DE69527125T2

DE69527125T2 - Verfahren und Vorrichtung zur DNS Analyse

Info

Publication number: DE69527125T2
Application number: DE69527125T
Authority: DE
Inventors: Takeshi Fujita; Masaharu Kiyama; Shin-Ichiro Umemura
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1994-11-09
Filing date: 1995-11-09
Publication date: 2003-02-27
Anticipated expiration: 2015-11-10
Also published as: DE69527125D1; US6106777A; EP0711840B1; EP0711840A2; US20010036637A1; EP0711840A3

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur DNA-Analyse auf dem Gebiet der klinischen Diagnose und der Biologie, sowie eine Vorrichtung hierfür.
Mit den Fortschritten, die in letzter Zeit auf dem Gebiet der Technik der DNA-Analyse erzielt wurden, hat man der Analyse über Informationen der DNA/RNA-Sequenz auf dem Gebiet der klinischen Diagnose und der Biologie erhebliche Aufmerksamkeit geschenkt. Auf dem Gebiet der Biologie wurden beispielsweise Fortschritte in Bezug auf eine Bestimmung der gesamten Nucleotidsequenz einer Vielzahl von DNAs von Tieren und Pflanzen gemacht, wie beispielsweise das Human- Genomprojekt zeigt. Dabei wurden die kodierende Region eines neuen Proteins und dessen Regulationsort für die Expression schrittweise analysiert, wobei auch Erkenntnisse über pathogene Gene, z. B. Onkogene und dergl., gewonnen wurden.
Auf dem Gebiet der klinischen Diagnose hat andererseits die Einführung der Technik der DNA-Analyse die Identifizierung zahlreicher Ätiologien sowie die Einführung von Laboratoriumstests beschleunigt, was auf die wertvollen Ergebnisse der genannten Forschungsarbeiten zurückzuführen ist. Die Diagnose von Infektionskrankheiten, einschließlich viraler Hepatitis vom Typ C und AIDS (erworbenes Immunschwächesyndrom) aufgrund einer Infektion durch HIV (humanes Immunschwäche-Virus) stellt ein Beispiel für die Gebiete dar, bei denen die Einführung der DNA-Diagnose aufgrund der erforderlichen hohen Nachweisempfindlichkeit und aufgrund der Beziehung zwischen dem infektiösen Verhalten dieser Viren (Retroviren) und des DNA/RNA-Polymorphismus sehr erwünscht ist. Für Laboratoriumstests von Tumorzellen, die derzeit auf einer empirischen pathologischen Diagnose beruhen, und für Tests auf HLA (humanes Leukozyten-Antigen) (wo die Probenzahl aufgrund des Bedürfnisses nach einer Registrierung in Myeloid-Banken rasch ansteigt) setzt man große Erwartungen auf die Technik der DNA-Analyse, die genaue Informationen liefern kann.
Kürzlich wurde ein erheblicher, für die genannten Gebiete erwünschter Fortschritt in der DNA-Analysentechnik gemacht, indem ein Verfahren zur Trennung geringfügig unterschiedlicher DNA-Sequenzen unter Ausnutzung von Konformationsunterschieden einer Einzelstrang-DNA bei der Elektrophorese entwickelt wurde, und zwar zusätzlich zu herkömmlichen DNA-Sequenzierungs- und Hybridisierungsverfahren. Wie beispielsweise aus Genomics, Bd. 5 (1989), S. 874-879, hervorgeht, hat ein als SSCP (Single Strand Conformation Polymorphisms = Einzelstrang- Konformationspolymorphismus) bezeichnetes Verfahren Interesse als Technik zum hochempfindlichen Nachweis sogar nur einer einzigen Basensubstitution gefunden. Das Trennverfahren weist den Sequenzunterschied durch Nachweis des Unterschieds in der Konformation in Form der unterschiedlichen Beweglichkeit bei der Gelelektrophorese nach, wobei sich die Aufmerksamkeit auf den Befund konzentriert hat, dass austretende DNA, die normalerweise aus einem Paar von komplementären Doppelsträngen zusammengesetzt ist, im Zustand eines Einzelstrangs typischerweise unter geeigneten Bedingungen (Ionenstärke, Temperatur und dergl.) einer autonomen Assoziation der Einzelstrang-DNA mit sich selbst innerhalb des Moleküls unterliegt und bestimmte, für die Sequenz spezifische Konformationen bildet, wobei die Konformationen je nach der Sequenz variieren.
Das Verfahren weist Unterschiede in der DNA mit hoher Empfindlichkeit nach; da aber die Elektrophorese als Trennverfahren herangezogen wird, ist eine so lange Zeitspanne für die Trennung erforderlich, dass nur unter Schwierigkeiten ein hoher Durchsatz erzielt werden kann. Die Auswahl der Bedingungen, um in wirksamer Weise die Unterschiede in der DNA-Sequenz über die Unterschiede in der Beweglichkeit bei der Elektrophorese herauszufinden, stellt eine aufwändige Arbeit dar. Außerdem lässt sich das Verfahren kaum automatisieren. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass die Trennung in einigen Fällen unter einer Vielzahl von Bedingungen durchgeführt werden muß, um den gesamten Polymorphismus gründlich abzutrennen.
Ferner wurde ein als denaturierende Gradienten- Gelelektrophorese bezeichnetes Verfahren zum Nachweis geringfügiger Unterschiede in der DNA-Sequenz vorgeschlagen. Da sich aber auch dieses Verfahren der Elektrophorese bedient, ist es mit den vorbeschriebenen Nachteilen behaftet.
Man weiß, dass Unterschiede zwischen den Denaturierungsbedingungen einer Doppelstrang-DNA mit einer vollständig komplementären Sequenz und den Bedingungen einer Doppelstrang-DNA mit einer fast komplementären (jedoch nicht vollständig komplementären) Sequenz als Differenz der Veränderung der Absorption nachgewiesen werden können, wenn eine derartige Doppelstrang-DNA zu einer Einzelstrang-DNA denaturiert wird (Schmelzkurve) (vergl. z. B. I. V. Razlutuskii, L.S. Shlyakhtenko und Yu. L. Lyubchenko: Nucleic Acids Research, Bd. 15, Nr. 16 (1987), S. 6665-6676). Ferner ist es bekannt, dass der Typ der Konformation einer Einzelstrang-RNA (Haarnadel, Stamm, Schleifenstruktur und dergl.) durch die Veränderung der Absorption nachgewiesen und identifiziert werden kann, wenn die Basenpaarung der Einzelstrang-RNA denaturiert wird (Schmelzkurve) (vergl. z. B. L. G. Laing und D. E. Draper, J. Mol. Biol., Bd. 237 (1994), S. 560-576).
