DE2527349A1 - Verfahren zum zuechten von pflanzenvarianten mit verbesserten eigenschaften - Google Patents

Description

Verfahren zum Züchten von Pflanzenvarianten mit verbesserten Eigenschaften · _t.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Züchten von Pflanzenvarianten mit verbesserten Eigenschaften. Mit der Erfindung sollen^Pflanzen dadurch verbessert werden, dass vollständig neue phenotypische Eigenschaften geschaffen werden, die im Fall einer vegetativen Vermehrung beständig sind und die oei genetischer Vermehrung unmittelbar fixiert v/erden, ohne den Vorteil der Auswahl genetischer vorheriger Eigenschaften aufgeben zu nüssen.

Bei einer Tflanze oder einem G-ev.'ächs kann r.an annehmen, dass das !Funktionieren in den Zellen durch ein "rohes" genetisches Potential bestimmt wird, das in jedem der Zellkerne des Individuums identisch ist, sowie durch das System oder die epigenetische

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Umgebung, die dieses feste Funktionieren in deren Regulierung verändert. In der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Ausdruck "System oder epigenetische Umgebung" eine Gesamtheit von Veränderlichen, die beim Funktionsablauf in der Zelle eine Rolle spielen, nämlich

1) das zellbildende Gel, das die Elemente des Stoffwechsels enthält und das bestimmte biochemischen und biophysikalischen Gleichgewichten in jedem Augenblick unterworfen ist;

2) Strukturen der Membrane und in der Zelle vorhandene Strukturen, beispielsweise vom Chlorophyll gefärbte Pflanzenzellen (= Sitz der Photosynthese oder Chloroplast) und Iviitochondrien (= Teil des Chondrions der Zellen);

3) diejenigen Wirkungen, in denen sich die Lage jeder Zelle überlagern, und zwar bezüglich der Gesamtheit der Pflanze, und die ein Funktionieren bewirken, das in eine besondere Richtung ausgerichtet ist, und zwar bezüglich der anderen Zellen, deren Funktionieren damit koordiniert wird;

4) das fluktuierende Umgebungsmilieu, in dem die Pflanze wächst.

Die genetische Information kann sich auf · verschiedene Art und Weise ausdrücken, wobei sie dieser Gesamtheit der Faktoren unterworfen ist, deren Wirkung sich identisch in jeder Generation wiederholt. Dies zeigt z.B. die Heteroph_vllie gewisser Pflanzen, beispielsweise Sagittaria sagittifolia, Salvinia, usw.

Mit der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass es möglich ist, ausgehend von einer einzigen und konstanten genetischen Information verschiedene Ausdrücke dieser Information zu erhalten, und zwar lediglich durch imderung der epigenetischen Umwelt. Diese Änderung erfolgt ohne Einfluss eines auf die Zellen ausgeübten Drucks durch Kultur von "Geweben" in vitro.

Man hat schon die Variabilität von regenerierten Pflanzen studiert, die mittels Kultur von Geweben in vitro erhalten wurden. Vgl. hierzu die Arbeiten von Lutz (Rev. Gen. Bot., 1969, 76,

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309-359), die das Studium von morphogenetischen Verhaltensweisen von Gewebekultüren betreffen. Der Artikel beschreibt, dass der normale Tabakstamm für seinen Unterhalt ausser einem Grundmilieu, beispielsweise das .Milieu von "KNOP" (vgl. "La Culture des Tissus Vägetaux", GAUTHEHET R.J. 1959-Ed. Masson et Cie.) oder das Milieu von "LIURaSHIGE J. und SKOOG F. /"1962 Revue Physiologia Plantarum J_5 Seite 473_7, Kinetin und AIA (indolessigsäure) oder Kinetin und 2-4 D ( 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure).

J. Mousseau hat ausserdem die Variabilität einer Pflanzenpopulation untersucht, die aus Neubildungen von Tabak in vitro entstanden sind (Colloque International du G.N.R.S. 293 - Culture de Tissus de Plantes - Strasbourg, 234-239)·

Auch bezüglich anderer Pflanzen wurden Studien durchgeführt. Hier kann man beispielsweise die Arbeit von Pelletier et al. zitieren /Ann. Amelior. Plantes 1971; 21, (2) 221-233.7 "bezüglich der Kultur von weissem Klee in vitro.

Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung, welches im folgenden näher erläutert werden wird, gestattet es, ausgehend von einer Pflanze, die einzigartige und fixierte genetische Eigenschaften hat, Varianten durch Veränderung der epigenetischen Umgebung zu erzeugen. Die Eigenschaften der Varianten bleiben nach mehreren Selbstbefruchtungen konstant. Durch Kreuzung zwischen den Varianten oder Abarten erhält man ohne einen äusseren genetischen Einfluss eine kräftigere Pflanze. Der Ausdruck "kräftiger" bedeutet im Zusammenhang dieser Erfindung eine Pflanze, die schneller und besser wächst und die widerstandsfähiger ist, insbesondere gegenüber Über- oder Untertemperaturen, gegenüber Oranismen, beispielsweise Viren und "Pilzen und gegenüber anderen Faktoren, die normalerweise das Wachstum einer Pflanze stören, und zwar stets verglichen mit einer Kontrollpflanze derselben Art, die durch normale Vermehrung erhalten wurde.

In der vorstehenden Beschreibung bedeutet der Ausdruck "Pflanze" landwirtschaftliche Pflanzen und Küchenpflanzen. Bezüglich der

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landwirtschaftlichen Pflanzen v/ird beispielsweise auf Getreide (V/eizen), Gerste, Soja, Raps, Mais, insbesondere die iⁿ.,-Generation der Homozygoten der Hybriden von Mais usw. verwiesen. Als Beispiel für Küchenpflanzen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet v/erden künnen, seien erwähnt Salat, Erbsen, Bohnen und ähnliche Pflanzen.

Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung-besteht in den folgenden Schritten:

a) Es wird in ein synthetisches Währmilieu Gewebe eingesetzt und kultiviert, welches aus dem Keimprozess von Samenkörnern einer einzigen Mutterpflanze erhalten wird. Das Mahrmilieu für die Kultur besteht einerseits aus einem Grundmilieu, das aus Mineralsalzen, Nährstoffen, Eisen und Saccharose besteht, und andererseits aus Wachsturnssubstanzen in ausreichender Menge, um die Bildung von Keimlingen zu ermöglichen.(cal = wörtlich übersetzt "Schwiele" wird im folgenden als Keimling bezeichnet).

b) Die so ausgebildeten Keimlinge werden in ein morphogenes Milieu pikiert, das aus dem vorstehend definierten Grundmilieu besteht, dessen Gehalt an Saccharose und an Wahcsturnssubstanzen unterschiedlich ist.

c) Man topft die so erhaltenen Pflanzen ein.

Durch Selbstbefruchtung der auf diese Weise erhaltenen Pflanzen erhält man überraschender- und unerwarteterweise Familien von Nachfolgegenerationen, die fixierte genetische Eigenschaften haben, ohne dass ein genetischer äusserer Einfluss stattgefunden hatte. Durch Kreuzung zwischen diesen Familien erhält man zusätzlich kräftigere Pflanzen.

Um nach einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens nach der Erfindung Varianten von Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften zu erhalten, führt-man die folgenden Verfahrensschritte aus:

a) Man aetzt die Keimblätter oder Gewebe, die sich aus dem Keimen vom Samenkorn einer einzigen Mutterpflanze ergeben, in

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das vorstehend definierte Nährmilieu und kultiviert sie, um Keimlinge zu formen,

b) man pikiert die so gebildeten Keimlinge in das vorstehend definierte morphogene Milieu,

c) man topft die so erhaltenen Pflanzen ein,

d) man vermehrt die Pflanzen durch geschlechtliche Vermeh-

Die aus einer einzigen Variante der Pflanze nach der Erfindung hervorgehenden Samenkörner, d.h. einer Pflanze, die genetisch fixierte Eigenschaften hat, oder mit anderen V/orten einer homozygotischen Pflanze, werden unter sterilen Bedingungen gekeimt. Ein Beispiel für das Keimen von Samenkörnern unter sterilen Bedingungen wird weiter unten am Beispiel von Salat gegeben. ·--

Das beim ersten Verfahrensschritt nach der Erfindung zur Anwendung gelangende synthetische Mährmilieu ist ein nicht-morphogenes Milieu, das, wie vorstehend angedeutet, einerseits aus einem aus Mineralsalzen, Nährstoffen, Eisen und Saccharose bestehenden Grundmilieu besteht und andererseits aus geeigneten V/achstumssubstanzen.

Bei dem Verfahren nach der Erfindung kommt eine Gesamtheit von Mineralsalzen zur Anwendung, die aus Makroelementen und aas Uikroelementen bestehen. Beispiele für Makroelemente und Mikroelemente, die für die Zwecke der Erfindung geeignet sind, werden weiter unten gegeben.

Bezüglich der für die Zwecke der -Erfindung geeigneten Y/achstumssubstanzen sei beispielsweise auf OL-Indolbuttersäur.e (AIB) verwiesen, Qt-HaphthaliiBSsig—säure (ANA), 6-Furfuryl amino pur in (Kinetin), 2,4-Dichlorphenoxyessig—säure oder (2,4 D), Indol

säure (AIA), Benzyladenin (BA) oder jede andere analoge Wachstums sub stanz, die der Pachmann verwendet. Die vorstehend angegebenen Hamen oder Abkürzungen in Klammern sind für den Pachmann geläufig. Sie werden im weiteren Verlauf dieser Beschreibung verwendet. Der Pachmann kann durch itoutineversuche die Konzentra-

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tionen der Waehstumssubstanzen bestimmen, die für die Zwecke der Erfindung geeignet sind.

Die Kultur im synthetischen Nährmilieu wird bei der Erfindung vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 18 und 23 C null bis 18 Stunden lang pro Tag durchgeführt, und zwar unter den wirksamsten Beleuchtungsbedingungen, um die Chlorophyllassimilation zu begünstigen. Diese Bedingungen sind für den Fachmann leicht zu bestimmen.

Das Nährmilieu enthält eventuell ein Geliermittel, beispielsweise Agar. Das Hydrolysat des Kasein und der Milch der Kokosnuss können für flüssige Kulturmilieus verwendet werden.

Der pH-Wert der Milieus kann in grossen Grenzen schwanken, ohne das Wachstum des Keimlings zu stören. Für die Verfestigung des Nährbodens bevorzugt man jedoch einen pH~Yfert in der Grössenordnung zwischen 5,7 und 6,5. Bei flüssigen Nährmilieus liegen geeignete pH-Werte im Bereich zwischen 5,5 und 6,5.

Eisen wird vorzugsweise dem Nährmilieu in Gegenwart eines Chelatmittels zugefügt, beispielsweise in Gegenwart van Äthylendiamintetraessigsäure (SDTA).

Ss ist besonders vorteilhaft, die Keimlinge beim Verfahren nach der Erfindung in nicht-morphogenen Bedingungen während einer Mindestzeit von wenigstens 2 aufeinanderfolgenden Umpflanzungen oder Pikierungen zu halten.

