DE3041744C2

DE3041744C2 -

Info

Publication number: DE3041744C2
Application number: DE3041744A
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Uji Kyoto Jp Nakajima; Kazuhiko Nagaokakyo Kyoto Jp Nagata; Masao Uji Kyoto Jp Kageyama; Toyohiko Kyoto Jp Suga; Kenzo Uji Kyoto Jp Motosugi
Original assignee: Unitika Ltd
Current assignee: Unitika Ltd
Priority date: 1979-11-07
Filing date: 1980-11-05
Publication date: 1990-07-12
Also published as: FR2472608B1; FR2472608A1; JPS5668391A; IT8050089A0; CA1156570A; IT1146060B; GB2066261B; SE8007818L; JPS6343079B2; DK471880A; GB2066261A; DE3041744A1

Description

Die Erfindung betrifft eine neue und nützliche Glucose-6- phosphat-dehydrogenase und ein Verfahren zu deren Herstel lung. Sie betrifft insbesondere eine Glucose-6-phosphat dehydrogenase, die zur Bestimmung von Glucose, Glucose-6- phosphat, Hexokinase und Hexose-6-phosphat-isomerase bei klinischen Versuchen auf medizinischem Gebiet verwendet werden kann und auch zur Bestimmung von Fructose und Glucose in der Nahrungsmittelindustrie. Die Erfindung be trifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Dehydrogenase.

In jüngerer Zeit hat man Enzyme wegen ihrer hohen Spezifi tät bei der Art ihrer Reaktionen, des Substrates (d. h. des Materials, auf dem sie aktiv sind) und der optischen Eigenschaften als Katalysatoren für medizinische und Nah rungsmittelanalysen verwendet. Es ist bekannt, daß die Bestimmung von Glucose- und Hexokinasemengen in Körper flüssigkeiten in klinischen Versuchen wichtige Parameter sind. Die Analyse von Glucose- und Fructosemengen in der Nahrung ist auch ein wichtiges Parameter bei der Herstellung von Invertzucker. Zur Zeit wird Glucose-6-phosphat-dehydro genase aufgrund ihrer sehr hohen Reaktionsspezifizität, ihrer Substrat- und optischen Eigenschaften für die Bestimmung die ser Parameter in großem Umfang eingesetzt, und sie stellt deshalb ein immer wertvoller werdendes Enzym dar.

Mikroanalysen unter Anwendung von Enzymen haben zwar die vor erwähnten Vorteile, jedoch sind Enzyme sehr labil und sie ver lieren ihre katalytische Aktivität in verhältnismäßig kurzer Zeit, die von einigen Tagen bis zur mehreren Wochen liegen kann, auch dann, wenn man sie unterhalb Raumtemperatur auf bewahrt. Die Labilität von Enzymen ist deshalb ein erhebliches Problem bei der Verwendung von Enzymen für Mikroanalysen. Die bisher bekannten Zubereitungen von Glucose-6-phosphat-dehydro genase sind gleichfalls labil und aus Hefe stammende Glucose- 6-phosphat-dehydrogenase, wie sie im Journal of Biological Chemistry, Band 236, S. 1225 (1961) beschrieben wird, verliert im allgemeinen den größten Teil der Aktivität in wäßriger Lösung bei Raumtemperatur innerhalb von 1 bis 3 Wochen.

Die hohen Kosten sind ein anderer Grund, warum man Glucose- 6-phosphat-dehydrogenase bisher kaum für Mikroanalysen auf dem mendizinischen Gebiet und für Nahrungsmittelanalysen eingesetzt hat. Die Umsetzung von Glucose-6-phosphat-dehydro genase erfordert immer ein Coenzym und die meisten der übli chen Analysen unter Verwendung von Glucose-6-phosphat-dehydro genase benötigen als Ceonzym Nicotinamid-adenindinucleotid phosphat (nachfolgend als NADP bezeichnet). NADP ist be kanntlich sehr teuer. Zahlreiche Glucose-6-phosphat-dehydro genase-Zubereitungen sind bekannt, z. B. aus Advantage in Enzymology, herausgegeben von Alton Meister, Band 48, Seiten 97-191, und in den meisten Fällen benötigt man NADP als Coenzym bei der Enzymreaktion mit Ausnahme von solchen, die von Leuconostoc mesenteroides und Pseudomonas W 6 stammen, die kompatibel bei der Anwendung mit Nicotinamid adenindinucleotid (nachfolgend mit NAD bezeichnet) sind, das nur ein Zehntel oder weniger kostet wie NADP. Die aus Leuconostoc mesenteroides und Pseudomonas W 6 hergestellte Glucose-6-phosphat-dehydrogenase ist jedoch nicht wärmestabil und hält sich nicht lange, d. h. daß die Inaktivierung des Enzyms beim Stehenlassen während ein bis zwei Wochen bei Raumtemperatur festgestellt wird. Um die Vorteile der Analyse unter Verwendung von Glucose- 6-phosphat-dehydrogenase maximal ausnutzen zu können, hat man Untersuchungen durchgeführt, um eine Glucose-6-phosphat- dehydrogenase zu finden, die stabil ist und die mit billigen Coenzymen (d. h. anderen als dem teuren NADP) kompatibel ist.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine Glucose-6-phosphat-de hydrogenase zu zeigen, die wärmestabil ist, und die ihre Aktivität während einer längeren Zeit nicht verliert, und die außerdem kompatibel mit billigen Coenzymen (d. h. anderen als dem teueren NADP) ist.

