DE3126001C2

DE3126001C2 -

Info

Publication number: DE3126001C2
Application number: DE3126001A
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Hirakata Osaka Jp Yamamoto; Ryuzo Yawata Kyoto Jp Mizuguchi
Original assignee: Nippon Paint Co Ltd
Current assignee: Nippon Paint Co Ltd
Priority date: 1980-07-01
Filing date: 1981-07-01
Publication date: 1989-09-28
Also published as: JPS5716692A; DE3126001A1

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur selektiven Züch tung von Pflanzenzellen, die sich durch mindestens eine spezielle Eigenschaft auszeichnen, aus gezüchteten Pflanzenzellen, die aus einer höheren Pflanze induziert wurden.

Die Gegenstände der Ansprüche 2 bis 5 betreffen Ausgestaltungen dieses Verfahrens.

Zur selektiven Züchtung von Pflanzenzellen, die sich durch mindestenes eine spezielle Eigenschaft auszeichnen, aus ge züchteten Pflanzenzellen bzw. Pflanzenzellenkulturen be dient man sich gemäß der Literaturstelle "Plant Cell Tissue Culture", Seite 50, Herausgeber: Harada und Komamine, Rikogaku-sha, Tokio, Japan, einer Plattenkulturmethode. Hierbei wird die Plattenkulturmethode, die zur Reindar stellung von Mikroorganismen bei der Mikroorganismenzüch tung dient, auf die Pflanzenzellenzüchtung übertragen. Bei diesem Züchtungsverfahren wird ein gezüchtetes Pflanzen zellenaggregat zum Suspendieren von Zellenkulturen in einem flüssigen Medium geschüttelt, worauf die erhaltene Zellensuspension mit Hilfe eines Filters eines Porendurch messers von 200 µm oder darunter filtriert wird. Hierbei erhält man ein Filtrat mit Zellenaggregaten (Zellenzahl: etwa 1 bis 6) einer gegebenen Größe. Danach wird das er haltene Filtrat in einem gelösten Agarmedium dispergiert. Die erhaltene Dispersion wird auf einer Petrischale ausge strichen und anschließend inkubiert. Das geschilderte Ver fahren ist nicht besonders gut geeignet, da die eingebet teten Zellen im Falle einer zu niedrigen Zellenkonzentra tion sich weder teilen noch wachsen und bestimmte Arten von Pflanzenzellenkulturen ungeachtet der Zellenkonzentra tion überhaupt nicht wachsen. Allgemein gesagt, kann in einigen Fällen die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Zellenarten zur Ausbildung einer speziellen Eigenschaft (bei ihnen) führen. Selbst wenn bei der beschriebenen Plattenkulturmethode Zellen mit der (bei ihnen) entwickel ten speziellen Eigenschaft gewachsen sind, zeigen diese Zellen die betreffende spezielle Eigenschaft nach ihrer Vermehrung nicht (mehr) immer.

Der Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, unter Vermei dung der geschilderten Nachteile des bekannten Züchtungsver fahrens für Pflanzenzellenkulturen ein auf die selektive Züchtung sämtlicher Arten von Pflanzenzellenkulturen an wendbares Verfahren zur Züchtung von Pflanzenzellen zu ent wickeln, nach welchem eine selektive Züchtung von Zellen ungeachtet der Zellenkonzentration und unter Berücksichti gung der Wechselwirkung zwischen (einzelnen) Zellen möglich ist.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur selek tiven Züchtung von Pflanzenzellen, die sich durch min destens eine spezielle Eigenschaft auszeichnen, aus ge züchteten Pflanzenzellen, die aus einer höheren Pflanze induziert wurden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man

(a) ein gezüchtetes Pflanzenzellenaggregat in Segmente einer nominalen Größe von 2 bis 10 mm unterteilt,
(b) die erhaltenen Segmente in einem statischen Kultur gefäß zu den entsprechenden Zellenaggregaten wachsen und sich vermehren läßt und
(c) aus den erhaltenen Zellenaggregaten diejenigen Zellen aggregate auswählt, die sich durch mindestens eine der (gewünschten) speziellen Eigenschaften auszeichnen,