Die so gebildeten Keimlinge werden anschliessend in ein morphogenes Milieu pikiert. Das morphogene Milieu, das bei der Erfindung zur Anwendung kommt, besteht aus einem Grundmilieu, das beim Verfahrensschritt der nicht-morphogenen Kultur ausgebildet wurde, und zwar einem Grundmilieu, bei dem der Gehalt an Saccharose unterschiedlich vom Gehalt in nicht-morphogenem Milieu ist, sowie unterschiedlich zu einer oder mehreren V/achstumssubstanzen. Man pflanzt einmal um oder man lässt den Keimling sich regenerieren.

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Die Konzentrationen "bezüglich der Wachstumssubstanzen im morphogenen Milieu sind unterschiedlich von denen des nicht-morphogenen Milieus. Pur den Fachmann ist es einfach, durch Routineversuche diese Konzentrationen zu bestimmen. Man kann jedoch sagen, dass das morphogene Milieu im allgemeinen nicht 2,4 D enthält, weil diese Substanz im morphogenen Milieu vorliegt.

Die so erhaltenen Pflanzen werden anschliessend eingetopft und zunächst unter Bedingungen kultiviert, die im wesentlichen den Bedingungen für die morphogene Kultur entsprechen, und die im folgenden für Salat definiert werden. Die Bedingungen werden nach und nach den normalen Umweltbedingungen angepasst (Aussenkultur).

Das Verfahren nach der Erfindung wird im folgenden anhand der Fig. 1 näher erläutert, woraus sich weitere wichtige Merkmale ergeben.

Das Verfahren nach der Erfindung wird im folgenden genauer unter Bezugnahme auf Salat beschrieben, ohne dass dies eine Beschränkung bedeutet.

In dieser Beschreibung wird der Ausdruck "Salat" in seinem weitesten botanischen Sinn verwendet. Er ist synonyjn mit der genaueren botanischen Bezeichnung "Lactuca sativa L". Eine bibliografische Referenz, die sich auf die Gesamtheit dieser Art erstreckt, ist "Cultures maraichores" von Laumonnier R-1962 /"J.B. Baillere -Nelle Sncycl, Agricole Band

V/ie vorstehend angedeutet, keimen die Samenkörner unter sterilen Bedingungen. Ss wird bevorzugt, die Samenkörner des Salats wie folgt keinem zu lassen:

Nach dem Anfeuchten in einem feuchten Kittel, beispielsweise

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dem Mittel, das unter dem Handelsnamen "Teepol" erhältlich ist, werden die Samenkörner in absolutem Alkohol sterilisiert und anschliessend in 8 #-igem Calciumhypochlorid 20 Minuten lang.

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Sie werden anschliessend dreimal mit sterilem i/asser gewaschen. Dann werden sie steril auf ein feuchtes Filterpapier in eine Petrischale abgelegt. Sie werden 48 Stunden lang in einem Kühlschrank einer Temperatur von 4 C ausgesetzt, um das Keimen zu regulieren und um eine eventuelle Dormanz zu heben.

Das Keimen erfolgt im Treibhaus oder in einem Wärmeschrank bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und 23°C. Das Keimen kann im Dunkeln erfolgen. In diesem Fall erhält man eine starke Verlängerung des Stengels. Es kann auch bei Tageslicht erfolgen, beispielsweise mit Beleuchtungszeiten zwischen etwa 8 und 12 Stunden, wodurch ein schnelleres Keimen und ein kürz'erer Stengel erhalten wird.

Nach 4 bis 5 Tagen zeigt sich eine weisse Wurzel, die mit Häärchen bedeckt ist, anschliessend mit dunkelgrünen Keimblättern, die dann im Glas (in vitro) unter sterilen Bedingungen nach dem Verfahren nach der Erfindung kultiviert werden.

Das verwendete Milieu für die Kultur bei dem Verfahren nach der Erfindung wird wie vorstehend erläutert gebildet: A) aus einem Grundmilieu, das enthält:

1) eine Gesamtheit von Mineralsalzen, die aus Makroelementen und Mikroelementen bestehen,

2) Nährstoffen,

3) Eisen in Gegenwart eines Ghelatmittels, beispielsweise Äthylendiamintetrftessigsäure (EDTA) und

4) Saccharose;

und B) aus Wachsturnssubstanzen, die aus einer der vorstehend erwähnten Substanzen ausgewählt werden, die vorzugsweise sind:

OC-Naphthalinessigsäure (ANA) und/oder 6-Furfurylaminopurin (Kinetin)·

Das Nährmilieu enthält eventuell wie vorstehend erwähnt ein Geliermittel, beispielsweise Agar. Falls es sich um ein Milieu für flüssige Kulturen handelt, können das Hydrolysat von Kasein

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und der Kokosnussmilch verwendet werden.

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Der pH-Wert der verwendeten Milieus kann in grossen Grenzen variieren, ohne das Wachstum des Keimlings zu stören. Zwecks Verfestigung des Nährbodens verwendet man jedoch vorzugsweise einen pH-Wert in der Grössenordnung zwischen 5,7 bis 6,5. Bei flüssigen Milieus sind geeignete pH-Werte im Bereich zwischen 5,5 und 6,5.

Die im Nährmilieu enthaltenen Makroelemente werden wie folgt zusammengesetzt: Kali- und Ammoniumnitrat, Magnesiumsulfat (KgSO₄, 7H₂O), Calciumchlorid (CaCl₂, 2H₂O) und Kaliuramonophosphat. Die Gesamtheit der Mineralsalze wird auf dem Fachgebiet im allgemeinen als "Makroelemente von Murashige und Skoog" bezeichnet /"Revue Physiologia Plantarum JJj, Seite 473_J7.

Die im Kulturmilieu enthaltenen Mikroelemente sind Mangansulfat, Zinksulfat und Kupfersulfat, Kali3odid,Borsäure, Calciumchlorid und Doppeloxyd von Molybdän und von Natrium. Diese Gesamtheit der Elemente sind "die Mikroelemente von Murashige und Skoog". Nach einer abgeänderten Ausführungsform des Verfahrens nach der Erfindung können Calciumchlorid und Doppeloxyd des Molybdäns und des Natriums durch die Gesamtheit ersetzt werden, die vorstehend als Aluminiumchlorid (Al Cl₅, 6H₂O) und Nickelchlorid (NiCl₂, 6H₂O) beschrieben wurden. Diese andere Gesamtheit der Mikroelemente wird im allgemeinen "Mikroelemente von Heller" genannt /"vgl. "La Culture de Tissus Yegetaux" von Gautheret, am angegebenen 0rt7«

Die Mengen der Makroelemente und Mikroelemente, die notwendig sind, um ein Liter des Kulturmilieus nach der Erfindung herzustellen, sind wie folgt:

Vakroelemente SKOOG

Mikroelemente SKOOG

Salz

Gewicht in mg/1 des Milieus

Salz

Gewicht in mg/1 des Milieus

NH₄ITO₃
KNO.

'3

CaCl₂,
MgSO₄,

1650 1900

(2 H₂O) 440

(7 H₂O) 370

170

MnSO₄, (4 H₂O)
ZnSO₄, (7 H₂O)
H₃BO₃

Na₂MoO,, (2 H₂O)
/ i

₂ CuBO

50988*2

(5

22,300 8,600 6,200

0,830 0,350

0,025

Nach der vorstehend beschriebenen Abänderung kann man auch
folgende Zusammensetzung nehmen:

Makrοelemente SKOOG	H5BO3	Hikr0elemente H3LLER	Gewicht in mg/1	H2O)	1,000
ςη1, Gewicht in mg/lg	ZnSO4,		des Milieus	0)	1,000
ucU-z des Milieus	MnSO4,			H2O)	0,076
NH4NO3 1650	CuSO4,		H2O)	0,030
KNO5 1900	AlCl3,	(7		0,050
CaCl2, (2 H2O) 440	KJ	(Hp	2°)	0,010
MgSO4,(7 H2O) 370	NiCl2	(5	0,030
KH2PO4 170	(6
	(6 H

Wie vorstehend angedeutet, enthält das Kulturmilieu auch die
nachstehend zitierten Nährstoffe in den folgenden Proportionen
für einen liter des Kulturmilieus:

Meso-inosit Calciumpantothenat Nikotinsäure Vitamin B6-Pyridoxin Vitamin B1-Thiamin Biotin

100,00 mg 1,00 mg 1,00 mg 1,00 mg 1,00 mg 0,01 mg

Diese Gesamtheit der Nährstoffe wird im allgemeinen als "Nährstoffe von Morel" bezeichnet /vgl. GAUTHERET am angegebenen Orte/.

Eisen wird vorzugsweise dem Nährmilieu in Anwesenheit eines Chela.tmittels zugefügt, beispielsweise in Anwesenheit von Äthyiendiamintetraessig—säure (EDTA). Kan verwendet beispielsweise für einen
Liter Nährmilieu 37,2 mg Na₂ EDTA und 27,8 mg PeSO₄ (7 H₂O), was
einer Eisenkonzentration von 5,6 mg/l entspricht.

Versuche haben gezeigt; dass jede Wachsturnssubstanz, die im Kulturmilieu vorliegt, beim Salat erfindungsgemäss in einer Konzentration verwendet werden soll, die nicht grosser sein soll als 1 mg/l (10"* ^ g/l), bezogen auf das Nährmilieu. Eine höhere Konzentration

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als 1 mg/l verhindert die Entwicklung des Stammes. Andererseits kann der Fachmann leicht die Mindestmenge der Wachsturnssubstanz bestimmen, die notwendig ist.

Nach der Erfindung ist eine Konzentration jeder Y/achs turns subs tanz, die im Kulturmilieu vorliegt, von 1 mg/1 wirksam, um das Y; achs en der Keimline beginnen zu lassen. Sine zwei- bis fünfmal grössere Menge reicht im allgemeinen aus, um die Entwicklung sekundärer Keimlinge aufrechtzuerhalten, die von primären Keimlingen ausgeht. Man hat gezeigt, dass die Viachsturnssubstanz AHA, die in geeigneten Mengen mit dem Grundmilieu nach der Erfindung verwendet wird, zur Wurzelbildung führt, dass die Mischung ANA-Kinetin die Ausbildung von Knospen begünstigt und dass die Wachsturnssubstanz Kinetin es gestattet, den Keimling in nicht-morphogenen Bedingungen zu halten. Der Fachmann kann leicht die zu verwendende Substanz und deren Konzentration in Abhängigkeit von der betreffenden Wachsturnsphase bestimmen.

Andererseits haben Vergleichsversuche, die in synthetischen Nährlösungen durchgeführt wurden, die sich von denen nach der Erfindung unterschieden, und zwar in der .Zusammensetzung ihres G-rundmilieus oder in der Art der Wa chs turns sub st anz en, gezeigt, dass die bei der Erfindung zur Verwendung kommenden Kulturmilieus spezifisch für die Entwicklung der Keimlinge mittels Kultur der G-ewebe in vitro im Pail von Salat sind.