Gemäß diesen Verfahren ist nach dem Gewinnen einer Probe keine Elektrophorese erforderlich, so dass diese Verfahren insofern vorteilhaft sind, als die Vorgangsweise einfach ist und die Messungen leicht als optische Messungen mit höherer Zuverlässigkeit durchgeführt werden können.
Ferner wurde eine Technik vorgeschlagen, die das Messen und Nachweisen der folgenden Erscheinung umfaßt: Wenn eine Doppelstrang-DNA mit einer vollständig komplementären Sequenz und eine Doppelstrang-DNA mit einer nahezu, aber nicht vollständig komplementären Sequenz denaturiert werden, wird die Übertragung der Fluoreszenzenergie, die durch zwei Typen von die einzelnen komplementären Stränge individuell markierenden Fluorophoren induziert wird, beseitigt, wodurch der Unterschied in den Sequenzen der zwei nicht vollständig komplementären DNA-Typen nachgewiesen wird (JP-A-Hei-7- 31500). Da nach dem Gewinnen einer Probe keine Elektrophorese erforderlich ist, werden die gleichen Vorteile wie beim vorstehend beschriebenen Beispiel erreicht.
Jedoch können mit diesem Verfahren nur Sequenzzusammensetzungen (GC-Gehalt und dergl.) oder die Deletion/Insertion von Basen nachgewiesen werden. Die Identifizierung von detaillierten Sequenzunterschieden, insbesondere von DNA-Polymorphismus unter Einschluß der Substitution einzelner Basen ist bei diesen Verfahren mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden. Diese Verfahren erfordern die Regelung der Denaturierungsbedingungen auf einer so extrem niedrigen Rate, dass die Verfahren kaum zum Nachweis und zur Bestimmung bei hohem Durchsatz anwendbar sind.
T. von Nguyen et al., "Comparative Studies on the Secondary Structure of Ovalbumin Messenger RNA and Its Complementary DNA Transcript", Biochemistry, Bd. 16, Nr. 18 (1977), S. 4090-4100, beschreiben den Nachweis der Sekundärstruktur in Einzelstrang-cDNA und einen Vergleich dieser Sekundärstruktur mit der Sekundärstruktur der entsprechenden Messenger-RNA. Die Daten dieser Sequenzvergleiche können nicht zur Analyse des DNA- Polymorphismus durch Vergleich der Einzelstrang-DNA-Sequenz von Interesse mit bekannten Einzelstrang-DNAs herangezogen werden.
R. Makino et al., "F-SSCP: Fluorescence-based Polymerase Chain Reaction-Single-strand Conformation Polymorphism (PCR- SSCP) Analysis", PCR Methods and Applications, (1992), S. 10- 13, beschreiben das Messen der Schmelzkurve von Doppelstrang- DNA durch ein optisches Verfahren. Dieses Verfahren bedient sich der Veränderung der optischen Absorption während der Denaturierung einer Doppelstrang-DNA zu einer Einzelstrang- DNA. Die erhaltene Schmelzkurve der Doppelstrang-DNA wird sodann mit anderen Schmelzkurven von Doppelstrang-DNA verglichen, um Mutationen nachzuweisen.
Ferner wurde keine direkte optische Analyse des DNA- Polymorphismus unter Einschluß der Substition einzelner Basen in einer Einzelstrang-DNA geprüft.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Zur Überwindung der vorstehenden Schwierigkeiten wird erfindungsgemäß die Schmelzkurve der Konformation einer Einzelstrang-DNA direkt erfasst, wodurch ein genaueres und zweckmäßigeres Verfahren der Signalverarbeitung zusammen mit einer hierfür geeigneten Vorrichtung von vereinfachter Struktur bereitgestellt wird.
Zur Abtrennung und Analyse einer Einzelstrang-DNA einer Ziel-DNA-Region unter Einschluß eines heterozygoten Typs mit mehr als zwei DNA-Typen in einer Zelle umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren das Speichern der Schmelzkurven sämtlicher bekannter Polymorphismustypen (Matrizenkurven), das Vergleichen der Signalkurve einer Probe mit einer derartigen einzigen Matrizenkurve oder mit sämtlichen Kurven, die durch lineares Verbinden einer Mehrzahl der Matrizenkurven in Kombination erstellt worden sind, und das Feststellen, dass der DNA-Typ, nämlich die Sequenzeigenschaften des gemessenen Einzelstrang-DNA- Fragments, als eine Kombination der Matrizenkurven definiert ist, mit der Maßgabe, dass der RMS-Wert zwischen der Signalkurve und der Kombination unterhalb eines gegebenen Wertes möglichst klein ist.
Für die DNA-Analyse durch PCR für die klinische Diagnose soll die Sequenzinformation des Ziel-DNA-Fragments zusammen mit der Menge des PCR-Produkts erhalten werden. Daher ist die vorliegende Erfindung vorteilhafterweise so konzipiert, dass gleichzeitig sämtliche vorerwähnten Informationen über die quantitative Messung der Schmelzkurve erhalten werden.
Indem man dafür sorgt, dass eine Probenhalteeinrichtung, die die Probe hält und die Probentemperatur reguliert, eine Einrichtung mit einem größeren Oberflächen/Volumen-Verhältnis darstellt, erreicht man eine raschere Denaturierungsgeschwindigkeit für die Messung. Infolgedessen wurde festgestellt, dass die Schmelzkurve einer Einzelstrang- DNA während der Temperaturerhöhung zur Auflösung der Konformation eine Kurve darstellt, die sich von der Schmelzkurve während der Temperaturabsenkung zur Bildung der Konformation unterscheidet, was ein Anzeichen für das Vorliegen von Hysterese darstellt. Durch Verarbeiten der Daten mit einer Signalverarbeitungseinrichtung, die identisch mit den vorstehenden Ausführungen ist, lässt sich ein DNA- Polymorphismus mit einer einzigen Basensubstitution analysieren.
Es wurde festgestellt, dass bei Einlagerung eines Interkalationsmittels, wie Ethidiumbromid, das die Fluoreszenzwellenlänge nach der Einlagerung in die DNA- Basenpaarung verschieben kann, die Intensität der Fluoreszenz, die aufgrund der Wechselwirkung der Einzelstrang-DNA mit dem Interkalationsmittel während der Bestrahlung mit dem Anregungsstrahl emittiert wird, sich entsprechend der Denaturierung der Einzelstrang-DNA verändert. Daher lässt sich durch Messen der Intensität und Verarbeitung der Daten mit einer Signalverarbeitungseinrichtung, die identisch mit den vorstehenden Ausführungen ist, die Sequenzinformation über das Einzelstrang-DNA-Fragment erhalten.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 ist ein Blockdiagramm zur Darstellung der Struktur eines Detektors eines ersten erfindungsgemäßen Beispiels.
