Anordnen a) einer ersten Mischung eines kolloidalen Hochdichtezentrifugationsmediums und der Probe, die die Substanzen enthält, auf dem Boden eines Zentrifugenröhrchens, wobei in der Mischung die Dichte definiert ist, b) einer Lösung niedriger Dichte oben auf der Mischung in a)
(iii) Zentrifugieren des Röhrchens derart unter einer spezifisch definierten g-Kraft, dass der/den erwünschte(n) Substanz(en) oder dem/den gelöste(n) Stoff(en) in der Probe ermöglicht wird, zu der Niedrigdichtelösung zu schwimmen, während (eine) andere Substanz(en) in der Probe in dem unteren dichteren Medium bleibt/bleiben,
(iv) getrenntes Sammeln der erwünschten Substanz(en),

Wie oben erwähnt, kann die oben beschriebene Runde der Schritte (i)-(iv) wiederholt werden, wie ein, zwei, drei oder eine beliebige Anzahl von Malen, umfassend eine zweite, dritte, vierte etc. Mischung einer definierten Dichte und zentrifugiert bei einer zweiten, dritten, vierten etc. g-Kraft. Der Fachmann auf diesem Gebiet kann die geeigneten Kombinationen von g-Kräften und Dichten basierend auf den Dichten der Substanz(en), die von der Probe getrennt werden soll(en), auswählen. Eine derartige systematische Variation von g-Kräften wurde im Zusammenhang mit Dichtegradientenzentrifugation im Stand der Technik nicht vorgeschlagen. Auch waren die Vorteile des Verwendens eines kolloidalen Zentrifugationsmediums zu diesem Zweck ziemlich unerwartet, da ein Verfahren, das gemäß der vorliegenden Erfindung gestaltet ist, Reinheiten bereitstellen kann, die den Ergebnissen der Verfahren des Stands der Technik, die auf die breite Vielfalt von Proben angewandt wurden, für die die vorliegende Erfindung nützlich ist, überlegen sind.
In einer Ausführungsform wird ein kolloidales Dichtegradientenzentrifugationsmedium einer geringeren Dichte als die Mischung in a) zwischen der Mischung in a) und der Niedrigdichte-Lösung in b) angeordnet. Dies ergibt eine extra Barriere zwischen der gemischten Probe und der Niedrigdichte-Lösung und verbessert und vereinfacht das Wiedergewinnen nach der Trennung. In dem vorliegenden Kontext bezieht sich der Begriff „diskontinuierlich" auf ein sukzessives Schichten von Lösungen unterschiedlicher Dichte, z.B. in einem Zentrifugenröhrchen.
Die kolloidale Natur des Zentrifugationsmediums ist ein wesentliches Merkmal der Erfindung und wird Vorteile bereitstellen, wie eine stark verbesserte Stabilität des Dichtegradienten. Das verwendete Zentrifugationsmedium gemäß der Erfindung sollte ein schweres Medium sein, wie ein kolloidales, auf SiO₂ basierendes Material. Das Medium sollte inert sein, bei Vorhandensein seines Salzes autoklavierbar sein, einen niedrigen oder keinen Endotoxingehalt, einen osmotischen Druck so niedrig wie möglich, bevorzugt unter 20 mOsm/kg, eine niedrige Viskosität in Salz (< 5cP), bei hoher Dichte (> 1,3 g/ml; RG) besitzen. Ein repräsentatives Beispiel eines geeigneten Mediums ist ReadyGrade^® (im Allgemeinen als RG bezeichnet und erhältlich von Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden). Alternativ können SiO₂-Teilchen von kommerziellen Quellen gekauft werden, wie Naycol und gemäß gut bekannter Techniken durch den Verwender silanisiert werden. Die einzigartigen Eigenschaften des Mediums machen es möglich, die nativen Eigenschaften der Substanzen nach der Trennung beizubehalten. Weitere Details in Hinblick auf das Medium werden unten angegeben. Demgemäß ist die vorliegenden Erfindung im Vergleich zum Stand der Technik vorteilhaft, da sie Kosten auf einen wesentlichen Grad verringern kann.
Die Lösung in b) ist bevorzugt eine wässrige Lösung, wie eine Pufferlösung.
Die Dichte in a) ist höher als jene der erwünschten zu trennenden Substanz(en). Im vorliegenden Kontext wird der Fachmann verstehen, dass die Begriffe „Niedrigdichte" und „Hochdichte" im Verhältnis zueinander verwendet werden und es nicht beabsichtigt ist, sie mit irgendwelchen anderen Dichten zu vergleichen. Veranschaulichende Dichten werden unten angegeben.
Im Verfahren der Erfindung werden die Schritte (i)-(iv) einmal oder mehr wiederholt, abhängig davon, nach welcher Substanz gesucht wird oder welche Kontaminanten entfernt werden sollen. Die g-Kraft im/in den Zentrifugationsschritt(en) und die Dichte des kolloidalen Mediums werden gemäß der zu trennenden Substanz(en) variiert.
