DK142059B - Anvendelsen af tarm-saltlage til fremstilling af heparin med hoej renhedsgrad - Google Patents

Description

142050

Den foreliggende opfindelse angår anvendelsen af tarm-saltlage, der er opnået ved bestrøning af for tarmslim befriede dyretarme med fast kogsalt, til fremstilling af heparin med høj renhedsgrad ved udfældning og rensning på i og for sig kendt måde.

Med heparin har medicinen for længe siden fået stillet et naturligt forekommende antikoagulationsmiddel til rådighed, hvilket middel ligesom tidligere er uundværligt også i den moderne medicin og finder stadig mere udbredt anvendelse.

I de sidste år er en række metoder, scan alle har til formål at isolere det virksomme stof heparin på etadig mere skånende måde udfra heparinholdigt dyrisk væv, såsom lunge, lever og i nyere tid først og fremmest af tarmslim (mucosa) fra svin, kvæg og får, blevet kendt (britisk patentskrift nr. 754.885, tysk patentskrift nr. 1.228.241, OSA patentekrift nr. 3.058.884 og tysk patentskrift nr. 1.253.868). Sådanne råstoffer har p.g.a. deres lette fordærvelighed den ulempe, at de har begrænset lagringsevne, som ganske vist kan forlænges ved hjælp af frysning, hvilket imidlertid foruden yderligere teknisk indsats også fører til væsentlige omkostningsforøgelser. Ved oparbejdningen bliver såvel driftspersonalet som beboere i de tilgrænsende omgivelser ikke sjældent stillet over for uventede problemer som følge af den dermed forbundne luftforurening.

I tysk patentskrift nr. 1.253.868 beskrives udvinding af heparin sammenfattende for nogle sædvanlige metoder. Derved bringer man det dyriske væv i kontakt med varm, vandig saltopløsning i begyndelsestrinnet med henblik på frigørelse af heparinet fra cellerne. Heparinmængden i det derved dannede medium er yderet ringe.

Det har vist sig, at den på slagterier og tarmafslimningsvirk-somheder fremkomne saltlage indeholder heparin. Denne saltlage fremkommer, når dyretarme, som forinden er blevet befriet for tarmslim, bestrøs med fast kogsalt med henblik på konservering og afvanding. Denne saltlage betegnes i det følgende som saltlage eller tarm-saltlage, når intet andet er anført.

2 142059

Det må derfor vinder hensyn til tysk patentskrift nr. 1.253.868 betegnes som overordentlig overraskende, at den ved simpel indsaltning af dyriske tarme, som forinden er blevet befriet for tarmslim, dannede saltlage indeholder større mængder he-parin. Det kunne heller ikke forudses, at dette heparin foreligger næsten fuldstændig fri for kemisk beslægtede biprodukter, så at der blandt saltlager, der hidtil kun er kendt som et miljøforurenende affaldsprodukt, findes en, der udgør en hidtil ukendt råstofkilde for det som følge af råstofmangel allerede meget knappe heparin. P.g.a. den vidtgående udeblivelse af forureninger, kan oparbejdningen af råheparin foretages særlig skånende, og de i forbindelse med den hidtige teknik kendte omstændelige isolationsmetoder (se USA patentskrift nr. 3.451.996 og britisk patentskrift nr. 1.221.784) bortfalder dermed. Man opnår til slut heparinkvaliteter, som man ikke når op på i de på markedet til rådighed stående he-parinpræparater. Ved udfældning og rensning på i og for sig kendt måde af tarm-saltlage, der er opnået ved bestrøning af for tarmslim befriede dyretarme med fast kogsalt, opnås ifølge opfindelsen hepariner med noget over 200 USP-enheder/mg. De hidtil kendte kromatografiske rensningsmetoder fører til heparin med en titer på 120-180 antikoaguleringsenheder/mg (dansk patentskrift nr. 100.677). De hidtil i handelen gående hepa-rinpræparater indeholder i reglen heparinkvaliteter på 150 USP-enheder/mg, i nogle få tilfælde også 155 USP-enheder/mg.

Med en USP-enhed/mg forstås herved den specifikke aktivitet, som opnås ved U.S.P.-prøven, hvormed hæmningen af dannelsen af småklumper af konserveret fåreplasma måles. 1 USP-enhed svarer til ca. 1,1 international enhed (IE). Da aktivitetsværdierne for de i handelen gående heparinpræparater på trods af talrige fremgangsmådeforbedringer stadig er utilfredsstillende, foreskriver eksempelvis USP, at heparinpræparater (fra tarmslim) skal indeholde mindst 140 USP-enheder. Kun i laboratoriet er det hidtil lykkedes L.W. Kananagh og L.B.

