DE2510327A1

DE2510327A1 - Purinnukleosid-5'-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3'-(2')-diphosphate

Info

Publication number: DE2510327A1
Application number: DE19752510327
Authority: DE
Inventors: Yasutaro Hamagishi; Sawao Murao; Toyokazu Nishino; Toshikazu Oki
Original assignee: Sanraku Ocean Co Ltd
Current assignee: Mercian Corp
Priority date: 1974-03-29
Filing date: 1975-03-10
Publication date: 1975-10-09
Also published as: GB1507175A; DE2510327C2; NL7503238A; FR2274312A1; FR2274312B1; US4059487A; NL171910C; NL171910B

Description

Purinnukleosid-5¹-phosphat-(mono-, di- oder tri^-3¹-

Die Erfindung betrifft neue Purinnukleosid-5'-phosphat-(mono- ₍ di- oder tri-)-3'- (2*)-diphosphate sowie die Lithium-, Natrium- und Kaliumsalze davon sowie Verfahren zur Herstellung 3er Purinnukleosid-5 '-phosphat- (mono-, di- oder tri)-3'-(2')-diphosphate, Insbesondere befasst sich die Erfindung mit neuen Purinnukleosid-5' -phosphat- (mono-, di- oder tri-) -3' - (2') -diphosphaten, welche durch eine enzymatische übertragung von Pyrophosphorylgruppen von ATP, dATP und pppApp auf bestimmte 5'-Purinnucleotide unter Verwendung von Mikroorganismen hergestellt werden, die zu den Genera Streptomyces, Actincmyces und Streptoverticillium gehören, oder mit einer neuen Nukleotidpyrophosphotransferase davon sowie mit Verfahren zur Herstellung der Purinnukleosid-5·-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3^!-(2")-diphosphate. Ferner betrifft die Erfindung eine neue Nuklsotidpyrophosphotransferase sowie Methoden zu ihrer Gewinnung und Reinigung aus der Kulturbrühe sowie von Myzein von Mikroorganismen, die zu den Genera Streptomyces,- Streptovertici Ilium sowie Actinomyces gehören.

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Es ist bekannt, dass Adenosintetraphosphat (ppppA), Guanosintetraphosphat (ppGpp) sowie Guanosinpentaphosphat (pppGpp) in der Natur, insbesondere in Mikroorganismen und Tieren, als seltene Nukleosidphosphate verteilt sind. Das ppGpp und das pppGpp werden mit besonderem Interesse bei der Regulierung von Protein- und Ribonukleinsäuresynthesen in E. coli beobachtet, wobei man annimmt, dass sie eine wichtige. Rolle bei der GIykolyse, Lipidsynthese, dem Energiestoffwechsel sowie der Phosphorylierung von verschiedenen Mikroorganismen spielen.

Erfindungsgemäss werden Purinnukleosid-5¹-phosphat-(mono-, dioder tri-) -3'- (2')-diphosphat-Verbindungen durch das folgende Symbol:

mXpp

wiedergegeben, worin X für eines der Nukleoside steht, das aus Adenosin (abgekürzt A), Guanosin (abgekürzt G) und Inosin (abgekürzt I) ausgewählt ist, während ρ einen Phosphatrest bedeutet (p(CH₂)ρ bedeutet einen Methylenphosphatrest). Der Phosphatrest wird auch als Phosphorylgruppe bezeichnet.

m gibt die Anzahl der Phosphorylgruppen in der 5'-Stellung des Nukleosids an und ist eine ganze Zahl von 1 bis 3. Das ^Mp" nach dem "X" befindet sich in der 3'- (2¹) -Stellung. Die Angabe "3'-(2')" zeigt an, dass die Position der Phosphorylgruppe, die mit der Ribose verknüpft ist, entweder die 3¹- oder die 2'-Position der Ribose ist. Es ist nämlich ein reversibler Austausch der Phosphorylgruppe zwischen der 3'- und der 2^s-Stellung der Ribose in dem Nukleosid unter bestimmten Bedingungen möglich. Beispielsweise gibt pppApp an, dass es sich um Adenosin-5'-triphosphat-3'-(2¹}-diphosphat handelt, p(CH₉)ppGpp bedeutet ß, y-Methylenguanosin-5' -triphosphat-3 · - (2') -diphosphat.

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Es ist schwierig, seltene Purinnukleosidphopshate, wie ppGpp und pppGpp, aus Mikroorganismen wegen der sehr geringen verteilung darin zu extrahieren. Die chemische Synthese dieser Nukleosidphosphate ist bis jetzt noch nicht gelungen. Biochemische Synthesen von ppGpp sowie pppGpp sind unter Einsatz von E. coli-Ribosomen, ATP und GDP oder GTP möglich, dieses Verfahren ist jedoch nicht für eine industrielle Produktion in grossen Mengen infolge der komplizierten Verfahrensstufen sowie der extrem niedrigen Ausbeute geeignet.Andere neue Nukleosid-5' -phosphat (-mono-, di- oder tri-) -3' - (2 ·) -diphosphate, wie pppApp, ppApp, ppplpp etc. können nicht von E. coIi ©rsΐ igt werden» Um gründlich die physiologische Rolle dieser Hukleot-ide in Organismen zu untersuchen, besteht ein Bedarf an der Entwicklung eines einfachen und wirtschaftlichen Verfahrens zu ihrer Herstellung. ATP ist die wichtigste Substanz bei der Phosphorylierung und dem Energiestoffwechsel von Organismen« Es konnte gezeigt werden, dass F.. coil und B. subtilis enzymatisch die charakteristischen Nukleotide, und zwar ppGpp sowie pppGpp, welche an Nukleinsäure- und Proteinsynthesen teilnehmen, aus ATP und GDP oder GTP zu synthetisieren vermögen. Jedoch hat die Reinigung des Enzyms, das eine Rolle bei der Bildung von ppGpp und pppGpp spielt, fehlgeschlagen. Eine Vielzahl von Phosphotransferasen und Nukleotid-abbauenden Enzymen wurde aus Mikroorganismen isoliert und charakterisiert, das Enzym, welches die Bildung der vorstehend erwähnten Nukleosidphosphate bewirkt, ist jedoch bisher nicht bekannt geworden.

Der Erfindung liegen Untersuchungen über Purinnukleosidphosphatverbindungen als biochemische Reagentien, hochenergetische Phosphatadditive und Arzneimittel zugrunde. Es wurden viele natürliche Quellen für Mikroorganismen, die eine potentielle Nukletoidpyrophosphotransferase-Aktivität besitzen, untersucht. Dabei wurde die Erkenntnis gewonnen, dass eine neue Spezies,

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dia zu Streptomyces, und zwar Streptomyces adephospholyticus nov. sp A4668 gehört, eine potentielle Nukleotidpyrophosphotransferase-Aktivität besitzt und isoliert werden kann, wobei das Enzym, das pppGpp, ppApp, ppplpp etc. durch Katalysieren der übertragung der Pyrophosphorylgruppe von ATP, dATP und pppApp auf ATP, GTP, GDP, IDP, AMP etc. erzeugt, aus dem Kultur filtrat erhalten und zu einem im wesentlichen homogenen Ganzen gereinigt werden kann. Die Erfindung beruht ferner auf der Erkenntnis, dass Nukleotidpyrophosphotransferase in einigen t'skannten Spezies von Strahlenpilzen auftritt, wobei es ohnf weiteres gelang, die Nukleosid-5¹-phosphat-(mono-, dioder tri-)3' — <2*)-diphosphate durch die charakteristische übertragung der Pyrophosphory!gruppe in der 5'-Stellung von ATP, dATP \\ϊϊά ppplpp auf Purinnukleosidphosphate, wie AMP,ADP, ATP, GMP, GDP₇ IDP, ΓϊΡ etc. unter Einsatz der Kulturbrühe sowie von Myzeln von Hukleotidpyrophosphostransferase-erzeugenden Mikroorganismen hersuateller^ Ferner fällt in den Rahmen der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung und Charakterisierung des Enzyms»

Es werden folgende Abkürzungen verwendet:

AMP: Adenosin-5'-monophosphat ADP: Adenosln-5'-diphosphat GMP: Guanosin-5'-monophosphat IMP: Inosin-5'-monophosphat IDP: Inosin-5'-diphosphat ITP; Inosin-5¹-triphosphat p(CH₂)ppA: ß, r"-Methylenadenosin-5'-triphosphat

p(CH₂)ppG: ß, T^-Methylenguanosin-5¹-triphosphat ppApp: Adenosin-5·-diphosphat-3'-(2')-diphosphat

Untersuchungen der physiologischen Rolle von Nukleotiden in Organismen sowie der Verteilung sowie der Biochemie des Enzyms

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haben die Erkenntnis ergeben, dass die Nukleotidpyrophosphotransferase das Wachstum von verschiedenen Tumorzellen in Kulturen stimuliert oder inhibiert und auch eine ausgeprägte Antitumoraktivität zeigt. Ferner inhibieren die neuen Nukleosid-5'-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3'-(2*)-diphosphate das Wachstum von leukämischen L121O-Zellen in Mäusen und verhindern eine Thrombusbildung.

Es wurde ferner gefunden, dass diese Nukleotide für medizinische Zwecke eingesetzt werden können, beispielsweise als Chemotherapeutika sowie Diagnostiziermittel.

Durch die Erfindung werden neue Nukleosid-5¹-phosphat-(mono-, di- oder tri)-3'-(2')-diphosphate sowie ihre Salze der allgemeinen Formel:

mXpp
geschaffen.

Ferner fällt in den Rahmen der Erfindung die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung der vorstehend beschriebenen neuen Nukleosid-5'-phosphat-(mono-, di- oder tri-) 3¹-(2')-diphosphate durch enzymatische übertragung einer Pyrophosphorylgruppe von bestimmten Nukleotiden auf andere bestimmte Nukleotide unter Einsatz von Mikroorganismen oder eines aus diesen hergestellten Enzyms. Durch die Erfindung werden neue Nukleosid-5'-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3'-(2'-)monophosphate geschaffen, b ei denen ein Phosphat an der 3*-(2^S)-Stellung der vorstehend beschriebenen Nuklso-sid-S¹ -phosphat- (monc--=, di- oder tri-)-3^s~{2')-diphosphate fehlt. Ferner wird eine neue Nukleatidpyrophosphotransferase geschaffen, die in charakteristischer Weise die Pyrophosphoryl-Übertragungsreaktionen katalysiert.