Die erwünschte(n) zu trennenden Substanz(en) ist/sind Zellen, Mikroorganismen, Virus, und Bruchteile davon, Nucleinsäuren und beliebige Proteine. Vor der Zentrifugation wird die Probe zu einer Mischung mit dem Medium verarbeitet, um eine geeignete Dichte davon bereitzustellen. Die Probe kann praktisch beliebigen Ursprungs sein, wie eine biologische Probe, z.B. Zellen, Blut etc. Fäkalien, z.B. um auf Nahrungsmittelvergiftung, wie Salmonellen-Bakterien, Nahrungsmittel, Proben, die zum Analysieren der Umwelt nützlich sind, z.B. in Verdacht stehende Verunreinigungen oder genetisch manipulierte Organismen etc., zu testen. Demgemäß ist ein großer Vorteil des vorliegenden Verfahrens, dass es auf viel komplexere Proben als der Stand der Technik anwendbar ist. Die Erfindung kann innerhalb eines weiten Bereiches von Gebieten angewandt werden, wie für klinische Analysen, forensische Medizin, Routinetests und viel mehr. Ein paar spezifische Gebiete, in denen das vorliegende Verfahren speziell vorteilhaft ist, werden im letzten Absatz der vorliegenden Beschreibung beschrieben.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform des Verfahrens wird/werden die erwünschte(n) Substanz(en) vor der Zentrifugation derivatisiert, um die Trennung zweier Substanzen ähnlicher Dichte zu verbessern. Ein Beispiel dafür ist es, die erwünschte(n) Substanz(en) mit einem Affinitätsreagenz zu behandeln, das mit einem Hoch- oder Niedrigdichteteilchen verknüpft ist, wie mit mAb beschichtete Kügelchen einer geeigneten Dichte.
In einer spezifischen Ausführungsform ist das oben beschriebene Verfahren spezifisch angepasst, um unterschiedliche Zelltypen, wie X- and Y-Spermazellen, voneinander in einer Probe auf der Basis ihrer Schwebedichte, Form, Permeabilität, Bewegung und/oder Viskosität in einem Dichtegradientenmedium durch Zentrifugation zu trennen. Das Verfahren umfasst die nachfolgenden Schritte gemäß Anspruch 1, wobei die Probe eine Samenprobe ist und die erwünschten Substanzen die getrennten Zellen sind.
Obwohl sogar im Prinzip ein beliebiges Dichtemedium, das zum Bilden der oben erwähnten Typen von Gradienten für die X- und Y-Sperma-Trennung verwendet werden könnte, ist das Dichtemedium dieser Ausführungsform die Art von kolloidalem Dichtemedium, die oben diskutiert wurde.
Die Probe wird mit Hochdichtemedium gemischt und ggf. wird das Medium in Schritt A) zentrifugiert, um einen Dichtegradienten zu bilden, bevor die Probe in das Zentrifugenröhrchen hineingegeben wird. Der Gradient ist bevorzugt sehr flach oder im Wesentlichen planar, d. h. er umfasst eine sehr kleine Dichte-Differenz im Zentrifugenröhrchen, mindestens am Zentrum des Gradienten.
In dieser Ausführungsform ist der Gradient diskontinuierlich. Es ist wichtig, dass der Gradient die notwendige Trennung bereitstellt, was bedeutet, dass es möglich sein sollte, Fraktionen wiederzugewinnen, bei denen X- bzw. Y-Sperma auf mindestens 70 % oder mehr, bevorzugt 100 % angereichert wird.
Gegebenenfalls wird die Samenprobe vor der Trennung gereinigt. Diese Reinigung kann auf eine beliebige erwünschte Weise stattfinden, wie durch diskontinuierliche Zentrifugation.
Wenn die Probe vom Kalb stammt, ist die oben genannte Dichte nahe jener der X- und Y-Spermazellen, d. h. ungefähr 1,120 g/ml. Die entsprechenden Werte für menschliche Zellen sind im Wesentlichen dieselben. Diese Dichten sind unter den experimentellen Bedingungen anwendbar, die unten im experimentellen Teil erwähnt werden. Die vorliegende Erfindung bezieht sich nicht auf Zentrifugationen, während denen menschliche X- bzw. Y-Spermazellen Dichten besitzen, die um 1,185 g/ml zentriert sind.
In dem oben angegebenen Verfahren kann die Trennung verbessert werden durch Manipulieren der Dichte von X- und Y-Spermazellen, z. B. durch Ändern des pH, der Leitfähigkeit der Probe und/oder des Mediums. Die Manipulation kann das Quellen lassen von X- und Y-Spermazellen umfassen.
Die ganzen oben erwähnten Zentrifugationen zur Trennung von X- und Y-Zellen voneinander in einem Dichtegradienten, wie oben definiert, werden abhängig von der Wahl der Gradientenlösung, der Gradientenform, des Zentrifugenrotors, der Zentrifugationszeit, der g-Kraft bei bekannten Viskositäten, Osmolarität und Konzentrationsniveaus ausgeführt werden.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Trennen wie oben, wobei die Probe mit dem Medium gemischt wird, um eine Dichte des gemischten Proben-Mediums zu erreichen, die nahe der Dichte der X- und Y-Spermazellen liegt. In diesem Fall wird die Trennung hauptsächlich durch isopyknische Zentrifugation erreicht. Das Trennungsmuster, das in dieser Variante der Erfindung erhalten wird, wird daher bevorzugt auf den unterschiedlichen Schwebedichten der Spermazellen basieren.
Das kolloidale Dichtegradientenmedium umfasst eine Suspension von Teilchen mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 2-40nm, bevorzugt ein hydratisiertes Teilchen von 10-30 nm.