wobei aus den erhaltenen Zellenaggregaten ein einzelnes Zellenaggregat, bei dem die betreffende speziellen Eigen schaft am deutlichsten ausgeprägt ist, selektiert wird, andererseits kann man eine Mehrzahl von Zellenaggregaten, die sich durch eine spezielle Eigenschaft auszeichnen, selektieren, indem man die Häufigkeitsverteilung der Zellenaggregate mit unterschiedlichen numerischen Werten des Indikators für die spezielle Eigenschaft aufstellt, einen Mittelwert und eine Standardabweichung ( σ ) er mittelt und dann diejenigen Zellenaggregate, die einen Indikatorwert (X _i) zwischen dem maximalen Wert (X _max) und dem nicht mehr als dreifachen Wert der Standard abweichung, vorzugsweise dem nicht mehr als einfachen Wert der Standardabweichung vom maximalen Wert, auf nimmt. Der genannte Indikatorwert ergibt sich aus der Gleichung:

X _max ≧ X _i ≧ X _max - 3 σ.

Unter der Definition "Segmente einer nominalen Größe von 2 bis 10 mm" sind Segmente in Form dreidimensionaler Ge bilde, die sowohl regelmäßig als auch unregelmäßig sein können, z. B. Würfel, Kugeln, Säulen, Prismen und ähnliche Formen einer nominalen oder maximalen Größe von 2 bis 10 mm, zu verstehen.

Das selektive Züchtungsverfahren gemäß der Erfindung ist wirksamer als sämtliche bekannten Verfahren, da die Ver fahrensmaßnahmen einfacher sind und die Dauer der selekti ven Züchtung kürzer ist. Darüber hinaus kann es auf die verschiedensten Pflanzenzellenkulturen unterschiedlicher phytochemischer Eigenschaften angewandt werden. Es eignet sich auch zur selektiven Züchtung von Pflanzenzellenkultu ren mit mehreren speziellen Eigenschaften.

Die Erfindung wird anhand des in der Zeichnung schematisch dargestellten und auf das später folgende Beispiel 2 Bezug nehmenden Selektionsschemas für Selektionsmaßnahmen bei ge züchteten Euphorbia millii-Zellenaggregaten beschrieben.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendbare Pflanzenzellenkulturen erhält man entweder durch nach übli chen Verfahren durchgeführtes Induzieren von Kallus aus einem beliebigen Organ oder Gewebe, z. B. Wurzeln, Stengeln, Blättern, Blüten, Pollen und Wachstumspunkten oder deren Zellen, und anschließende sterile Züchtung des betreffen den Kallus oder durch Beimpfen eines Pflanzenkörpers mit dem Bakterium "Agrobacterium tumefaciens" zur Induzierung von Tumorgewebe und anschließende sterile Züchtung der be treffenden Gewebemasse.

Unter den Ausdruck "spezielle Eigenschaft" fallen physiolo gische, biochemische und/oder morphologische Eigenschaften. Physiologische Eigenschaften sind beispielsweise verschiedene Arten von Widerstandsfähigkeit, z. B. Widerstandsfähigkeit gegenüber hohen oder tiefen Temperaturen, Salzbeständigkeit, Säure- und/oder Alkalienbeständigkeit und dergleichen, oder fehlende Erfordernisse für (bestimmte) Nährstoffe, wie Vitamine, Aminosäuren oder Auxine. Biologische Eigenschaf ten sind beispielsweise die Eigenschaft der Produktion von primären oder sekundären Metaboliten oder die Eigenschaft zur Umwandlung organischer Verbindungen in den Pflanzen körper. Unter morphologische Eigenschaften fällt bei spielsweise die Aggregationseigenschaft.

Wie bereits angedeutet, besteht die Erfindung in einer selek tiven Züchtung von Pflanzenzellen im Rahmen der noch im einzelnen zu beschreibenden Stufen (a), (b) und (c). Diese Stufen werden nunmehr näher erläutert:

Stufe (a) (Unterteilung eines gezüchteten Pflanzenzellenaggregats zu Segmenten)