Diese Aufgabe wird durch Glucose-6-phosphat-dehydrogenase gemäß Anspruch 1 gelöst. Dieses Produkt zeichnet sich dadurch besonders aus, daß es nach 15-minütigem Inkubie ren in einer Pufferlösung mit einer Konzentration von 5 bis 500 mM/l, einem pH von 7 bis 10,5 und einer Temperatur von 50°C wenigstens 80% ihrer Anfangsaktivität bei behält.

Die erfindungsgemäße Glucose-6-phosphat-dehydrogenase ist somit sehr wärmestabil, so daß man sie nach dem Isolieren während längerer Zeiträume länger aufbewahren kann als die übliche Glucose-6-phosphat-dehydrogenase. Das Enzym ist außer ordentlich brauchbar für biochemische Forschungen, in der Nahrungsmittelindustrie und für klinische Versuche. Außer dem ist das Enzym mit NAD kombatibel und da dies viel weniger kostet als NADP kann man es mit Vorteil als ein preiswertes Reagens einsetzen.

Fig. 1 ist eine grafische Darstellung und zeigt die Restaktivität von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase gemäß der Erfindung (Kurve A) und von einer von Hefe abstammenden Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (Kurve B) nach Erhitzen auf verschiedene Temperatu ren während 15 Minuten.

Fig. 2 ist eine grafische Darstellung und zeigt die Rest aktivität der erfindungsgemäßen Glucose-6-phosphat- dehydrogenase (Kurve C) und von einer von Hefe stammenden Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (Kurve D) nach Lagerung bei 30°C.

Die erfindungsgemäße Glucose-6-phosphat-dehydrogenase behält nach etwa 15-minütigem Inkubieren in einer Puffer lösung von etwa 50°C wenigstens etwa 80% und vorzugsweise wenigstens etwa 90% und insbesondere etwa 100% der Anfangs aktivität bei. Insbesondere behält die erfindungsgemäße De hydrogenase wenigstens 80% ihrer Anfangsaktivität bei, wenn man sie etwa 15 Minuten in einer Pufferlösung von etwa 57°C behandelt. Die Konzentration und der pH der Pufferlösung sind nicht auf spezielle Werte beschränkt, aber im allgemei nen liegt die Konzentration im Bereich von 5 bis 500 mMol/l (nachfolgend mit mM bezeichnet) und der pH im Bereich von 7 bis 10,5. Für die Zwecke der Erfindung wird eine 100 mM tris-HCL-Pufferlösung (pH etwa 9,0) mit einem Gehalt von 100 mM Kaliumchlorid mit Vorteil verwendet.

Die physikochemischen Eigenschaften der Glucose-6-phosphat- dehydrogenase gemäß der Erfindung werden nachfolgend ange geben:

1. Funktion des Enzyms

Die Glucose-6-phosphat-dehydrogenase der Erfindung katalysiert folgende Reaktion:

Hexose-6-phosphat+Coenzym (oxidierte Form) ⇄
Hexosealdonsäure-6-phosphat+Coenzym (reduzierte Form)

Hexose-6-phosphat ist der allgemeine Ausdruck für Glucose- 6-phosphat, Mannose-6-phosphat und Galactose-6-phosphat und Hexosealdonsäure-6-phosphat ist der allgemeine Ausdruck für Gluconsäure-6-phosphat, Mannonsäure-6-phosphat und Galac tonsäure-6-phosphat. Das Coenzym kann entweder NADP oder NAD sein.

2. Substratspezifität

Die Micheliskonstante (Km-Wert) des Enzyms für Glucose-6- phosphat ist etwa 0,16 mM. Die Reaktionsgeschwindigkeit für Mannose-6-phosphat und Galactose-6-phosphat bei einer gegebenen Substratkonzentration sind etwa 40% bzw. 20% im Vergleich zu Glucose-6-phosphat. Die Km-Werte für NADP und NAD sind 0,016 bzw. 1,64 mM.

3. Optimaler pH

Etwa 9,0 (bei 30°C)

4. Stabiler pH-Bereich

Es findet eine geringe Deaktivierung des Enzyms beim Inkubie ren mit einem pH von 7,0 bis 10,5 bei 4°C während 24 h statt.

5. Optimaler Funktionstemperaturbereich

Der optimale Funktionstemperaturbereich für Umsetzungen liegt bei etwa 25 bis 75°C. Die Aktivität erhöht sich bei einem pH von 8,9 mit dem Steigen der Temperatur von 25°C auf 75°C.

6. Wärmebeständigkeit

Das Enzym ist gegen Erwärmen auf 57°C während wenigstens 15 Mi nuten stabil.

7. Molekulargewicht

Gelfiltrationschromatografie auf Sephacryl S-200 zeigte, daß das Enzym ein Molekulargewicht von etwa 230 000 hat. Hefe- und Leuconostoc mesenteroides-abgeleitete Glucose-6-phosphat-dehydrogenase haben ein Molekulargewicht von etwa 100 000, gemessen bei der Gelfiltrationschromatografie mit Sephacryl S-200.

8. Bestimmung und Definition der Aktivität

Ein Gemisch von 2 mM Glucose-6-phosphat, 0,5 mM NADP und 5 mM Magnesiumchlorid in 50 mM tris-HCL-Puffer mit einem pH von 8,9 wird hergestellt. Eine geeignete Menge an Glucose- 6-phosphat-dehydrogenase wird zu dem Gemisch zugegeben und dann wird die Erhöhung der Absorption an reduzierter Form von NADP (NADP H) bei 340 nm während einer gegebenen Zeit gemessen. Nimmt man an, daß die enzymatische Aktivität, bei welcher die Absorption von 1 Mikromol NADP H bei 340 nm pro Minute ansteigt, eine Einheit ist, so hat das gereinigte Enzym eine Potenz von etwa 100 Einheiten /mg bei 30°C.