Bevorzugt sind die Teilchen derivatisierte SiO₂-Teilchen, bevorzugter silanisierte SiO₂-Teilchen.
Detaillierte Beschreibung der Zeichnug:
1 stellt eine schematische Ansicht des Arbeitsprinzips des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung dar. Im in der Zeichnung gezeigten Beispiel wurden vier Zentrifugationsschritte ausgeführt. Die Anzahl von Zentrifugationsschritten und die g-Kraft wird gemäß der Natur der zu trennenden Substanzen variiert.
Experimenteller Teil
Die Erfindung wird nun im Zusammenhang mit den unten angegebenen Beispielen beschrieben, die nicht als den Umfang der vorliegenden Erfindung, wie sie durch die angefügten Ansprüche definiert ist, beschränkend interpretiert werden sollen.
Allgemeine, veranschaulichende, nicht-beschränkende Beschreibung:
Die Probe, gemischt mit RG (ein Beispiel eines kolloidalen Mediums gemäß der Erfindung) auf eine Dichte von 1,057 g/ml, wird auf dem Boden eines Zentrifugenröhrchens angeordnet, wird ggf. mit RG mit einer Dichte von 1,030 g/ml überlagert und darauf wird eine Lösung von 0,150 M NaCl aufgebracht. Danach wird das Röhrchen 1 bis 5 Minuten bei 10.000 × g_av (1, 1) zentrifugiert. Die resultierende untere Phase, resuspendiert und gemischt mit RG auf eine Dichte von 1,200 g/ml, wird auf dem Boden eines neuen Zentrifugenröhrchens angeordnet, ggf. mit RG mit einer Dichte von 1,090 g/ml überlagert und darauf wird eine Lösung von 0,150 M NaCl aufgebracht. Dann wird das Röhrchen für 1 bis 5 Minuten bei 1.000 × g_av zentrifugiert. Beliebige Zellen und Protozoen von der Probe werden in der obersten Phasenschicht wiedergewonnen (2, 1). Die resultierende untere Phase wird resuspendiert und in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt, wird ggf. mit RG mit einer Dichte von 1,130 g/ml überlagert und darauf wird eine Lösung von 0,150 M NaCl aufgebracht. Dann wird das Röhrchen 1 bis 5 Minuten lang bei 10.000 × g_av zentrifugiert. Beliebige Bakterien von der Probe werden nun in der obersten Phasenschicht (3, 1) wiedergewonnen. Die resultierende untere Phase wird resuspendiert und in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt, ggf. mit RG mit einer Dichte von 1,130 g/ml überlagert und darauf wird eine Lösung von 0,150 M NaCl aufgebracht. Dann wird das Röhrchen 1 bis 5 Minuten lang bei 50.000 × g/_av zentrifugiert. Alle Viren der Probe werden nun in der obersten Phasenschicht wiedergewonnen (4, 1).
Durch Anordnen der Probe, gemischt mit RG, auf dem Boden des Zentrifugenröhrchens werden, im Gegensatz zu den bekannten Techniken, alle Kontaminationsprobleme, die mit der Anwendung einer heterogenen Probenlösung oben auf einer anderen Lösung zusammenhängen, vermieden.
Gemäß des neuen Verfahrens der Erfindung schwimmt das leichte Dichte-Material in der Probenmatrix in Schritt 1 (1). Dies bedeutet, dass die Zellen/Mikroorganismen nicht länger durch einen möglicherweise gebildeten Pfropfen sedimentieren müssen, sondern sie werden in diesem Schritt wegen ihrer Dichte (ρ > 1,057) in der unteren Phase bleiben. Daher wird der durchschnittliche hydrostatische Druck, der aus der Zentrifugation folgt, höher sein als in den Techniken des Stands der Technik. Dies beruht darauf, dass die Entfernung zum Rotationszentrum länger ist, wenn sich die Probe im unteren Teil des Röhrchens befindet, im Vergleich dazu, wenn die Probe auf das obere Ende geladen wird. Diese Tatsache trägt zu einer verbesserten Ausbeute verglichen mit dem Stand der Technik bei, wenn die vorliegende Erfindung eingesetzt wird.
In den Schritten 2, 3 und 4 (1) schwimmen erwünschte Zellen, Bakterien und Viren aus der darunter liegenden Probenphase und werden günstigerweise aus der obersten Phasenschicht wiedergewonnen. Hierdurch werden alle Manipulationen mit der Probenphase vermieden, und daher wird die Rekontamination mit z. B. Inhibitor-Aktivitäten von der Probenlösung eliminiert.
Da die Probe, die Zellen/Mikroorganismen enthält, im unteren Teil des Zentrifugenröhrchens in jedem Zentrifugationsschritt angeordnet ist, wird die Sedimentation der Zellen/Mikroorganismen in Richtung der Wand oder des Bodens des Röhrchens vermieden. Dies verringert die Zell-Schädigungsfrequenz und vergrößert die Ausbeute im Vergleich zu den Techniken des Stands der Technik.
Mit diesem neuen Verfahren wurde es auch möglich, Viren durch diskontinuierliche Dichtezentrifugation zu reinigen. In Techniken des Stands der Technik wurden zu große kolloidale Teilchen im Dichtemedium verwendet. Die Teilchen sedimentierten so schnell wie die viralen Teilchen bei den höheren g-Kräften, die für die Sedimentation/Flotation des Virus benötigt werden, und lösten dadurch die Phasengrenzen auf. Auch war die Dichte der bekannten Dichtemedien zu gering, um das Mischen der Probe und des Mediums zu einer Dichte von 1,200 g/ml zu ermöglichen, was ein Erfordernis für diese Trennung ist.