Figg. 2 (a) und (b) sind Diagramme zur Darstellung der Absorptionsdaten und Differentialabsorptionsdaten, die durch Temperaturdifferenzierung der Absorptionsdaten erhalten wurden, zur Darstellung der Schmelzkurve einer Einzelstrang- DNA des bekannten Typs DQA1·0101 der DNA im Exon 2 der HLA- DQA1-Region.
Figg. 3 (a) und (b) sind Diagramme zur Darstellung der Absorptionsdaten und Differentialabsorptionsdaten, die durch Temperaturdifferenzierung der Absorptionsdaten erhalten wurden, zur Darstellung der Schmelzkurve einer Einzelstrang- DNA des bekannten Typs DQA1·0102 der DNA im Exon 2 der HLA- DQA1-Region.
Figg. 4 (a) und (b) sind Diagramme zur Darstellung der Absorptionsdaten und Differentialabsorptionsdaten, die durch Temperaturdifferenzierung der Absorptionsdaten erhalten wurden, zur Darstellung der Schmelzkurve einer Einzelstrang- DNA des bekannten Typs DQA1·0103 der DNA im Exon 2 der HLA- DQA1-Region.
Figg. 5 (a) und (b) sind Diagramme zur Darstellung der Absorptionsdaten und Differentialabsorptionsdaten, die durch Temperaturdifferenzierung der Absorptionsdaten erhalten wurden, zur Darstellung der Schmelzkurve einer Einzelstrang- DNA des bekannten Typs DQA1·0301 der DNA im Exon 2 der HLA- DQA1-Region.
Figg. 6 (a) und (b) sind Diagramme zur Darstellung der Absorptionsdaten und Differentialabsorptionsdaten, die durch Temperaturdifferenzierung der Absorptionsdaten erhalten wurden, zur Darstellung der Schmelzkurve einer Einzelstrang- DNA des bekannten Typs DQA1·0401 der DNA im Exon 2 der HLA- DQA1-Region.
Figg. 7 (a) und (b) sind Diagramme zur Darstellung der Absorptionsdaten und Differentialabsorptionsdaten, die durch Temperaturdifferenzierung der Absorptionsdaten erhalten wurden, zur Darstellung der Schmelzkurve einer Einzelstrang- DNA des bekannten Typs DQA1·0601 der DNA im Exon 2 der HLA- DQA1-Region.
Figg. 8 ist ein Diagramm der Ableitung der Schmelzkurve vom Typ DQA1·0301 nach Anpassung auf der Basis der Gauss- Verteilungskurven.
Figg. 9 ist ein Diagramm der Ableitung der Schmelzkurve einer heterozygoten Probe der Typen DQA1·0102 und DQA1·0301 unter Darstellung der charakteristischen Parameter der Kurve.
Figg. 10 ist ein Diagramm einer weiteren Analysenprobe einer heterozygoten DNA.
Figg. 11 stellt ein Messbeispiel der Hysteresekurve einer Schmelzkurve dar.
Fig. 12 stellt in schematischer Weise den Verfahrensablauf eines erfindungsgemäßen Beispiels dar.
Fig. 13 ist eine schematische Darstellung der Struktur des Detektors des ersten erfindungsgemäßen Beispiels.
Fig. 14 ist eine detaillierte Ansicht der Struktur der spektroskopischen Zelle eines erfindungsgemäßen Beispiels.
Fig. 15 stellt ein Blockdiagramm eines Beispiels für die Struktur eines Detektors zum Erfassen der Fluoreszenz der DNA und des Interkalationsmittels dar.
Fig. 16 ist ein Diagramm der Schmelzkurve über die Fluoreszenz von HLA-DQA1·0101 und HLA-DQA1·0102.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Nachstehend wird die Erfindung anhand eines Beispiels erläutert.
Fig. 1 ist ein Blockdiagramm der Grundstruktur des erfindungsgemäßen DNA-Analysegeräts. Ein UV-Strahl (mit einer Wellenlänge von 260 nm) aus der Lichtquelle 1 wird an einem optischen System 2 in zwei Strahlen unterteilt, die dann individuell in ein Probenteil 4 und in ein Kontrollteil 5, die sich beide in einer Zellhaltevorrichtung 6 befinden, einfallen. Anschließend werden die individuellen Strahlen, die mit optischen Systemen (nicht dargestellt) kollimiert werden, von einem Photomultiplier 7 erfasst und sodann durch den Verstärker 9 geleitet und von der analytischen Signalverarbeitungsvorrichtung 10 verarbeitet. Die Zellhaltevorrichtung 6 kann die. Temperatur des Probenteils 4 und des Kontrollteils 5 gegebenenfalls mit dem Temperaturregler 8 entsprechend den programmierten Temperaturprofilen steuern. Die Temperatursteuerung kann mit einer gewünschten Geschwindigkeit der Temperaturerhöhung oder -senkung vorgenommen werden. Die Temperatur in der Zellhaltevorrichtung 6 wird mit einem Temperaturfühler (nicht abgebildet) gemessen und gleichzeitig dem Rückkoppelungs- Temperaturregler 8 und der Signalverarbeitungsvorrichtung 10 zugeführt. Da es erforderlich ist, dass die Temperatur bestimmter Proben im Bereich von -20 bis 100ºC gesteuert wird, soll die Zellhaltevorrichtung 6 so beschaffen sein, dass trockene Luft vom Boden jeder Probenhaltezelle 4 und 5 nach oben strömt, um das Auftreten einer Kondensatbildung an der Oberfläche beider Zellen zu verhindern.
Das Steuerungsteil 5 ist so angeordnet, dass die Absorption einer Pufferlösung zur Lösung einer Probe im Probenteil 4 und die Absorption der Probenzelle korrigiert werden, um die DNA-Nettoabsorption zu bestimmen. Dies stellt in der Spektrometrie eine Routinetechnik dar. Bei den in den nachstehend beschriebenen Beispielen angegebenen Daten handelt es sich durchweg um korrigierte Daten.
Nachstehend wird die DNA-Polymorphismusanalyse unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorrichtung beispielhaft beschrieben.
Im vorliegenden Beispiel wurde Einzelstrang-DNA von HLA (humanes Leukozyten-Antigen) Klasse II:DQA1-Region unter Anwendung einer asymmetrischen PCR-Methode aus von humanen Blutzellen extrahierter genomischer DNA amplifiziert. Anschließend wurde die DNA-Polymorphismus-Analyse (DNA- Typisierung) der Region durchgeführt.