9. Reinheit

Bei einer 7,5%igen Acrylamid-Scheibenelektrophorese bei einem pH von 9,4 wandert eine gereinigte Probe des Enzyms zu einer positiven Elektrode und gibt ein einzelnes Band. Bei der SDS-Elektrophorese wandert die Probe gleichfalls zur posi tiven Elektrode und gibt ein einzelnes Band.

10. Zusammensetzungsanalyse

Der Anteil an Aminosäuren in dem Enzym wird nachfolgend in Mol-% angegeben:

1,05% Asparginsäure, 5,42% Threonin, 4,56% Serin, 11,86% Glutaminsäure, 3,66% Prolin, 6,67% Glycin, 7,92% Alanin, 0,62% Cystein, 6,09% Valin, 1,97% Methionin, 5,59% Iso leucin, 8,04% Leucin, 3,72% Tyrosin, 4,88% Phenylalanin, 5,28% Lysin, 3,40% Histidin, 6,56% Arginin und 2,72% Tryptophan.

11. Kristallstruktur

Die Kristallstruktur des Enzyms muß noch untersucht werden, weil man das Produkt bisher nicht kristallisiert hat.

Die Glucose-6-phosphat-dehydrogenase gemäß der Erfindung kann hergestellt werden, indem man sie aus einer Kultur von Mikroorganismen vom Genus Bacillus gewinnt. Die bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Glucose-6-phosphat- dehydrogenase verwendeten Mikroorganismen sind Bacillus stearother mophilus mit der Hinterlegungsnummer ATCC 7953, 8005, 10149, 12980 und 29609.

Für die Kultivierung
kann man verschiedene Nährmittel verwenden. Als Kohlenstoff quellen können Saccharide, wie Glucose, Saccharose, Fructose, Stärkehydrolysate, Melasse und Sulfitablauge sowie organi sche Säuren, wie Essigsäure und Milchsäure, oder Alkohole, die von den Mikroorganismen verwendet werden können, wie Ethylalkohol und Butylalkohol, Fette und Öle, aliphatische Säuren von Glycerin verwendet werden. Geeignete Stickstoffquel len sind anorganische und organische Verbindungen, wie Ammo niumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniak, Aminosäuren, Pepton, Fleischextrakt und Hefeextrakt. Anorga nische Salze schließen Kalium-, Natrium-, Phosphorsäure-, Zink-, Eisen-, Magnesium-, Mangan-, Kupfer-, Calcium- und Cobaltsalze ein. Gewünschtenfalls können die Nährmittel Salze von Spurenmetallen, Maismaische, Vitamine und Nucleinsäuren enthalten. Man kann die allgemein bekannten Nährmedien für die Kultivierung von Mikroorganismen verwenden.

Der Mikroorganismus wird aerob in einem der vorerwähnten Medien während etwa 2 bis 6 bei einer Temperatur zwischen etwa 20 bis 80°C und vorzugsweise etwa 40 bis 70°C und insbesondere bei etwa 60°C kultiviert. Für eine industrielle Arbeitsweise wird bevorzugt, die Kultivierung unter Einstellung des Verdünnungsgrades vorzunehmen, der mehr als 90% der maximalen spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit eines Mikroorganismus, der unter kontinuierlichen Kultivierbedingungen (µmax) kultiviert wird, ausgedrückt als Verdünnungsgrad in l/h des verwendeten Mikroorganismus, beträgt. Die kontinuierliche Kultivierung bei einem auf mehr als 90% des µmax des Mikroorganismus eingestellten Verdünnungsgrad bildet mehr Zellen als bei einer absatzweisen Arbeitsweise, und die Zellen enthalten mehr Glucose-6-phosphat- dehydrogenase als das bei einer absatzweisen Verfahrensweise pro Zelleneinheit erzielte Maximum. Insbesondere wird bei kontinuierlicher Kultivierung bei einem Verdünnungsgrad, der in der Nähe von µmax gehalten wird, etwa 1,3mal soviel Glucose-6-phosphat-dehydrogenase gebildet wie in einem absatzweisen Verfahren. Wird die kontinuierliche Kultivierung bei einem Verdünnungsgrad von weniger als 0,9 µmax durchgeführt, dann neigt das Glucose-6-phosphat-dehydrogenase-Niveau dazu, niedriger zu sein als bei einem absatzweisen Verfahren.

Der Verdünnungsgrad (nachfolgend mit D bezeichnet), wie er hier angewendet wird, wird durch folgende Gleichung (I) ausgedrückt:

worin D den Verdünnungsgrad (1/h)
F die Menge (l/h), mit welcher die Fermentationsflüssigkeit zu dem Fermentator geführt und abgezogen wird,
V das Volumen (1) der Fermentationsflüssigkeit in dem Fermentator bedeuten.