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In den Rahmen der Erfindung fällt auch die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung der charakteristischen Nukleotidpyrophosphotransferase unter Verwendung von Mikroorganismen. Darüber hinaus wird ein chemotherapeutisches Mittel gegen Krebs sowie ein Mittel zur Verfügung gestellt, das eine Thrombenbildung zu inhibieren oder hemmen ve mag, beispielsweise nach Operationen sowie unter Bedingungen, unter denen ein starkes Blutplättchen-Zusammenballen auftritt. Die Erfindung wird nachfolgend, insbesondere unter Bezugnahme auf die beigefügten zeichnungen, näher erläutert.

Es zeigen:

Fig. 1 bis 3 UV-Absorptionsspektren von Adenosin-5'-triphosphat-3'-diphosphat, Guanosin-5'-diphosphat-3'-diphosphat und Inosin-5¹ triphosphat-3'-diphosphat in H₂O, wobei auf der vertikalen Achse die optische Dichte aufgetragen ist.

Fig. 4 und 5 NMR-Spektren von Guanisin-S'-diphosphat-S'-diphosphat bzw. Inosin-5'-trisphophat-3'-diphosphat.

Fig. 6 ein C NMR-Spektrum von Adenosin-5'-triphosphat-3'-diphosphat in D₂O (100 MHz).

Fig. 7 den Zeitverlauf der Enzymproduktion durch (A) Streptomyces morookaensis ATCC 19166 und (B) Streptomyces aspergilloides ATCC 14808, wobei auf der vertikalen Achse die ml des Volumens der gepackten Zelle und der pH-Wert {rechts} sowi^ die Enzymaktivität (links) und auf der horizontalen Achse die Stunden aufgetragen sind.

Fig. 8 die Beziehung zwischen der Ensyrnkonzentration. uac! c-er Warmestabilität des aus Strectomyces morookaensis? ATCC 15166 erhaltenen Enzyms _f wobei auf dar vertikalen. Achse der Prozentsatz der 'Restaktivität aufgetragen is·tu

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Fig. 9 das Molekulargewicht der Enzyme, die aus den Mikroorganismen gemäss vorliegender Erfindung erhalten werden, and zwar berechnet unter Anwendung einer Sephadex G-7B-Gel^j filtration sowie von Standardproteinen als Verc₍j.sichsproben, wobei auf der vertikalen Achse das Molekulargewicht (x 10^} und auf der horizontalen Achse die Bruchzahl aufgetragen ist.

Mikroorganismen sowie Methoden zu ihrer Züchtung: Mikroorganimsen:

Die erfindungsgemäss eingesetzten Mikroorganismen sind eine neue Spezies von Streptomyces, Streptomyces adephospholyticus, nov. sp. A4668 sowie bekannte Spezies von Strahlenpilz die zu den Genera Streptomyces, Actinomyces und Streptoverticillium gehören. Da die Strahlenpilze leicht natürlich oder künstlich mutierbar sind, umfassen erfindungsgemäss die Mikroorganismen den typischen Stamm sowie alle natürlichen und künstlicheh Varianten und Mutanten desselben. Dies bedeutet, dass die erfindungsgemässen Mikroorganismen alle Stämme von Strahlenpilzen umfassen_r die eineNukleotidpyrophosphotransferase-AktivitSt aufweisen.

Die folgenden Stämme werden als Beispiele genannt:

Streptomyces aspergilloides ATCC 14804 Streptomyces morookaensis ATCC 19166 Streptomyces hachijoensisATCC 19769 Streptoverticillium septatum ATCC 27464 Actinomyces violascens ATCC 23968

Kulturen dieser Stämme wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Md., hinterlegt und sind jedermann verfügbar.

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Einer der Stämme, der erfindungsgemäss verwendet wird, und zwar Streptomyces adephosoholyticus nov. sp. A4668, wurde kürzlich von einer Bodenprobe isoliert, die bei Sakai-city, Osaka, Japan, gesammelt wurde. Er besitzt folgende morphologische, makroskopische, mikroskopische sowie biochemische Eigenschaften:

a) Morphologische Eigenschaften (inkubiert auf einem Malzhefeextrakt- Agarmei
bis 20 Tagen).

extrakt-Agarmedium bei 28°C während einer Zeitspanne von 10

Die Luftmyzel sind einfach verzweigt, wobei sich an den Spitzen der Myzelfäden-Sporenträger lange offene Spiralen bilden. Die reifs Sporenkette ist lang und trägt mehr als 10 Sporen pro Kette.

Die Sporen sind oval und besitzen ei.ne stachelige Oberfläche. Ihre Abmessungen bacragsn C_;4-OΛ λ 0,6-0,8 μ. Ein Auftreten von Heisein, Sporenträgern oder Sklerctia wird nicht beobachtet.

Die Inkubation wird bei 28°C durchgeführt, sofern nichts anderes angegeben ist.

b) Züchtungseigenschaften auf verschiedenen Medien:

1) Auf einem Rohrzucker/Nitrat-Agar: Wachstum; langsam oder massig
Luftmyzels teilweise samtig weiss mit einem purpurnen

Stich

Substratmyzel: weiss bis hellgelb, teilweise hellgelb-orange Lösliches Pigment: keines

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2) auf einem Glukose/Asparagin-Agar: Wachstum: massig, Oberfläche faltig

Luftmyzel: teilweise samtig weiss mit einem purpurnen Stich

Substratmyzel: leicht gelblich
Lösliches Pigment: keines

3) auf einem Glyzerin/Asparagin-Agar: Wachstum: massig

Luftmyzel: teilweise samtig, zuerst weiss mit

grün-gelbem Stich, nach 2-wöchigem Züchten leicht gräulich-purpur Substratmyzel: zerst leicht gelb-orange, später leicht

grau-rötlich-braun

Lösliches Pigment: gewöhnlich keines, manchmal ein hellgelbes nach 2-wöchigem Züchten

4) auf einem Stärkeagar (Agar aus Stärke und anorganischen

Salzen):

Wachstum: massig

Luftmyzel: teilweise gepunktet, weiss bis gräulichpurpur oder purpur oder purpur-weiss auf einer alten Kultur

Substratmyzel: weiss bis hellgelb in einer jungen Kultur, hellgelb-orange in einer alten Kultur

Lösliches Pigment:" keines

5) auf einem Tyrosinagar:
Wachstum: massig

Luftmyzel% reichlich, weiss, sehr leicht purpur in

einer alten Kultur

Substratmyzel: gräulich-gelb bis rosa-beige oder massig gelblich bis gelblich-braun, hellbraun in einer alten Kultur

. Lösliches Pigment: gelb bis gräulich-gelb-braun, verschwindet in einer alten Kultur

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6) auf einem Nähragar:

Wachstum: massig, Oberfläche faltig LuftEiyzel: keine

Substratmyzel: leicht grau-rötlich-braun Lösliches Pigment: leicht braun, verschwindet in einer

alten Kultur

7) auf einem Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar: Wachstum: reichlich, faltige Oberfläche Luftmyzel: samtig weiss bis hellgelb Substratmyzel: hellgelb bis gräulich-gelb, massig

gelblich bis grün-gelblich bis leicht grau-rötlich-braun in einer alten Kultur Lösliches Pigment: keines

8) auf einem Hafermehlagar:

Wachstum: reichlich, faltige Oberfläche Luftmyzel: weiss, verändert sich in gräulich-gelblich

bis grünlich-gelb oder purpur-grünlich-gelb

in einer alten Kultur Substratmyzel: gräulich-gelb in einer jungen Kultur,

leicht gräulich-gelbbraun bis heilbraun in

einer alten Kultur
Lösliches Pigment: keines

c) Physiologische Eigenschaften:

1) Wachstunistemperatur: die optimale Temperatur liegt bei bis 30°C. Bei 1O°C erfolgt ein spärliches Wachsen, oberhalb 37 C wird kein Wachsen festgestellt.

2) Gelatineverflüssigung auf einem Glukose/Pepton/Galatine-Medium bei 2O°C: positiv

3) Stärkehydrolyse auf einem Agar aus Stärke und anorganischen Salzen: positiv

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4) Peptonisierung und Koagulation von abgerahmter Milchs positiv

5) Melaminbildung auf einem Tyrosinagar, einem Papton/Hsfeextrakt/Fe -Agar sowie einer Trypton/Hefeextraktbiühe: positiv

6) Nitratreduktion: positiv

7) Verbrauch von Kohlehydraten auf einem Pridham-Gottlieb-Grundmedium: reichliches Wachstum mit L-Arabinose, D-Xylose,

D-Glukose, D-Fruktose, Inosit, Raffinose und D-Mannit, leichtes Wachstum mit Rohrzucker, kein Wachstum oder sehr geringes Wachstum rait L-Rhamnose.

Nimmt man eine Klassifizierung auf der Basis der morphologischen und physiologischen Eigenschaften des Stammes gemäss "The Actinomycetes", Band II, 1961 von S.A. Waksman, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, 1957 sowie International Journal of Systematic Bacteriology, Band 18 (1968) Nr. 2 und 4 und Band 19 (1969) Nr. 4 vor, dann gehört der Stamm zu dem Genus Streptomyces, da vegetative Myzel nicht in den flüssigen Medien zu bazillären Fragmenten getrennt wurden und Luftmyzel einfach verzweigt waren, wobei die Sporophoren lange offene Spiralen an den Myzelfäden bilden.

Vergleicht man diese mikrobiologischen Eigenschaften mit denjenigen bekannter Spezies von Streptomyces, dann ähnelt der erfindungsgemässe Stamm offensichtlich der Lavendulae-Reihe, und zwar Streptomyces lavendulae und St. venezualae, unterscheidet sich jedoch von diesen Stämmen in Details.

Die Züchtungseigenschaften sowie die physiologischen Eigenschaften der erfindungsgemässen Stämme sind im Vergleich zu bekannten Spezies denjenigen von Actinomyces violascens sehr ähnlich. Aus den Ergebnissen von parallelen Züchtungen des erfindungsgemässen Stammes und des Standardstammes von Act.

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violascens ISP 5183 gehen einige Unterschiede bezüglich der Züchtungseigenschaften hervor, beispielsweise der Farbe der Luft- und Substratmyzel sowie des Aussehens auf Hefeextrakt/ MalzexfcraktrAgar, Tyrosinagar, Pepton/Hefeextrakt/Fe -Agar sowie Nähragarmedium, ferner werden Unterschiede bezüglich des Kohlenstoffassimilierungsverhaltens festgestellt. Der erfindungsgamässe Stamm vermag D-Mannit, Inosit und Fruktose zu assimilieren, während Act. violascens nicht zur Assimilation von D-Mannit in der Lage ist und nur schwach die zwei anderen Zucker zu verbrauchen vermag.

Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, dass der erfindurrragamässe Stamm als neue Spezies zu identifizieren ist. Er wird als St, adephospholyticus nov, sp. A4668 bezeichnet.