In dieser Stufe wird ein auf einem festen Medium gewachsenes Pflanzenzellenkulturaggregat in Segmente einer gewünschten sichtbaren Größe unterteilt, um die Größe der Segmente gleichmäßig zu gestalten. Dies erfolgt zur Eliminierung des Einflusses der Größe des Explantats auf das Wachstum der Pflanzenzellen u. dgl. sowie zur Erleichterung des Wachstums und der Vermehrung der Segmente in der zweiten Stufe (b) und der Selektion der Zellenaggregate in der dritten Stufe (c). In der folgenden Verfahrensstufe kann man Segmente von Zellenaggregaten einer nominalen Größe von 2 bis 10 mm gut, solche einer nominalen Größe von 2 bis 5 mm besonders gut wachsen lassen. Segmente einer nominalen Größe von unter 2 mm eignen sich nicht, da sich Einzelzellen solcher Segmente nicht aktiv teilen und die Wachstumsgeschwindigkeit in der nächsten Stufe zu gering ist, was dazu führt, daß der Selektionsgrad sinkt. Anderer seits eignen sich auch Segmente einer nominalen Größe von über 10 mm nicht besonders, da die verminderte Anzahl der Segmente eine Verunreinigung mit Zellen, bei denen die jeweils (gewünschte) spezielle Eigenschaft nicht so deut lich ausgeprägt ist, zur Folge hat. Auch hier sinkt somit der Selektionsgrad. In letzterem Falle sinkt, da die Zellen aggregate großdimensioniert sind, auch der Wirkungsgrad des Verfahrens selbst.

Ein Zellenaggregat läßt sich nach beliebigen üblichen Ver fahren zur künstlichen Teilung lebender Materialien zu Seg menten einer nominalen Größe innerhalb des angegebenen Be reichs, beispielsweise von 2 bis 10 mm, unterteilen. Um die Segmentgröße möglichst gleichmäßig zu machen, wird das Zel lenaggregat vorzugsweise mit Hilfe eines scharfkantigen Werkzeugs, z. B. eines Skalpells oder einer Rasierklinge, ge teilt.

Stufe (b) (Wachstum und Vermehrung der Segmente in einem Kulturgefäß)

In dieser Stufe werden die in Stufe (a) erhaltenen Segmente in einem statischen Kulturgefäß gezüchtet. Als Kulturgefäß eignet sich jedes üblicherweise zur Zellenzüchtung verwend bare Kulturgefäß. Bevorzugt wird jedoch ein durchsichtiges flaches Gefäß, beispielsweise eine Petrischale oder eine Mikrotitrationsplatte, da es bei Verwendung eines solchen Gefäßes einfach ist, die Segmente zu numerieren und zu züchten, die wachsenden Segmente derart in konstantem Ab stand voneinander zu halten, daß sie sich nicht mit einem anderen Segment mischen, und die Selektion in der nächsten Stufe (c) wirksam durchzuführen.

Im Rahmen des Verfahrens gemäß der Erfindung kann als Kul turmedium ein anorganisches synthetisches Medium, z. B. White′sches Basalmedium, Murashige′- und Skoog′sches Basal medium oder Linsmaier′- und Skoog′sches Basalmedium, jeweils ergänzt durch eine Spur organischer Verbindungen, z. B. Vi tamine, Kohlenstofflieferanten, wie Rohrzucker und Glukose, Phytohormone, wie Auxin und Cytokinin, und natürliche Extrakte, z. B. Malzextrakt und Kokosnußmilch, und erforder lichenfalls durch sonstige Zusätze, verwendet werden. Die Züchtungsbedingungen, z. B. Temperatur der Kultur, Licht einwirkung und Dauer der Züchtung (in d) lassen sich den jeweiligen Gegebenheiten anpassen. Die Übertragung der Seg mente der Zellenaggregate auf Agarmedium erfolgt im Hin blick auf eine möglichst einfache Handhabung und die Wirk samkeit auf das Zellenwachstum vorzugsweise durch bloßes Auftragen der Segmente auf die Oberfläche des Agarmediums.

Stufe (c) (Selektion von Zellenaggregaten, die sich durch mindestens eine spezielle Eigenschaft auszeichnen, von den in Stufe (b) gewonnenen Segmenten abstammenden Zellenaggregaten)