Nach einem standardmäßigen Verfahren wurden eine DNA- Probenlösung mit der extrahierten genomischen DNA, eine PCR- Pufferlösung mit einer Endkonzentration an 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,02% Gelatine und jeweils 200 uM der Desoxyribonucleotidtriphosphate (dATP, dCTP, dGTP und dTTP), 2,5 U Taq-Polymerase, jeweils 20 pMol der beiden Primertypen GH 26 und GH 27 entsprechend der zu analysierenden HLA-DQA1-Region (Ulf B. Gyllensten und Henry A. Erlich; Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, Bd. 85 (Oktober 1988), S. 7652-7656) in einem Teströhrchen vermischt, wonach das Gemisch mit Mineralöl überschichtet wurde. Folgende PCR-Zyklisierungsbedingungen wurden in der vorgegebenen Reihenfolge eingehalten: 27 Zyklen bei 94ºC (1 Minute), 57ºC (1, 2 Minuten) und 72ºC (1 Minute).
Unter Verwendung von 1/100 des Reaktionsprodukts wurde eine asymmetrische PCR durchgeführt. Die asymmetrische PCR- Lösung entsprach nahezu der für die PCR beschriebene Lösung, mit der Ausnahme, dass die Primermengen so modifiziert wurden, dass die Menge von GH 26 10 pMol und die Menge von GH 27 l pMol betrug. Folgende PCR-Zyklisierungsbedingungen wurden in der angegebenen Reihenfolge eingehalten: 15 Zyklen bei 94ºC (1 Minute), 57ºC (1, 2 Minuten) und 72ºC (1 Minute).
Das Reaktionsprodukt wurde entsalzt und mit einem Mikrofilter (MicroconR 30, Produkt der Firma Grace Japan) eingeengt und sodann in TNE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH-Wert 8,3), 30 mM NaCl) gelöst. Das erhaltene Produkt wurde als Probenlösung definiert.
Im vorliegenden Beispiel wurde eine asymmetrische PCR zur Herstellung einer Einzelstrang-DNA herangezogen, wobei aber auch andere Verfahren ebenso verwendet werden können, einschließlich eines Verfahrens, das die PCR-Amplifikation einer Doppelstrang-DNA und anschließendes Verdauen einer Einzelstrang-DNA mit λ-Exonuclease umfaßt (λ-Exonuclease- Verfahren), und ein Verfahren, das die PCR-Amplifikation in einem Zustand, bei dem jeder der PCR-Primer an einer Membran immobilisiert ist, und das anschließende Abwaschen der nicht an der Membran immobilisierten Einzelstrang-DNA umfaßt, wobei die Temperatur auf die Schmelztemperatur erhöht wird (Membranverfahren). Obgleich das Membranverfahren die Immobilisierung eines vorbestimmten Primers an der Membran erfordert, lässt sich mit diesem Verfahren eine Einzelstrang- DNA auf einfache Weise in hoher Reinheit herstellen. Ferner ist das Verfahren für die Automatisierung geeignet.
Die Probenlösung wurde in das Probenteil 4 gebracht, während der TNE-Puffer als Kontrolllösung in das Kontrollteil 5 gebracht wurde. Die Probentemperatur wurde auf 0ºC gesenkt. Anschließend wurde die Temperatur mit einer Erhöhungsgeschwindigkeit von 1ºC/min auf 60ºC erhöht.
Figg. 2 bis 7 (a) und (b) stellen die Schmelzkurven der Einzelstrang-DNAs der bekannten 6 Typen (DQA1·0101, DQA1·0102, DQA1·0103, DQA1·0301, DQA1·0401, DQA1·0601; The WHO Nomenclature Committee for Factors of the HLA System, 1989, Immunogenetics, Bd 31 (1990), S. 131-140) der HLA-DQA1- Region-DNA (242 bp oder 239 bp) als Absorptionsdaten und differentielle Absorptionsdaten in Abhängigkeit von der Temperatur dar(die Daten der beiden anderen Typen, d. h. DQA1·0201 und DQA1·0501 sind hier nicht dargestellt, da die Erfinder die homozygoten Proben nicht erhalten konnten). In den Figuren (b) sind nur die differentiellen Absorptionsdaten dargestellt. Eine einzige Base ist zwischen den Typen DQA1·0101 und DQA1·0102 verschieden; drei Basen sind zwischen den Typen DQA1·0101 und DQA1·0103 verschieden; und zwei Basen sind zwischen den Typen DQA1·0102 und DQA1·0103 verschieden.
27 Basen sind zwischen den Typen DQA1·0101 und DQA1·0301 verschieden. Die Typen DQA1·0401 und DQA1·0601, die um drei Basen kürzer als die übrigen Typen sind, weisen Sequenzunterschiede in 20 Basen oder mehr im Vergleich zur Sequenz von DQA1·0101 auf, wobei jedoch nur eine Base zwischen diesen Typen DQA1·0401 und DQA1·0601 unterschiedlich ist.
Außerdem stellen die einzelnen Figuren (a) und (b) die Analysenergebnisse der gleichen Proben dar, wobei aber die Figur (a) die Analysenergebnisse, die bis zum Prioritätstag der vorliegenden Anmeldung erhalten wurden, zeigt und die Figur (b) die Analysenergebnisse, die erst kürzlich erhalten wurden, darstellt. Der Grund dafür, dass die beiden Figuren jeweils nicht vollständig übereinstimmen, obgleich sie die Analysenergebnisse der gleichen Proben darstellen, liegt in der unterschiedlichen Perfektion der analytischen Maßnahmen und in der Datenkorrektur, die bei den weniger perfektionierten analytischen Vorgängen angewandt wurde. Diese Tatsache bedeutet aber nicht, dass die Analysen nicht reproduzierbar sind.
Die Figuren zeigen, dass Gruppen mit sehr unterschiedlichen Sequenzen, z. B. eine Gruppe von DQA1·0101 - DQA1·0103 (Typ 1), eine Gruppe von DQA1·0301 (Typ 3) und eine Gruppe von DQA1·0401 und DQA1·0601 (kurzer Typ) deutlich unterschiedliche Merkmale in ihren Schmelzkurven aufweisen. Ferner ist ersichtlich, dass der Typenunterschied, z. B. der Unterschied in einer Base oder zwei Basen (z. B. DQA1·0101 - DQA1·0103, DQA1·0401, DQA1·0601) als ein ausgeprägter Unterschied nachgewiesen werden kann.
Fig. 8 zeigt die Ableitung der Schmelzkurve des Typs DQA1·0301 unter Anpassung auf der Basis der Verteilungsfunktionen nach Gauss. Wie aus Fig. 8 hervorgeht, lässt sich die Schmelzkurve des Typs DQA1·0301 in zufriedenstellender Weise durch Überlagerung von zwei Gauss- Kurven darstellen.
Mit anderen Worten, dies zeigt, dass durch Aufstellen der Schmelzkurven der bekannten DNA-Typen und Vergleich der Schmelzkurve einer Proben-DNA mit den Schmelzkurven dieser bekannten DNA-Typen als Matrizen der Typ der Proben-DNA identifiziert werden kann. Ferner kann durch Anpassen der Gauss-Kurve an die Schmelzkurve diese Identifizierung numerisch und in wirksamer Weise durchgeführt werden.