Das Symbol "µmax", wie es hier verwendet wird, bedeutet den maximalen spezifischen Wachstumsgrad (1/h) eines unter kontinuierlichen Kultivierbedingungen kultivierten Mikroorganismus und ist ein spezifischer Wachstumsgrad, den man zur "Auswasch"- Zeit feststellt, d. h. der Zeit, wenn der Mikroorganismus in einem Chemostat (siehe Herbert, Elsworth und Telling, Journal of General Microbiology, Band 14, Nr. 8, Seiten 601-622, 1956) aufgrund des Ansteigens in D nicht mehr eine stationäre Zellkonzentration beibehält. µmax von thermophilen Mikroorganismen, wie sie erfindungsgemäß verwendet werden, kann wie folgt bestimmt werden: 1,5 bis 20 l eines Nährmediums in einem 2- bis 30-l-Fermentator werden mit dem Mikroorganismus für eine absatzweise Kultivierung bei 40°C bis 75°C und vorzugsweise bei 48°C bis 61°C und bei einem pH von 4,5 bis 9,0 und vorzugsweise zwischen 6,0 und 8,0 inokuliert; wenn das Wachstum des Mikroorganismus den Gehalt der Kohlenstoffquelle in der Brühe auf weniger als 0,01 Gew.-% vermindert, wird ein Nährmedium der gleichen Zusammensetzung wie zuerst dem Fermentator zugegeben worden war, zu dem Fermentator gegeben, um eine kontinuierliche Kultivierung zu starten, bei welcher der einzige Begrenzungsfaktor die Kohlenstoffquelle ist. Auf diese Weise wird ein Chemostat erreicht. Wenn die kontinuierliche Kultivierung eine stationäre Phase erreicht hat, wird D stufenweise durch Messen der Zellkonzentration in der Fermentationsflüssigkeit und der restlichen Kohlenstoffquelle in der Fermentationsflüssigkeit innerhalb gegebener Zeitabstände erhöht, und wenn D den spezifischen Wachstumsgrad des Mikroorganismus übersteigt, beginnt die stabile Zellkonzentration abzunehmen, während der Gehalt an Kohlenstoffquelle zuzunehmen beginnt.

Das Phänomen, bei dem eine Erhöhung von D die kontinuierliche Kultivierung veranlaßt, aus der stationären Phase herauszukommen, wird als "Auswaschen" bezeichnet und die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit zur Auswaschzeit ist µmax. µmax variiert für einen gegebenen Organismus in Abhängigkeit von der Art des Nährmediums und der Kultivierbedingungen, aber für eine gegebene Kombination von Mikroorganismus, Nährmedium und Kultivierbedingungen ist µmax konstant und stellt deshalb eine verlässliche Zahl für den Betrieb über längere Zeiten dar, sobald er einmal gemessen ist.

Bei der Durchführung des beanspruchten Verfahrens wird D bei einer kontinuierlichen Kultivierung, die nach Erreichen einer gewünschten Zellkonzentration bei einer üblichen Vorkultivierung und ansatzweisen Kultivierung durchgeführt wird, auf einen vorbestimmten Wert limitiert. Der Übergang zu einer kontinuierlichen Kultivierung kann zu jeder Zeit der absatzweisen Kultivierung erfolgen, jedoch wird vorzugsweise die Kultivierung in der letzten Stufe der logarithmischen Wachstumsphase einer absatzweisen Kultivierung in eine kontinuierliche Kultivierung überführt und D sollte auf einen vorbestimmten Wert sobald wie möglich festgelegt werden.

Eine nachfolgend beschriebene Ausführungsform der Erfindung besteht in der Kultivierung von Bacillus sterothermophilus ATCC 29 609 in einem Nährmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle. Wenn eine chemostate kontinuierliche Kultivierung in einem 30-l-Fermentator (der mit 20 l des Mediums gefüllt ist) bei einer Optimaltemperatur von etwa 57°C und einem Optimal-pH von etwa 6,8 durchgeführt wird, beträgt µmax des Mikroorganismus 1,1 (l/h). Um daher eine kontinuierliche Kultivierung bei D gleich µmax durchzuführen, wird ein frisches Nährmedium der gleichen Zusammensetzung wie in der absatzweisen Kultivierung kontinuierlich zu dem Fermentator gegeben und von diesem abgeführt in einer Menge, die 1,1mal pro Stunde so groß ist wie das anfangs dem Fermentator zugeführte Volumen, oder in einer Menge von 22 l/h, berechnet aus Formel (I). Die Zufuhr und das Abziehen können mittels einer Dosierpumpe erfolgen.

Die Glucose-6-phosphat-dehydrogenase gemäß der Erfindung kann aus der Kultur gewonnen werden. Das Enzym kann man als abgetrennte Lebendzellen, behandelte Lebendzellen, als Rohenzym oder als gereinigtes Enzym gewinnen. Für die Reinigung können übliche Verfahren der Enzymreinigung angewendet werden; nach dem Zentrifugieren oder anderen geeigneten Maßnahmen werden die Zellen mit einem Homogenisator, durch eine französische Presse oder durch Ultraschallwellen homogenisiert, und die Zellmembrane werden durch Zentrifugieren entfernt, wobei man ein Zellextrakt erhält, das dann mit Sulfat-Streptomycin oder Sulfat-Protamin behandelt wird, worauf sich gegebenenfalls ein Ausfällen mit Ammoniumsulfat, Aceton oder einer Wärmebehandlung anschließt. Sofern eine weitere Reinigung erforderlich ist, kann man diese Reinigung mit einer Ionenaustausch-Chromatographie über einer DEAE- Cellulose-Säule, Adsorptionschromatografie über Hydroxyapatit oder durch Gelpermeations-Chromatographie über Sephadex kombinieren. Auf diese Weise kann man die erfindungsgemäße Glucose- 6-phosphat-dehydrogenase aus dem Kulturmedium abtrennen und reinigen.