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um die Erfindung zu veranschaulichen, aber sie nicht zu begrenzen.
Beispiel 1 – Detektion von E. coli in Hackfleisch
Zu 10 g örtlich erworbenem Hackfleisch wurden 90 ml 0,15 M NaCl zugegeben, und dann wurde die Probe homogenisiert. Variierende Mengen von E. coli (10⁴, 10³, 10², 10¹) in 50 μl 0,15 M NaCl wurden mit 0,5 g homogenisierter Probe (= Spike-Proben) bzw. 0,45 ml 0,15 M NaCl (= Kontrolle) gemischt. Die Spike-Proben wurden 30 Minuten lang vor der Verwendung derart stehen gelassen, dass jegliches Binden der Bakterien an die Nahrungsmatrix auftreten konnte. Spike-Proben und entsprechende Kontrollen wurden mit 85 μl RG verschmiert und auf eine Enddichte von 1,057 g/ml gemischt. Die Mischung wurde auf den Boden eines Zentrifugenröhrchens übertragen (1,5 ml), mit 0,5 ml einer RG-Lösung mit einer Dichte von 1,030 g/ml und darauf mit 0,2 ml einer 0,15 M NaCl-Lösung überlagert. Dann wurde Zentrifugation in einer Tafelzentrifuge bei 10.000 × g_av 1 Minute lang ausgeführt. Dann wurde die untere Phase in eine Spritze angesaugt, wodurch die Kanüle zuerst den nicht pipettierbaren Pfropfen, der von der Hackfleischmatrix gebildet wurde, durchdrang, und wurde in ein neues Röhrchen überführt. Es wurde kein sichtbares Pellet beobachtet, aber um irgendwelche mikroskopische Mengen von pelletiertem Material (mit gebundenen Bakterien) zu erhalten, wurden die verbleibenden 100 μl resuspendiert, bevor sie in die Spritze gezogen wurden. Die so erhaltene untere Phase wurde mit 585 μl RG gemischt, um eine Dichte von 1,200 g/ml zu erhalten, dann mit 0,2 ml einer RG-Lösung mit einer Dichte von 1,090 g/ml überlagert und darauf wurden 0,1 ml einer 0,15 M NaCl-Lösung gegeben. Dies wurde 1 Minute lang bei 1.000 × g_av zentrifugiert. Die oberen Phasen wurden mit einer Pasteurpipette angesaugt und abgelassen und dann wurde die untere Phase resuspendiert, in ein neues Röhrchen überführt, mit 0,2 ml einer RG-Lösung mit einer Dichte von 1,130 g/ml und 0,1 ml einer 0,15 M NaCl-Lösung überlagert. Dann wurde eine Zentrifugation bei 10.000 × g_av 1 Minute lang ausgeführt. Die oberen Phasen wurden mit einer automatischen Pipette in drei Portionen von 75 μl fraktioniert und dann analysiert.
Zum Vergleich mit Techniken des Stands der Technik wurden Spike-Proben und Kontrollen auf 0,6 ml einer Percoll^®-Lösung in 0,15 M NaCl, pH 7,40 mit einer Dichte von 1,057 bzw. oben auf 0,6 ml BacXtractor (ρ = 1,057, 0,15 M NaCl, pH 7,40) geladen. Dann wurden die Proben bei 10.000 × g_av zentrifugiert. Die unteren 100 μl der unteren Phase von jeder Probe und Kontrolle wurden in eine Spritze gezogen und analysiert. Für die Bestimmung der Menge von E. coli durch Kultivieren wurden 2 × 10 μl variierender Verdünnungen der verschiedenen Proben auf Platten ausgebreitet. Manuelles Zählen der Kolonien und Berechnen der Menge wurde nach der Inkubation über Nacht ausgeführt. Für die Detektion von E. coli durch eine DNA-Technik wurden 10 μl von jeder Probe in einem PCR-Test verwendet.
Gemäß des Verfahrens der Erfindung betrug die Ausbeute mit den Spike-Proben 80-100% im Vergleich zu 50-80% mit den zwei älteren Techniken. Die Ausbeute in den Kontrollen war etwas geringer in jedem Fall im Vergleich zu den Proben. Dieses Phänomen wurde früher berichtet und beruht sehr wahrscheinlich auf dem Schutzeffekt, den die endogene Flora im Hackfleisch auf die in die Proben gegebenen Bakterien besitzt.
Durch die PCR-Technik konnten so wenig wie 1,3 cfu E. coli pro Reaktionsröhrchen (10 cfu/0,5 g homogenisierte Probe; 200 cfu/g Hackfleisch) unter Verwenden des Verfahrens der Erfindung detektiert werden, während bis herunter auf 10 cfu E. coli pro Analyse (100 cfu/0,5 g homogenisierte Probe; 2.000 cfu/g Hackfleisch) unter Verwenden von Verfahren des Stands der Technik für Dichtegradientenzentrifugation detektiert werden konnten. Eine direkte Analyse ergab keinerlei positive Reaktion. In den Kontrollen konnten 1,3 cfu E. coli pro Reaktionsröhrchen unter Verwenden jeder Technik detektiert werden.