Die Kultur in einer synthetischen Nährlösung wird erfindungsgemäss vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen etwa 18 und 23⁰C 0 bis 18 Stunden pro Tag lang durchgeführt, und zwar unter den günstigsten Belichtungsbedingungen, um die Chlorophyllassimilation zu begünstigen. Diese Assimilationsbedingungen sind-für den Pachmann leicht zu bestimmen. Die Kulturen in flüssigem fcilieu werden im allgemeinen bei 20⁰C und 15 Stunden am Tag durchgeführt.

Bei Salat verläuft die Ausbildung der Wurzeln nicht gleichzeitig mit der Ausbildung der Keime des Keimlings. Die Wurzelbildung kann ohne Zusatz von Wachstumssubstanzen stattfinden, aber die

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Latenzzeit ist oft grosser als ein üonat. Bach dein Verfahren nach der Erfindung werden die Keimlinge in ein morphogenes Milieu pikiert, das eine Vachsturnssubstanz enthält, die die Ausbildung der Keime induziert. Man entnimmt sobald es eine sichtbare Regeneration auf dem Keimling gibt, die Keime, sobald diese eine ausreichende Grosse haben. Man setzt sie in ein morphogenes Milieu, das eine vvachstumssubstanz hat, die die Y/urzelbildung einleitet: Ein solches Milieu wird im folgenden wurzelbildendes Milieu genannt. Dieses wurzelbildende Milieu besteht aus dem vorstehend definierten Grundmilieu mit zusätzlicher Saccharose und einer Wachs turns subs tanz die od.-Naphthalinessigsaure ist (ANA) oder OC-Indolbuttersäure (AIB) und Agar. Agar wird in ausreichender Menge verwendet, um die Keime an Ort und Stelle zu halten, und um nicht die Aussendung von Wurzeln zu stören. Man hat gefunden, dass zum Überleben der Keime auf die Saccharose nicht verzichtet werden kann, v/eil eine totale Abwesenheit von Agar nicht die Ausbildung von Wurzeln favorisiert. Der pH-',Vert des wurzelbildenden Milieus liegt vorzugsweise zwischen 5>7 und 6,5.

Ein wurzelbildendes Milieu, das für die Zwecke der Erfindung besonders geeignet ist, enthält das vorstehend definierte Grundmilieu, dem man pro Liter etwa 20 - 35 g, vorzugsweise 30 g Saccharose und die Yifachstumssubstanz zugeführt hat. Die für die Keimlinge wurzelbildende Substanz ANA leitet die Regeneration von dichten und knotenreichen Wurzeln ein. Andererseits verhindert sie deren. Aussendung bei Konzentrationen über 10 g/l· Im Gegensatz dazu ist die Substanz AIB bei zehnmal schwächeren Dosen wirksam und bewirkt weniger häufig anormale V/urzeln. Die für die V/urzelbildung der Keime ,bevorzugte V/achs turns subs tanz nach der Erfindung ist also AIB. Der zweite Verfahrensschritt des Verfahrens nach der Erfindung wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen etwa 5 und 20⁰G, vorzugsweise bei etwa 15°C, 8 Stunden lang pro Tag durchgeführt. Am Ende eines Zeitraumes zwischen 7 und 21 Tagen etwa können die Keime eingetopft werden.

Durch das Verfahren nach der Erfindung können Varianten von Salat erhalten werden, wie dies die nachstehend erläuterten Versuchs-

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ergebnisse zeigen. Diese Varianten unterscheiden sich von allen Varianten, die durch die herkömmlichen Mutationsmethoden erhalten worden sind. Die während der Kultur der "Gewebe" in vitro induzierten Abänderungen verändern die epigenetische Umgebung der Zelle. Diese epigenetischen Variationen rufen keine Änderungen des Genoms hervor, jedoch in der Abfolge und Intensität des Programms, oder sie betreiben die Entwicklung von redundanten Genen.

Der Phenotyp jeder nach der Erfindung erhaltenen regenerierten Pflanze ergibt sich aus '.Wirkungen zwischen einer intakten genetischen Information, der eingeführten zellenbildenden Störung während der Kultur der "Gewebe" auf dem Niveau der Keimlinge, wovon er ein Resultat ist, und der Umweltbedingungen, in denen sich die Pflanze entwickelt.

Die zellenbildende Störung, die während der Kultur der "Gewebe" in vitro des Keimlings induziert wird, ist umso akzentuierter, als die Keimlinge über eine gev/isse Zahl von Umpflanzungen in nicht-morphogenen Bedingungen gehalten werden. Unter diesen Bedingungen ist jede Zelle sehr wenig "spezialisiert". Ihr Niveau oder zellbildender Zustand verändert sich wenig. Das funktionieren des Genoms kann also ein sehr grosses Variationsfeld haben:

- Zunächst, bedingt durch die geringe Anziehung, die auf die Zelle einwirkt und sie aus ihrer Regulierung "abweichen" lässt, d.h. bei der Änderung des Ausdrucks der Gesamtheit des Genoms, die mit dem epigenetischen Zustand verbunden sind;

- des weiteren, weil die "ZeilVariante", die im Kern des Keimlings erscheint, leicht überlebt, v/eil von ihr wenig Leistung verlangt wird.

Zusammengefasst kann gesagt werden, dass die Abänderungen vorzugsweise während der Kultur der amorphen Keimlinge eingeführt werden, d.h. erst von der Morphogenese der Keime ausgehen, die man möglicherweise wahrnimmt. Die geerbte Information der neu geformten Pflanzen kann verwendet oder "befreit" werden, und zwar nach einem besonderen Programm, das von demjenigen der Vergleichspflanzen abweicht.

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Es wird somit insbesondere bei dem Verfahren nach der Erfindung bevorzugt, dass die Keimlinge wenigstens zwei oder drei aufeinanderfolgende Umtopfungen lang in nicht-morphogenen Bedingungen gehalten werden. Eine grössere Anzahl von Umtopfungen, beispielsweise sechs Umtopfungen oder mehr, ist nicht notwendig, um Varianten zu erhalten. In gewissen Fällen kann dies jedoch ohne Nachteil geschehen. Derartige Bedingungen werden beispielsweise erhalten, wenn die Kulturen vom primären Keimling an im Dunkeln gehalten werden oder wenn nur Kinetin ohne Kupplung mit ANA verwendet wird oder durch mechanische Einwirkung» wodurch die Zellmenge von der Kultur aus dem bewegten flüssigen Milieu abgeschieden wird. Die Kulturen werden vorzugsweise im Dunkeln gehalten ausgehend vom primären Keimling während zwei bis drei Umtopfungen.

Das Verfahren nach der Erfindung kann bei allen Arten von Salat angewendet werden, nämlich Gewächshausarten, Wintersalat usw., beispielsweise die Arten "VaI d'Orge", "Gallega", "Averya Ep₇", "Batavia".

Bei dem synthetischen Nährmilieu nach der Erfindung ergibt 3ich die Ausbildung eines primären Keimlings," der sich dem Milieu anpasst, indem neue Substanzen verarmt oder freigesetzt werden. Das Pikieren in ein neues Milieu, das/aem Anfangsmilieu identisch ist, zerstört das vorher ausgebildete Gleichgewicht im Keimling und führt zu einer schnellen Nekrose. Auf diesem Niveau wird eine Vergiftung vermieden, indem die Belastung des Milieus an Wachstumgssubstanzen verringert wird. Versuche haben gezeigt, dass die Stengelbildung, die Vermehrung oder Regeneration von durch das Nährmilieu verursachten Wurzeln,, welches Nährmilieu für die Ausbildung der primären Keimlinge verweniet wird, dass diese Phänomene unverändert bleiben, wenn die Keimlinge in dasselbe Grundmilieu pikiert werden, das etwa zwei bis fünfmal weniger Wachstumssubstanz enthält...

Die primären Keimlinge können dazu dienen, flüssiges Milieu auszusäen. Einen Monat nach dem Beginn des Kultivierens kann man feststellen, dass die Keimlinge verwittert sind, und dass die

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Zellmengen sich aktiv vermehrt haben. Sie bilden eine dichte Kultur aus, deren Farbe gelb, okergelb oder hellgrün ist, je nach den Keimlingen. Die Zellvermehrung im bewegten flüssigen Milieu ist viel schneller als die Zellvermehrung im Nährmilieu. Dies beruht darauf, dass die Wachstumssubstanzen viel schneller zu allen Zellen der Keimlinge gelangen:als bei einem LIilieu mit einem Nährboden, v/o es eine gewisse Latenzzeit gibt, die der Ausbreitung der V/achstumssubstanzen entspricht, um in das Innere der Keimlingszellen zu kommen. Die Kultur im flüssigen Milieu ist eine Variante der Erfindung, insbesondere um morpho- gene Bedingungen zu erhalten. Das Plaseinhydrolysat und Kokosmilchhydrolysat, die verwendet v/erden, um das flüssige LIilieu auszubilden, gestatten es jedoch nicht, vollständig identische Milieus zu erhalten, weil dies Naturprodukte sind. Die bevorzugte Perm für das synthetische Nährmilieu nach der Erfindung ist somit der Nährboden.

Durch Kultur in vitro erhält man nach der Erfindung eine sehr breite Spanne verschiedener Neubildungen. Dies entspricht der Homozygotenstruktur. Es gibt alle Zwischenformen zwischen rohen Umrissen einer organisierten Struktur und einem Keim, nämlich:

- grüne Xnötchen, die Auswüchse bilden, "'

- Blätter, die direkt aus dem Keim spriessen;

. mit besonderer durchsichtiger Textur, etwa wie "eingemacht"-mit unregelmässiger und schlecht definierter Kontur ohne Achse oder gut strukturierte Nerven; . dicke, dunkelfarbige,runde oder sehr zackige Blätter; • feinere zartgrüne und konische Blätter;

- Knospen mit sehr geraden Blättern.

Man kann keine Y.urzelbildung bei diesen verschiedenen Formen beobachten, die dem Tode geweiht sind.

Is gibt verschiedene Keimformen:

1) rosettenförmig', mit sehr grossen, runden Blättern,

2) mit sehr langen Zwischenknoten und "buschigen" und schlecht ausgebildeten Hilfsknoten,

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3) mit Verwachsungen, die während des ganzen Wachstumszyklus erhalten bleiben,

4) mit Blättern, die von einer Pflanze zur anderen verschieden sind, aber auch bei derselben Pflanze: unregelmässig geformte Blätter mit blattstielartigem Konus und waffelartigen Abweichungen. Diese Organe erscheinen nur am Anfang der Morphogenese. Anschliessend nimmt der Prozess der Differenzierung reguläre Pormen an, und der Keim benimmt sich normal.

Die ausgebildeten Keime v/erden anschliessend pikiert, wie vorstehend angedeutet, und zwar in ein wurzelbildendes Milieu.

In diesem Stadium erfolgt eine erste natürliche Auslese der Keime (Plantule = Keim oder kleine Pflanze). Nur die Individuen, die verwurzeln, können eingetopft werden und ihren Zyklus durchführen. Dies zeigt die Bedeutung des wurzelbildenden Milieus.