Zum Zweck einer Selektion von Zellenaggregaten, die sich durch eine spezielle Eigenschaft auszeichnen, kann der Grad des Zellenwachstums als Hinweis darauf dienen, wenn die spezielle Eigenschaft eine bestimmte Widerstandsfähig keit, ein fehlendes Verlangen nach der Zufuhr bestimmter Stoffe und ein Aggregationsverhalten ist. Wenn die spezielle Eigenschaft in der Bildung eines Metaboliten oder in der Umwandlung einer organischen Verbindung in dem Pflanzen körper ist, kann die Konzentration des Metaboliten oder die Konzentration der organischen Verbindung als Hinweis oder Anzeichen für die betreffende spezielle Eigenschaft herangezogen werden. Bei der Selektion von Zellenaggrega ten, die sich durch eine spezielle Eigenschaft auszeichnen, mit Hilfe des Wachstumsgrades als Indikator für die be treffende Eigenschaft kann man die Selektion der Zellen aggregate visuell bewerten. Vorzugsweise erfolgt jedoch die Bewertung auf der Basis des Waschstumsindex während der Kulturdauer, da der Wachstumsindex als numerischer Wert darstellbar ist. Bei der Selektion von Zellenaggregaten, die sich durch eine spezielle Eigenschaft auszeichnen, auf grund der Konzentration einer Verbindung als Indikator für die betreffende Eigenschaft kann die Selektion der Zellen aggregate - falls möglich (z. B. wenn die Zellen ein natür liches Pigment, z. B. ein Anthocyanin, Carotenoid oder Naphthochinon enthalten - ebenfalls visuell bewertet oder überwacht werden. Vorzugsweise erfolgt jedoch hier die Bewertung dadurch, daß man die Selektion auf einer Ermittlung der Konzentration der betreffenden Verbindung in den vermehrten Zellenaggregaten durchführt, da die Kon zentration als numerischer Wert wiedergegeben werden kann.

Die Selektion der Zellenaggregate erfolgt nach der in Anspruch 1 beschriebenen Weise.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren werden die in Stufe c selektierten Zellen aggregate wiederholt unterteilt, gezüchtet und selektiert, d. h. die Verfahrensstufen (a), (b), und (c) können beliebig oft wiederholt werden. Hierbei erhält man stabile Zellen stämme, bei denen jeweils mindestens eine spezielle Eigen schaft besonders deutlich ausgeprägt ist.

Zur Herstellung von Zellenaggregaten im großtechnischen Maßstab können die selektierten Zellenaggregate in ent sprechender Weise wie Mikroorganismen, beispielsweise in einer statischen oder flüssigen Kultur gezüchtet und vermehrt werden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veran schaulichen.

Beispiel 1

Junge Triebe von Euphorbia tirucalli werden gründlich mit Wasser gewaschen und in etwa 5 cm lange Stücke zerschnitten. Danach werden die erhaltenen Stücke der jungen Triebe durch 5-minütiges Eintauchen in eine 70%ige Ethanollösung und anschließendes 10-minütiges Eintauchen in eine 10%ige Chlorkalklösung sterilisiert. Die sterilisierten Stücke werden in einem aseptischen Gefäß in steriles destillier tes Wasser getaucht und darin gewaschen, um den Ethanol und Chlorkalk vollständig zu entfernen. Die derart behan delten Stücke der jungen Triebe werden nun mit einem steri lisierten Skalpell zu 0,5 bis 1 cm langen Segmenten zer schnitten. Die hierbei erhaltenen sterilen Segmente werden steril auf synthetisches Agarmedium gelegt. Das verwendete synthetische Agarmedium erhält man durch Zusatz von 3% (G/V) Rohrzucker, 0,2% (G/V) Malzextrakt, 1 ppm 2,4-Dichlor phenoxyessigsäure, 0,1 ppm Thiaminhydrochlorid, 0,5 ppm Pyridoxinhydrochlorid, 0,5 ppm Nikotinsäure, 2 ppm Glycin und 100 ppm Inosit zu Murashige′- und Skoog′schem Basal medium, Einstellen des pH-Werts der Mischung mittels 0,1 n NaOH auf 6,0, Zusatz von 0,8% (G/V) Agar zu dem Ge misch und übliches bekanntes Sterilisieren.

Die Segmente der auf das geschilderte synthetische Agar medium gelegten jungen Triebe werden bei einer Temperatur von 25°C unter Licht einer Lichtstärke von 2000 Lux ge züchtet. Nach etwa 1 Woche läßt sich in der Umgebung der Schnittfläche der Segmente eine gelblich-weiße Kallus bildung feststellen.