Die erfindungsgemäße Glucose-6-phosphat-dehydrogenase ist sehr wärmestabil, so daß sie nach der Isolierung über längere Zeiträume gelagert werden kann als dies mit den bekannten Glucose- 6-phosphat-dehydrogenase-Zubereitungen möglich ist. Deshalb wird die erfindungsgemäße Dehydrogenase mit besonderem Vorteil für biochemische Forschungen, in der Nahrungsmittelindustrie und für klinische Versuche verwendet. Beispielsweise kann das Glucoseniveau in Nahrungsmitteln oder in Körperflüssigkeit mit einer hohen Genauigkeit unter Verwendung einer Reaktionsflüssigkeit aus Glucose-6-phosphat-dehydrogenase gemäß der Erfindung, Hexochinase, NAD, ATP und Magnesiumchlorid bestimmt werden. Die Glucosemenge in Nahrungsmitteln ist ein wichtiges Parameter bei der Herstellung von Invertzucker und die Glucosemenge in der Körperflüssigkeit wird bei der Diagnose von Diabetes verwendet. Bei einer anderen Anwendung kann man die Aktivität von Phosphoglucose-isomerase bestimmen, indem man das Glucose-6- phosphat-Niveau in der Körperflüssigkeit mit einer Reaktionsflüssigkeit mißt, die aus Glucose-6-phosphat-dehydrogenase gemäß der Erfindung, NAD und Magnesiumchlorid besteht. Die Aktivität wird als Parameter für die Untersuchung auf Krebs, z. B. Krebsmetastasen der Brust, angewendet.

Die erfindungsgemäße Glucose-6-phosphat-dehydrogenase reagiert als Coenzym mit NAD, welches ein sehr viel billigeres Coenzym ist als NADP, so daß die Coenzyme mit Vorteil als billige Reagentien verwendet werden können.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen, Vergleichsbeispielen und Anwendungsbeispielen erläutert.

Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1

Ein Medium (250 l) mit einem Gehalt an 0,5 g/dl (Deciliter) Polypepton, 9,5 g/dl Hefeextrakt, 1,0 g/dl Saccharose, 0,18 g/dl Kaliumsulfat, 0,644 g/dl Dinatriumphosphat, 0,027 g/dl Magnesiumsulfat, 0,032 g/dl Zitronensäure, 0,0007 g/dl Ferrosulfat und 0,015 g/dl Mangansulfat wurde auf pH 7,0 eingestellt und 10 Minuten bei 115°C hitzesterilisiert. Anschließend wurde das Medium mit einem Stamm von Bacillus stearothermophilus ATCC 29 609 inokuliert und eine belüftete Kultivierung wurde bei 60°C während 3 h mit einem Innendruck von 0,5 bar (Überdruck) vorgenommen.

Unmittelbar nach der Kultivierung wurden 700 g der Zellen mittels einer Zentrifuge unter Wasserkühlung gewonnen. Die Zellen wurden gefroren und 300 g der gefrorenen Probe wurden in 600 g von 0,1 M Phosphatpuffer (pH: 7,5) suspendiert und anschließend mit einer französischen Presse homogenisiert und die Zellmembrane wurden durch Zentrifugieren entfernt, wobei man ein Rohextrakt mit einem Gehalt an Glucose-6-phosphat-dehydrogenase erhielt. Zu 600 ml des Rohextraktes wurden 300 ml einer 1%igen wäßrigen Lösung von Sulfatprotamin gegeben, und das Gemisch wurde gründlich gerührt. Der entstandene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren und das überstehende Protamin wurde gewonnen. Zu der überstehenden Lösung wurde nach und nach festes Ammoniumsulfat gegeben, bis bei 4°C eine 50%ige Sättigung vorlag. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gewonnen und in 0,1 M Phosphatpuffer (pH: 7,5), gelöst. Die Lösung wurde durch Dialyse gegen eine 20fache 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH: 7,5) entsalzt.

Das so erhaltene flüssige Rohenzym wurde durch eine DEAE-Cellulosesäule geschickt, die mit 20 mMol Phosphatpuffer (pH: 7,5), enthaltend 2 mMol Mercaptoethanol und 2 mMol Natriumethylen diamintetraacetat, äquilibriert worden war. Nach dem Eluieren mit einer Lösung aus Kaliumchlorid in Phosphatpuffer der gleichen Zusammensetzung wie oben, wurde die gewünschte Glucose- 6-phosphat-dehydrogenase bei einer KCl-Konzentration in der Nähe von 0,15 M erhalten. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert, entsalzen und durch eine Hydroxyapatitkolonne geleitet, die mit 5 mM Phosphatpuffer (pH: 7,5) äquilibriert worden war, und dann mit einem Lineargradienten, beginnend von 5 mMol Phosphatpuffer und endend mit 250 mMol Phosphatpuffer, eluiert. Die gewünschte Glucose-6-phosphat- dehydrogenase erhielt man bei einer Pufferkonzentration in der Nähe von 75 mMol. Die aktiven Fraktionen wurden vereint, konzentriert, entsalzt und einer Ultragel-ACA 34-Chromatografie unterworfen, unter Verwendung eines Eluierungsmittels aus 05 mM tris-HCl-Puffer, enthaltend 0,1 M Kaliumchlorid. Die erhaltenen aktiven Fraktionen wurden durch eine DEAE-Sephadex A-50- Säule, die mit 30 mMol Phosphatpuffer (pH: 7,7), enthaltend 2 mMol Mercaptoethanol und 2 mMol Natriumethylendiamintetraessigsäure, äquilibriert worden war, geleitet und dann mit einem Lineargradienten von 0,1 bis 0,4 M Kaliumchlorid in einem Puffer der gleichen Zusammensetzung wie oben eluiert. Man erhielt auf diese Weise gereinigte Glucose-6-phosphat-dehydrogenase bei einer Kaliumchloridkonzentration in der Nähe von 0,2 M.