Wenn die Wurzeln gebildet sind, bildet die Aufnahme in der Erde eine zweite Barriere einer Gegenauswahl. Die Keime kommen aus sterilen Behältern, die sehr feucht sind. Die sehr dünnen Blätter und auch die Wurzeln sind sehr zerbrechlich. Sie müssen sehr vorsichtig behandelt werden und sind auch bezüglich Austrocknung und Verfaulen empfindlich.

Damit sich die Pflanze unter besten Bedingungen entwickeln kann, v/erden die Töpfe in ein kleines Gewächshaus eingesetzt. Sie werden 18 Stunden pro Tag beleuchtet. Im Verlauf einer Woche geht man von gesättigter Luft auf einen Feuchtigkeitsgrad der Luft über, der dem der Aussenluft entspricht-, indem die Abdeckung des Gewächshauses nach und nach angehoben wird.

Chromosomenzählungen, die an den so erhaltenen"? "-Pflanzen (P-Generation oder Eltern-Generation) durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass jede Pflanze eine normale Chromosomenzahl hat, näm-r lieh 2n = 18. Diese ist identisch mit der der einzigen Liutterpflanze, von der sie abstammen. Dies zeigt, dass es keinen Chro-

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inosoiiienverlust gegeben hat.

Dennoch hat man festgestellt, dass die erhaltenen P₀-Pflanzen bezüglich Vergleichspflanzen, die durch normale Vermehrung ausgehend von Samenkörnern des Salats derselben einzigen Futterpflanze aufgezogen wurden, Unterschiede haben, und zwar sowohl vom morphologischen Standpunkt aus, wie auch physiologisch. Als beobachtete Unterschiede kann man insbesondere feststellen:

- das schnellere Wachsen der P -Pflanzen. Diese wachsen schneller als gleichzeitig in Gewächshäusern und im Laboratium kultivierte Vergleichspflanzen,

- in jedem Fall bildet sich der "Apfel" v/enig oder gar nicht. Bei zu hoher Temperatur ist der 'tfuchs fast unmittelbar.

- die Entwicklung des Blütenzweiges,

- die Grosse bzw. Gestalt und Höhe der Pflanze, die kleiner sind als normal draussen kultivierte Pflanzen.

Andererseits wurde festgestellt, dass es verschiedene Ξ-ntwicklungsmodalitäten gibt, die auf der Jahreszeit beruhen, in der sich die P₀-Pflanze entwickelt.

Es ist bekannt, dass Salat eine einhäusige Pflanze ist. Die Selbstbefruchtung ist also leicht. Es genügt, die Gesamtheit der Blütenstände mit einem Sack zu schliessen, der unten gut geschlossen wird. Dadurch vermeidet man die Befruchtung durch Insekten und den Verlust der Saatkörner der ersten reifen Fruchtstände.

Die sich aus jeder degenerierten P_Q-Pflanze ergebenden Samenkörner ergeben die P-,-Generation der Pflanze. Die Selbstbefruchtung der P-j-Pflanzen ergibt die Generation P₂ usw. Jede dieser Generationen wird genetisch durch Kultur im Gestell untersucht. In der P₁ -Generation zeigt die Analyse, dass es Abtrennungen unter gewissen Familien geben kann. Hat man einmal die Varianten erhalten, die sich auf diesem Niveau P-] nicht mehr trennen, so gibt es bis zum Ende keine weitere- genetische Abtrennung. Die Chromosomenzahl der Individuen ist immer normal (2n = 18). Andererseits wurde festgestellt, dass die Gesamtheit der Varianten der morphologi-

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sehen Unterschiede Dezogen auf Vergleichspflanzen, insbesondere eine Verringerung im Pflanzengewicht, eine Vergrösserung in der Zahl der entwickelten Hilfsaugen ergibt, die meistens mit dem Yifachstum einer grösseren Anzahl von Hilfsblättern verbunden ist, während die Anzahl der Blätter des "Apfels" sich selten zu ändern scheint. Man konnte auch feststellen, dass eine Tendenz zur Schaffung eines Pflanzentyps besteht, deren Grosse und gelegentlieh auch deren grösste Blattlänge kleiner sind als bei den Vergleichspflanzen.

Abgesehen von den bereits erwähnten Unterschieden in der Kultur der Gewebe muss man auch darauf hinweisen, dass sich eine Abweichung oder Seitenlinie ergibt, eine Verdoppelung des "Gedächtnisses" und der "Ansteckung", bezogen auf das Funktionieren der Zelle.

Dies führt zu der Überlegung, dass die auf demselben Niveau einer neu gebildeten Knospe befindlichen Zellzonen einen zellbildenden Zustand haben können, der ihnen eigen ist, wenn die Zellen, die jeweils diese Gebiete verursacht haben, selbst sieh in einem verschiedenen epigenetischen Zustand befinden.

Diese Tatsachen gestatten es, die Anwesenheit von verschiedenen Blatt-Typen an derselben regenerierten Pflanzen zu erklären.

Andererseits wurde festgestellt, dass es bei ein und demselben Stamm verschiedene Typen von Varianten gibt:

- ausgehend von verschiedenen Keimlingen und

- ausgehend von demselben Keimling.

Zwei Zellen eines bestimmten Keimlings haben keine identische Funktion, selbst wenn sie eng benachbart sind. Sie sind umso unabhängiger voneinander, wie ihr Abstand voneinander wächst.

Bei der Korphogenese oder Umwandlung der Pflanzen der Generation P₁ und P₂ hat man festgestellt, und zwar durch Analyse der Blattzahlen bei verschiedenen Stadien, dass das Verhalten jeder Familie der Varianten oder der Vergleichspflanzen nicht statisch ist. Es gibt eine eigene Entwicklung jeder Familie während des

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- ¹9 - 252734S

gesamten v7a chs turns zyklus. Jede Familie bildet ein System, das seinen eigenen Rhythmus und seine eigene Parameter besitzt.

Die Selbstbefruchtung der Varianten ergibt keine Trennung vom Mendelschen Typ. Man hat auch die Ergebnisse von reziproken Kreuzungen der Varianten mit den Vergleichspflanzen und den Varianten zwischen diesen studiert. Die bezüglich der Vergleichspflanzen _t und der Varianten des Salats, der nach Kultur in vitro und anschliessender Selbstbefruchtung erhalten wurde, hat gezeigt, dass es eine Übertragung der Stärke gab, wenn man die nachkommen vergleicht, die sich aus der Kreuzung bzw. aus der Selbstbefruchtung ergeben.

Nach der Erfindung kann man ausgehen von einer einzigen Salatart und durch Kreuzung in dieser Art eine homozygotische Pflanze erhalten, die lediglich deshalb stärker ist, weil die epigenetische Umwelt verändert wurde. Diese neue Pflanze kann im Zeitraum von etwa 3 Monaten erhalten werden. Dies bedeutet einen beträchtlichen Vorteil verglichen mit früheren Züchtungsverfahren, wobei darauf verwiesen sei, dass bis heute die Züchtung einer homozygotischen Pflanze die Kreuzung einer Pflanze einer bestimmten Art mit einer anderen Art über 8 oder 9 Generationen verlangt hat, bevor die Pflanze fixiert war, d.h. bevor eine homozygotische Pflanze erhalten wurde.

Wie vorstehend erläutert ist das Verfahren nach der Erfindung auf landwirtschaftliche Pflanzen, beispielsweise G-etreide, Soja, Hais, Gerste, Raps usw. und auf andere sog. Küchenpflanzen oder Gemüsepflanzen anwendbar.

Bezüglich des Getreides (V/eizen)-wird im folgenden die Zusammensetzung eines Milieus gegeben, das für eine nicht-morphogene Kultur der Gewebe geeignet ist, die sich aus den Keimen einer einzigen Llutterpflanze des Korns ergeben. Dieses Kilieu besteht aus den folgenden Substanzen:

1. Ein Grundmilieu enthaltend:

- Makroelemente und IJikroelemente von MILLER

- Harnstoffe von PUJII (x 1 oder χ 10)

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und von Glyzin 2.10 kg/l

- Fe EDTA 10~⁴ M oder 0,5 10~⁴ M

- Agar 1 i°

- Saccharose 12 $

2. Sine Wachsturassubstanz, die 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure ist (2,4 D) (Konzentration 2,10" kg/l).

Ein für die Erfindungszwecke geeignetes morphogenes Milieu, ebenfalls zur Aufzucht von Getreide, besteht aus dem vorstehend definierten Grundmilieu, bei dem der Saccharosegehalt bei nur 2 ^cß> liegt und aus einer V/achsturnssubstanz, die aus Indolessigsäure (AIA) in einer Konzentration von 10" besteht.

Im folgenden werden Beispiele für ein Milieu gegeben, das für die nicht-morphogene Kultur von Geweben geeignet ist, das sich aus dem Keimen von Mais und Soja ergibt.

Nicht-morphogenes Milieu für Mais

a) Grundmilieu

Mikroelernente und Makroelemente von MILLER wie vorstehend definiert.

Saccharose 30 g/l

Eisen EDTA 5.10~⁵ kg/l Nährstoffe FUJII 1 ml/l

b) Wachstumssubstanzen

2,4 D 5.1O"⁶ kg/l AIA 5.1O"⁷ kg/l Kinetin 10~⁷ kg/l

Nach einer besonders vorteilhaften Variante fügt man diesem Milieu andere Aminoessigsäuren hinzu, beispielsweise Serin und Inosit.

Nicht-morphogenes Milieu für Soja a) Grundmilieu

Makroelemente von GAMBORG 100 ml/l

Mikroelemente ·■" " 1 ml/l

Fe-EDTA 10 ml/l

Nährstoffe MOREL 2 ml/l

Saccharose 20 g/l

Agar

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252734S

b) " achs turns subs tanzen

2,4 D 10"⁶ kg/1

BA 2,1Ο"⁷ kg/l

pH-Wert des Milieus 5,8

Morphogene Milieus für Kais und Soja können aus nieht-morphogenen Milieus wie vorstehend definiert dadurch erhalten v/erden, dass der Gehalt an Saccharose und an Wachsturnssubstanz geändert wird.

Die Idikr ο elemente und Makro elemente MILLER und GrAIiBORG- wie auch Nährstoffe TUJ11 sind in der Fachwelt bekannt. Für v/eitere Einzelheiten sei auf die folgenden Veröffentlichungen verwiesen:

"In vitro development of callus from the pollen of Lolium and Hordeum" von Clapham D. 1971. Z-Pflanzensüchtung 69» 2, 142-155 für die Nährstoffe von I⁷UJII,

"Cellule Induction and organ redifferenciation of Triticum Aegilips and Agropyron by another culture" von KIMAiDA und SAKAIvIOTO S. - 1971 - Japanese Journal of Palynology. 1, 1-8, für die Makro- und llikr ο elemente von MILLER, und

"Culture methods and Detection of glucanases in suspension cultures of wheat and barley" von GAI.IBORG- O.L. und STSLEIGH D. 1968 - Canad. J. Bioehem. 46, 417-421.

Die Erfindung wird im folgenden in weiteren Einzelheiten durch Beispiele näher erläutert.