Tabelle 1 zeigt zusammenfassend die Amplitude (a), die Peakposition (Mittelwert, u) und den Bereich (Standardabweichung, σ) einer Mehrzahl von Gauss-Kurven, die an die Ableitungen der Schmelzkurven der in den Fig. 2 bis 7 dargestellten bekannten 6 Typen angepasst sind. Tabelle 1
Die Anzahl der Terme in den Gauss-Funktionen, die zur Anpassung verwendet werden, ist als die Anzahl definiert, bei der der Anpassungsfehler auf einem Minimum gesättigt ist. Wie in der Tabelle gezeigt ist, lässt sich die Ableitung einer Schmelzkurve, die einer der Typen entspricht, durch ihre charakteristischen Parameter (a, u, σ) wiedergeben. Vergleicht man die Schmelzkurve einer unbekannten DNA (Typ) mit den Schmelzkurven dieser bekannten Typen von DNA- Polymorphismus als Matrizen über einen Vergleich mit den in Tabelle 1 aufgeführten Parametern, lässt sich das Verfahren nicht nur über eine automatische Rechnerverarbeitung durchführen, sondern es lässt sich durch das mathematische Verfahren auch ein strikter Vergleich erreichen.
Für das mathematische Verfahren, bei dem eine frisch gemessene und eingegebene Signalkurve mit einer der bekannten, vorher aufgestellten Schmelzkurven oder mit sämtlichen Kurven, die vorher durch lineare Kombination einer Mehrzahl der Matrizenkurven aufgestellt worden waren, verglichen wurde, soll eine Matrizenkurve mit dem geringsten statistischen Fehler oder eine Kombination der Matrizenkurven, die die linear kombinierte Kurve mit dem geringsten statistischen Fehler ergibt, als die Sequenzcharakteristiken eines Einzelstrang-DNA-Fragments, das aus dem Proben-Doppelstrang-DNA-Fragment hergestellt worden ist, definiert werden.
Fig. 9 stellt die Ableitung der Schmelzkurve einer heterozygoten Probe von 0102 und 0301 (die DQA1·0102 und DQA1·0301 wiedergeben) zusammen mit den charakteristischen Parametern der Kurve dar. Bei einer derartigen heterozygoten Probe wird die Ableitung als die Überlagerung von Matrizenkurven der einzelnen DNA-Typen wiedergegeben, was zeigt, dass die Typisierung auf dem Prinzip der Spektralanalyse durchgeführt werden kann.
Aufgrund der Ergebnisse von Fig. 9 sind in Tabelle 2 die Parameter der einzelnen DNA-Typen zusammengestellt. Wenn speziell eine heterozygote DNA die Parameterwerte von u (Peakposition) und σ (Standardabweichung) aufweist, die fast die gleichen wie die in Tabelle 2 angegebenen Regressionswerte sind, so handelt es sich bei der heterozygoten DNA um einen Heterozygoten von zwei aus den Werten abgeleiteten DNA-Typen. Tabelle 2
Im vorliegenden Beispiel konnte eine für die Praxis ausreichend genaue Schmelzkurve bei einer Temperaturerhöhungsgeschwindigkeit von maximal 5ºC/min erreicht werden. In diesem Fall beträgt die Analysenzeit etwa 10 Minuten pro Probe, wodurch eine Beschleunigung bis zum 20- fachen oder darüber, verglichen mit den herkömmlichen DNA- Sequenzierungs- und SSCP-Verfahren(4 Stunden oder mehr), erzielt werden konnte.
Fig. 10 stellt ein weiteres Analysenbeispiel einer heterozygoten DNA auf der Basis der Fig. 2 (a) bis 7 (b) dar. Im vorliegenden Beispiel sollten die Schmelzkurven der 8 DNA-Typen in der HLA-DQA1-Exon-2-Region (242 bp oder 239 bp (3 bp-Deletion)) als Matrizen für die einzelnen sense-Stränge vorher gemessen werden. Die gemessene heterozygote Kurve aus einer Probe stimmt nur mit der synthetischen Kurve der Matrize 0101, wiedergegeben als DQA1·0101, und der Matrize 0102, wiedergegeben als DQA1·0102, überein (RMS = 0,00008). Infolgedessen ist ersichtlich, dass die Probe als die heterozygote DNA der beiden Typen identifiziert werden kann.
Für die Polymorphismusanalyse ist es erforderlich zu bestimmen, zu welchem Typ der DNA-Typ einer analytischen Probe gehört und/oder ob der DNA-Typ neu ist oder nicht. Ferner sollte im wesentlichen eine heterozygote Probe mit einer Mehrzahl von DNA-Typen isoliert und analysiert werden. Im vorliegenden Beispiel kann jedoch eine genaue Identifizierung eines DNA-Typs auf glatte Weise unter Verwendung einer Signalverarbeitungsvorrichtung durchgeführt werden, wobei die Schmelzkurven, die sämtlichen bekannten Polymorphismustypen entsprechen (Matrizenkurven), gespeichert werden, eine frisch gemessene und eingegebene Signalkurve mit einer Mehrzahl der Matrizenkurven oder mit sämtlichen Kurven, die vorher durch lineare Kombination einer Mehrzahl der Matrizenkurven aufgestellt worden sind, verglichen wird und festgestellt wird, dass eine Kombination der Matrizenkurven, die zum geringsten RMS-Wert unterhalb eines vorgegebenen Wertes führt, den DNA-Typ (nämlich Sequenzeigenschaften) des gemessenen Einzelstrang-DNA-Fragments ergibt. Ferner können Kombinationen mit größeren Wahrscheinlichkeiten in der Reihenfolge kleinerer RMS-Werte ausgegeben werden.
Bezüglich der in Fig. 10 dargestellten Ergebnisse, ergibt sich der Wert dieses Verfahrens aus Tabelle 3.
Die Kombination mit dem geringsten endgültigen Fehler stellt eine genaue heterozygote Kombination dar. Der Wert des Fehlers ist fast der gleiche wie der Reproduzierbarkeitsfehler (oder kleiner als dieser) bei der 5-fachen Messung der Schmelzkurve. Tabelle 3 zeigt den Reproduzierbarkeitsfehler und RMS-Wert einer genauen Kombination (die in der Tabelle mit dem Doppelkreis markierte Kombination) zusammen mit den RMS-Werten einiger anderer Kombinationen mit geringerem Fehler unter den verbleibenden Kombinationen. Für eine heterozygote Kombination von Sequenzen, die sich in einer einzigen Base voneinander unterscheiden, handelt es sich beim DNA-Typ mit der höchsten Wahrscheinlichkeit einer fehlerhaften Beurteilung um einen homozygoten Typ jedes der einzelnen DNA-Typen, die ursprünglich den heterozygoten Typ darstellten. Wie aus Tabelle 3 hervorgeht, zeigt sich ein signifikanter Unterschied zwischen genauen und ungenauen Beurteilungen.