Jaques [Arzneimittelforschung (Drug res.) 24, nr. 12, 1942 (1974)] at isolere heparin ved hjælp af gentagen krystallisation som bariumsalt med maksimalt 175 USP-E/mg.

3 142059

Ved anvendelse af tarm-saltlage, der er opnået ved bestrøning af for tarmslim befriede dyretarme med fast kogsalt, som råstof til fremstilling af heparin ved udfældning og rensning på i og for sig kendt måde er det lykkedes at isolere heparin i teknisk målestok i en sådan renhed, at det foreligger som et næsten farveløst materiale. Alle hidtil fra andre råstoffer hidrørende til rådighed stående råhepariner må derimod først affarves ved hjælp af omstændelige og tabgivende metoder (USA patentskrift nr. 3.179.566).

Saltlage er derimod et lagringsegnet, næsten lugtløst stof, som under langvarig lagring ikke udsættes for kvalitetstab.

Dermed bortfalder kemiske og andre konserveringsmetoder.

Opfindelsen angår således anvendelsen af tarm-saltlage, der er opnået ved bestrøning af for tarmslim befriede dyretarme med fast kogsalt, som udgangsmateriale til fremstilling af heparin med høj renhedsgrad ved udfældning og rensning på i og for sig kendt måde.

Opfindelsen illustreres nærmere i de følgende eksempler.

Eksempel 1 600 liter saltlage blev i et 1500 liter røreværk ved stuetemperatur under omrøring i løbet af en halv time tilsat 600 liter methanol. Der blev efteromrørt i samme tid, hvorefter blandingen henstod i ca. 1 time.

Derefter blev den uklare ovenstående væske dekanteret over i en anden beholder, og de dannede saltkager blev tilbage. Den opnåede suspension henstod derefter i to dage. Derpå blev der atter dekanteret, den ovenstående væske blev bortkastet, og det udfældede materiale blev isoleret ved hjælp af centrifugering. Efter tørring i vakuum opnås 1,68 kg af et produkt, som har 11 USP-enheder/mg. Det består endnu for ca. 60% vedkommende af kogsalt.

En aliquot af det således opnåede råheparin svarende til 425.000 4 142059 USP-enheder eller 38,65 g blev ekstraheret 3 gange, hver gang med 200 ml 2 M kogsaltopløsning, idet der blev omrørt i 1 time ved 60°C. De forenede ekstrakter blev fortyndet med vand, indtil opløsningen indeholdt ca. 0,9 mol/1 chloridioner. Derpå tilsattes 200 ml af en anionbytter ("lewatit" CA 9249) i chlo-ridformen, og der blev omrørt i 1 time. Derpå blev der frasuget og eftervasket med ca. 200 ml 0,9 M kogsaltopløsning. Ionbytteren blev derpå i 5 timer omrørt med 2 M kogsaltopløsning ved 40°C og derefter frasuget samt eftervasket med 2 M kogsaltopløsning. Eluatopløsningen blev forenet med vaskeopløsningen og fældet med et 1,5 gange så stort volumen methanol. Bundfaldet blev fracentrifugeret, eftervasket, først med ca. 50 ml vand-methanol (1+1,5 volumendele) og derpå med ca. 50 ml methanol, samt tørret.

Man opnår 1,91 g Na-heparinat med 202 USP-enheder pr. mg.

15 g af som ovenfor beskrevet opnået natriumheparinat med ga.

200 USP-enheder pr. mg blev opløst i 200 ml 2 M kogsaltopløsning. Opløsningen blev suget gennem et sugefilter, og resten blev først vasket med 30 ml 2 M kogsaltopløsning og derefter med ca. 250 ml fuldstændig afsaltet vand. De forenede opløsninger bleV derpå med fuldstændig afsaltet vand indstillet på en chlorid-molaritet på 0,9. Derefter blev rensningen gentaget med 1 liter "levatit" CA 9249 som ovenfor beskrevet.

De forenede eluat- og vaskeopløsninger blev videreforarbejdet som ovenfor anført. Efter vaskning og tørring af det udfældede materiale opnåede man 11,1 g natriumheparinat, der havde en aktivitet på 254 USP-enheder pr. mg.

- Eksempel 2 3 liter saltlage blev fortyndet med 13 liter vand (se tysk patentskrift nr. 1.156.938). Derpå blev der med eddikesyre (ca.

50 ml) syrnet til pH 3,2. Efter nogle timer var der blevet afsat et udfældet materiale, som efter dekanteringen af den klare, ovenstående væske blev fracentrifugeret. Efter tørring opnår man