Beispiel 2 – Detektion von E. coli in Fäkalien
Zu 10 g menschlichen Fäkalien wurden 90 ml 0,15 M NaCl zugegeben und die Probe wurde homogenisiert. Variierende Mengen von E. coli (10⁴, 10³, 10², 10¹) in 50 μl 0,15 M NaCl wurden mit 0,5 g homogenisierter Probe (Spike-Proben) bzw. mit 0,45 ml 0,15 M NaCl (= Kontrolle) gemischt. Die Spike-Proben wurden 30 Minuten lang vor der Verwendung stehen gelassen, so dass jegliches Binden der Bakterien an die Nahrungsmatrix auftreten konnte. Spike-Proben und entsprechende Kontrollen wurden mit 85 μl RG verschmiert und auf eine Enddichte von 1,057 g/ml gemischt. Die Mischung wurde auf den Boden eines Zentrifugenröhrchens überführt (1,5 ml), mit 0,5 ml einer RG-Lösung mit einer Dichte von 1,030 g/ml und darauf mit 0,2 ml einer 0,15 M NaCl-Lösung überlagert. Dann wurde eine Zentrifugation in einer Tafelzentrifuge bei 10.000 × g_av 1 Minute lang ausgeführt. Danach wurde die untere Phase in eine Spritze angesaugt, wodurch die Kanüle zuerst den durch die Probenmatrix gebildeten nicht-pipettierbaren Pfropfen durchdrang, und wurde in ein neues Röhrchen überführt. Ein kleines Pellet wurde beobachtet, und um das pelletierte Material (mit gebundenen Bakterien) zu erhalten, wurden die verbleibenden 100 μl resuspendiert, bevor sie in die Spritze gezogen wurden. Die so erhaltene untere Phase wurde mit 585 μl RG gemischt, um eine Dichte von 1,200 g/ml zu erhalten, dann mit 0,2 ml einer RG-Lösung mit einer Dichte von 1,090 g/ml überlagert und darauf wurden 0,1 ml einer 0,15 M NaCl-Lösung gegeben. Dann wurde die Zentrifugation bei 1.000 × g_av 1 Minute lang ausgeführt. Die oberen Phasen wurden mit einer Pasteurpipette angesaugt und abgegeben und dann wurde die untere Phase resuspendiert, in ein neues Röhrchen überführt, mit 0,2 ml einer RG-Lösung mit einer Dichte von 1,130 g/ml und mit 0,1 ml einer 0,15 M NaCl-Lösung überlagert. Dann wurde eine Zentrifugation bei 10.000 × g_av 1 Minute lang ausgeführt. Die oberen Phasen wurden mit einer automatischen Pipette in drei Portionen von 75 μl fraktioniert und dann analysiert.
Zum Vergleich mit der Technik des Stands der Technik wurden Spike-Proben und Kontrollen oben auf 0,6 ml einer Percoll^®-Lösung in 0,15 M NaCl, pH 7,40 mit einer Dichte von 1,057 bzw. auf 0,6 ml BacXtractor (ρ =1,057, 0,15 M NaCl, pH 7,40) geladen. Dann wurden die Proben bei 10.000 × g_av zentrifugiert. Die unteren 100 μl der unteren Phase von jeder Probe und Kontrolle wurden in eine Spritze gezogen und analysiert.
Für die Bestimmung der E.coli-Menge durch Kultivieren wurden 2 ×10 μl variierender Verdünnungen von den verschiedenen Proben auf Platten ausgebreitet. Manuelles Zählen der Kolonien und die Berechnung der Menge wurde nach der Inkubation über Nacht ausgeführt. Für die Detektion von E. coli mit einer DNA-Technik wurden 10 μl von jeder Probe in einem PCR-Test verwendet.
Gemäß des Verfahrens der Erfindung betrug die Ausbeute mit den Spike-Proben 80-100% im Vergleich zu 50-80% mit den zwei älteren Techniken. Die Ausbeute in den Kontrollen war etwas geringer in jedem Fall im Vergleich zu den Proben. Dieses Phänomen wurde früher berichtet und beruht sehr wahrscheinlich auf dem Schutzeffekt, den die endogene Flora in der Fäkalienprobe auf die in die Proben gegebenen Bakterien besitzt.
Durch die PCR-Technik konnte so wenig wie 1,3 cfu E. coli pro Reaktionsröhrchen (10 cfu/0,5 g homogenisierte Probe; 200 cfu/g Fäkalien) unter Verwenden des Verfahrens der Erfindung detektiert werden, während bis herab zu 10 cfu E. coli pro Analyse (100 cfu/0,5 g homogenisierte Probe; 2.000 cfu/g Fäkalien) unter Verwenden von Verfahren des Stands der Technik für Dichtegradientenzentrifugation detektiert werden konnte. Eine direkte Analyse ergab keinerlei positive Reaktion. In den Kontrollen konnten 1,3 cfu E. coli pro Reaktionsröhrchen unter Verwenden jeder Technik detektiert werden.