Beispiel I

Dieses Beispiel erläutert die Kultur von Geweben in vitro nach dem Verfahren nach der Erfindung. Die verwendete Salatart ist Averya Ep^. Die Bedingungen der Kultur waren v/ie folgt: 'temperatur 23 C 18 Stunden des Tages. Die Beleuchtung wurde durch Leuchtröhren durchgeführt, die unter dem Handelsnamen "GROLUX" erhältlich sind. Ihre Lichtstärke liegt in der Grössenordnung von 5000 bis 3000 lux. Ihre Wellenlänge liegt zwischen 4000 und 7000 A. Die Samenkörner v/urden nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren gekeimt. Uach 4 bis 5 Keiintagen wurden die Keimblätter in vitro kultiviert. Das verwendete Kulturmilieu hatte bezogen auf 1 Liter des Milieus die folgende Zusammensetzung:

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	Makrο e1erneηte	252734S
	Salz
A) Grundmilieu	M4NO5
1)	KNO5 CaCl2, (2 H2O)	Gewicht in mg/l
	MgSO4, (7 H2O)	1650
	KH2PO4	1900 440
	Mikroelemente	370
	Salz	170
	MnSO4, (4H2O)
2)	ZnSO4, (7 H2O)	Gewicht in mg/l
	H5BO5 KJ	22,300
	Na2MoO4, (2 H2O)	8,600
	CuSO4, (5 H2O)	6,200 0,830
	CaCl2, (6 H2O)	0,350
	Nährstoffe	0,025
	Meso-inosit	0,025
	GaIciumpant0thenat	Gewicht in mg/l
3)	Nikotinsäure	100,00.·
	Vitamin B6-Pyridoxin	1,00
	Vitamin B1-Thiamin	1,00
	Biotin	Ί,ΟΟ *'
	Pe-EDTA	1,00
	Na2EDTA	0,01
	Pe SO4 (7 H2O)
4)	Saccharose	37,2 mg
	Agar	27,8 mg
	20 g
5)	8 g

Agar und Saccharose wurden nach Auffüllen des Milieus auf 1 zugefügt.

B) Wachstumssubstanz

ANA ·· . 1 mg/l Kinetin 1 mg/l

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Mit einem solchen Milieu erhält man eine Zellvermehrung zum Niveau der Narbe des Keimblattes. Nach etwa einem Monat sind die Keimlinge ausreichend gev/achsen, um pikiert werden zu können. Die Keimlinge sind hellgrün und ziemlich kompakt. Das Keimen der Keimblätter in Dunkelheit begünstigt die Ausbildung von Knospen, sofern die Keimlinge einmal unter Licht kultiviert sind.

Beispiel 2 - Vergleichsversuche mit verschiedenen Nährinilieus Bei diesem Beispiel wurde das Nährmilieu nach der Erfindung mit verschiedenen Nährmilieus verglichen, wobei wie im Beispiel 1 verfahren wurde.

Die verwendeten Nährmilieus bestanden, wie das Milieu nach der Erfindung, aus einem Grundmilieu. und enthielten eine oder zwei Waehsim^GS-abctsnzen. Die Zusammensetzungen der Grundsubstanz sind in der Tabelel angegeben:

TABELLE I
Zusammensetzung der verschiedenen Grundmilieus

Milieu Nr.	I	II	III	IV
Zusammensetzungen
Makroelemente	SKOOG	SKOOG	3K00G 1/2	HELLER
Hikroelemente	SKOOG	HELLER	HELLER	HELLER
Nährstoffe	MO ESL	MOREL	MOREL	MOREL
Eisen	Pe1 EDTA	Pe EDTA	Pe EDTA	Pe Gl5
Kaseinhydrolysat	/	/	/	/
Kokosmilch	/	/	/	/
Saccharose	20 g	20 g	20 g	20 g
Agar	8 g	8 g	8 g	8 g
pH-Wert	5,9	5,9	5,9	5,9

Die i-Iakroelemente HELLER nach Tabelle I bestehen aus den folgenden Mineralsalzen, deren Menge im folgenden angegeben ist;

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Makroelemente HELLER

Salz Menge in mg/l

NaSO₃ 600

MgSO₄, (7. H₂O) 250

PO₄H₂Na, (H₂O) 125

CaCl₂, (2 H₂O) . 75

KCl 750

Das Milieu IT enthielt Eisen in Gestalt von PeCl^ (6 H^O) mit einer Konzentration von 1 mg/l.

Jedes der Grundmilieus I, II, III und IV wurde mit Wachstumssubstanzen oder eine Gruppe von Wachsturnssubstanzen gekoppelt, nämlich

- Gt -Napthalin^essigsäure (ANA) "A"

- 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4 D) "D"

- Furfurylaminpurinsäure (Kinetin) "K".

Die Wachstumssubstanzen A, D und K wurden jeweils nur in Konzentrationen von 1 mg/l und 0,5 mg/l verwendet oder jeweils zu zweit gekoppelt. Die Konzentration jeder Y/achstumssubstanz war jeweils 1 mg/l oder 0,5 mg/l. Insgesamt wurden somit 48 verschiedene Milieus untersucht, an denen man die'Geschwindigkeit der Ausbildung der Keimlinge studiert hat. Jedes Milieu war in 12 Behältern vorhanden.

Das Pflanzenmaterial wurde in jedem Behälter von dem Keimblattpaar eines Keimblattes gebildet. Die Homozygotät (= Konstantheit in den Eigenschaften der Generationen) des Salats erlaubt diese verhältnismässig kleine Anzahl an Wiederholungen. Das Milieu, das sich für die Kultur am besten eignet, wurde nach der Vermehrung der Grosse des verwurzelten oder verpflanzten Gebildes bestimmt.

Drei oder vier Wochen nach dem Aussäen besassen alle Keimlinge eine in etwa zylindrische Form, deren Dicke zwischen 1 und 2 mm lag. Ihre Ausbreitung auf der Oberfläche des Nährbodens schwankte jedoch beträchtlich von einem Kulturmilieu zum anderen. In dieser Analyse wurde nur das Volumen des Keimlings untersucht.

S09882/(H0i

Es wurde die mittlere Wirkung auf die Entwicklung der Keimlinge der Gesamtheit der Wachstumssubstanzen,bezogen auf jedes verv/endete Grundmilieu, untersucht und der Gesamtheit der Grundinilieus, "bezogen auf jede Kombination der Wachstumssubstanzen.

Diese Analyse der Mittel wurde mittels des Testes von durchgeführt, der von RIVZS M. in Ann. Amel. des Plantes, 1959, 9, Seite 357-376 zitiert wurde.

Das Verfahren des "Hew Range Test" von DUNCAN wurde verwendet. Anschliessend wurden die Mittel nach der Methode von SCHIFFE neu angeordnet, das auch von RITES M. wie oben angegeben zitiert wurde.

Diese Versuche bestehen darin, den Unterschied "D beobachtet" zu vergleichen, der zv/ischen den paarweise genommenen Mitteln berechnet wurde, wobei jeder Ausdruck "D theoretisch" wie folgt bestimmt ist: 2

D₊, = t(n ,k,oc)

■°th ⁼ "^tneore'^t:i-^sciler berechneter Wert

t(n_r, k,(?C) = in der Tabelle "Studentized, range t_m"

abgelesener Wert an der Schwelle oC , η Freiheitsgrade; k = Anzahl der Mittel, die die beiden betrachteten Mittel trennen. 2
8 = Quadrat des mittleren Residuums oder residuelle Variante.

e . b = Wirksamkeit eines jeden Blocks mal Anzahl der Blocks = Anzahl der verwendeten Repräsentanten bei der Berechnung jedes Mittels.

a) Mittlere Analyse für jedes Grundmilieu

Nach dieser Methode wurde gefunden, dass im Mittel das Milieu II weniger wirksam war, während die anderen Milieus im wesentlichen gleich zu sein schienen.

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Milieus	I	II	III	17
Mittel nach Duncan	10,43	8,75	10,72	10,57

b) Mittlere Analyse bezüglich verschiedener Kombinationen von tfachstumssubstanzen

Es wurden folgende Resultate

K -

A

10-'

erhalten:

D

1

A

- D

K

1

A ·

- K

D

5x1

Ο"4

Wachsturnssubstanz

ΙΟ"5

11,52

5x10~4

8

O"5

5x1O"4

5x1O~4

9

Ο"5

5x1

10

,58

Konzentration in g/l

6,72

7,79

,35

9,43

11,91

,2Q

11

Mittel nach dem Test von Duncan

1

1

0~4

Wachs turns subs tanz

5x1O"4

H

0"^

8

o->

,37

Konzentration in g/l

11,33

,70

,45

Mittel nach dem Test von Duncan

Bei der vorstehenden Tabelle wie auch beim Ausführungsbeispiel dieser Beschreibung sind die identischen Konzentrationen für die Paare der Wachstumssubstanzen A-D, A-K und K-D die Konzentrationen jeder Substanz.

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen an, dass im Mittel die folgenden Substanzen das Wachstum gut anregen: Kinetin und ANA in den Konzentrationen dieses Versuchs, die Verbindung AITA-Kinetin in der geringsten Dosis. Die Substanz D (2-4 D), die allein oder in Anwesenheit von AIiA oder von Kinetin verwendet wurde, wie auch die Verbindung ANA-Kinetin in starker Dosis scheinen die Entwicklung des Stammes zu verhindern.

Für jedes der vier Grundmilieus würde ein Vergleichsversuch mit dem Test von Duncan wie vorstehend beschrieben bezüglich der Mittelwerte der Entwicklung in Abhängigkeit von jeder Kombination der V/a chs tuns sub s tanz en durchgeführt. Die Resultate der Tabelle II weiter unten zeigen an, dass das beste Mittel zum Anregen von V/achstum Kinetin ist in der Konzentration 1O^-* g/l oder

—4- /
5.10 g/l, je nach dem Grundmilieu. Die bedeutendste Entwicklung

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wurde mit dem Milieu III erreicht.

ANA hat auf das Wachstum eine Wirksamkeit etwa entsprechend der von Kinetin, wenn dies mit dem Milieu I verwendet wird, oder "bei geringer Dosis mit den Milieus III und IY,

Ss sei erwähnt, dass die Verbindung ANA-Kinetin in geringer Dosis keine bedeutende Entwicklung verursacht. Diese Paarung "begünstigt aber ein konstantes Resultat bei den vier Grundmilieus.

Es wurde ebenfalls der histologische Aspekt beobachtet. !Jach einer geeigneten Behandlung wurden nacheinander die Schnitte mit Heiaatoxylin, Alkylblau und Eosin gefärbt.

Die aufeinanderfolgenden Schnitte der feuchten Keimlinge, die kompakte grünö. Punkte darstellten, zeigten, dass die Konsistenz und die Farbe des Keimlings mit dem Organisationstyp der ^eIIe verbunden waren, die den Keimling zusammensetzte. Die nassen und beigen Partien wurden durch eine Gesamtheit von Zellen variablen Volumens gebildet, die oft gross und gesetzlos angeordnet waren. Die Zellwände, die nicht so starr schienen, wurden mit Alkylblau gefärbt, v/ährend der Zellinhalt zerstört wurde.