Nachdem der Kallus auf dem festen Medium 6 Monate lang ver mehrt bzw. verstärkt worden war, wird der vermehrte Kallus einer nominalen Größe von etwa 1 cm mit Hilfe eines sterilen Skalpells in 96 Segmente einer nominalen Größe von etwa 2 mm unterteilt. Diese 96 Segmente werden gewogen, von Nr. 1 bis 96 durchnumeriert und auf drei Petrischalen eines Durchmessers von jeweils 9 cm mit jeweils 25 ml des angegebenen, jedoch vitaminfreien synthetischen Agarme diums (d. h. Murashige′- und Skoog′sches Basalmedium, er gänzt durch 3% (G/V) Rohrzucker, 0,2% (G/V) Malzextrakt, 1 ppm 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 2 ppm Glycin, 100 ppm Inosit und 0,8% (G/V) Agar) transplantiert. Die Segmente werden auf dem Medium bei einer Temperatur von 28°C unter Licht einer Lichtstärke von 2000 Lux gezüchtet. Nach 14 Ta gen werden die verschiedenen Zellenaggregate entnommen und gewogen, worauf der Wachstumsindex des Zellenaggregats er rechnet wird. Die erhaltenen Werte für den Wachstumsindex werden, wie die folgende Tabelle I ausweist, in eine Reihe gebracht, worauf die Anzahl der Segmente in jeder Reihe ge zählt und ihr Mittelwert und ihre Standardabweichung er rechnet werden. Zwei Zellenaggregate zeigen Wachstums indizes in einem Bereich zwischen dem maximalen Wert und dem nicht mehr als Einfachen der Standardabweichung vom maximalen Wert, nämlich das Zellenaggregat Nr. 75 (einer nominalen Größe von etwa 8 mm) mit einem Wachstumsindex von 2,98, und das Zellenaggregat Nr. 36 (einer nominalen Größe von etwa 7 mm) mit einem Wachstumsindex von 2,55.

Nun wird das Zellenaggregat Nr. 75 in 36 Segmente und das Zellenaggregat Nr. 36 in 28 Segmente unterteilt, wo rauf diese Segmente in der geschilderten Weise weiterge züchtet werden. Die Ergebnisse finden sich ebenfalls in Tabelle I. Die Unterteilung, Züchtung und Selektion werden weitere dreimal in der geschilderten Weise wiederholt, wo bei die ebenfalls in Tabelle I aufgeführten Ergebnisse erhalten werden. Nach insgesamt fünfmal wiederholter Un terteilung, Züchtung und Selektion beträgt der Mittelwert des Wachstumsindex 5,42. Der Mittelwert für den Wachstums index der Vergleichszellenaggregate, die auf dem vitamin haltigen Medium gezüchtet wurden, liegt zwischen 5,28 und 5,81. Dies zeigt, daß im Rahmen des Verfahrens gemäß der Erfindung Zellen, die keine Vitamine benötigen und in gleichem Maße wachsen wie Zellen, die Vitamine benötigen, erfolgreich gewonnen werden können.

Tabelle I

Beispiel 2

Ein gezüchtetes Euphorbia millii-Zellenaggregat P (einer nominalen Größe von etwa 12 mm), das auf einem festen Me dium wachsen gelassen worden war, wird mit Hilfe eines sterilen Skalpells in 43 Segmente einer nominalen Größe von etwa 3 mm unterteilt. Diese 43 Segmente werden von Nr. 1 bis Nr. 43 numeriert und auf eine Petrischale eines Durchmessers von 9 cm mit 25 ml eines synthetischen Agar mediums übertragen. Das verwendete synthetische Agarmedium erhält man durch Zusatz von 2% (G/V) Rohrzucker, 0,2% Malzextrakt, 10^-6M 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 0,1 ppm Thiaminhydrochlorid, 0,5 ppm Pyridoxinhydrochlorid, 0,5 ppm Nikotinsäure, 2 ppm Glycin und 100 ppm Inosit zu Murashige′- und Skoog′schem Basalmedium, Einstellen des pH-Wertes des Gemischs mit 0,1 n NaOH auf 6,0, Zusatz von 0,8% (G/V) Agar und übliches Sterilisieren des Ganzen.