Eine Kultur von St, adephospholyticus A 4668 wurde in dem Fermentation Research Institute, Japan, am 24, März 1973 sowis in der American Type Culture Collection, Rockville, Md., hinterlegt und den ständig in MikiOorganismensammlungen unter den Nummern ATCC Nr. 3i122 bzw. FSRM Nr. 1992 zugefügt.

Züchten der Mikroorganismen, welche eine Nukleotidpyrophosphotransferase-Aktivität besitzen:

Die neue Spezies, und zwar St. adephospholyticus, sowie andere authentische Stämme von" Strahlenpilzen, die eine Nukleotidpyrophosphotransferase-Aktivität besitzen, enthalten das Enzym als solches und zeichnen sich dadurch aus, dass sie das Enzym in dem Kulturfiltrat extrazellular unter den allgemeinen Gärungsbedingungen, die zum Züchten von anderen Strahlenpilzen ange^-ndet werden, ausscheiden. Wenn auch das Züchten auf einem festen Medium sowie ein Abtrennen von Myzeln zur Herstellung des Enzyms möglich sind, so ist dennoch die Gewinnung des Enzyms, das aktiv in dem Kulturfiltrat durch eine aerobe Submerskultur ausgeschieden worden ist, besonders vorteilhaft bei der

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industriellen Erzeugung grosser Mengen der reinen Enyzmzubereitung.

Medien, die aus bekannten Nährquellen für das Wachstum von Strahlenpilzen bestehen, können zur Herstellung der Nukleotidpyrophosphotransferase verwendet werden. Als Kohlenstoffquelle enthält das Medium vorzugsweise Glukose, Rohrzucker, Maltose, Fruktose, Stärke, Stärkehydrolysat, Glyzerin, Glycin, Alanin, Glutaminsäure, Melassen, Dextrin, öl, Fette oder dergleichen. Als Stickstoffquelle enthält das Medium vorzugsweise organische Materialien, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Fischmehl, Kaseinhydrolysat oder Harnstoff. Als anorganische Quellen für Stickstoff kommen Nitrate und Ammoniumsalze in Frage, beispielsweise Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid. Das Medium enthält ferner andere anorganische Salze, beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat sowie Kaliumcarbonat, sowie Spurenmengen an Schwermetallen, wie Mangan, Eisen, Zink und dergleichen. Bei der Durchführung von belüfteten Submerskulturen wird ein Antischäumungsmittel, wie beispielsweise ein flüssiges Paraffin, Sojabohnenöl, ein Fettöl oder ein Silikon, verwendet.

Die Züchtungstemparatur liegt gewöhnlich zwischen 20 und 40°C, wobei der bevorzugte Temperaturbereich zwischen 25 und 30 C schwankt. Es ist nicht notwendig, den pH-Wert des Kulturmediums während des Züchtens zu steuern. Die Enzymaktivität in-dem KuI-turfiltrat erreicht ein Maximum nach einer Inkubationszeit von 42 bis 72 Stunden.

Enzym und Methode su seiner Reinigung: Reinigung:

Ein Beispiel für die Herstellung des Enzyms wird nachfolgend beschrieben:

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100 ml eines Mediums aus 2 % Glyzerin, 4 % Polypepton, 0,1 % KH₃PO₄, 0,1 % K₃HPO₄, 0,04 % MgSO₄^H₃O und jeweils 2 ppm Mn und Fe wird in 500 ml Sakaguchi-Schüttelkolben gegeben und bei 120 C während einer Zeitspanne von 15 Minuten sterilisiert. Auf dieses sterilisierte Medium werden Streptomyces aspergilloides ATCC 14808 und St. morookaensis ATCC 19166 in getrennten Kolben aus einer Agarschrägkultur mittels einer Platinschlaufe aufgeimpft, worauf auf einem sich hin- und herbewegenden Schüttler bei 28°C inkubiert wird. Der Zeitverlauf der Enzymerzeugung in dem Kulturfiltrat, der aus Fig. 7 hervorgeht, wird nach der später beschriebenen Methode bestimmt.

Die Fig.. 7 A zeigt den Zeitverlauf der Enzymaktivität von St. morookaensis ATCC 19166 und die Fig. 7B denjenigen von St. aspergilloides ATCC 14808. Dabei wird die Enzymaktivität als Einheit/ml ausgedrückt, und zwar bestimmt durch die Bildung von pppApp oder Pi (anorganisches Phosphat). Das Zellwachstum wird als P.C.V. wiedergegeben (gepacktes Zellenvolumen I.

Nach der Gärung kann das Enzym gereinigt und nach üblichen Methoden gewonnen werden, beispielsweise durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat, durch Lösungsmittelausfällung, durch Extraktion, durch Adsorption, durch Elektrophorese, durch Elektrofokusierung, durch Gelfiltration, durch Verwendung von Ionenaustauscherharzen oder dergleichen oder durch eine Konsbination von Methoden, wobei in diesem Falle wenigstens eine o^-sr mehrer der angegebenen ausgewählt warden.

Unter Züchtungsbedingungen, die ein Wachsenlassen der Mikroorganismen gestatten, findet man das Enzym hauptsächlich in dem flüssigen Teil der Kulturbrühe nach dem Entfernen d&z Myzein. Die Gewinnung des Enzyms in reiner Form aus deu; Kulturfiltrat, in welchem es sich in hoher Konzentration angereichert hat, ist bei der Durchführung in industriellem Maßstabe vorteilhaft.

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Reinigungs- und Herstellungsverfahren des Enzyms aus St <, morookaensis ATCC 19166 wird als Beispiel in Tabelle I angegeben .

Die Reinheit der fertigen Enzymzubereitung wird durch Polyacrylamid- und SDS-Polyacrylamid-Ge!elektrophorese untersucht, Die gereinigte Enzymzubereitung wandert als einzige Bande auf den Gelen, woraus hervorgeht, dass das Enzym elektrophoretisch homogen ist.

Tabelle I

Reinigungsverfahren von Nukleotidpyrophosphotransferase aiu3 Streptomyces morookaensis ATCC 19166

VoIu- ^I £££, 5?f£ men,mx _{tä E±n}_ _{ΟΌ j tivität

^28Onm

heiten ^28Olm'

Kulturfiltrat 20000 77190 1218420 0,63 100 (NH,),SO,-Niederschlag, 60%i- ^{9789 471811 25622}° ¹'^{84 61}'¹ ge Sättigung

DÄAÄ-Zellulose- 11200 436800 146940 2,98 56,6 Säule (pH 5,6)

CM-Sephadex C-50- 1660 72422 16384 4,42 9,4 Säule (pH 5,6)

CM-Sephadex C-25- 910 16244 309 52,6 2,1 Säule (pH 5,5)

DfiAÄ-Sephadex 159 6298 20 315 0,8

A-25 (pH 8,7)

Sephadex G-75 14 6<^19 6,7 903 0,8 (pH 8,7)

Die sehr geringe Ausbeute an gereinigtem Enzym in dem Beispiel wird durch einen beträchtlichen Verlust an Enzymaktivität bei der Entfernung von unreinem Protein während des Reinigungsverfahrens sowie durch die schnelle Inaktivierung durch Verdünnung

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verursacht.

Die Zugabe von Proteinen, wie Kasein sowie Rinderserumalbumin und nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mitteln, wie Tween und Span, zu der Enzymlösung schützt das Enzym gegenüber einer Inaktivierung, verbessert die Ausbeute an gereinigtem

Enzym und macht es möglich, das Enzym während einer langen Zeitspanne zu lagern.

Die Snzymuntersuchungen werden unter Anwendung einer der folgenden Methoden durchgeführt;

1} Anorganische Phosphattastimmung durch eine Modifizierung der Nakamurs-Methode: Die Standard-Reaktionsmischung enthält 0,2 al eines 0,25m Glycin-NaOH-Puffers (pH 10,0), 0,05 ml einer 0,05m MgCl₂-Lösung, 0^05 ml eines 0,05m-ATP, 0,1 ml der Enzymlösung (die durch den Puffer erforderlichenfalls verdünnt wird) und 0,1 ml destilliertes Wasser in einem Endvolumen von¹ 0,5 ml. Nach einer Inkubation bei 37°C während einer Zeitspanne von 10 Minuten wird die Reaktion durch Zugabe von 0,5 ml einer O,2n-Essigsäure beendet, worauf auf Eis abgeschreckt wird. Sofort danach werden 3 ml eines Entwicklungsreagenses (Amidolmolybdat) zugesetzt, worauf die Mischung während einer Zeitspanne von 10 Minuten bei 37°C stehen gelassen wird. Die optische Dichte wird bei 750 nm gemessen. Die Anzahl der Mole an freigesetztem Pi wird berechnet, wobei die Pi-Standardkurve verwendet wird. Eine Einheit der Enzymaktivität wird als die Menge Enzym definiert, welche 1 yMol ^pi P^o Minute unter Standardbedingungen zu bilden vermag.

2) Bestimmung von bei der Reaktion gebildetem pppApp und AMP unter Anwendung von radioaktivem ATP.

Die Reaktionsmischung enthält 20 mM Adenosin-8-3H-triphosphat (2 mCi/mMol) , 5 mM MgCl₂, 62,5 mM Glycin-NaOH-Puffer (pH 10,0)

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sowie O,1 ml der Enzymlösung. Das Gesamtvolumen beträgt 0,2 ml. Die Mischung wird bei 37°C während einer Zeitspanne von 10 Minuten inkubiert. Die Inkubation wird durch Zugabe von 0,01 ml 1n-Essigsäure beendet. 20 ul der Reaktionsmischung werden dann auf eine Polyäthylenimin (PÄIJ-Zellulose-F-Dünnschichtplatte (E. Merck AG) fleckweise aufgebracht, worauf getrocknet und in einer 0,75m KH^PO.-Lösung mit einem pH-Wert von 3,4 während einer Zeitspanne von 2 Stunden bei Zimmertemperatur entwickelt wird. Nach der Chromatographie werden die Platten getrocknet und mit UV-Licht bestrahlt, das von einer Manasul-UV-Lampe ausgeschickt wird, um das gebildete pppApp und AMP zu lokalisieren. Die Flecken auf den Chromatogrammen, die pppApp und AMP entsprechen, v/erden ausgeschnitten und in eine Szintillationsampulle gegeben, die 0,5 ml einer 0,1η HCl enthält. Die Ampullen werden v/ährend einer Zeitspanne von 15 Minuten einer Siedebehandlung unterzogen, um die Nukleotide zu eluieren, die an der PÄI-Zellulose adsorbiert sind. Die Radioaktivität wird mittels 10 ml einer BRAY-Lösung in einem Flüssigkeitsszintillationszähler gemessen. Eine Einheit der Enzymaktivität wird als die Menge des Enzyms definiert, die 1 uMol pppApp oder AMP pro Minute unter den vorstehend geschilderten Bedingungen bildet.