Tabelle 3

c.f. Hetero (DQA1·0101/0102)

DNA-Typen Fehler (PMS) · 10&supmin;&sup4;
0101/0102 hetero 0,74
0101 homo 1,28
0102 homo 1,55
0101/0103 hetero 2,56
0101/0201 hetero 4,5
Reproduzierbarkeitsfehler 0,8
Durch eine im wesentlichen gleichmäßige Regulierung der Temperatur der Proben bei hoher Geschwindigkeit wurde die dynamische Reaktion der Konformation eines Einzelstrang-DNA- Fragments einiger Proben bis zur Temperaturveränderung in einem Bereich über 10ºC/min der Temperaturerhöhung oder - senkung identifiziert. Insbesondere wurde festgestellt, dass während der Denaturierung und Bildung der Konformation (während der Temperaturerhöhung bzw. der Temperatursenkung) die Schmelzkurve einer Hysteresekurve (1 → 2 → 3 → 4 → 5 → 6 → 2 → 3 → 4 → 5 → ...) gemäß der Darstellung in Fig. 11 folgte. Spezifisch in bezug auf Sequenzunterschiede, z. B. Substitutionen, Deletionen oder Insertionen von Basen, variiert die Hysteresekurve in Abhängigkeit von der Probe. Dies zeigt, dass das Verfahren nicht nur in bezug auf die Veränderung der Absorption, sondern auch in bezug auf die Hysteresekurve der Absorption, an der sich eine genauere Bestimmung eines derartigen Typs mit höherer Geschwindigkeit vornehmen lässt, anwendbar ist, indem man eine gemessene Hysteresekurve mit den Matrizen-Hysteresekurven auf die gleiche Weise wie beim Signalverarbeitungsverfahren vergleicht.
Auf diese Weise wurde die Messung einer Probe innerhalb von 1 Minute (in 50 Sekunden) mit maximaler Geschwindigkeit beendet, wobei eine Hysteresekurve in 2 Zyklen der Temperaturerhöhung und -senkung erzeugt wurde. Die Hysteresekurve variiert je nach der Geschwindigkeit der Temperaturerhöhung. Wird daher die Geschwindigkeit der Temperaturerhöhung je nach dem Typ auf einen geeigneten Wert eingestellt, lässt sich eine wirksame Hysteresekurve entsprechend dem DNA-Typ erzeugen. Somit kann die DNA-Analyse auf der Grundlage der Abhängigkeit der Hysteresekurve von der Geschwindigkeit der Temperaturerhöhung vorgenommen werden.
Beispiele für eine Vorrichtung zur DNA-Analyse sind in den Fig. 12 und 13 dargestellt. Diese Vorrichtungen gewährleisten ein kontinuierliches Fließsystem von einer PCR als Vorbehandlung bis zur Messung der Schmelzkurve.
Fig. 12 zeigt schematisch den Fließverlauf. Fig. 13 zeigt schematisch die Struktur der Vorrichtung. Fig. 14 zeigt die spektroskopische Zelle in Detailansicht.
Der Reaktionsablauf durch die Stufen (a) bis (g) ist in Fig. 12 dargestellt. Wie unter (a) gezeigt ist, wird die PCR in einer PCR-Zelle 600, in der das Oligonucleotid A 602 als PCR-Primer auf einer porösen Filtermembran 601 am Boden der PCR-Zelle immobilisiert ist, durchgeführt. In die PCR-Zelle 600 wird extrahierte und gereinigte genomische DNA als Probe gebracht. Die Zelle wird sodann in der Vorrichtung von Fig. 13 befestigt. Wie unter (b) gezeigt ist, wird mit fortschreitender PCR eine Doppelstrang-DNA (PCR-Produkt) entsprechend der Proben-DNA in der Weise erzeugt, dass der Einzelstrang an der festen Phase mit einem Ende an der Filtermembran 601 fixiert ist. Die Denaturierung der Doppelstrang-DNA trennt eine freie Einzelstrang-DNA in der flüssigen Phase gemäß der Darstellung unter (d) von der mit einem Ende an der Filtermembran (feste Phase) fixierten Einzelstrang-DNA, wie unter (c) gezeigt ist. Die Einzelstrang-DNA der flüssigen Phase wird in einer Pufferlösung zur Messung gelöst. Die DNA-Lösung wird in eine spektroskopische Zelle gebracht. Die Temperatur der spektroskopischen Zelle wird so gesteuert, dass der Zustand einer Einzelstrang-DNA in der flüssigen Phase (im denaturierten Zustand) gemäss der Darstellung unter (e) und die Bildung der Konformation gemäß der Darstellung unter (f) eingehalten werden. Wie unter (g) gezeigt ist, wird die Absorption in der spektroskopischen Zelle zur Aufstellung der Schmelzkurve gemessen.
Fig. 13 zeigt in schematischer Darstellung den Aufbau der Vorrichtung. Wie nachstehend beschrieben, wird nach Einbringen einer PCR-Lösung, eines Waschpuffers und eines Spektroskopiepuffers durch Öffnungen in 705, 706 einer Probenvorbehandlungszelle 700 in die PCR-Zelle 600 eingebracht. Die PCR-Zelle 600 wird mit einem vorgegebenen Erwärmungszyklus reguliert. Ein poröser Filter 601, auf dem der Primer A immobilisiert ist, wird in die PCR-Zelle 600 gelegt. In der Probenvorbehandlungszelle 700 werden die anhand von Fig. 12 beschriebenen Behandlungen (a) bis (d) durchgeführt.
Auf dem porösen Filter 601 im Innern der PCR-Zelle 600 ist das Oligonucleotid A (10 pMol), als PCR-Primer immobilisiert. Anschließend wird die extrahierte und gereinigte genomische DNA (100 ng) als Probe in den PCR- Lösungsbehälter 701 gebracht. Gas wird aus der Gasquelle 707 über Ventile 723, 722 und 721 in den PCR-Lösungstank 701 eingeleitet, wodurch die PCR-Lösung (50 ul) durch Ventile 725 und 724 in die PCR-Zelle 600 geleitet wird. In diesem Fall handelt es sich bei der PCR-Lösung um ein Lösungsgemisch aus Primer (Oligonucleotid) B (10 pMol), jeweils 10 nMol der einzelnen Desoxyribonucleotidtriphosphate (dNTP: dATP, dCTP, dGTP, dTTP) und einer wärmebeständigen DNA-Polymerase (Taq- Polymerase) (1 Einheit) in einer Pufferlösung mit einem Gehalt an 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,3), 1,5 mM MgCl&sub2;, Gelatine (0,001%) (Endkonzentrationen).
In diesem Zustand wird die PCR unter Regulierung der Temperatur der PCR-Zelle 600 mit warmer oder kalter Luft durchgeführt. Der PCR-Zyklisierungszustand besteht in 25 Zyklen von 94ºC für 30 Minuten, 55ºC für 1 Minute und 72ºC für 30 Sekunden, in der angegebenen Reihenfolge. Die gesamte Reaktionszeit betrug 50 Minuten. Die für die PCR erforderliche Zeitspanne wird nach Möglichkeit auf etwa 20 Minuten abgekürzt, indem man die Zellform dünner ausbildet und das Oberflächen/Volumen-Verhältnis vergrößert. Durch Schließen der Ventile 724, 728 ließ sich die Verdampfung der Reaktionslösung bei höheren Temperaturen im wesentlichen verhindern.
Nach Beendigung der Umsetzung wird Gas aus der Gasquelle 707 durch die Ventile 722, 723 in einen Behälter mit Wasch- oder Spektroskopie-Puffer eingeleitet, wobei der Waschpuffer durch Ventile 726, 725, 724 mehrmals auf den Filter 601 zum Waschen des Filters 601 fließt. Dadurch wird restlicher Primer und restliches dNTP abgewaschen. Die Abfallflüssigkeit wird durch ein Ventil 728 in einen Behälter für Abfallflüssigkeit 703 entsorgt. Das PCR-Produkt verbleibt auf dem Filter 601. Sofern unerwünschte Bestandteile, die durch den Filter 601 nicht hindurchtreten können, möglicherweise verbleiben, kann Gas aus einer Gasquelle 708 durch ein Ventil 728 eingeleitet werden, während die Abfallflüssigkeit durch das Ventil 724 in einen Behälter für Abfallflüssigkeit 709 entsorgt wird. Wie in Fig. 12 (b) gezeigt ist, werden alle diese Bewegungen in einem Zustand durchgeführt, bei dem sich die Doppelstränge auf dem porösen Filter 601 im Zustand der festen Phase befinden.
Unter anschließendem Einführen einer endgültigen Waschlösung (die als Spektroskopiepuffer dient) in die PCR- Zelle und Herbeiführen eines Schmelzzustands im Innern der PCR-Zelle 600 durch Erhöhen der Temperaturfließt die Lösung aus der PCR-Zelle 600 unter Verwendung der Gasquelle 708 in Richtung zum Auslaß 705. Genauer ausgedrückt, wird gemäß der Darstellung in Fig. 12 (d) eine Einzelstrang-DNA in der flüssigen Phase gesammelt und sodann in die Spektroskopiezelle 300 übertragen. Im vorliegenden Beispiel wurde als Waschpuffer ein TNE-Puffer (20 ul; 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH-Wert 8,3), 30 mM NaCl) verwendet. Nach Einführen und Messen der Probe in der Spektroskopiezelle 300 wird die Probe in den Flüssigkeitsabfallbehälter 704 entsorgt, wobei Waschpuffer durch die Ventile 726, 727 in die Zelle fließt. Infolgedessen wird die Probe nach der Messung entsorgt, während das Innere der Spektroskopiezelle gewaschen wird. Anstelle eines Flüssigkeitsabfallbehälters 704 kann ein Fraktionssammler angebracht werden, um die Probe nach der Messung zu gewinnen.