Die so erhaltene Glucose-6-phosphat-dehydrogenase wanderte zu einer positiven Elektrode bei einer Scheibenelektrophorese bei pH 9,4 unter Verwendung von 7,5% Acrylamid und ergab ein einzelnes Band. Sie zeigte auch ein einzelnes Peak für ein Molekulargewicht von 250 000 bei einer Sephadex G-200-Chromatografie.

Die Ausbeute an Enzym betrug etwa 10 mg und die Stärke war etwa 100 Einheiten/mg. Der Reinigungsgrad des Enzyms war etwa 1500 im Vergleich zu dem Rohextrakt, dessen Reinheit mit 1 bewertet wurde.

Die erfindungsgemäße Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase wurde hinsichtlich der Stabilität mit einer von Hefe abgeleiteten Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, wie sie in Vergleichsbeispiel 1 erhalten wurde, verglichen. Die Ergebnisse sind in den Fig. 1 und 2 angegeben. Fig. 1 zeigt die Restaktivitäten der beiden Enzyme nach 15-minütigem Erhitzen auf verschiedene Temperaturen in 100 mMol tris-Puffer (pH: 9,0) mit einem Gehalt von 100 mMol Kaliumchlorid. In der Fig. ist Kurve A die erfindungsgemäße Glucose-6-phosphat-dehydrogenase und Kurve B die von Hefe abgeleitete Glucose-6-phosphat-dehydrogenase. Fig. 2 zeigt die zeitabhängige Veränderung der Restaktivität der beiden Enzyme nach einer Lagerung bei 30°C in 100 mMol tris- Puffer (pH: 9,0). In dieser Kurve ist die Kurve C die erfindungsgemäße Glucose-6-phosphat-dehydrogenase und die Kurve D die von Hefe abgeleitete Glucose-6-phosphat-dehydrogenase. Aus diesen beiden Fig. geht hervor, daß nahezu die gesamte Aktivität der von Hefe abgeleiteten Glucose-6-phosphat-dehydrogenase irreversibel bei einer 15minütigen Wärmebehandlung bei 50°C verloren geht, während die erfindungsgemäße Glucose- 6-phosphat-dehydrogenase bei der Behandlung bei 50°C ihre Aktivität nicht verlor. Bei einer Behandlung bei 30°C verlor die von Hefe abgeleitete Glucose-6-phosphat-dehydrogenase ihre Aktivität in 10 Tagen, während die erfindungsgemäße Glucose-6-phosphat-dehydrogenase keinen Abfall der Aktivität auch nach einer 50tägigen Lagerung zeigte. D. h., daß die erfindungsgemäße Glucose-6-phosphat-dehydrogenase überraschend stabil gegen Wärme ist und daß dies eine lange Haltbarkeit anzeigt. Diese Eigenschaft fehlt bei den bekannten Glucose-6-phosphat-dehydrogenase-Zubereitungen.

Beispiele 2 bis 5

Verwendeter Mikroorganismus: Bacillus stearothermophilis ATCC 29 609.
Formulierung des Nährmediums: Mediums der nachfolgenden Formulierungen, bei dem Glucose, die als Kohlenstoffquelle verwendet wurde, in 1 l Leitungswasser gelöst wurde:

1,3 g Glucose, 1,0 g Hefeextrakt, 0,5 g Pepton, 0,5 g KH₂PO₄, 0,5 g Na₂HPO₄ · 12H₂O, 0,1 g MgSO₄ · 7H₂O, 0,01 g ZnSO₄ · 7H₂O, 0,01 g MnSO₄ · 7H₂O, 0,01 g CuSO₄ · 5H₂O, 0,01 g CoCl₂ - 6H₂O.

Keimstadium: 20 ml des obigen Nährmediums wurden in einen 100 ml-Erlenmeier-Kolben gegeben und 100 ml des gleichen Nährmediums wurden in einen 500 ml-Erlenmeier-Kolben gegeben und nach dem Verschließen der Kolben mit einem Baumwollpfropfen wurden die Medien mit überhitztem Wasserdampf 10 Minuten bei 121°C und 1 bar sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde das Medium in dem 100 ml-Kolben aseptisch mit etwa 5 g einer gefriergetrockneten Probe von Bacillus stearothermophilus ATCC 29 609, erhalten von der American Type Culture Collection, inokuliert. Das Medium wurde dann einer Schüttel-Kultivierung (160 UpM) während 24 h bei 55°C auf einem Kreisschüttler unterworfen, wobei der Mikroorganismus wuchs und das Grad der Trübung in einem solchen Maße zunahm, daß die Absorption bei 600 nm (gemessen mit einem Spektrofotometer Model 101 und nachfolgend als OD₆₆₀ nm bezeichnet) 0,8 bis 1,0 betrug. Etwa 5 ml des gekeimten Mikroorganismus (Inoculum) wurden auf das Medium in dem 500 ml-Kolben übertragen und der Kolben wurde dann einer Schüttel-Kultivierung während einiger Stunden unter den gleichen Bedingungen wie oben angegeben unterworfen. Wenn die OD₆₆₀ nm etwa 1,0 erreicht, wurde die Kultivierung abgebrochen.