Enzym:

Die Nukleotidpyrophosphotransferase-Zubereitung, die von den erfindungsgemässen Mikroorganismen durch eine Kombination der verschiedenen vorstehend erwähnten Methoden erhalten wird, hat sich als neues Enzvm erwiesen, das folgende physikalisch-chemische Eigenschaften besitzt;

a) Enzymreaktion und Substratspezifität;

Die aus den vorstehend erwähnten 6 Mikroorganismen erhaltenen

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Enzyme katalysieren die Übertragungsreaktion einer Phosphorylgruppe von ATP, dATP und pppApp auf die 3¹-(2')-Stellung von AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, IMP, IDP, ITP, p(CH₂)ppA, p(CH₂)ppG oder dergleichen. Die neuen Reaktionsprodukte sind pApp, ppApp, pppApp, pGpp, ppGpp, pppGpp, plpp, pplpp, ppplpp, p(CH₂)ppApp, p(CH₂)ppGpp oder dergleichen.

Andere Pyrimidinnukleotide, p-tfitrophenylphosphat, Pyrophosphat, Glukose-1-phosphat, Glycerin-3-phosphat, Tripolyphosphat, Nukleoside sowie Basen können nicht eine Phosphorylgruppe annehmen oder abgeben. Es gibt einige Unterschiede bezüglich der Pyrophosphatakzeptor- und -donatoraktivitäten, und zwar je nach dem pH-wert, den Metallionen sowie den Mikroorganismen, im allgemeinen verläuft jedoch die Donatoraktivität über die Reihenfolge ATP, pppApp und dATP, während diejenige der Phosphatakzeptoraktivität über Adenosinphosphat, Guanosinphosphat und Inosinphosphat in der angegebenen Reihenfolge festzustellen ist.

b) pH-Optimum und Metallbedarf:

Das Enzym, das die Bildung von pppApp aus ATP zu katalysieren vermag, zeigt einen absoluten Bedarf an zweiwertigen Metallionen. Es wird keine Aktivität in der Reaktionsmischung festgestellt, falls zweiwertige Metallionen fehlen. Das pH-Optimum sowie die optimalen Konzentrationen an zweiwertigen Ionen hängen von den jeweiligen Metallionen sowie den Enzymquellen ab, wie aus der Tabelle II hervorgeht.

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Tabelle II

Beziehung zwischen dem pH-Wert und den Metallionen auf die Enzymaktivität

En zymqueIlen

Actinomyces violascens ATCC 23968

Streptoverticilliura

septatum ATCC 27464

Streptomyces morookaensis ATCC 19166

Streptomyces aspergilloides ATCC 14808

Streptomyces hachij oensis ATCC 19769

Metall	Optimale	5	χ	X	X	X	ΙΟ"³	Opti	Relative
ionen	Konzentration,	3	χ	X	X	X	10"³	maler	Aktivi
	m	5	X	X	X	X	ΙΟ"³	pH-Wert	tät, %
Mg++ -	5	X	ιοίΞ	X	X	ΙΟ"³	10-10,5	100
Mn++	5	X	3	X		ΙΟ"³	9,5-10	45
Co++		ιοίϊ	7	X	. 5x10~³	9	43
Zn++	ΙΟ"²	5	X		9,5
Fe++	7	5	X	ΙΟ"³	9	30
Mg++	5	5	X	ΙΟ"³	9,5-10	100
Mn++	5	7	ίο—	ΙΟ'³	10-10,5	40
Co++	7	5	. 5χ10"³	8-8,5	35
Zn++	5	7	ιο~³	8,5-9	20
Fe++	5	2	ΙΟ"³	?,5-8	20
Mg++	5	ίο-³	10-11	100
Mn++	10"³	11	60
Co++	10-³	9-9,5	65
Zn++	ΙΟ"³	9,5	15
Fe++	ΙΟ"³	8-S	25
Mg++	ΙΟ"³	10-11	100
Mn++	10~³	10,5	50
Co++	5x1θ"³	8,5-9	60
Zn ,	ΙΟ"³	9-10	20
4-+ Fe	ΙΟ'³	8,5	55
Mg++	ΙΟ"³	9,5	100
Mn++	10~³	9-9,5	35
Co++	8-8,5	75
Zn++	8,5-9	20
Fe++	7,5	25

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c) Optimale Temperatur:

Bezüglich der optimalen Temperatur der Enzymreaktion treten unabhängig von der Art der eingesetzten Mikroorganismen keine Unterschiede auf. Die Temperatur von 40 bis 45 C ist bei einem optimalen pH-Wert in Gegenwart von Magnesiumionen optimal.

d) Stabilität:

Das von den sechs Strahlenpilzstammen isolierte Enzym ist in ähnlicher Weise bei einem pH-Wert stabil, der zwischen 7 und 11 schwankt und bei einem sauren pH-Wert unterhalb 6 instabil. Ist die Enzymlösung bei 37 C während einer Zeitspanne von 2 Stunden gestanden, dann beträgt die Restaktivität 10 bis 20 % bei einem pH-viert von 4, 30 bis 50 % bei einem pH-Wert von 5 und 60 bis 70 % bei einem pH-Wert von 6. Wenn auch die Wärmestabilität durch das Ausmaß der Verdünnung der Enzymlösung sowie durch das Vorliegen von unreinen Protein beeinflusst wird, so ist es dennoch im allgemeinen oberhalb 60 C instabil. Wird beispielsweise das Enzym, das von St. morookaensis ATCC 19166 erhalten wird, auf verschiedene Enzymproteinkonzentrationen verdünnt und während einer Zeitspanne von 10 Minuten in einem O,O5m-Glycin-NaOH-Puffer (pH 10), der 5 χ 10 m Magnesiumionen enthält, erhitzt, dann kann keine thermische Inaktivierung sogar bei 90 C beobachtet werden, wenn die Enzymproteinkonzentration hoch ist, bei einer geringen Enzymproteinkonzentration erfolgt jedoch eine schnelle Inaktivierung sogar bei 30°C, wie aus Fig.8 hervorgeht.

Die thermische Inaktivierung sowie die Inaktivierung bei einem sauren pH-Wert kann durch Zugabe von 20 bis 300 ug/ml an Proteinen, wie Serumalbumin, Kasein oder dergleichen, oder von 0,001 bis 0,01 % an nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mitteln, vie Tween, Span oder dergleichen, verhindert werden.

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e) Inhibitoren:

Inhibierende Wirkungen von 40 Substanzen, die allgemeine Enzyminhibitoren sind, wie Nukleoside, Nukleotide sowie ihre Basen, wurden auf ihre Wirkung auf die Enzyme, die aus den sechs Strahlenpilzen gewonnen wurden, untersucht.

Von den getesteten Nichtsubstrat-Nukleinsäuren bewirken Guanin, Guanosin, d-GDP und d-GTP (jeweils 10 mMol) eine merkliche Inhibierung, während andere Nukleinsäuren, wie Adenin, Adenosin, 2'-(3¹J-AMP, Hypoxanthin, Inosin, Xanthin, üracil, üridin, Cytosin, Cytidin, CMP und NAD nicht inhibierend sind. Bestimmte Konzentrationen an Natriumborat, 5 mMol Quecksilberacetat, 5 mMol Jodacetat sowie 0,1 iriMol N-Bromsuccinimid inhibieren 50 bis 80 % der Enzymaktivität.

f) Stimulierung:

Die Enzymaktivität kann merklich stimuliert werden, d.h. durch die Zugabe von 0,05 bis 0,001 % an nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mitteln, wie Tween 20, 40 und 60 sowie Span 20, 40 und 60 und 80 oder dergleichen, 0,005 bis 0,001 % Natriumdodecylsulfat, 0,001 bis 0,01 % Polyäthylenglykol 6000, 10 bis 200 ug/ml bestimmter Proteine, wie Serumalbumin und Kasein oder dergleichen erhöht werden. Die Enzymaktivität wird ferner dadurch erhöht, dass das Enzym mit diesen Aktivatoren bei 30 bis 0 C während einer Zeitspanne von 10 bis 60 Minuten vor der Enyzmreaktion inkubiert wird.

g) Enzymuntersuchung:

wie vorstehend beschrieben
h) Molekulargewicht:

Werden die gereinigten Enzyme, die aus jedem Strahlenpilzstamm

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isoliert worden sind, auf geeichte Sephadex G 75-Säulen, die mit O,O5m Glycin-NaOH-Puffer mit einem pH-Wert von 9,0 ins Gleichgewicht gebracht bzw. äquilibriert worden sind, dann lässt sich die Enzymaktivität als einziger symmetrischer Peak eluieren. Das scheinbare Molekulargewicht des Enzyms wird unter Verwendung von Bezugsproteinen, und zwar Chymotrypsin, Eialbumin, RNase sowie Kalbserumalbumin, berechnet (vgl. die Fig. 9).

In Fig. 9 zeigt (1) das Molekulargewicht des St. morookaensis ATCC 19166-Enzyms, (2) das Molekulargewicht von St. aspergilloides ATCC 14808 und Streptoverticillium septatum ATCC 27464,

(3) das Molekulargewicht von St. hachijoensis ATCC 19769,

(4) das Molekulargewicht von Actinomyces violascens ATCC 23968 und (5) das Molekulargewicht von St. adephospholyticus A 4688.

Wird eine Gelfiltration in einer Lösung mit einer hohen Ionenstärke (0,1m KCl) durchgeführt/ dann wird das scheinbare Molekulargewicht niedrig, wie aus den Klammern in der Tabelle III hervorgeht. Die Molekulargewichte der Enzyms sind in der Tabelle III zusammengefasst, die auch die Ergebnisse der Gelfiltration sowie die Ergebnisse zeigt, die bei der Durchführung einer Polyacrylamidgelelektrophorese in 0,1 % SDS unter Einsatz von Kalbserumalbumin, Lysozym und f-Globulin als Standardsubstanzen erhalten worden sind.

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Tabelle III

Stämme

Methoden

Actinomyces violascens ATCC 23968

Streptomyces morookaensis ATCC 19166

Streptomyces aspergilloides ATCC 14808

Streptoverticillium septatum ATCC 27464

Streptomyces hachijoensisATCC 19769

Streptomyces adephospholiticus ATCC 31122

Sephadex G-75 SDS-PoI/acryl-

amideIhKtrο-phorese

26000 35000 (25000) 23000-24000 32000 (23000) 21000-23000 32000 1 8000 28000-29000

i) Sedimentationskoeffizient:

Unter Anwendung einer Glyzeringradienten (15 - 55 %)-Zentrifugation unter Einsatz von ^Globulin,Kalbserumalbumin sowie RNase als Innenstandards werden Sedimentationskoeffizienten von 2,65 für das St. morookaensis ATCC 19166-Enzym, von 2,45 für das St. aspergilloides ATCC 14808-Enzym und von 2,10 für das St. adephospholyticus-Enzym ermittelt.

j) Isoelektrischer Punkt:

Die isoelektrischen Punkte der gereinigten Enzyme werden unter Einsatz einer Elektrofokusierungssäule mit einem Ampholin mit einem pH-Wert von 5 bis 8 (LKB Instruments Inc.) ermittelt (vgl. die Tabelle IV).