Bei der vorerwähnten Bauweise der Vorrichtung betrug das Verhältnis der Anzahl der PCR-Zellen 600 und der Anzahl der Spektroskopiezellen 300 1 : 1, wobei aber durch Anbringen einer Mehrzahl von PCR-Zellen über Ventile an eine einzige Spektroskopiezelle die Reaktionsprodukte sequentiell zur Messung in die Spektroskopiezelle eingeführt werden können.
Alternativ kann durch direktes Zuführen einer biologischen Zellprobe, wie Blut, als Probenmaterial in die PCR-Zelle 600, durch Durchführen der Extraktion einer Proben- DNA nach einem bekannten Verfahren und durch anschließendes Durchführen der vorerwähnten DNA-Typisierung das System von der Extraktion bis zur Analyse konsistent gemacht werden. Jedoch kann die Gesamtstruktur eines derartigen Systems möglicherweise auch komplizierter gestaltet sein.
Fig. 14 stellt ein Beispiel für den Aufbau der in Fig. 13 verwendeten Spektroskopiezelle 300 dar, wobei auf der linken Seite eine Seitenansicht dargestellt ist und auf der rechten Seite eine Querschnittansicht entlang der Linie A-A der Seitenansicht in Pfeilrichtung dargestellt ist.
Die Spektroskopie-Mikrozelle 300 im vorliegenden Beispiel ist aus Quarzglas und schwarzem Quarzglas gefertigt. Das Fenster des Lichtweges ist aus (durchsichtigem) Quarzglas gefertigt. Die restlichen Teile des Zellkastens in einem rechteckigen Parallelepiped, bei dem die Oberseite offen ist, sind aus schwarzem Quarzglas gefertigt. An der Oberseite sind innen Abstandshalter aus Quarzglas angebracht, wobei Fließkanäle 303 an beiden Seiten frei gelassen werden. Ein rechteckig geformter Halteteil für die Probenlösung mit einer Lichtweglänge von 10 mm und einem quadratischen Querschnitt mit einer Kantenlänge von 1,4 mm ist unterhalb der Abstandshalter ausgebildet. Ein Temperaturfühler 301 ragt leicht aus dem Halteteil für die Probenlösung am Mittelteil der Abstandshalter nach innen. Wie durch den breiten Pfeil in der Figur gezeigt (Einsetzen), wird die Spektroskopie- Mikrozelle 300 in das Innere des Temperaturreglers 302 eingesetzt, um die Temperatur der Probenlösung zu regulieren.
In der vorliegenden Ausführungsform ist die Zellwand aus schwarzem Quarzglas mit einer Dicke von etwa 1 mm gefertigt, da dieses Glas eine wesentlich geringere Streulichtreflexion bei einer relativ hohen Wärmeleitfähigkeit und einer sehr hohen Festigkeit aufweist. Für das Zellmaterial eignet sich ein Material von geringer Streulichtreflexion und hervorragender Wärmeleitfähigkeit. Ein weiteres Beispiel ist eine Aluminiumlegierung, die mit Platinschwarz und TiN (Titannitrid) beschichtet ist. In der Zelle des vorliegenden Beispiels ist der Temperaturfühler 301 in den Temperaturregler 302 eingebettet, um die Probentemperatur in einer zentralen Stellung des Lichtweges zu messen. Daher kann mit der Zelle die Temperatur der Proben hochwirksam geregelt werden. Ferner kann mit der Zelle die Temperatur mit hoher Präzision gemessen werden. Verglichen mit allgemeinen handelsüblichen Spektroskopiezellen weist die erfindungsgemäße Zelle ein höheres Oberflächen/Volumen- Verhältnis von 2800 auf, so dass mit der Zelle ein Temperaturanstieg oder eine Temperatursenkung mit einer Geschwindigkeit von 0,1ºC/min bis 5ºC/sec realisiert werden kann.
Schließlich erfolgt eine Beschreibung eines Beispiels unter Verwendung von Ethidiumbromid, wobei die Fluoreszenz einer Proben-DNA und des Interkalationsmittels zur Aufstellung einer Schmelzkurve erfasst wird.
Fig. 15 zeigt ein Blockdiagramm eines Beispiels der Detektorbauweise, zur Erfassung der Fluoreszenz der DVA und des Interkalationsmittels. Ein UV-Strahl (mit einer Wellenlänge von 260 nm) aus einer Lichtquelle 801 durchläuft einen Filter und ein optisches System 802, z. B. eine Linse, und trifft dann auf eine in einem Probenhalter 805 befindliche Probe 804. Aufgrund der Anwesenheit von Ethidiumbromid, das in die. Proben-DNA eingelagert ist, wird Fluoreszenz mit 590 nm emittiert, die dann einer Kollimation mit dem optischen System 807 unterzogen und mit dem photoelektrischen Umsetzer 808 erfaßt wird. Das Signal wird anschließend durch den Verstärker 805 in einer analytischen Signalverarbeitungseinrichtung 810 verarbeitet. Der Probenhalter 805 kann die Probentemperatur unter Einhaltung des gegebenenfalls für den Temperaturregler 806 programmierten Temperaturprofils regeln. Die Temperaturregelung kann gegebenenfalls auf eine Geschwindigkeit der Temperaturerhöhung oder Temperatursenkung von 0,1ºC/min bis 2ºC/sec voreingestellt werden. Die Temperatur kann im Bereich von -20ºC bis 100ºC mittels einer elektronischen Heiz- und Kühleinrichtung unter Ausnutzung des Peltier-Effekts geregelt werden.
Im vorliegenden Beispiel kann die Zelle zur Signalverarbeitung und zur Verhinderung des Auftretens der Taubildung an der Zelloberfläche vorbereitet werden, wie vorstehend beschrieben wurde.
Bei der Bestimmung der Schmelzkurve aufgrund der sich durch das Interkalationsmittel ergebenden Fluoreszenz nimmt die Fluoreszenzintensität mit der Denaturierung der Konformation einer Einzelstrang-DNA ab. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Fluoreszenz, die vom Ethidiumbromid, das in die die Konformation bildenden Basenpaare eingelagert ist, emittiert wird, aufgrund der Tatsache, dass die Interkalation bei Denaturierung der Konformation beseitigt wird, nicht mehr emittiert wird. Die Schwierigkeiten mit der Reproduzierbarkeit wurden früher erwähnt, wozu die Veränderung der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Konzentration des Ethidiumbromids gehören. Jedoch sollte bei Verwendung der Schmelzkurve, die auf die Fluoreszenzintensität bei der untersten Grenztemperatur standardisiert ist, die Reproduzierbarkeit zwischen Proben gesichert werden können.
Fig. 16 stellt die Schmelzkurve von HLA-DQA1·0101 und HLA-DQA1·0102 mittels Fluoreszenz dar. Auf die gleiche Weise wie im Fall von Absorption lässt sich die Substitution einer einzigen Base identifizieren. Die Daten in Fig. 16 wurden bei einer Konzentration gemessen, die dem 1/50-fachen der Konzentration im Fall von Absorption entsprachen. Durch Anwenden der Fluoreszenz wurde die Empfindlichkeit auf das 10- bis 100-fache verbessert (Präzision bei der Messung der Schmelzkurve = Verbesserung des S/N-Verhältnisses) Wie im Fall von Absorption wird die Signalverarbeitung unter Vergleich mit Matrizenkurven vorgenommen. Infolgedessen werden sämtliche Proben genau analysiert.
Vorstehend wurden einige erfindungsgemäße Beispiele beschrieben, wobei der Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt ist. Somit fallen auch ein Verfahren, das die Analyse einer Schmelzkurve einer Einzelstrang-DNA und dabei das Gewinnen von Informationen über die DNA-Sequenz umfaßt, sowie eine Vorrichtung hierfür unter den Umfang der vorliegenden Erfindung.
Durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die vorstehend beschrieben wurden, lassen sich DNA-Informationen zumindest in dem minimalen Umfang, wie er für die klinische Diagnose und DNA- Tests erforderlich ist, nämlich das Vorliegen oder das Fehlen einer Zielsequenz, gegebenenfalls die Konzentration der Zielsequenz und deren Sequenzeigenschaften, erhalten. Das gesamte Verfahren von der Vorbehandlung bis zur Gewinnung der DNA-Informationen und deren Analyse lässt sich innerhalb kurzer Zeit unter Anwendung einer Vorrichtung von einfacher Bauweise und einfacher Verfahrensmaßnahmen beenden.