Die 43 Segmente werden auf dem Medium bei einer Temperatur von 28°C unter Licht einer Lichtstärke von 3000 Lux ge züchtet. Nach 10 Tagen werden sämtliche 43 Zellenaggregate einer nominalen Größe von etwa 5 bis 8 mm, die durch Wachs tum und Vermehrung aus den Segmenten erhalten wurden, entnommen und erneut mit Hilfe eines sterilen Skalpells in Segmente einer nominalen Größe von etwa 3 mm unter teilt. Hierbei wird jedes Zellenaggregat in etwa 4 bis 7 Segmente unterteilt. Jedes dieser 4 bis 7 Segmente wird aufgenommen, gewogen und 1 h lang in 5 ml einer 2%igen methanolischen Salzsäure eingeweicht, worauf die Absorp tion der methanolischen Lösung bei 530 nm (λ_max des Pigments) gemessen wird. Das Pigmentgewicht und der Pig mentgehalt der 43 Segmente ergibt sich aus der Eichkurve. Hierauf werden aufgrund dieser Werte sechs von den ur sprünglich 43 Zellenaggregaten (aus denen die sechs Segmente mit dem höchsten Pigmentgehalt herrühren), d. h. die Zellenaggregate Nr. 6, 18, 30, 36, 40 und 43, ent sprechend dem in den Zeichnung dargestellten Selektions schema und der folgenden Tabelle II selektiert. Daraufhin werden von diesen sechs Zellenaggregaten herrührende 36 Segmente mit Nr. 1 bis Nr. 36 numeriert, in eine Petri schale eines Durchmessers von 9 cm mit 25 ml desselben synthetischen Agarmediums, wie es auch für die erste Züch tung verwendet wurde, übertragen und unter den auch bei der ersten Züchtung eingehaltenen Bedingungen weiterge züchtet. Sämtliche 36 Zellenaggregate, die durch Wachstum und Vermehrung aus den genannten 36 Segmenten erhalten wurden, werden in der geschilderten Weise in Segmente einer nominalen Größe von etwa 3 mm unterteilt, worauf in der ge schilderten Weise der Pigmentgehalt irgendwelcher dieser Segmente colorimetrisch bestimmt wird. Aufgrund der Pigment gehaltwerte werden sechs Zellenaggregate von den ursprüng lich 36 Zellenaggregaten (aus denen die betreffenden sechs Segmente mit einem hohen Pigmentgehalt herrühren), d. h. die Zellenaggregate Nr. 5, 8, 10, 16, 26 und 30 selektiert. Das Ganze wird in entsprechender Weise noch viermal wie derholt (vgl. das Selektionsschema und Tabelle II). Nach der dritten Züchtung werden sechs von 38 Zellenaggregaten selektiert, nach der vierten Züchtung werden fünf von 32 Zellenaggregaten selektiert, nach der fünften Züchtung werden fünf von 26 Zellenaggregaten selektiert und nach der sechsten Züchtung werden fünf von 28 Zellenaggregaten selektiert.

Tabelle II

Aus der Tabelle II geht hervor, daß sich nach sechsmaliger Wiederholung der Unterteilung, Züchtung und Selektion ein Zellenaggregat eines Pigmentgehalts von 0,280% isolieren läßt.

Sämtliche von dem Zellenaggregat Nr. 6 mit dem höchsten Pigmentgehalt abgeleiteten und nach der sechsten Selektion erhaltenen Segmente werden in einen 100 ml Erlenmeyer- kolben mit 50 ml eines einen pH-Wert von 6,0 aufweisenden flüssigen Mediums in Form von Murashige′- und Skoog′schem Basalmedium, das durch 2% (G/V) Rohrzucker, 0,2% (G/V) Malzextrakt, 10^-6M 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 0,1 ppm Thiaminhydrochlorid, 0,5 ppm Pyridoxinhydrochlorid, 0,5 ppm Nikotinsäure, 2 ppm Glycin und 100 ppm Inosit er gänzt worden ist, gefüllt und unter den geschilderten Be dingungen 14 Tage lang gezüchtet. Danach wird das Kultur gemisch in einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben mit 500 ml des beschriebenen flüssigen Mediums überführt, unter den ge schilderten Züchtungsbedingungen inkubiert und danach filtriert. Hierbei erhält man 105 g gezüchteter Zellen aggregate. Die erhaltenen Zellenaggregate werden in üb licher bekannter Weise lyophilisiert, wobei 4,7 g Trocken substanz erhalten werden.