Fermentationsstufe: In einen 30 l-Fermentator wurden 20 l des Nährmediums der gleichen Zusammensetzung wie in der Keimstufe vorgelegt und die Sterilisierung wurde während 15 Minuten bei 121°C und 1 bar vorgenommen. Zu dem Medium wurde etwa 1 l des Inoculums gegeben und dann wurde eine absatzweise Kultivierung bei 55 ± 1°C, pH 6,5 bis 7,0 (eingestellt mit 4 N NaOH) und bei einer Luftzufuhr von 20 l/Minute bei 900 UpM durchgeführt. Da während der Kultivierung eine Schäumung auftrat, wurde eine geringe Menge eines Entschäumungsmittels zugegeben. Etwa 2,5 h nach Beginn der Kultivierung erreichte die OD₆₆₀ nm 1,2 (0,56 g Trockenzellen pro l) und das Glucoseniveau in der Fermentationsflüssigkeit nahm auf weniger als 00,1 Gew.-% ab, worauf die kontinuierliche Fermentierung dann sofort begonnen wurde. Da µmax von Bacillus stearothermophilus ATCC 29 609 1,4 (1/h) beträgt, wurde ein sterilisiertes Nährmedium der gleichen Zusammensetzung wie bei der Keimstufe dem Fermentator in einer Menge von 28,0 l/h zugegeben, und die Fermentationsflüssigkeit wurde in der gleichen Geschwindigkeit aus dem Fermentator abgezogen. Auf diese Weise wurde der µmax bei 1,00 (in Beispiel 2) gehalten und eine kontinuierliche Kultivierung wurde durchgeführt unter Verwendung einer 5-fachen Volumenmenge Nährmedium zum auf das Volumen der Fermentationsflüssigkeit in dem Fermentator.

Die kontinuierliche Kultivierung wurde in gleicher Weise wie vorher angegeben vorgenommen mit der Ausnahme, daß D auf 0,9 µmax verändert wurde (das zugeführte Medium und die abgezogene Fermentationsflüssigkeit betrugen 25,2 l) in Beispiel 3 und 0,75 µmax (zugeführte Menge und abgezogene Menge: 21,0 l/h) in Beispiel 4.

Die Mengen an Glucose-6-phosphat-dehydrogenase in den in den Beispielen 2, 3 und 4 erhaltenen Zellen wurden gemessen und werden in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 gibt auch die Menge an Glucose- 6-phosphat-dehydrogenase in den Zellen an, die man bei einer absatzweisen Verfahrensweise (Beispiel 5), die durchgeführt wurde, bevor man zu einer kontinuierlichen Kultivierung überging, erhielt.

Tabelle 1

Aus der Tabelle wird ersichtlich, daß die durch kontinuierliche Kultivierung erhaltenen Zellen, bei der D bei Höher als 0,9 µmax gehalten wurde, ein höheres Glucose-6-phosphat-dehydrogenase- niveau ergaben als bei einer absatzweisen Verfahrensweise.

Beispiel 6

In einen 30 l-Fermentator wurden 10 l eines Mediums gegeben, das hergestellt worden war durch Auflösen in 1 l Leitungswasser eines Gemisches aus 1,3 g Glucose, 1,0 g Ammoniumsulfat, 0,5 g Hefeextrakt, 0,5 g Monokaliumposphat, 0,5 g Dinatriumphosphat und 0,1 g Magnesiumsulfat. Das Medium wurde mit überhitztem Wasserdampf bei 121°C und 1 bar während 15 Minuten sterilisiert. 1 l eines flüssigen Inoculums von Bacillus stearothermophilus ATCC 12 980, das auf einem Nährmedium der gleichen Zusammensetzung wie vorher angegeben gekeimt worden war, und bei dem die Absorption bei 660 nm etwa 1,0 erreichte, wurde auf das sterilisierte Medium übertragen und die Kultivierung wurde bei 57°C und bei einem pH zwischen 6,5 und 7,0 (eingestellt mit 4 N NaOH) unter Zugabe von Luft in einer Menge von 20 l/Min. bei 900 UpM durchgeführt. Nachdem bei einer absatzweisen Kultivierung während etwa 2,5 h die Absorption bei 660 nm 1,0 erreichte, wurde ein sterilisiertes Nährmedium der gleichen Zusammensetzung wie vorher angegeben, kontinuierlich mit einer Dosierpumpe in einer Menge von 24,0 l/h zugeführt und die Fermentationsflüssigkeit wurde in der gleichen Menge und mit der gleichen Vorrichtung aus dem Fermentator abgezogen. Insgesamt wurden 100 l Nährmedium bei der kontinuierlichen Kultivierung verwendet. Unmittelbar nach der Fermentierung wurde zentrifugiert, wobei man 500 g der Zellen gewann.