Claims

1. DNA-Analyseverfahren, welches umfaßt:

Herstellen einer Probe eines Einzelstrang-DNA-Fragments aus einer Probe eines Doppelstrang-DNA-Fragments,

Denaturieren der Konformation der Probe des Einzelstrang-DNA-Fragments unter gegebenen Denaturierungsbedingungen,

Messen der Schmelzkurve, welche die Beziehung zwischen den Denaturierungsbedingungen und den erhaltenen Denaturierungsergebnissen darstellt, und

Vergleichen der gemessenen Schmelzkurvendaten mit den bekannten Schmelzkurvendaten einer bekannten Sequenz eines Einzelstrang-DNA-Fragments, um Sequenzinformation über die Probe des Einzelstrang-DNA-Fragments zu erhalten und den DNA- Polymorphismus, einschließlich der Substitution einer einzigen Base, in der Probe des Einzelstrang-DNA-Fragments zu analysieren.

2. DNA-Analyseverfahren, welches umfaßt:

Einlagern eines Interkalators, der Fluoreszenz bei einer gegebenen Wellenlänge nach Aufnahme eines Anregungsstrahls einer anderen gegebenen Wellenlänge emittieren kann, wenn er in die Basenpaarungsteile, die durch die Konformation der Probe des Einzelstrang-DNA-Fragments in der Probenlösung gebildet werden, eingelagert wird, wobei die Wellenlänge der von dem Komplex mit dem Interkalator und der Probe des Einzelstrang-DNA-Fragments emittierten Fluoreszenz sich von der Wellenlänge unterscheidet, die von dem Interkalator an sich emittiert wird,

Strahlen des Anregungsstrahls der gegebenen Wellenlänge auf die Probe des Einzelstrang-DNA-Fragments, in das der Interkalator eingelagert ist,

Denaturieren der Konformation der Probe des Einzelstrang-DNA-Fragments in der Probenlösung unter gegebenen Denaturierungsbedingungen, während mit dem Anregungsstrahl bestrahlt wird,

Nachweisen der Änderung der Intensität der Fluoreszenz der vorgegebenen Wellenlänge aufgrund der Denaturierung der Probe des Einzelstrang-DNA-Fragments,

Vergleichen der gemessenen Schmelzkurvendaten mit bekannten Schmelzkurvendaten einer bekannten Sequenz eines Einzelstrang-DNA-Fragments, wobei Sequenzinformation über die Probe des Einzelstrang-DNA-Fragments erhalten wird und DNA- Polymorphismus, einschließlich der Substitution einer einzigen Base, in der Probe des Einzelstrang-DNA-Fragments analysiert wird.

3. DNA-Analyseverfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Vergleich der gemessenen Schmelzkurvendaten der Probe des Einzelstrang-DNA-Fragments mit bekannten Schmelzkurvendaten umfaßt:

das Vergleichen der gemessenen Schmelzkurvendaten mit einem der Datensätze von bekannten Schmelzkurven oder mit Datensätzen von Kurven, die durch lineare Kombination einer Vielzahl von bekannten Kurvendatensätzen erhalten werden, und

Bestimmen, daß der Datensatz der bekannten Schmelzkurve mit dem geringsten statistischen Fehler oder die lineare Kombination der Datensätze mit dem geringsten statistischen Fehler die Sequenzinformation der Probe des Einzelstrang-DNA- Fragments darstellt.

4. DNA-Analyseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Vergleich der gemessenen Schmelzkurvendaten der Probe des Einzelstrang-DNA-Fragments mit den bekannten Schmelzkurvendaten umfaßt:

Berechnen des statistischen Fehlers zwischen den gemessenen Schmelzkurvendaten und einem der Datensätze von bekannten Schmelzkurven oder jedem der Datensätze von Kurven, die durch lineare Kombination einer Vielzahl von bekannten Schmelzkurvendatensätzen erhalten werden, wodurch ein Satz Kurvendaten mit dem geringsten Fehler ausgewählt wird,

Durchführen der Berechnung und Auswahl für jeden der verbleibenden Datensätze der bekannten Schmelzkurven oder jeden der Datensätze von Kurven, die durch lineare Kombination einer Vielzahl von bekannten Schmelzkurven erhalten werden, und

Darstellen einer gegebenen Anzahl von Kurvendatensätzen nach sich erhöhendem statistischen Fehler als Sequenzinformation der gemessenen Probe des Einzelstrang-DNA-Fragments.

5. DNA-Analyseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Konformation der Probe des Einzelstrang-DNA- Fragments thermisch denaturiert wird und die Schmelzkurvendaten aus der Veränderung der Absorption oder der Intensität der Fluoreszenz der Probe gegen die Veränderung der Temperatur abgeleitet wird.

6. DNA-Analyseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Sequenzinformation über die Probe des Einzelstrang-DNA-Fragments durch abwechselndes Ändern der Denaturierungsbedingungen für die Denaturierung und die Renaturierung der Konformation der Probe des Einzelstrang-DNA-Fragments auf kontinuierliche Weise und durch Messen und Analysieren der Hystereseeigenschaften der Veränderung der Absorptions- oder Fluoreszenzintensität erhalten wird.

7. DNA-Analyseverfahren nach Anspruch 2, wobei der Interkalator Ethidiumbromid ist.

8. DNA-Analyseverfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Vergleich der gemessenen Schmelzkurvendaten der Probe des Einzelstrang-DNA-Fragments mit bekannten Schmelzkurvendaten umfaßt:

Vergleichen der gemessenen Schmelzkurvendaten mit der linearen Kombination bekannter Kurvendatensätzen, die jeweils durch Übereinanderlegen gegebener Funktionen vorläufig angepaßt wurden, und

Bestimmen, daß ein bekannter Schmelzkurvendatensatz mit dem geringsten statistischen Fehler als die Sequenzinformation über die Probe des Einzelstrang-DNA-Fragments definiert wird.

9. DNA-Analysegerät, welches umfaßt:

eine Amplifikationsreaktionszelle für die Immobilisierung eines der Amplifikationsreaktions-Primer auf einer Membran und zum Bewirken der selektiven Amplifikation einer spezifischen DNA-Region und zur Herstellung einer Probe von Einzelstrang-DNA-Fragmenten als Analysengegenstand,

eine Spektroskopiezelle zum Halten einer Probelösung, welche die in der Amplifikationszelle hergestellte Probe der Einzelstrang-DNA-Fragmente enthält,

Übertragungsvorrichtung zum Übertragen der Probelösung, welche die Probe der Einzelstrang-DNA-Fragmente enthält, von der Amplifikationsreaktionszelle in die Spektroskopiezelle,

eine spektroskopische Vorrichtung zum Messen der UV- Absorption der Probe der Einzelstrang-DNA-Fragmente in der Probenlösung,

eine Denaturierungsvorrichtung zum Denaturieren der Konformation, gebildet durch die Probe der Einzelstrang-DNA- Fragmente in der Probenlösung, unter vorbestimmten Denaturierungsbedingungen, und

ein eine Signalverarbeitungsvorrichtung zum Vorbestimmen der Denaturierungsbedingungen und zum Speichern von Signalen aus der spektroskopischen Vorrichtung und der Denaturierungsvorrichtung und zum Erstellen der gemessenen Schmelzkurvendaten der Probe der Einzelstrang-DNA-Fragmente, basierend auf den gespeicherten Signalen, und zum nachfolgenden Vergleichen der gemessenen Schmelzkurvendaten mit den Schmelzkurvendaten von bekannten Sequenztypen eines oder mehrerer Einzelstrang- DNA-Fragmente zum Erwerb einer Sequenzinformation über die Probe von Einzelstrang-DNA-Fragmenten und zum Analysieren von DNA-Polymorphismus, einschließlich der Substitution einer einzigen Base, in der Probe des Einzelstrang-DNA-Fragments,

wobei die DNA-Analysevorrichtung eine Vorrichtung zum kontinuierlichen Durchführen eines Fließsystems von der DNA- Amplifikationsreaktion als einleitende Behandlung hin zum Messen der Schmelzkurve ist.

10. DNA-Analysegerät nach Anspruch 9, worin eine Vielzahl von Amplifikationsreaktionszellen über Ventile an die einzige Spektroskopiezelle verbunden ist und die Probenlösung, welche die in jeder der Amplifikationsreaktionszellen hergestellte Probe der Einzelstrang-DNA-Fragmente enthält, nacheinander in die Spektroskopiezelle eingeführt wird.