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Tabelle IV
Isoelektrischer Punkt

Stämme pH-Wert

Actinomyces violascens ATCC 23968 7,5

Streptomyces morookaensis ATCC 19166 .6,9

Streptomyces aspergilloides ATCC 14808 6,8

StreptoverticiIlium septatum ATCC 27464 9,2

Streptomyces hachijoensisATCC 19769 8,3

Streptomyces adephospholyticus ATCC 31122 7,6

Wie vorstehend erwähnt worden ist, stimmen die physikalischchemischen Eigenschaften des Enzyms nicht mit denjenigen bekannter Enzyme überein. Vielmehr hat sich das Enzym als neuer und charakteristischer Enzymtyp herausgestellt.

Ein Verfahren zur Herstellung von Nukleotidpyrophosphotransferase zeichnet sich dadurch aus, dass Mikroorganismen, die zu den Genera Streptomyces, StreptoverticiIlium und Actinomyces gehören, nach üblichen Methoden gezüchtet werden, worauf das Enzvm von dem Kulturfiltrat und den Myzein während eines Reinigungsverfahrens unter Anwendung einer Ammoniumsulfatausfällung, einer Lösungsmittelausfällung, einer Extraktion, einer Chromatographie unter Einsatz eines Ionenaustauscherharzes sowie einer Gelfiltration abgetrennt wird. Ferner wird eine enzymatische Methode zur Verfügung gestellt, mit deren Hilfe es leicht möglich ist, die neuen Nukleosid-5¹-phosphat-(mono-, dioder tri-)3'-(2¹)-diphosphate mit hohen Ausbeuten durch übertragung der Pyrophosphorylgruppe aus der 5'-Stellung von ATP, dATP und pppApp auf die 3'-Stellung von Guanosin-, Adenosin- oder Inosinnukleosidphosphaten (mono-, di- oder tri-) herzustellen.

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Herstellung der neuen Nukleosid-5¹-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3·-(2')-diphosphate:

Verschiedene Enzymzubereitungen, wie beispielsweise eine Kulturbrühe, ein Kulturfiltrat, ein Zellhomogenat, ein (NH.)₂SO.-Niederschlag, Fraktionen von Ionenaustauscherharz-Chromatographien sowie Gelfiltrationen oder dergleichen, die Nukleotidpyrophosphotransferase enthalten, können zur Herstellung der neuen Nukleosid-5'-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3'-(2*)-diphosphate gemäss vorliegender Erfindung verwendet werden.

Die Phosphatdonatoren sind auf ATP, dATP und pppApp beschränkt, während es sich bei den Phosphatakzeptoren um ATP, ADP, AMP, GTP, GDP, GMP, ITP, IDP, IMP oder dergleichen handelt, und zwar entsprechend dem neuen gebildeten Nukleosid-5'-phosphat-3¹-(2*)-diphosphat. Einer oder mehrere Phosphatdonatoren sowie einer oder mehrere Phosphatakzeptoren können zur Durchführung der Enzymreaktion eingesetzt werden.

Ein Beispiel für die Zusammensetzung der Reaktionsmischung wird nachfolgend angegeben:

250 mMol Glycin-NaOH-Puffer (pH 10,0) 50 mMol ATP-Natriumsalz

50 mMol Phosphatakzeptor (Nukleosid-

phosphat)

50 mMol MgCl₂
3 Einheiten/ml Enzymlösung

insgesamt 24 ml

Der Phosphatdonator und -akzeptor kann eine freie Säure oder ein Natrium-, Lithium- oder Kaliumsalz davon sein oder aus einer Kombination aus freier Säure und Salzen bestehen, wobei ferner das Verhältnis des Phosphatdonators zu dem Akezptor in Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen und der Enzymaktivität verändert werden kann.

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6	ml
4	ml
4	ml
4	ml
6	ml

Es ist vorzuziehen, die enzymatische Reaktion unter optimalen Bedingungen bezüglich pH-Wert, Temperatur, des Vorliegens oder Fehlens von zweiwertigen Metallionen, einer entsprechenden Substratkonzentration oder dergleichen durchzuführen, damit das Enzym eine maximale Aktivität erreicht. Beispielsweise liegt der optimale pH-Bereich zwischen 6 und 11 und der optimale Temperaturbereich zwischen 25 und 40 C. Bei den eingesetzten zwei-

++ ++ ++ ++ wertigen Metallionen handelt es sich um Fe ,Mn , Mg , Co , Zn und dergleichen. Im allgemeinen wird die Enzymreaktion bei einer Temperatur von 37 C während einer Zeitspanne von 2 bis 4 Stunden durchgeführt.

Nach Beendigung der Enzymreaktion wird die Reaktionsmischung mit 0,1n Chlorwasserstoffsäure neutralisiert, worauf die neuen Purinnukleosid-5*-phosphat-(mono-, di- oder tri-)3¹-(2·)-diphosphate durch eine Kombination von üblichen Reinigungsmethoden isoliert und gereinigt werden, beispielsweise durch Adsorption an Aktivkohle, durch Chromatographie unter Verwendung von Anionen- oder Kationenaustauscherharzen, durch Losungsmittelausfällung oder dergleichen. Beispielsweise wird die vorstehend beschriebene Reaktionsmischung bei 37°C während einer Zeitspanne von Stunden inkubiert, mit 0,1n HCl neutralisiert und auf eine lonenaustauscherharzsäule (Dowex-1, Cl-Typ oder DÄAü-Sephadex A25) aufgegeben. Adsorbierte Reaktionsprodukte werden mit einem entsprechenden Puffer (verdünnter HCl oder verdünnter HCl + NaCl im Falle von Dowex-1, Cl-Typ zur Herstellung des Natriumsalzes, sowie tris-HCl + LiCl im Falle von DÄAÄ-Sephadex zur Herstellung des Lithiumsalzes) eluiert. Das Eluat wird an Aktivkohle adsorbiert und erneut mit Ammoniak/Alkohol (50 % Äthanol/1,4 % Ammoniakwasser), Ammoniak/Azeton oder 2,8 %igem Ammoniakwasser eluiert.

Nachdem der Ammoniaküberschuss in dem Eluat durch Einengen im Vakuum entfernt worden ist, werden die Natrium- oder Lithium-

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salze der neuen Nukleosid-5'-phosphat-3'-(2')-phosphate in Form eines weissen mikrokristallinen Pulvers dadurch erhalten, dass die Lösung in der Kälte stehen gelassen wird, oder dass Lösungsmittel, wie Alkohole, Azeton oder dergleichen, zugesetzt werden. Zur Herstellung der freien Säure wird das Natrium- oder Lithiumsalz des Nukleosid-5'-phosphat-3'-(2¹)-phosphats in angesäuertem Wasser aufgelöst und an Aktivkohle adsorbiert. Dann wird die freie Säure mit Ammoniak/Alkohol (50 % Äthanol/;!, 4 % Ammoniakwasser) eluiert. Nachdem der Ammoniaküberschuss durch Eindampfen im Vakuum entfernt worden ist, wird die freie Säure mit 10 Volumina Azeton ausgefällt.

Struktur der neuen Nukleosidphosphate:

Die Strukturen der neuen Nukleosid-5'-phosphat-3'~(2¹J-phosphate gemäss vorliegender Erfindung werden durch UV-Adsorptionsspektren, eine Gesamtphosphatbestimmung, NMR-Analyse sowie einen enzymatischen Abbau in der folgenden Weise bestimmt:

Wird beispielsweise die Reaktionsmischung, in welcher ATP mit den Enzymen in Gegenwart von Mg inkubiert worden ist, an DÄAÄ-Sephadex A-25 in einer Säule (Cl ) adsorbiert und mit einem Puffer eluiert, wobei die Lithiumchloridkonzentration von 0,1 auf 0,3m linear erhöht wird, dann werden zwei Peaks bei ⁰ durch 0,1m und 0,2m Lithiumchlorid eluiert. Diese Fraktionen werden zusammengefasst und im Vakuum konzentriert, worauf zwei Arten von Nukleotiden durch die Zugabe von 10 Volumina eines 95 %igen Äthanols ausgefällt werden. Die Ergebnisse einer Perjodatoxydation, einer Gesamtphosphatbestimmung, eines aufgenommenen UV-Spektrums, einer C-NMR-Analyse sowie eines enzymatischen Abbaus mittels einer Schlangengiftdephosphodiesterase und 3'-Nukleotidase zeigen, dass der erste Peak ein AMP-Lithiumsalz und der zweite Peak ein neues Adenosin-5'-triphsophat-3'-(2')-diphosphat-Lithiumsalz ist, das eine Pyrophosphatstruktur aufweist, die an der 3'-(2')-Stellung des ATP sitzt und wie folgt wiedergegeben werden kann:

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Struktur von pppApp

ooo

HD—P-O-? -0-P-O-CK₀ ..0 OK OH OH

(D

OH

:o - ? - oh

0 =

0
I

P - OH

OH

Um die neuen Nukleosid-5¹-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3'-(2¹)-diphosphate, die unter Anwendung der erfindungsgemässen Methoden erzeugt worden sind, zu charakterisieren und zu identifizieren, sind die Ergebnisse bezüglich des Lithiumgehaltes, der spektralen Eigenschaften, ermittelt durch UV und NMR, des Molverhältnisses von Pi zu Nukleotid, berechnet anhand der Werte des Gesamtphosphats, sowie der Rxbosegehalte in der Tabelle V zusammengefasst. UV-Adsorptions- und NMR-Spektren von typischen Nukleosid-5'-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3^f-(2·)-diphosphaten gemäss vorliegender Erfindung gehen aus den Fig. 1 bis hervor und erläutern die Eigenschaften dieser Verbindungen.