Beispiel 3 – Detektion von E. coli im Boden
Zu 10 g kompostiertem Boden wurden 90 ml 0,15 M NaCl gegeben und dann wurde die Probe homogenisiert. Variierende Mengen von E. coli (10⁴, 10³, 10², 10¹) in 50 μl 0,15 M NaCl wurden mit 0,5 g homogenisierte Probe (= Spike-Proben) bzw. mit 0,45 ml 0,15 M NaCl (= Kontrolle) für die Analyse durch die neue Technik gemischt. Um Proben zu erhalten, die für einen Vergleich mit den Techniken des Stands der Technik nützlich sind, wird die homogenisierte Probe zuerst einer Selbst- Sedimentation 60 Minuten lang überlassen und dann wurde die obere Flüssigkeit verwendet, um Spike-Proben wie oben beschrieben, zu erzeugen.
Man ließ die Spike-Proben 30 Minuten lang vor der Verwendung stehen, so dass ein beliebiges Binden der Bakterien an die Probenmatrix auftreten konnte. Spike-Proben und entsprechende Kontrollen wurden mit 85 μl RG verschmiert und auf eine Enddichte von 1,057 g/ml gemischt. Die Mischung wurde auf den Boden eines Zentrifugenröhrchens (1,5 ml) überführt, mit 0,5 ml einer RG-Lösung mit einer Dichte von 1,030 g/ml und darauf mit 0,2 ml einer 0,15 M NaCl-Lösung überlagert. Dann wurde eine Zentrifugation in einer Tafelzentrifuge bei 10.000 × g_av 1 Minute lang ausgeführt. Die oberen Phasen wurden mit einer Pasteurpipette angesaugt und abgelassen. Ein großes Pellet wurde gebildet und, um das gesamte pelletierte Material (mit gebundenen Bakterien) zu erhalten, wurde die untere Phase vor dem Überführen in ein neues Röhrchen resuspendiert. Daher wurde die erhaltene untere Phase mit 585 μl RG gemischt, um eine Dichte von 1,200 g/ml zu erhalten, dann mit 0,2 ml einer RG-Lösung mit einer Dichte von 1,090 g/ml überlagert und darauf wurden 0,1 ml einer 0,15 M NaCl-Lösung gegeben. Dann wurde eine Zentrifugation bei 1.000 × g_av 1 Minute lang ausgeführt. Die oberen Phasen wurden mit einer Pasteurpipette angesaugt und abgelassen und dann wurde die untere Phase einschließlich des Pellets resuspendiert, in ein neues Röhrchen überführt, mit 0,2 ml einer RG-Lösung mit einer Dichte von 1,130 g/ml und 0,1 ml einer 0,15 M NaCl-Lösung überlagert. Dann wurde eine Zentrifugation bei 10.000 × g_av 1 Minute lang ausgeführt. Die oberen Phasen wurden mit einer automatische Pipette in drei Portionen von 75 μl fraktioniert und dann analysiert.
Für einen Vergleich mit Techniken des Stands der Technik wurden speziell hergestellte Spike-Proben und Kontrollen auf 0,6 ml einer Percoll^®-Lösung in 0,15 M NaCl, pH 7,40 mit einer Dichte von 1,057 bzw. oben auf 0,6 ml BacXtractor (ρ = 1,057, 0,15 M NaCl, pH 7,40) geladen. Dann wurden die Proben bei 10.000 x g_av zentrifugiert. Die oberen Phasen wurden angesaugt und abgelassen und dann wurde die untere Phase angesaugt, bis 100 μl verblieben. Die Flüssigkeit über dem gebildeten Pellet (60 μl) wurde angesaugt und analysiert.
Zur Bestimmung der Menge von E. coli durch Kultivieren wurden 2 × 10 μl variierender Verdünnungen von den verschiedenen Proben auf Platten verbreitet. Manuelles Zählen der Kolonien und die Berechnung der Menge wurde nach der Inkubation über Nacht ausgeführt. Für die Detektion von E. coli durch eine DNA-Technik wurden 10 μl von jeder Probe in einem PCR-Test verwendet.
Durch die neue Technik betrug die Ausbeute mit den Spike-Proben 80-100% im Vergleich zu 10-20% mit den zwei älteren Techniken. Die Ausbeute in den Kontrollen war etwas geringer in jedem Fall im Vergleich zu den Proben. Dieses Phänomen wurde früher berichtet und beruht sehr wahrscheinlich auf dem Schutzeffekt, den die endogene Flora in der Bodenprobe auf die zugefügten Bakterien in den Proben besitzt.
Durch die PCR-Technik konnten so wenig wie 1,3 cfu E. coli pro Reaktionsröhrchen (10 cfu/0,5 g homogenisierte Probe; 200 cfu/g Boden) unter Verwenden des Verfahrens der Erfindung detektiert werden, während bis herunter zu 10 cfu E. coli pro Analyse (1.000 cfu/0,5 g homogenisierte Probe; 20.000 cfu/g Boden) unter Verwenden von Verfahren des Stands der Technik für Dichtegradientenzentrifugation detektiert werden konnten. Eine direkte Analyse gab keinerlei positive Reaktion. In den Kontrollen konnten 1,3 cfu E. coli pro Reaktionsröhrchen unter Verwenden jeder Technik detektiert werden.