Andererseits waren die kompakten grünen Punkte besser strukturiert. Die kleinen und regulären Zellen hatten ein meristematisches, vom Eosin stark rosa gefärbtes Zytoplasma. Es erschienen vermengte Gefässe, ZeI !fäden, halbkreisförmig um ein oder mehrere Gefässe angeordnete Zellen, Zellgruppen, die in regelmässigen Kugeln ähnlich wie Embryonen angeordnet waren, und auch an der Oberfläche des Keimlings im Scheitelpunkt stärker entwickelte Formationen von Wurzeln, Knospen oder Blättern, die sich zu entwickeln begannen.

Eine erste Beobachtung nach drei oder vier Wochen hat gezeigt, dass im Milieu IV wie auch in den Milieus, die 2-4 D enthielten, es feuchte Keimlinge gab, die harte Chlorophyllausbildungen verringerter Grosse geringer oder keiner Häufigkeit ergaben.

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Abgesehen von den Milieus wie auch vom Milieu I mit Zusatz von Kinetin und dem Milieu III mit ANA in starker Dosis konnte festgestellt werden, dass die ChlorophyllausTDildungen homogen waren. Zs wurde auch festgestellt dass die Färbungsintensität mit dem Kulturmilieu variierte. Die lebhafteste und kompakteste Intensität wurde bei den Milieus I und II erhalten, die die Verbindung ANA - Kinetin in einer Konzentration von 5.10 g/l enthielt.

Anschliessend wurden etwa 6 Wochen lang die Milieus beobachtet, die die Chlorophyllformationen ausbildeten, d.h. die Milieus I, II und III, die die ^T.Vachs turns sub stanz en AiIA, Kinetin und ANA Kinetin mit den Konzentrationen von 10 bzw. 5«x 10 g/l enthielten.

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S ω ■rs

xh I O τ— η ^	O O CO	29 - in CM in	ir. vD	c—
ο	7,50	7,58	7,00	7,41
xh O τ— Q in	8,41	99*6	9,58	co O O T
I I O	9\ CO	7,75	7,90	9,33
xh O ν— •	O in O	in CNJ O	O O CM ^—	ω in
I O	00*6	τ— co"	9,40	O O O
τ— •	co v—	8,35	L6*0l.	10,66
1 O χ—	O v—	85*9	99*6	τ— c—
I O τ— ι ι ΙΠ	11,00	O in O f—	CM	13,75
tn I O	co	τ— CM	τ— CTi C- ν—	"VD VD t—
I O	12,16	8,70	11,66	12,81
I O T—	13,66	9,36	O O 9·,	80*6
I £ O rQ O ·Η CG £ μ\ / So-p fco / +^ M »υ / rJ te d N / ο ο ay/ H	r M	M M	III	H

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Die nachfolgende Tabelle III schematisiert die Ergebnisse "bezüglich der Milieus, die Chlorophyll ausbilden. Unabhängig vom Grundmilieu wurde festgestellt, dass AM die Ausbildung von Wurzeln bewirkt und Kinetin eine feuchte oder weiche Vermehrung hellgrüner Farbe, die sehr selten stengelig ist.

Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass die Verbindung AlTA + Kinetin in Abhängigkeit vom Grundmilieu und der Konzentration dieser Substanzen direkt mit äer Entwicklung normaler oder unnormaler Blätter verbunden war, die gelegentlich direkt aus dem Keimling hervorsprossen, und auch mit der Ausbildung von Knospen oder Keimen. Die Grosse der Keimlinge war jedoch verhältnismässig gering.

Starke Dosen an ANA und Einetin schienen die Entwicklung von Knospen nach deren anfänglicher Ausbildung zu verhindern, während

-4
bei einer Konzentration von 5x10 g/l die Keime gut wuchsen und auch gut aussahen.

Nach den vorstehenden Ergebnissen ist das Kinetin eine Wachstumssubstanz, die die schnelle Entwicklung der Keimlinge gestattet, ohne dass es eine Stengelbildung gibt, während die Verbindung ANA-Kinetin die Ausbildung von Knospen induziert und ANA die Ausbildung von Wurzeln. Andererseits sind die Grundmilieus I und II die geeignetsten.

Beispiel 3 - Pikieren primärer Keimlinge Die primären Keimlinge der Art Averya E 27, die nach dem Beispiel 2 in den Milieus I, II und III in Anwesenheit der Wachstumssubstanzen A, K oder ihrer I.Iischung erhalten wurden, wurden jeweils auf demselben Grundmilieu pikiert,, dem dieselben Wachsturnssubstanzen zugefügt waren, wie bei dem Anfangsmilieu, das beim Beispiel 2 verwendet wurde. Diese letzteren wurden aber mit den nachstehend angegebenen Konzentrationen verwendet.

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• - 31 -

Yr'achs turns sub s t anz	A	10-5	K	5.10~4	ΊΟ"5	A-K	ΙΟ"3
Konzentration beim Beginn der Entwick lung der Keimlinge in g/l	5.1 (T4	5.10"'	io-4	5.10"4	5.1O"4	5.1O"4
Konzentration beim ' ersten Pikieren in g/l	ΙΟ"4	1CT4

Die Beobachtungen nach einer Woche, darauf 6 Y/ochen nach dem Pikieren, sind in den nachstehenden Tabellen IY und V schematisiert, in denen die Färbungen der Keimlinge und ihre verschiedenen Typen identisch sind mit denen der nachstehenden Tabelle III.

Die Phänomene der Stengelbildung, Vermehrung oder !Regeneration der Y/urzeln, die durch das vorhergehende Milieu eingeführt wurden, blieben bestehen.

Gewisse Stämme jedoch haben nach dem Ungleichgewicht, welches durch die Übertragung eingeführt wurde, ihr Funktionieren nicht anpassen können.und gehen schneller oder langsamer in Nekrose über.

Das heisst, dass

1) der Stamm im Milieu III enthaltend die Wachstumssubstanz

in einer- Konzentration von 5x10 g/l wurde beginnend mit der ersten ',Yoehe nach dem Pikieren nekros;

2) &±e Stämme auf den Llilieus 1 und IJ enthaltend die 7/aehs turnssubstanz K in einer Konzentration von 10 g/l brachten mehrere braune Keimlinge und wurden etwa bei der 6. Woche nekros, während die anderen Keimlinge* sich entwickelt haben, wobei sie ihre Farbe nach und nachänderten. Sie haben sich dann stabilisiert. Das kann durch Verbleich der Tabellen III, IV und V festgestellt werden.

Die Keimlinge, die grösstenteils grün waren, wurden oft beige, und zwar unabhängig davon, ob sie morphogen waren oder nicht, mit Ausnahme bei den Milieus I und II, die die Substanz K in

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der Konzentration von 5.10 g/l enthielt.

Die am besten entwickelten Keime wurden mit dem Milieu I enthaltend A-K (10"⁴" g/l) und dem Milieu II enthaltend A-K (5.1O~⁴ g/l) erhalten. Aber die grösste Regenerationsfrequenz ergab sich bei den Milieus I und II mit dem Gemisch A-K bei einer Konzen-

-4
tration von 5*10 g/l.

Des weiteren unterstützen nur die Milieus I und II enthaltend die Substanz K in einer Konzentration von 10 g/l die homogene Entwicklung nicht regenerierender Keimlinge.

Beispiel 4 Kultur in flüssigem Milieu

Die primären Keimlinge, erhalten nach den Beispielen 1 oder 2 ausgehend von den Arten VaI d'orge und Averya E 27, dienten dazu, um ein flüssiges Milieu zu bereiten. Hierzu wurden Erlenmeyer-Kolben mit grossem Hals und dem Inhalt von 2 50 ml verwendet, in die man 30 ml Kulturmilieu gab. Eine Drehung mit 100 U/min hat die Zellgruppen getrennt gehalten. Das verwendete flüssige Nährmilieu hatte dieselbe Zusammensetzung wie das Milieu II, das bei den Beispielen 2 und 3 verwendet wurde mi.t der Ausnahme, dass Agar nicht verwendet wurde und durch 20 g Kaseinhydrolysat und durch 100 g Kokosnussmilch ersetzt wurde.

Ein Monat nach dem Beginn der Kultur konnte festgestellt werden, dass die Keimlinge zerfallen waren und dass die Zellenmassen sich aktiv vermehrten, wobei sie eine dichte Kultur in der j?arbe gelb, oksrgelb oder hellgrün je nach den Keimlingen ausbildeten.

Es wurde festgestellt, dass die Zellvermehrung in flüssigem, bewegtem Milieu schneller war als die Zellvermehrung in einem Milieu mit einem Nährboden.

Beispiel 5

»urzelbildung der regenerierten Keimlinge Bei diesem Leispiel wurde die V/irkung der Substanzen in ANA und AIB auf die Wurzelbildung der Keime untersucht, die vom Stamm

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Averya Ξ 27 ausgingen, der auf dem G-rundmilieu I kultiviert wurde, das die Verbindung A-K als Va chs turns sub stanz be'i einer Konzentration von 5.10 g/l enthielt.

Das wurzelbildende Hilieu wurde einerseits aus dem vorstehend definierten Grundmilieu I (Beispiel 2) hergestellt, wobei 30 g Saccharose pro liter des LIiIieus und 6 g Agar vorhanden waren, und andererseits aus ANA oder AIB in den in der folgenden Tabelle VI angeführten Konzentrationen, in der die nach drei "lochen erhaltenen Resultate auf dem vorstehend angegebenen wurzerbildenden Milieu wiedergegeben sind.

Die Wachsturnssubstanz B ist bei kleineren Dosen als die Substanz A aktiv. Eine Ausbildung von normalen Wurzeln aus allen Keimen kann nicht beobachtet werden ausser bei Konzentrationen von 20 und 30 Iiikrogramm.

Die in den vorstehend angegebenen Dosen verwendete Substanz B gestattet es also, eine schnellere 7/urze!bildung bei einer größeren Anzahl von Keimen zu erhalten.

Beispiel 6

Entwicklung unter nicht-sterilen Bedingungen - Kultur in Töpfen Die bei diesem Beispiel eingetopften Keime stammten vom Stamm VaI d'orge und Averya S 27, dessen nach der Erfindung kultivierten Keimlinge unter nicht-morphogenen Bedingungen während etwa 10 aufeinanderfolgender Umpflanzungen gehalten wurden, worauf

sie zur Regenerierung angeregt wurden.

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TABELLE VI

Anzahl der verwurzelten Pflanzen/Anzahl der untersuchten Pflanzen Beobachtungen bei 3 Wochen

Temperatur in C Wachs turns subs tanz	Konzen tration in jug/l 10 10	Kulturstück 230O	E	Wärme s ehrank 15°C	E	•	Gesamt	E
Typ der Wurzeln	O O CVJ cm	N		N		3/6	N
Vergleichspflanze	30 30	1/6	3/5 5/5	1/6			2/12	5/12 5/12
Wachstums substanz A B	40 40		1/6	7/7 4/7		7/12 4/12
A B	50 50	5/6		0/6 5/6		1/12 10/12
A B	60 60	2/6 5/6	1/6 3/6	6/6 5/7	8/12 10/13	1/12 3/12
A B	2/6 1/6	4/6	3/6 3/6	5/12 • 4/12	7/12
A B	3/6	2/6 1/5	3/6	6/12	2/12 1/12
A B	2/5	0/6 3/6	2/12 5/12

N = normale V/urzeln E = dichte Wurzeln A = ANA B = AIB

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" ⁵⁵ " 252734S

Die Töpfe wurden zunächst in ein kleines Gewächshaus bei einer Belichtung von 18 Stunden eingesetzt. Nach etwa einer Woche ging man von gesättigter Luft im Gewächshaus zu einem Luftfeuchtigkeitsgrad über, der der Aussenluft angepasst war, indem nach
und nach die Abdeckung des Gewächshauses geöffnet wurde.