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Tabelle V

Eigenschaften

Nukleosid-5'-phosphat-3'-di phosphat-Lithiumsalz pppApp ppApp pppGpp ppGpp pGpp Ppplpp

üv-Adsorption, Bemerkung 1	258	258	258	258	257,5	250
y^ max (1)	260,5	260	254,5	254,5	253,5	249,5
(2)	260,5	260	258	258	258	254,5
(3)	230,5	230,5	229	229	229	221,5
^ min (1)	228	228	224	225,5	223,5	22₃
(2)	228 14,3	228 14,2	226 11,8	225,5 11,8	225,5 11,8	225 7,4
r (3) C-26Onm 10~3 (D	15,1	15,0	12,0	11,9	12,1	7,4
(2)	15,1	15,0	11,8	11,8	11,8	12,2
(3)

Phosphatgehalt,

Molverhältnis 1:4,92 1:4,00 1:4,95

1:3,82 1:3,02 1:4,69

Lithiumgehalt, Molverhältnis	1:7,1	1:6,0	1:6,8	1:6,2	1 :5,2	1:7
Bindeposition des Phosphats Bemerkung 4	5'-, 3'	- 5¹-	5'-	5¹-	5¹-	5¹-
		3¹-	3'-	3¹-	3¹-	3¹-

Bemerkung 1\
Bemerkung 2;

Die UV-Adsorption wird in (1) 0,01n HCl, .(2) destilliertem Wasser und (3) 0,01η NaOH gemessen Die Gesamtphosphatbestimmung wird nach der Nakamura-Methode durchgeführt, nachdem 0,5 bis 3 ml der Probelösung mit 0,5 ml einer 60 %igen Perchlorsäure abgebaut, während einer Zeitspanne von 1 Stunde erhitzt und auf ein Gesamtvolumen von 10 ml mit destilliertem Wasser gebracht worden sind.Das anorganische Phosphat in einer abgebauten Probe wird anhand der optischen Dichte bei 700 nra bestimmt, wobei eine Sfaardard-K^PO.-Kurve verwendet wird, nachdem 0,5 ml einer 1,5 %igen H₃SO₄, 0,5 ml einer 3,3 %igen Ammoniummolybdatlösung und 0,5 ml eines Amidolreagenses zu 3,5 ml der abgebauten

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Lösung zugesetzt worden sind und die Probe während einer Zeitspanne von 20 Minuten bei 125°C stehen gelassen worden ist

Bemerkung 3: Der Lithiumgehalt wird durch Flammenphotometrie

unter Verwendung eines Jarrell Ash Flame Emission Spektrophotometers, Modell AA-780, bestimmt: C₂H₄ (0,4 kg/cm²), 1,75 l/Minute, Luft (1,5 kg/cm²), 9,0 l/Minute, Empfindlichkeit 3,90, Wellenlänge: 2708 £.

Bemerkung 4: Zuordnung der Struktur sowie der Bindeposition des Pyrophosphats zu dem Nukleosid durch NMR-Spektroskopie .

Die Nukleosid-5'-phosphat-3'-(2¹)-phosphat-Proben werden in D„0

13

aufgelöst. Protongeräuschentkupplungs- C-NMR-Spektren werden bei 25,2 MHz unter Verwendung eines Varian XL-100-15- Spektrophotometers aufgenommen, der unter Einhaltung der Fourier-Umwandlungsmethode bei Zimmertemperatur arbeitet. Alle chemischen Verschiebungen werden unter Bezugnahme auf Dioxan als Innenstandard berechnet.

Protonen-NMR-Spektren werden unter Verv/endung der gleichen Vorrichtung aufgezeichnet, die nach der Fourier-Umwandlungsmethode bei 100 MHz arbeitet.Chemische Verschiebungen werden unter Verwendung von 2,2-Dimethyl-2-silapental-5-sulfonat als Innenstandard aufgezeichnet.

Durch die Erfindung werden ferner neue Nukleosid-5'-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3¹-(2¹)-monophosphate zur Verfügung gestellt, die auf Nukleosid-5¹-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3'-(2¹)-diphosphate zurückgehen, sowie das Verfahren zur Herstellung dieser weiteren Nukleoside.

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Werden Nukleosid-5¹-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3'-(2")-diphosphate in O,1n HCl oder O,In NaOH in Gegenwart eines Bariumsalzes während einer Zeitspanne von 1 bis 2 Stunden bei 37 C

behandelt und durch eine KarMnation aus Adsorption an Aktivkohle, Lösungsmittelausfällung und Ionenaustauscherharzchroiratographie gereinigt, dann lassen sich die neuen Nukleosid-5'-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3'-(2¹)-monophosphate (II) leicht in Form eines weissen mikrokristallinen Pulvers als Ergebnis der Freisetzung eines Phosphats von der Pyrophosphorylgruppe in der 3'-Stellung der Nukleosid-5'-phosphat-(mono-, di- oder tri-}~ 3'-(2')-diphosphate herstellen.

Phosphat

(Adenin j Guanin I Hypoxanthin

O Oil

O = P-OH

(II)

Biologische Aktivität der neuen Nukleosid-5'-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3'-diphosphate sowie der Nukleotidpyrophosphotransferase:

Die charakteristische Eigenschaft der Nukleotidpyrophosphotransferase besteht darin, dass sie das Wachstum von Heia S₃-

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L121O- und L5178Y-Zellen in einer Kultur bei einer relativ niedrigen Konzentration von 5 bis 10 Einheiten/ml hemmt. Werden diese Zellen mit verschiedenen Konzentrationen des gereinigten, von St. adephospholyticus A 46 68 erhaltenen Enzyms in einem geeigneten Medium inkubiert, und zwar RPMI 1640 - 20 % Kalbserum für L5178Y- und L1210-Zellen und MEM - 10 % Kalbserum im Falle von Heia-Zellen, dann wird das Wachstum der Zellen merklich inhibiert, wobei gleichzeitig eine Inhibierung einer Proteinsynthese festzustellen ist, wie aus der Tabelle VI hervorgeht. Ferner kann eine Antitumorwirkung sehr deutlich anhand von experimentellen Tumoren in Mäusen gezeigt werden. Werden beispielsweise BDF₁-MaUSe mit einem Gewicht von 18 bis 22 g intraperitoneal mit 2 χ 10° L1210-Zellen beimpft und werden das Nukleotid und das Enzym intraperitoneal 1 χ täglich während einer Zeitspanne von 10 aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend 24 Stunden nach der Impfung, verabreicht, dann unterdrücken das Enzym und das pppApp deutlich die Entstehung einer Bauchwassersucht, ohne dass dabei eine toxische Wirkung gegenüber den Mäusen festgeteilt wird, wobei ausserdem die Lebensdauer verlängert wird, wie aus der Tabelle VII hervorgeht, während ATP und ein wärmeinaktives Enzym keine Wirkung auf Mäuse mit Tumoren ausüben. Man kann annehmen, dass das Nukleotid und das Enzym gemäss vorliegender Erfindung eine ähnliche Wirkung auf Menschen haben, wenn sie intraperitoneal verabreicht werden. Das Nukleotid oder Enzym wird mit einem üblichen pharmazeutisch verträglichen nicht-toxischen Träger für eine intraperitoneale Verabreichung kombiniert.

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Tabelle VI

Wirkung einer gereinigten Nukleotidpyrophosphotransferase von St. adeophospholyticus A 4668 auf das Zellwachstum und die Proteinsynthese

Inhibierung, % der Vergleichsproben

Zellwachstum Protein-

L5878Y L121O ' synthese

L121O

O 24 35 59

Enzymkon zentration, Einheiten/ml	Zellen:	Ze He
O		O
1		O
5		1
10		25

O	0
9	12
30	29
92	63

Tabelle VII

Wirkungen von Nukleotid- und gereinigter Nukleotidpyrophosphotransferase auf die Lebensdauer von Mäusen mit L1210

Substanzen

pppApp 7Li

ATP 2Na

Natives Enzym, spezifische Aktivität 1293

Wärmeinaktives Enzym, keine Aktivität

Vergleich

Dosis, mg/kg pro Tag	MST Tag	T/C,	30 Tage überlebende
20	16,8	189	2/5
10	12,5	140	1/5
5	14,0	157	1/5
20	8,6	97	0/5
10	9,2	103	0/5
5	8,7	98	0/5
2	13,4	151	1/5
1	13,8	155	0/5
0,5	12,2	137	0/5
2	9,8	110	0/5
1	10,6	119	0/5
0,5	9,0	101	0/5
—	8,9	100	0/10

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Tier: männliche BDF₁ Tumor: L121O, Sloan-Kettering-Linie, 10 Zellen/Kopf,i.p.

MST: mittlere Überlebeηszeit

Die folgenden Beispiele erläutern die Methoden zur Durchführung der Erfindung, ohne sie zu beschränken. Die Mengenangaben beziehen sich, sofern nichts anderes angegeben is't, auf das Gewicht.

Beispiel 1

Ein wässriges Medium mit der folgenden Zusammensetzung und mit dem nachstehend angegebenen pH wird hergestellt:

Glyzerin 2,0

Polypepton 4,0

KH₃PO₄ 0,1

K₂HPO₄ 0,1

MgSO₄-7H₂O 0,05

Mn⁺ (als MnSO₄) 2 ppm

Fe⁺⁺ (als FeSO₄) 2 ppm

pH 7,0

100 ml dieses Mediums werden bei 120°C in einem 500 ml-Sakaguchi-Schüttelkolben sterilisiert, der mit einer Kultur von Streptomyces asperigilloides ATCC 14808 beimpft wird. Die Inkubation erfolgt bei 28⁰C während einer Zeitspanne von Tagen auf einer Schüttelvorrichtung. 10 1 dieses Mediums in einem 2O 1-Gärungsgefäss aus rostfreiem Stahl werden aseptisch mit 1 Volumen-% der vorstehend beschriebenen v/achsenden Kultur beimpft. Die Gärung wird bei 28⁰C während einer Zeitspanne von 40 Stnden unter Rühren und Belüftung durchgeführt.

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Nachdem die Myzeln von der Kulturbrühe durch Filtration abgetrennt worden sind, wird Ammoniumsulfat dem Filtrat (1) zugesetzt, wobei eine 60 %ige Sättigung erzielt wird. Die Lösung wird vermischt und über Nacht in der Kälte stehen gelassen. Der erhaltene Niederschlag (2) wird durch Zentrifugieren abgetrennt, in Wasser gelöst und während einer Zeitspanne von 24 Stunden gegen laufendes Wasser dialysiert. Dieser Niederschlag, der während der Dialyse auftritt, wird durch Zentrifugieren entfernt. Die dialysierte Zubereitung wird auf eine DÄAÄ-Zellulosesäule aufgebracht, die mit einem 0,01m Acetatpuffer (pH 5,5) äquilibriert worden ist. Das Enzym wird durch die Säule ohne Retention geschickt. Die aktive Fraktion (3) wird auf eine CM-Sephadex C-25-Säule aufgebracht, die mit einem 0,01m Acetatpuffer (pH 5,5) äquilibriert worden ist, der 0,001m MgCl₂ enthält. Nachdem die Säule mit dem gleichen Puffer gewaschen worden ist, wird das Enzym linear mit dem gleichen Puffer eluiert, der mit 0,1 bis 0,5m NaCl versetzt wird. Die aktive Fraktion, die mit 0,35 bis 0,45m NaCl (4) eluiert worden ist, wird durch die Zugabe von Ammoniumsulfat (60 %ige Sättigung) konzentriert. Das ausgefällte Enzym wird in einer kleinen Menge eines 0,01m tris-HCl-Puffers (pH 8,7), der 0,01m MgCl₂ enthält, aufgelöst, ausreichend gegenüber dem gleichen Puffer dialysiert und auf eine DÄAü-Sephadex A-50-Säule aufgebracht, die mit 0,01m tris-HCl (pH 8,7), der 0,01m NaCl enthält, äquilibriert worden ist. Nachdem die Säule mit dem gleichen Puffer gewaschen worden ist, wird das Enzym stufenweise mit 0,02, 0,05 und 0,15m NaCl eluiert.