Beispiel 4 – Spermareinigung von Bakterien und Viren in Rindersamen
Eine frische Samenprobe von einem gesunden Bullen wurde nach Verdünnung durch 1:10 mit 0,15 M NaCl in 16 Fraktionen von 0,45 ml, die jeweils ungefähr 10⁷ Spermien enthielt, geteilt. Variierende Mengen von BVDV (bovine virus diarrhoea virus; 10⁶, 10⁵, 10⁴) bzw. Campylobacter fetus (10⁶, 10⁵, 10⁴) in 50 μl 0,15 M NaCl wurden in 12 Röhrchen gegeben und in vier der Röhrchen wurden 50 μl 0,15 M NaCl als Kontrolle gegeben.
Spike-Proben (6 Röhrchen) und Kontrollen (2 Röhrchen) wurden mit 85 μl RG auf eine Enddichte von 1,057 g/ml gemischt. Die Mischung wurde auf den Boden eines Zentrifugenröhrchens (3,0 ml) überführt, mit 0,5 ml einer RG-Lösung mit einer Dichte von 1,030 g/ml und darauf mit 0,5 ml einer 0,15 M NaCl-Lösung überlagert. Dann wurde eine Zentrifugation in einem ausladbaren Rotor bei 10.000 × g_av 1 Minute lang ausgeführt. Die oberen Phasen wurden durch eine Pasteurpipette angesaugt und abgelassen. Die untere Phase wurde resuspendiert, in ein neues Röhrchen überführt und mit 585 μl RG gemischt, um eine Dichte von 1,200 g/ml zu erhalten, mit 0,5 ml einer RG-Lösung mit einer Dichte von 1,090 g/ml und darauf mit 0,5 ml einer 0,15 M NaCl-Lösung überlagert. Dann wurde eine Zentrifugation bei 1.000 × g_av 1 Minute lang ausgeführt. Die oberen Phasen wurden durch eine Pasteurpipette angesaugt und abgelassen und dann wurde die untere Phase resuspendiert, in ein neues Röhrchen überführt, mit 0,5 ml RG-Lösung mit einer Dichte von 1,130 g/ml und mit 0,5 ml einer 0,15 M NaCl-Lösung überlagert. Dann wurde eine Zentrifugation bei 1.000 × g_av 1 Minute lang ausgeführt. Fraktionen wurden von den Röhrchen von oben mit einer automatischen Pipette in vier Portionen von 300 μl und zwei Fraktionen von 0,5 ml gesammelt. Die Fraktionen wurden im Hinblick auf Sperma, BVDV und Campylobacter fetus analysiert.
Zum Vergleich mit der Technik des Stands der Technik wurden die Proben (6 Röhrchen) und Kontrollen (2 Röhrchen) jeweils oben auf einem diskontinuierlichen Gradienten gelagert, der aus 0,5 ml 80 % bzw. 0,5 ml 40% SpermXtractor bestand. Dann wurden die Proben bei 400 × g_av 10 Minuten lang zentrifugiert. Die Gradienten wurden von oben durch eine Pasteurpipette in 6 Fraktionen fraktioniert (die obere Phase, die erste Zwischenphase, die zweite Phase, die zweite Zwischenphase, die dritte Phase und das Pellet). Die Fraktionen wurden im Hinblick auf Sperma, BVDV und Campylobacter fetus analysiert.
Für die Detektion der Menge von Campylbacter fetus durch Kultivieren wurden 2 × 10 μl variierender Verdünnungen von den verschiedenen Proben auf Platten ausgebreitet. Manuelles Zählen der Kolonien und die Berechnung des Gehalts wurden nach der Inkubation über Nacht ausgeführt. Für eine Detektion von BVDV durch eine immunologische Technik wurden 10 μl jeder Probe in einem ELISA-Test verwendet.
Durch die neue Technik wurden weder Campylobacter fetus, noch BVDV in den drei oberen, Sperma enthaltenden Fraktionen von den Spike-Proben detektiert. Im Gegensatz dazu wurden BVDV und Campylobacter fetus in den unteren, Spermafreien Fraktionen detektiert. Die Kontrollen waren für diese Mittel negativ.
Unter Verwenden von Techniken des Stands der Technik waren detektierbare Mengen sowohl von BVDV, als auch von Campylobacter fetus in allen Fraktionen der Spike-Proben einschließlich Fraktionen mit angereicherten intakten Spermien vorhanden, obwohl sogar die meisten der Organismen in der obersten Fraktion verblieben. Die Kontrollen waren für diese Mittel negativ.
Weitere Anwendungen der Erfindung
Das Verfahren der Erfindung kann auch für z. B. Testen des Bakteriengehalts in einer Enzymfraktion aus einem Fermentationsprozess verwendet werden. Ein anderes Beispiel ist die Reinigung von aufgelösten Substanzen (Toxine, Antibiotika, Hormone) von Nahrungsmitteln. Nach dem Ansaugen der geeigneten Schicht wird eine Analyse durch GC-MS, ELISA, Dip-Stick etc. ausgeführt.
Ein weiteres Beispiel ist die Reinigung von aufgelösten Substanzen (Toxine, Antibiotika, Hormone) aus Nahrungsmitteln durch Mischen der Probe vor der Zentrifugation mit mAb-bedeckten Kügelchen einer geeigneten Dichte und Analysieren nach dem Lösen durch GC-MS, ELISA, Dip-Stick. Die Erfindung kann auch in der Kriminaluntersuchung/forensischer Medizin verwendet werden, z. B. die Reinigung von DNA von Blutflecken oder die Reinigung von Zellen/DNA von unter vakuumgehaltenen Proben. Ein anderes Beispiel ist die Reinigung von Sperma/DNA von Flecken/klinischen Proben. Die Erfindung ist auch nützlich für die Reinigung von Nukleinsäuren und Proteinen für analytische und/oder präparative Zwecke.