Sobald die Pflanzen stark genug waren, wurden Chromosomenzählungen durchgeführt, und zwar nach Fixierung und Färbung nach einem herkömmlichen Verfahren, das der Fachmann kennt. Jede Slternpflanze P hatte eine normale Anzahl von Chromosomen 2n = 18.

Es wurde festgestellt, dass das Y/achstum der Pflanzen P_Q unter den Bedingungen des Gewächshauses oder unter Laboratoriumsbedingungen schneller war als das von gleichzeitig kultivierten Vergleichspflanzen. In jedem Fall wurde der "Apfel" (pomme) wenig oder gar nicht ausgebildet. Bei zu hohen Temperaturen v/ar das
Wachsen fast sofort. Der Blütenzweig hat sich entwickelt. Die
Grosse und Gesamthöhe der Pflanze waren kleiner als diejenigen normalerweise draussen kultivierten Pflanzen.

Bei den Pflanzen P der Art VaI d'orge hat man drei ^'ntwicklungsarten festgestellt, die mit einer von den verschiedenen Jahreszeiten abhängigen frischen, mehr oder weniger längen Periode verbunden sind. Diese beobachteten lüntwicklungsarten sind nachstehend angegeben:

1) - LIit den Vergleichspflanzen vergleichbare Llorphogenese
Das Blühen wurde nach Ausbildung eines Anfangsapfels erreicht. Die durch ein Säckchen erreichte Selbstbefruchtung hat eine ausreichende Ernte von etwa 200 reifen Samenkörnern ergeben.

2) - Pflanzen, die bei der vV'urzelbildung zu blühen begannen
Trotz der verringerten Grosse der Blätter entwickelte sich der Blütenstand, und es ergab sich eine Stärke parallel mit dem "Wachstum. Das Blühen war nicht so bedeutend wie bei den Vergleichspflanzen und führte zu ,einer beträchtlichen Anzahl von fruchtbaren Samenkörnern, und zwar gleichzeitig mit sterilen Samenkörnern.

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3) - Pflanzen, die sehr früh zum Blühen gebracht wurden, wie

die vorstehenden Pflanzen, deren Stärke aber klein blieb. Hier war die verringerte Anzahl der Blüten von einer praktisch vollständigen Sterilität der Fruchtstände begleitet. Die Samenkörner blieben unreif oder keimten im Fruchtstand vor der Austrocknung der Samenkornträger.

Die Ernte der von den Pflanzen P sich ergebenden Samenkörner fand nach a_Ustrocknung der Samenkornträger statt. Die erhaltenen Resultate sind in der nachstehenden Tabelle VII angegeben.

TABELLE VII
Samenkornernte

P0, Pflanzen nummer	Anzahl der	Anzahl der Samen körner	.steril	Summe	Fruchtbare Samenkörner	'P- Zahl
25	Frucht stände	frucht bar	(65 ( 5gm	129	mittlere An zahl pro Blütenstand	0,45
27	12	59	152	200	4,91	0,24
24	13	48	157	214	3,69	0,36
26	18	57	(112 (27gm	233.	8,72	0,40
28	20	94	(14 (19gm	210	4,70	0,84
4	29	177	198	316	9,31	0,37
9 + 11	40	118	441	655	2,95	0,32
22	46	214	421	445	4,60	0,053
19	46	24	890	896	0,52	0,006
t2	152	6	—	—	0,03	#1,00
t4	10	262	-	-	6,55	#1,00
11	355	8,65

gm: im Fruchtstandygekeimt

"9" und "11" entsprechen einer "vorzeitigen" und "verzögerten" Ernte ein und derselben Pflanze.

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252734S

Bezüglich dieser Probe sind die regenerierten Pflanzen signifikant weniger fruchtbar als die Vergleichspflanzen. Andererseits muss auf die Variabilität in der Anzahl der Fruchtstände bei den verschiedenen unter analogen Bedingungen kultivierten Pflanzen hingewiesen werden. Die Gesamtheit der xiesultate zeigt die Anwesenheit einer unterschiedlichen Antwort auf die Umgebung bezüglich der regenerierten P -Pflanzen und bezogen auf die Vergleichspflanzen.

Des weiteren zeigt die mehr oder v/eniger starke Sterilität, die teilweise auf die mangelnde Stärke der Pflanze zurückgeht und teilweise auf die Notwendigkeit einer starken Belichtung, die Bedeutung der in diesem Stadium zugeführten Energie, um das Blühen und das Reifen der Samenkörner zu vollenden.

Die von jeder regenerierten Eltenpflanze P_Q sich ergebenden Samenkörner "stellen die Generation der Pflanzen P^ dar: Die Selbstbefruchtung der Individuen P^ gibt die Generation P₂. Die Generationen Ρ-, bis P, wurden untersucht. Die Beobachtungen wurden nach der zitierten Methode von DiLGlTELIE P. statistisch untersucht /"Theorie et methodes statistiques (2 vol.) Presses Agronomiques de Gembloux 3d. J. Duculot - 1970_J7, insbesondere durch Analyse der Variante auf zwei Klassifikationskriterien mit V/i ed er holung, gekreuztes Modell und Probe derselben 'Wirkung mittels Test von SNEDECOR zitiert von Dagnelie und durch die Methode "New Range Test" von DUNCAN a.a.O.

An der Generation P₁ wurde festgestellt, dass eine verglichen mit den Vergleichspflanzen wenig runde oder apfelförmige Pflanzenfamilie vorlag. Die Blätter waren rosettenartig angeordnet. Sie waren matt von samtartigem Aussehen, v/enig gezackt. Sie waren weder v/abenartig ausgebildet not gekräuselt, so dass die gesamte Pflanze ein "flaches" Aussehen hatte (a).

An der Generation Pp wurden wiederum homogene Abkömmlinge als Varianten verglichen mit der Vergleichspflanze festgestellt, -andererseits wurde das Aussehen der ?amilie untersucht, deren .Färbung besonders war und sich nicht in der Gesamtheit der unter-

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suchten Pflanzen absonderte. Es wurde insbesondere festgestellt, dass die Pflanzen sehr helle Mitterblätter hatten und dunkelgrüne Nerven (c), sowie ein blasserer und goldenerer homogener Ton, verglichen mit den Vergleichspflanzen. Man hat sie als "blond" (b) bezeichnet.

Des weiteren wurden Unterschiede zwischen den Vergleichspflanzen und den Pflanzen P- bezüglich der Anzahl der Blätter des "Apfels" oder "Kerns" festgestellt, bezüglich des Gewichts der Grünmasse, der Anzahl der Blätter der entwickelten axialen Knospen (vorstehend auch Hilfsknospen genannt), der Anzahl der axialen Knospen selbst, der Länge und der Breite des breitesten Blattes.

Die bezüglich der Pflanzen (a), (b) und (c) an der Generation P₂

beobachteten Eigenarten ergaben dieselben Eigenschaften in der Generation P^, die sich durch Selbstbefruchtung eines der Exemplare ergaben, das zufällig aus jeder Familie ausgewählt worden war.

Die Familien P-z, unterschieden nach a, b, c, wie auch die Vergleichspflanze t, deren Phenotypen sehr unterschiedlich sind, wurden ausgewählt,'um die übertragung ihrer Eigenschaften durch Kreuzung nach der Hybridationstechnik zu untersuchen.

Die Analyse hat gezeigt, dass die Slternpflanze a die Eigenschaft "flaches Blatt" besitzt und dass diese Eigenschaft vorzugsweise über die Mutter übertragen wird. Verschiedene Ausdrucksniveaus dieser Eigenschaft haben sich abhängig vom gewählten Elternteil manifestiert. Man kann annehmen, dass dies so geschieht, als ob es eine mehr oder weniger gute "Annahme" des Zytoplasmas des Elternteils "a" durch die verschiedenen Pollensamenkörner gibt.

Durch Analyse der Blattoberfläche"wurde festgestellt, dass jedes Elternteil, wenngleich auch mit einem isogenetischen Genotyp gekreuzt, durch die Kreuzung eine "Stärke" überträgt, und zwar in gleicher Weise über den Vater wie die Mutter und unabhängig davon, wer der betreffende Partner ist.

Eine detaillierte Analyse hat jedoch gezeigt, dass die Intensität dieses sehr speziellen Effekts der "Stärke" sehr spezifisch für

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die Partner und den Kreuzungssinn ist. Es muss unterstrichen werden, dass die wesentliche und vorteilhafte Eigenschaft der Erfindung darin besteht, dass man durch Kreuzung aus einer homozygotischen Pflanze stärkere Pflanzen erhält.

Beispiel 7

1. Kultur der Gewebe in vitro

In diesem Beispiel wurden die Gewebe in vitro kultiviert, die sich aus dem Keimen eines Samenkornes einer einzigen Mutterpflanze des Getreides, Spielart Cesar, ergaben.

Das verv/endete Kulturmilieu hatte die folgende Zusammensetzung:

A) Grundmilieu

Mikroelemente und iuakroelemente MILLER Nährstoffe PUJII (x 1)

Glycin 2.10"⁶ kg/l

Fe EDTA 1O~⁴ M

Agar 1 °/o

Saccharose 12 $

B) Y/achs turns sub s tanz
2,4 D 2.10~⁶ kg/1

Mit einem derartigen Milieu wurde eine Zellvermehrung erreicht. Iiach etwa einem Monat waren die Keimlinge ausreichend gewachsen, um pikiert werden zu können.

2) Eorphogenese der Keimlinge

Die vorstehend erhaltenen Keimlinge wurden in das morphogene LIilieu eingesetzt, das aus dem vorstehend angegebenen Grundmilieu bestand. Dieses hatte jedoch einen Saccharosegehalt von 2 "ρ und Indolacetatsäure (10~ ) als Wachstun:ssubstanz. 2,4 D war nicht vorhanden.

3) Eintopfung

Die Pflanzen wurden eingetopft, indem sie zunächst bei den Umweltbedingungen gehalten wurden, die während der Phase der morphogenen Kultur verwendet wurden, und indem sie nach und nach den normalen Umweltbedingungen (Kultur draussen) angepasst wurden.

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Unter den eingetopften Pflanzen zeigte eine gewisse Anzahl Eigenschaften von Varianten, insbesondere bezüglich, der Stärke und des Ertrages.

^s ist offenbar, dass die Erfindung im Rahmen der Kenntnisse des Fachmannes abgewandelt werden kann.