Die mit 0,05m NaCl eluierte Fraktion (5) wird wiederum gegen 0,01m tris-HCl-Puffer (pH 8,7) dialysiert, auf eine HydroxyI-apatit-Säule, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist, aufgebracht und mit einem linearen pH-Gradienten (pH 8 bis 9) des Puffers eluiert.

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Die aktive Enzymfraktion, die bei einem pH-Wert von 9 bis 8,7 (6) eluiert worden ist, wird dann auf eine Seohadex G-75-Säule aufgebracht, die mit O,O5m Glycin-NaOH-Puffer (pH 9,0), der 0,01m MgCl₂ enthält, äquilibriert worden ist.

Eine Gelfiltration wird unter Verwendung des gleichen Puffers durchgeführt, wobei eine homogene Enzymlösung (7)' erhalten wird. Die Ergebnisse der Enzymreinigung sind in der Tabelle VIII zusammengefasst :

	Volumen, ml	2	Gesamt aktivi tät, Einheiten	Tabelle VIII	Spezifi sche Ak tivität	Ausbeute,
Aktive Fraktion	10000		245000	Gesamtprotein, ^OD28Onm	0,97	100
(1)	600	80000	252000	2,5	32,5
(2)	1500	75000	32000	10,7	30,6
(3)	800	65000	7000	35,2	26,5
(4)	600	60000	1850	84,5	24,5
(5)	110	33000	720	186	13,5
(6)	45	19500	178	780	8,0
(7)		25
Beispiel

Streptomyces morookaensis ATCC 19166 und Actinomyces violascens ATCC 23968 werden getrennt unter den Bedingungen gemäss Beispiel 1 gezüchtet. In jedem Falle werden 1000 ml des Kulturfiltrats unter Einhaltung der in Beispiel 1 beschriebenen Reinigungsmethoden behandelt. Es werden die in der Tabelle IX angegebenen gereinigten Enzyme erhalten:

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	37 -	Gesamtaktivität, Einheiten Ausbeute, %	3	Actinomyces violascens ATCC 23968
	Tabelle IX	Spezifische Aktivität	31000
Stamm Nr.		0,81
Filtrat:	Gesamtaktivität, Einheiten
	Spezifische Aktivität	2050 6,6
	Gereinigtes Enzym:	1100


Beispiel

Streptomyces morookaensis ATCC 19166

42500

0,58

3650 8,6

960

Eine Enzymreaktionsmischung folgender Zusammensetzung wird hergestellt:

0,25m tris-HCl-Puffer (pH 9,0) 0,05m MgCl₂ ATP·2Na destilliertes Wasser

insgesamt

160	ml
20	ml
2	,5 g
20	ml

200 ml

Ein kleiner Kollodiumbeutel, der 10 ml der gereinigten Enzymlösung (spezifische Aktivität: 274, Gesamteinheiten: 465), die von Streptomyces morookaensis ATCC 19166 erhalten worden ist, enthält, wird in die vorstehend beschriebene Reaktionsmischung eingebracht, worauf bei 30°C während einer Zeitspanne von Stunden unter Rühren inkubiert wird.

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100 ml der Reaktionsraischung werden auf das 2-fache Volumen verdünnt/ das auf einen pH-Wert von 7,8 unter Verwendung von HCl eingestellt wird. Dann erfolgt eine Adsorption an einer DÄAÄ-Sephadex A-25 (3 χ 55 cm)-Säule, die mit einem 0_f01m tris-HCl-Puffer (pH 7,8)äquilibriert worden ist. Die Kolonne wird mit dem gleichen Puffer gewaschen, worauf pppApp mit einem linearen Salzgradienten von 0,15 bis 0,35m LiCl-in dem gleichen Puffer eluiert wird.

Die Fraktionen Nr. 95 bis 124 (jeweils 20 ml), die mit Salzkonzentrationen von 0,22 bis 0,25m eluiert worden sind, werden vereinigt, bei 37 bis 42°C im Vakuum konzentriert und dann durch den Zusatz von 5 Volumina einer Mischung aus Azeton und Äthanol (1:1, bezogen auf das Volumen) ausgefällt. Ein pppApp-Li-SaIz wird mit 95 Volumen-% Äthanol 5 χ gewaschen. Man erhält 1,55 g dieses Salzes nach dem Trocknen im Vakuum.

Beispiel 4

Die Reaktionsmischung besteht aus 250 mMol Glycin-NaOH-Puffer (pH 10,0) in einer Menge von 6,0 ml, 100 mMol ATP in einer Menge von 2,0 ml, 50 mMol MgCl₂ in einer Menge von 4,0 ml, 100 mMol des in der Tabelle X angegebenen Pyrophosphatakzeptors in einer Menge von 2,0 ml, destilliertem Wasser in einer.Menge von 4,0 ml sowie der Enzymlös.ung, die bei den verschiedenen Reinigungsstufen der Kulturbrühe von Streptomyces aspergilloides ATCC 14808 erhalten worden ist, in einer Menge von 6,0 ml. Die Reaktionsmischung wird bei 37°C während einer Zeitspanne von 2 Stunden inkubiert, an einer Dowex 1 χ 4-Säule (Cl-Typ) mit einer Abmessung von 1,7 χ 25 cm adsorbiert, wobei die Säule mit 0,01m NaCl in 0,01 η HCl äquilibriert worden ist, worauf mit einem linearen Gradienten von 0,01 bis 0,5m NaCl in 0,01n HCl eluiert wird. Fraktionen, die bei Konzentrationen von 0,2 bis 0,25m NaCl eluiert worden sind, werden vereinigt, mit 0,1n NaOH

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auf einen pH-Wert von 7 gebracht und erneut an einer DÄAÄ-Sephadex A-25-Säule (2,2 χ 25 cm) adsorbiert, die mit O,O1m tris-HCl-Puffer (pH 7,5) äquilibriert worden ist. Durch Eluieren mit 0,1 bis 0,3m LiCl werden Fraktionen mit einer optischen Dichte von 260 nm gesammelt. Sie werden im Vakuum bei 37°C konzentriert. Nach der Zugabe von 10 Volumina eines 99 Volumenligen Äthanols wird ein weisser Niederschlag erhalten. Der Niederschlag wird in einer kleinen Menge Wasser aufgelöst, worauf 5 Volumina eines 90 Volumen-%igen Äthanols zur erneuten Ausfällung des Niederschlags zugesetzt werden. Nach dem Trocknen des ausgefällten Niederschlags im Vakuum wird das in der Tabelle X angegebene Nukleotid-Lithiumsalz erhalten.

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- 4ο -Tabelle X

Enzymquellen

Spezifische Aktivität

Gereinigtes Enzym 650

If Il

Kulturfiltrat

Aktive Fraktion bei
einer DÄAÄ-Zellulose-
chromatographie

Aktive Frak
tion bei
einer CM-Sephadex- .
Chromatographie

Aktive Fraktion bei
einer DÄAÄ-Sephadex-Chromatographie

0,21

Phosphatdonator

ATP ATP ATP ATP ATP

pppApp ATP Phosphat- Hauptakzeptor produkt

ATP
ADP
GTP
GDP
ITP
AMP
ATP

pppApp

ppApp

pppGpp

ppGpp

ppplpp

pApp

1_r95

ATP ATP

pppApp

53,5

ATP ATP

pppApp

182

ATP	ATP	pppApp
dATP	GDP	ppGpp
ATP	GTP	pppGpp
ATP	GMP	pGpp
pppApp	GMP	pGpp

Ausbeute, mg als Lithium s al ζ

115

87 135 120

62

85

75

125

108

132 86

125 74 26 38

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Beispiel 5

Ein gereinigtes Enzym wird aus dem Kulturfiltrat von Streptomyces adephospholyticus A 4668 erhalten, wobei die Züchtung unter den Gärungsbedingungen von Beispiel 1 nach den dort beschriebenen Methoden durchgeführt wird. Eine 2o-fache volumetrische Verdünnung von 6 ml dieses gereinigten Enzyms (spezifische Aktivität: 1500, 60 Einheiten/ml) wird mit 5 ml eines 1m tris-HCl-Puffers (pH 10,0), 500 mg ATP-2Na, 100 mg ADP-2Na, 5,0 ml einer 0,05m MgCl_o-Lösung sowie 10 ml destilliertem Wasser während einer Zeitspanne von 2 Stunden bei 37 C inkubiert. Während der Enzymreaktion wird der pH-Wert auf 8,5 durch Zugabe von In NaOH eingestellt. Die Reaktionsmischung wird auf eine DÄAä-Sephadex A-25-Säule mit einer Abmessung von 2,2 χ 25 cm aufgebracht, die mit einem 0,01m tris-HCl-Puffer (pH 7,2) äquilibriert worden ist. Die Eluierung erfolgt mit einem linearen Gradienten eines 0,1 bis 0,3m LiCl in dem gleichen Puffer, wobei jeweils Fraktionen von 15 ml gesammelt werden. Die erhaltenen pppApp- und ppApp-Fraktionen werden auf 1/20 ihres Volumens im Vakuum konzentriert und mit 5 Volumina einer Mischung aus kaltem Azeton und Äthanol (9:1, bezogen aufdas Volumen) versetzt. Ungefähr 250 mg des durch Filtration erhaltenen Niederschlags werden in 100 ml Wasser aufgelöst, an einer DäAä-Sephadex A-25-Säule (1,8 χ 35 cm) adsorbiert und dann mit einer 0,15 bis 0,35m LiCl-Lösung eluiert. Die pppApp- und ppApp-Fraktionen werden auf 1/20 ihres Volumens bei 37°C im Vakuum eingeengt, worauf eine Ausfällung durch Zugabe von 5 Volumina einer Mischung aus Kaliumaceton und Äthanol (9:1, bezogen auf das Volumen) erfolgt. Nach einigen Waschungen mit der gleichen Mischung sowie einem Trocknen im Vakuum erhält man 70,5 mg ppApp*6Li und 142 mg pppApp·7Li in Form eines weissen mikrokristallinen Pulvers.