Die außergewöhnliche Reinheit einer getrennten Substanz, die durch die vorliegende Erfindung erhalten wird, macht sie speziell für alle Anwendungen vorteilhaft, bei denen eine hohe Reinheit ein Erfordernis ist, wie in den meisten Reinigungen von DNA und RNA. Sogar Ribosomen und andere Zellkomponenten könnten als echte Lösungen durch eine geeignete Gestaltung des vorliegenden Verfahrens erhalten werden. Sie ist auch vorteilhaft in der nachfolgenden Handhabung der nachfolgenden Handhabung derartiger Proben, da sie normalerweise PCR unterzogen werden, wobei in diesem Fall ein erster Schritt eine Lyse ist.
Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um lebende Zellen von toten Zellen zu trennen, wobei in diesem Fall der Zelltyp derselbe sein kann, da die Eigenschaften sich ändern, wenn die Zellen aufhören zu leben. Spezieller kann das vorliegende Verfahren zum Differenzieren zwischen aktiven und nicht-aktiven Zellen verwendet werden. In einigen Fällen sind Zellen lebensfähig, aber nicht kulturfähig, und können so nun von toten Zellen getrennt werden. In diesem Kontext ist es wesentlich, dass die Dichte einer lebenden Zelle nicht ein absoluter Wert ist, aber sie wird abhängig von ihrer Umgebung variieren, wie Osmolalität (Salzgehalt). Daher kann durch eine geeignete Manipulation der Umgebung die Dichte der lebenden Zellen geändert werden, aber die toten Zellen werden ihre Dichte behalten, und demgemäß wird das vorliegende Verfahren auf einfache Weise anwendbar sein.
Eine unerwartete Verwendung des vorliegenden Verfahrens besteht in der Analyse von verwendeten Abstrichtests, allgemein verwendet in Schlachthäusern. Es wurde gezeigt, dass das vorliegende Verfahren auf einen derartigen Abstrich anwendbar ist, ohne einen vorherigen Anreicherungsschritt. Dies macht es möglich, Pathogene in derartigen Proben auf eine schnelle und rentable Weise zu detektieren.

Claims

Verfahren zur diskontinuierlichen Dichtegradientenzentrifugation zum Trennen mindestens zweier Substanzen voneinander in einer Probe, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte umfaßt: (i) Mischen der Probe mit einem hochdichten Medium, um eine spezifische Dichte der Mischung zu erhalten; (ii) Anordnen (a) der Mischung eines Hochdichtezentrifugationsmediums und der Probe, die die zu trennenden Substanzen umfaßt, auf dem Boden eines Zentrifugenröhrchens, wobei in der Mischung die Dichte definiert ist und höher ist als jene der zu trennenden erwünschten Substanz(en), (b) einer Lösung niedriger Dichte oben auf der Mischung in (a); (iii) Zentrifugieren des Röhrchens derart unter einer definierten g-Kraft, daß der/den erwünschte(n) Substanz(en) oder dem/den gelöste(n) Stoff(en) in der Probe ermöglicht wird, zu der Niedrigdichtelösung zu schwimmen, während (eine) andere Substanz(en) in der Probe in dem unteren dichteren Medium bleibt/bleiben; (iv) getrenntes Sammeln der erwünschten Substanz(en); wobei das Zentrifugationsmedium ein kolloidales Dichtegradientenmedium ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein kolloidales Dichtegradientenzentrifugationsmedium einer niedrigeren Dichte als die Dichte der Mischung in (a) zwischen der Mischung in (a) und der Niedrigdichtelösung in (b) angeordnet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Lösung in (b) eine wäßrige Lösung ist.
Verfahren nach einem der oben stehenden Ansprüche, wobei das kolloidale Dichtegradientenmedium eine Suspension von Teilchen mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 2 bis 40 nm, bevorzugt einem hydrierten Durchmesser von 10 bis 30 nm, umfaßt.
Verfahren nach einem der oben stehenden Ansprüche, wobei die untere Phase nach dem Schritt (iv) gesammelt und resuspendiert wird, um eine zweite Mischung einer definierten Dichte bereitzustellen, mit der die zweiten Mischungsschritte (i)-(iv) wiederholt werden, wobei sowohl die Dichte der zweiten Mischung als auch/oder die g-Kraft während der Wiederholung der Schritte (i)-(iv) im Vergleich zur vorherigen Runde der Schritte (i)-(iv) verschieden ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei mindestens die Schritte (ii)-(iv) eine beliebige Anzahl von Malen abhängig von der Natur der erwünschten Substanz wiederholt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, wobei jede Kombination einer g-Kraft während des Zentrifugationsschrittes und einer definierten Dichte des kolloidalen Mediums für jede Runde von Schritten (i)-(iv) ausgewählt wird, um die Trennung einer oder mehrerer erwünschter Substanz(en) zu ermöglichen.
Verfahren nach einem der oben stehenden Ansprüche, wobei die zu trennende(n) erwünschte(n) Substanz(en) Zellen, Mikroorganismen, Virus, und Bruchteile davon, Nukleinsäuren und Proteine ist (sind).