Im folgenden sollen Fig. 1 und die Tafeln III, IV und V kurz erläutert werden:

Fig. 1; Die erste Zeile zeigt die -Ausbildung in den aufeinander folgenden Bildern beim ersten Verfahrensschritt, nämlich der nicht-morphogenen Kultur. Das letzte Bild der ersten Zeile zeigt als "cal" den sog. Keimling. Die zweite Zeile zeigt den zweiten Verfahrensschritt, nämlich die morphogene Kultur. Die dritte Zeile zeigt den dritten Verfahrensschritt, nämlich das Eintopfen. Die vierte Zeile zeigt den vierten Verfahrensschritt, nämlich das Kreuzen einschliesslich der Hybridation.

In der Tabelle III bedeuten die verschieden schraffierten Kästchen oben links die folgenden Farben:
"Vert intense" = dunkelgrün
"Vert clair" = hellgrün

"Vert opalescent" = opaleszierendes Grün "Jaune" = gelb
"Beige" = beige
"Ocre" = okerfarbig
"Necrose= nekrotisch

In der rechten oberen Spalte der Tafel III sind die Unterscheidungstypen angegeben, nämlich in der ersten Zeile "Knötchen, Wurzeln oder absorbierende Härchen", in der mittleren Zeile "anormale Blätter" und in der unteren Zeile "neugebildete Pflanzen mit grossen Blättern oder fadenförmigen Blättern".

Die untere Hälfte der Tafel III zeigt die Beobachtung nach 6 !lo chen bei primären Keimlingen - Art Averya E 27. Die oberste Zeile gibt das Grundmilieu an. Die linke Spalte gibt die Wachs-

509882/040t

turnssubstanzen in Gramm pro Liter an.

Die Tafel IV zeigt die Beobachtung nach einer Woche, erstes Pikieren - Averya E 27. Bie oberste Zeile zeigt wiederum das Grundmilieu und die linke Spalte die Wachstumssubstanzen in Gramm pro Liter.

Tabelle V zeigt die Beobachtung nach 6 Wochen. In der obersten Zeile wiederum das Grundmilieu und in der linken Spalte die Y/achs turns sub stanz en in Gramm pro Liter.

5ö9882/(KÖ1

TABLEAU IE

Coloration riss cals: Type de differenciation:

fiert intense Vert ciair

Vert opalescent Jaune

Beige Ocre

Hecrose

Nodules, racines ou poils absorbents. Feuilles anormales du 'folioles*.

Plantes neoformees ä feuilles larges ou "filiformes".

Observation äSsemaines CALS PRIiVIAIRES-AVEBYA E 27

Il

III

10~⁴

10

1-3

«Ff

10"⁴

10-3

t

A-K

10-3

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Observation ä 1 semaine

de

TABLEAU TST
PREMIER REP1QUAGE-AVERYA E 27

III

510— ⁴

ΙΟ'

510-⁴ Necrose

-4

AK

CTD

510

-4

Observation ä 6 semaines

TABLEAU J

tubs

ililieu de

base ancesta

'° fJ/1

III

10~⁴

510"⁴

-4

Necrose

Debut de necrose

Necrose

510-

ReeiquageN'2

Necrose

,-4

AK

510

-4

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Claims (28)

Agence Nationale de Valorisation de la Hecherche (A N V A R) - Patentansprüche -

1. Verfahren zum Züchten von Pflanzenvarianten mit verbesserten Eigenschaften, dadurch gekennzeichnet, dass

a) die Gewebe, die sich aus dem Keimen von Samenkörnern einer einzigen Mutterpflanze ergeben, in ein synthetisches, nichtmorphogenes Nährmilieu eingesetzt und dort kultiviert werden, welches Nährmilieu einerseits aus einem Grundmilieu besteht, das aus Mineralsalzen, Nährstoffen, Eisen und Saccharose besteht, und andererseits aus Wachstumssubstanzen in ausreichender Menge, um die Bildung von Keimlingen zu gestatten,

b) die so gebildeten Keimlinge auf ein morphogenes IJilieu pikiert werden, das aus dem vorstehend definierten Grundmilieu besteht, dessen Gehalt an Saccharose und dessen 7/achstumssubstanzen verschieden sind,

c) die so erhaltenen Pflanzen eingetopft werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die einzige Mutterpflanze eine landwirtschaftliche Pflanze ist, die aus Getreide (Weizen), Soja, Raps, Gerste und Mais ausgewählt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die einzige LIutterpflanze eine Küchenpflanze ist, die aus Salat, Bohnen und Erbsen ausgewählt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Samenkörner unter sterilen Bedingungen keimen und dass die Kultur der Milieus unter sterilen Bedingungen stattfindet.

r-

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Keimen bei einer Temperatur zwischen 20 und 23 C stattfindet.

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6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Keimen im Dunkeln oder bei Tageslicht mit etwa 8 bis 12 Stunden Belichtungszeit stattfindet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Grundmilieu Eisen in Chelatform enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Ohelatmittel Athylendiamintetraessigsaure ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur im synthetischen ITährmilieu bei einer Temperatur zwischen etwa 18 und 23°C eine zeitlang zwischen 0 und 18 Stunden pro Tag durchgeführt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das ITährmilieu zusätzlich eine Währsubstanz enthält, beispielsweise Agar.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert zwischen 5,7 und 6,5 liegt.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Keimlinge unter nicht-morphogenen Bedingungen während mindestens zwei aufeinanderfolgender Umpflanzungen gehalten werden, bevor sie in das morphogene Milieu pikiert werden.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des morphogenen Milieus zwischen 5,7 und 6,5 liegt.

14. Verfahren zum .Züchten von Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften, dadurch gekennzeichnet, dass

a) die Gewebe, die sich aus dem Keimen von Samenkörnern einer einzigen IJutterpf lanze ergeben, in ein synthetisches, nichtmorphogenes Nährmilieu eingesetzt und dort kultiviert v/erden, welches llährmilieu einerseits aus einem Grundmilieu besteht,

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das aus Mineralsalzen, Nährstoffen, Eisen und Saccharose "besteht, und andererseits aus Wachsturnssubstanzen in ausreichender Menge, um die Bildung von Keimlingen zu gestatten,

b) die so gebildeten Keimlinge auf ein morphogenes Milieu pikiert werden, das aus dem vorstehend definierten Grundmilieu "besteht, dessen gehalt an Saccharose und dessen Wachstumssubstanzen verschieden sind,

c) die so erhaltenen Pflanzen eingetopft werden, und dass

d) die so erhaltenen Pflanzen geschlechtlich vermehrt v/erden.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die einzige Mutterpflanze eine Salatpflanze ist, und dass die im Grundmilieu enthaltenen Mineralsalze aus Makroelementen und Mikroelementen bestehen, wobei die Makroelemente Kali- und Ammoniumnitrate sind, Magnesiumsulfat, Calciumchlorid und Kaliummonophosphalund die Mikroelemente aus Mangansulfat, Zinksulfat und Kupfersulfat ausgewählt werden, sowie Kali j oäLd, Borsäure und Calciumchlorid, Molybdän natriumoxid, ' Aliminiumchlorid und Kiekelchiοrid.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Mineralsalze Makroelemente und Mikroelemente von MURASHIC-E und SKOOG sind.

17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Mineralsalze Makroelemente von MURASHIGE und SKOOG- und die Mikroelemente von HEILER sind.

18. Verfahren nach -Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das im Grundmilieu enthaltene Eisen durch Äthylendiamintetraacetatsäure in Chelat übergeführt ist, und dass die Menge an Chelateisen ausgedrückt in Eisen bei etwa 5>6 mg/1 liegt.

19. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die V/achstumssubstanzen unter OC-Naphthalin.essigsäure und 6-Purfurylaminopurin ausgewählt werden, und dass die Konzentration jeder Wachstumssubstanz im genannten Nährmilieu

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kleiner oder gleich ist als etwa 1 mg/l an Nährmilieu.

20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die einzige Mutterpflanze eine Salatpflanze ist, und dass die beim Verfahrensschritt a erhaltenen Keimlinge in ein erstes morphogenes Milieu pikiert werden, das eine Wachstumssubstanz enthält, die die Ausbildung von Keimen einleitet, und dass die gebildeten Keime anschliessend in ein zweites morphogenes Milieu pikiert werden, das eine Wachstumssubstanz enthält, die die Bildung von Vrarzeln einleitet, nämlich ein sog. wurzelbildendes Milieu.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das wurzelbildende Kilieu aus dem Grundmilieu nach Anspruch 1 gebildet wird, aus Saccharose von etwa 20 - 35 gj vorzugsweise 30 g/l, aus einer ",Vachs turns subs tanz, die aus <y!-Naphthalinessigsäure und οι -Indolbut.tersäure ausgewählt wird.

22. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur im wurzelbildenden Milieu bei einer Temperatur zwischen etwa 5 und 20 C, vorzugsweise 15°G, durchgeführt wird, und zwar etwa 7 bis 21 Tage lang etwa%-8 Stunden pro Tag.

23. Verfahren nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmilieu ein flüssiges Milieu ist, das zusätzlich Kaseinhydrolysat und Kokosnussmilch enthält, wobei der pH-V/ert des flüssigen Llilieus zwischen 5>5 und 6,5 liegt.

24. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Wachstumssubstanz im wurzelbildenden Milieu kleiner als 0,1 mg/l ist.

25. Verfahren nach Ansoruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die einzige Mutterpflanze eine Kornpflanze ist, und dass das Grundmilieu aus Makroelementen und Mikroelementen von UIIiLER besteht, Nährstoffen PUJII und Gl_ycin, mittels Athylendiamin-

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tetra.essigsäure gela—tiertem Eisen, Agar, Saccharose, und dass die Wachstumssubstanz 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure ist.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das morphogene Milieu aus dem Grundmilieu nach Anspruch 25 besteht und einen geringeren Saccharosegehalt aufweist, und dass die Vv'achs turns sub s tanz $ -Indolessigsäure ist.

27. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die einzige Mutterpflanze eine Sojapflanze ist und dass das synthetische Kahrmilieu aus:

a) einem Grundmilieu:

Makroelementen GAMBORG 100 ml/l

Mikroelementen " 1 ml/l

Pe-EDTA 10 ml/l

Nährstoffen MOREL 2 ml/l

Saccharose 20 g/l

Agar ■ 7 g/l s ο Yf ie

b) Wachstumssubstanz:

2,4 D ' 10~£ kg/1

BA 2.10"⁷ kg/1 und dem

pH-Vfert des Milieus von 5,8 besteht.

28. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die einzige Mutterpflanze eine F^ Generation der homozygotischen Linie der Hybriden des Mais ist, und dass das synthetische IJährmilieu folgendermassen zusammengesetzt ist:

a) einem Grundmilieu, das Mikroelemente und Makroelemente von MILLER enthält,

Saccharose .. 30 g/l

Eisen EDTA 5.1O"⁵ kg/l

Nährstoffe PUJII 1 ml/l, und

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b) Wachstumssubstanzen

2,4 D 5.10"⁶ kg/1

ΑΙΑ 5.10"⁷ kg/l Kinetin 1CT⁷ kg/1.

29« Abart erhalten nach einem der Ansprüche 1 bis

509882/Ö40 1

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