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Beispiel 6

Eine Reaktionsmischung, die aus 250 mMol eines Glycin-NaOH-Puffers (pH 10,0) in einer Menge von 6,0 ml, 50 mMol ATP in einer Menge von 4,0 ml, 50 mMol GMP in einer Menge von 4,0 ml, 50 mMol MgCl₂ in einer Menge von 4,0 ml und der Enzymlösung (spezifische Aktivität: 150, 3 Einheiten/ml), erh.alten aus Streptoverticillium septatum ATCC 27464, in einer Menge von 6,0 ml besteht, wird bei 37 C während einer Zeitspanne von 4 Stunden inkubiert und auf eine mit Dowex 1x4, Cl-Typ, gefüllte Säule mit einer Abmessung von 1,7 χ 20 cm aufgebracht. Dann wird unter Einhaltung eines linearen Gradienten mit 0,01 bis 0,5m NaCl in einer 0,01n HCl eluiert. Fraktionen, die zwischen 0,21 und 0,24m NaCl eluiert worden sind, werden zusammengeschüttet und mit einer 0,1 η NaOll-Lösung neutralsiert und anschliessend an einer DÄAÄ-Sephadex A-25-Säule (2,2 χ 25 cm) adsorbiert, die mit einem 0,05m tris-HCl-Puffer (pH 7,5) äquilibriert worden ist. 200 ml der pGpp-Fraktion, die mit 0,1 bis 0,3m LiCl eluiert worden ist, werden auf 10 ml im Vakuum konzentriert und mit 10 Volumina eines 99 Volumen-%igen Äthanols versetzt. Der erhaltene Niederschlag des pGpp-Lithiumsalzes wird in einer kleinen Menge Wasser aufgelöst und erneut mit 90 Volumen-%igem Äthanol ausgefällt. Nach einem Trocknen im Vakuum erhält man 56,2 mg pGpp*5Li in Form eines weissen mikrokristallinen Pulvers.,

Beispiel 7

200 uMol ATP oder dATP sowie 200 uMol verschiedener Nukleotide werden unter Einsatz des gereinigten Enzyms inkubiert, wobei die Reaktionsmischung gemäss Beispiel 4 verwendet und die dort beschriebenen Reaktionsbedingungen eingehalten werden. Jedes Nukleotid wird aus der Reaktionsmischung nach den in den Beispielen 5 und 6 beschriebenen Isolations- und Reinigungsmethoden gewonnen. Die uauptreaktionsprodukte sowie ihre Ausbeuten gehen aus der Tabelle XI hervor.

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OfUGMNAL INSPECTED

	Phosphat	Tabelle	XI
Phosphat	akzeptor	Haupt	Ausbeute, mg
donator	ATP	produkt	als Li-SaIz
ATP	ADP	pppApp	132
If	GTP	ppApp	105
N	GDP	pppGpp	140
Il	GMP	ppGpp	130
η	ITP	pGpp	52,5
Il	IDP	ppplpp	74,2
η	GTP	ppipp	25,6
dATP	ADP	pppGpp	92,5
ti	GMP	PpApp	69,3
pppApp		pGpp	22,5
		pApp	18,3
Beispiel 8

Jeweils 20 ^m9 ^er gemäss Beispiel 7 erhaltenen Nukleosid-5¹-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3'-diphosphat-Lithiurasalze werden abgewogen und in 20 mg einer O,25n HCl aufgelöst, worauf die Lösung bei 37°C während einer Zeitspanne von 1 Stunde stehen gelassen wird. Nach einer Neutralisation mit einer 0,5n KOH-Lösung wird die Lösung durch Ionenaustauscherharzsäulen-Chromatographie, Adsorption an Aktivkohle sowie Lösungsmittelausfällung gemäss den Beispielen 1 und 2 gereinigt. Dabei werden mikrokristalline Pulver der Lithiumsalze gemäss folgender Tabelle erhalten :

	Tabelle XII	Ausbeute, mg als Li-SaIz
Ausgangsmaterialien	Produkte	11,2
pppApp	pppAp	13,8
ppApp	ppAp	9,8
pppGpp	pppGp	7,5
ppGpp	ppGp	6,3
pGpp	pGp	4,6
ppplpp	ppplp

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Claims

Patentansprüche

\\l Purinnukleosid-5¹-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3'-(2¹)-diphosphate der Formel mXpp sowie die entsprechenden Monophosphate der Formel mXp und die Lithium-, Kalium und Natriumsalze dieser Purin nnukleosidphosphate, wobei m für 1 bis 3 Phosphorylgruppen steht, die durch wenigstens einen Phosphatrest und Methylendiphosphatrest gebildet werden, ρ einen Phosphatrest bedeutet und X ein Nukleosid darstellt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Adenosin, Guanosin und Inosin besteht.
2. Purinnukleosid-5'-phosphat-(mono-,di- oder tri-)-3'-(2')-diphosphate sowie ihre Salze gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Purinnukleosidphosphaten ausgewählt sind, die aus pApp, ppApp, pppApp, pGpp, ppGpp, pppGpp, plpp, pplpp, ppplpp, p(CH₂)ppApp, ρ (CH₃) ppGpp und den Lithium-, Kalium- und Natriumsalzen davon bestehen.
3. Purinnukleosid-5'-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3'-(2')-monophosphate sowie ihre Salze gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Purinnukleosidphosphaten ausgewählt sind, die aus pAp, ppAp, pppAp, pGp, ppGp, pppGp- plp, pplp, PPP¹P/ p(CH₂)ppAp, ρ (CH₂)ppGp.sowie den Lithium-, Kalium- und Natriumsalzen davon bestehen.
4. Verfahren zur Herstellung von Purinnukleosid-5¹-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3'-(2¹)-diphosphaten oder ihren Salzen gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Pyrophosphorylgruppe aus der 5'-Stellung eines Donatornukleotids oder Desoxynukleotids in die 3¹-(2*)-Stellung eines Akzeptornukleotids in der Weise übertragen wird, dass das Donatornukleotid oder Desoxynukleotid und das Akzeptornukleotid mit einem Enzym in Kontakt gebracht werden, welches durch einen Mikroorganismus erzeugt worden ist, worauf die erhaltene Reaktionsmischung zur

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- 45 Bewirkung der übertragung inkubiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das eingesetzte Enzym eine Pyrophosphotransferase ist, die sich durch eine Substratspezifizität für ein Nukleotid oder Desoxynukleotid sowie durch die Fähigkeit auszeichnet, eine Pyrophosphorylgruppe von der 5'-Stellung des Donatornukleotids oder Desoxynukleotids in die 3¹-(2¹)-Stellung des Akzeptornukleotids zu überführen.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der eingesetzte Mikroorganismus ein Strahlenpilz ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der eingesetzte Strahlenpilz aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Streptomyces adephospholyticus nov. sp. ATCC 31122, Streptomyces aspergilloides ATCC 14808, Streptomyces morookaensis ATCC 19166, Streptomyces hachijoensis ATCC 19769, Streptoverticillium septatum ATCC 27464 und Actinomyces violascens ATCC 23968 besteht.
8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das eingesetzte Donatornukleotid oder Desoxynukleotid aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus ATP, dATP und pppApp besteht.
9. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Akzeptornukleotid aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, IMP,IDP, ITP, ρ (CH₃)PpA sowie p(CH₂)ppG besteht.
10. Enzym, gekennzeichnet durch eine Substratspezifizität für ein Donatornukleotid oder Desoxynukleotid sowie die Fähigkeit, eine Pyrophosphorylgruppe von der 5'-Stellung des Donatornukleotids oder Desoxynukleotids in die 3¹-(2')-Stellung eines Akzeptornukleotids zu überführen.

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11. Verfahren zur Herstellung eines Enzyms nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Strahlenpilzstamm in einer Brühe gezüchtet wird, worauf das Enzym aus der erhaltenen Kulturbrühe gewonnen wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der eingesetzte Strahlenpilzstamm ein Stamm ist, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Streptomyces adephospholyticus nov. sp. ATCC 31122, Streptomyces aspergilloides ATCC 14808, Streptomyces morookaensis ATCC 19166, Streptomyces hachijoensis ATCC 19769, Streptoverticillium septatum ATCC 27464 und Actinomyces violascens ATCC 23968 besteht.
13. Verfahren zur Herstellung der Purinnukleosid-5¹-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3¹-(2')-diphosphatsalze gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleosid von der inkubierten Mischung isoliert und durch eine Kombination aus Adsorption und anschliessender Eluierung mit einer Lösung gewonnen wird, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer verdünnten Chlorwasserstoffsäure-Natriumchlorid-Lösung sowie einem tris-Chlorwasserstoffsäure-Lithiumchlorid-Puffer besteht.
14. Verfahren zur Herstellung von Purinnukleosid-5'-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3¹-(2¹)-monophosphaten oder ihren Salzen gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Purinnukleosid-5 '-phosphat- (mono-, di- oder tri-)-3*-(2¹)-diphosphat oder ein Salz davon mit einer organischen Säure zur Hydrolysierung des Purinnukleosid-5'-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3'-(2')-diphosphats oder des Salzes davon kontaktiert und das Purinnukleosid-5 '-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3'-(2')-monophosphat oder ein Salz davon von der erhaltenen Reaktionsmischung abgetrennt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzte anorganische Säure aus Chlorwasserstoffsäure besteht.

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16. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym durch wenigstens eine der an sich bekannten Methoden abgetrennt und gereinigt wird, die aus einem Aussalzen, einer Losungsmittelausfällung, einer Extraktion, einer Adsorption, einer Elektrophorese, einer Elektrofokusierung, einer Gelfiltration oder aus der Verwendung von Ionenaustauscherharzen bestehen.
17. Pharmazeutische Zubereitung für eine intraperitoneale Verabreichung an Menschen und Tiere, gekennzeichnet durch eine Substanz gemäss Anspruch 1 in einer Konzentration, die dazu ausreicht, die Entstehung einer Bauchwassersucht zu verhindern, ohne dabei eine Toxizität des Empfängers in vivo zu verursachen, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen nicht-toxischen Träger.
18. Pharmazeutische Zubereitung für eine intraperitoneale Verabreichung an Menschen und Tiere, gekennzeichnet durch ein Enzym gemäss Anspruch 10 in einer Konzentration, die dazu ausreicht, die Entstehung einer Bauchwassersucht zu unterdrücken, ohne dabei eine Toxizität des Empfängers in vivo zu verursachen, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen nicht-toxischen Träger.

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