Die erhaltene Trockensubstanz wird in einem Mörser ver rieben, 24 h lang in der Kälte in 2%ige methanolische Salzsäure getaucht und schließlich filtriert. Der nach dem Filtrieren erhaltene Extrakt wird durch Verdampfen des Methanols bei einer Temperatur von 40°C oder darunter auf etwa 50 ml eingeengt. Das hierbei erhaltene Konzentrat wird in einen Scheidetrichter überführt, worauf in den Scheidetrichter 100 ml Äther gegossen werden. Nach gründ lichem Schütteln des Gemischs im Scheidetrichter wird die Ätherphase abgegossen. Nach mehrmals wiederholter Äther wäsche wird das gewaschene Konzentrat unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von 40°C oder weniger zur Trockene eingedampft. Der hierbei erhaltene Verdampfungs rückstand wird in einer geringen Menge einer 0,01%igen methanolischen Salzsäure gelöst. Die erhaltene Lösung wird durch präparative Dünnschichtchromatographie auf einer dünnschichtchromatographischen Zelluloseplatte (20 cm × 20 cm) unter Verwendung eines 5 : 1 : 5-Gemischs aus Salz säure, Essigsäure und Wasser als Entwickler aufgearbeitet. Nach der Entwicklung wird ein auf der Platte befindliches rotes Band abgekratzt und in eine 2%ige methanolische Salzsäure getaucht. Hierbei erhält man einen ein rotes Pigment enthaltenden Extrakt. Der erhaltene Extrakt wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von 40°C oder weniger zur Trockene eingedampft, wobei 218 mg eines dunkelroten Pulvers erhalten werden (4,6%, bezogen auf das Trockengewicht der Zellenaggregate, 0,208%, bezogen auf das Frischgewicht der Zellenaggregate).

Das erhaltene rote Pigment wird auf einem handelsüblichen Chromatographierpapier einer Papierchromato graphie unterworfen. Chromatographiert wird mit dem Lö sungsmittelsystem: n-Butanol/Essigsäure/Wasser (4 : 1 : 5), obere Schicht; n-Butanol/Chlorwasserstoffsäure/Wasser (5 : 1 : 4), obere Schicht; 1% Chlorwasserstoffsäure, und Essigsäure/Chlorwasserstoffsäure/Wasser (15 : 3 : 82). Danach werden die Rf-Werte des Pigments ermittelt. Die ermittel ten Rf-Werte sind mit den entsprechenden Rf-Werten des authentischen Chrysanthemins, das aus Delaware-Trauben extrahiert und isoliert worden war, identisch. Es erfolgt auch eine chemische Strukturbestimmung. Das UV-Spektrum des erhaltenen roten Pigments entspricht ebenfalls dem UV- Spektrum des authentischen Chrysanthemins.

Claims

1. Verfahren zur selektiven Züchtung von Pflanzenzellen, die sich durch mindestens eine spezielle Eigenschaft aus zeichnen, aus gezüchteten Pflanzenzellen, die aus einer höheren Pflanze induziert wurden, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) ein gezüchtetes Pflanzenzellenaggregat in Segmente einer nominalen Größe von 2 bis 10 mm unterteilt,
(b) die erhaltenen Segmente in einem statischen Kultur gefäß zu den entsprechenden Zellenaggregaten wachsen und sich vermehren läßt und
(c) aus den erhaltenen Zellenaggregaten diejenigen Zellen aggregate auswählt, die sich durch mindestens eine der (gewünschten) speziellen Eigenschaften auszeichnen, wobei aus den erhaltenen Zellenaggregaten ein einzelnes Zellenaggregat, bei dem die betreffende spezielle Eigen schaft am deutlichsten ausgeprägt ist, selektiert wird, andererseits kann man eine Mehrzahl von Zellenaggregaten, die sich durch eine spezielle Eigenschaft auszeichnen, selektieren, indem man die Häufigkeitsverteilung der Zellenaggregate mit unterschiedlichen numerischen Werten des Indikators für die spezielle Eigenschaft aufstellt, einen Mittelwert und eine Standardabweichung (σ) er mittelt und dann diejenigen Zellenaggregate, die einen Indikatorwert (X _i) zwischen dem maximalen Wert (X _max) und dem nicht mehr als dreifachen Wert der Standard abweichung, vorzugsweise dem nicht mehr als einfachen Wert der Standardabweichung vom maximalen Wert, auf nimmt. Der genannte Indikatorwert ergibt sich aus der Gleichung: X _max ≧ X _i ≧ X _max - 3 σ.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als höhere Pflanze Euphorbia tirucalli wählt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als höhere Pflanze Euphorbia millii wählt.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das ge züchtete Pflanzenzellenaggregat zu Segmenten einer nominalen Größe von 2 bis 5 mm unterteilt.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufen (a), (b) und (c) zweimal oder mehrmals wiederholt.