Die Zellen wurden in der 1,5fachen 0,1 M Phosphatpufferlösung suspendiert und mit einem Homogenisator homogenisiert. Nach dem Abtrennen der unlöslichen Stoffe mit einer Zentrifuge erhielt man ein Rohextrakt mit einem Gehalt an Glucose-6-phosphat- dehydrogenase. Zu 400 ml des Extraktes wurden 200 ml einer 10%igen wäßrigen Streptomycinsulfatlösung gegeben, und der erhaltene Niederschlag wurde auf einer Zentrifuge entfernt, wobei das Streptomycin in der überstehenden Flüssigkeit war. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit Ammoniumsulfat behandelt und dabei Fraktionen von einer 25%igen Sättigung (4°C) bis zur 50%igen Sättigung (4°C) gewonnen. Diese Fraktionen wurden in 50 mMol tris-HCl-Puffer (pH: 8,0) gelöst und die Lösung wurde über eine DEAE-Sephadex-Säule, die mit einem Puffer der gleichen Formulierung wie vorher angegeben, äquilibriert worden war, geschickt und dann mit einem Puffer der gleichen Formulierung wie oben, mit der Ausnahme, daß er Natriumchlorid enthielt, eluiert. Die gewünschte Glucose-6-phosphat-dehydrogenase wurde bei einer NaCl-Konzentration in der Nähe von 0,2 M gewonnen. Die aktive Fraktion wurde einer Säulenchromatographie über Hydroxyapatit unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 angegeben unterworfen. Die dabei erhaltene aktive Fraktion wurde durch eine Sephacryl S-200-Säule geleitet und mit 300 mMol tric-HCl-Puffer (pH 8,0), enthaltend 0,1 M Natriumchlorid, eluiert. Man erhielt eine Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, die ein einzelnes Band bei einer Scheibenelektrophorese mit Acrylamid wie in Beispiel 1 ergab. Das Enzym zeigte ein einzelnes Peak bei einer Sephadex G-200-Chromatografie wie in Beispiel 1, entsprechend einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 230 000.

Die Ausbeute an Enzym betrug etwa 20 mg und die Stärke etwa 100 Einheiten/mg. Der Reinigungsgrad des Enzyms war etwa 1100 im Vergleich zu dem Rohextrakt, das mit 1 bewertet wurde.

Anwendungsbeispiele 1, 2 und 3

Die in Beispiel 1 hergestellte Glucose-6-phosphat-dehydrogenase wurde zur Bestimmung der Glucosemenge in Standard-Sera mit einem bereits bekannten Gehalt von 76 mg/dl (Anwendungsbeispiel 1), 155 mg/dl (Anwendungsbeispiel 2) und 43 mg/dl (Anwendungsbeispiels 3) an Glucose verwendet.

Verfahren

Eine Reaktionsflüssigkeit wurde hergestellt durch Auflösen von 1 Einheit/ml Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, 2 Einheiten/ ml Hexokinase, 2 MMol NAD, 2 mMol ATP und 2 mMol MgCl₂ in 1 ml einer 100 mMol Phosphatpufferlösung (pH: 8,5). Nach 5-minütigem Stehen bei 30°C wurde die Reaktionsflüssigkeit mit 20 µl des jeweiligen Standard-Serums vermischt. Nach 5-minütiger Umsetzung bei 30°C wurde die Absorption bei 340 nm mit einem Spektrofotometer gemessen. Zur Kontrolle wurden 20 µl reines Wasser zu einer Reaktionsflüssigkeit der gleichen Formulierung wie vorher angegeben gegeben und nach 5 Minuten bei 30°C die Adsorption bei 34 nm bestimmt. Die Adsorption des Kontrollversuches wurde von der Adsorption der jeweiligen Standard- Seren abgezogen, um auf diese Weise die Erhöhung der Adsorption zu bestimmen. Die Glucosemenge (mg) in 1 dl eines jeden Standard- Serums wurde nach folgender Gleichung berechnet:

145,8 × (Erhöhung der Adsorption)=Glucosemenge (mg) in 1 dl Probe.

Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.

Ansatz Nr.
Messung
Anwendungsbeispiel 1
79 mg/dl
Anwendungsbeispiel 2	151 mg/dl
Anwendungsbeispiel 3	43 mg/dl

Aus den Ergebnissen in Tabelle 2 geht hervor, daß die bekannten Glucosekonzentrationen in Proben sehr gut übereinstimmten mit den gemessenen Glucosekonzentrationen, und daß man somit Glucosekonzentrationen nach dem vorerwähnten Verfahren messen kann.

Claims

1. Glucose-6-phosphatdehydrogenase, erhältlich durch Züchten von Bacillus stearothermophilus ATCC 7953, ATCC 8005, ATCC 10 149, ATCC 12 980 und ATCC 29 609 und Gewinnen der Glucose-6-phosphatdehydrogenase aus der Kultur und gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

a) sie katalysiert folgende Reaktion: Hexose-6-phosphat + Coenzym (oxidierte Form) Hexosealdonsäure-6-phosphat + Coenzym (reduzierte Form), wobei Hexose-6-phosphat der allgemeine Ausdruck für Glucose-6-phosphat, Mannose-6-phosphat und Galactose-6-phosphat und Hexosealdonsäure-6-phosphat der allgemeine Ausdruck für Gluconsäure-6-phosphat, Mannonsäure-6-phosphat und Galactonsäure-6-phosphat ist und das Coenzym entweder NADP oder NAD sein kann;
b) sie behält nach 15minütigem Inkubieren in einer Pufferlösung mit einer Konzentration von 5 bis 500 mMol/l, einem pH von 7 bis 10,5 und einer Temperatur von 50°C wenigstens 80% ihrer Anfangsaktivität bei;
c) Km-Wert für NAD=1,64 mM;
d) optimaler pH=9,0 bei 30°C;
e) sie ist gegen Erwärmen auf 57°C wenigstens 15 Minuten stabil;
f) Molekulargewicht von etwa 230 000 (Gelfiltrationschromatographie auf Sephacryl S-200).

2. Verfahren zur Herstellung der Glucose-6-phosphatdehydrigenase des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus stearothermophilus ATCC 7953, ATCC 8005, ATCC 10 149, ATCC 12 980 oder ATCC 29 609 züchtet und das Enzym aus der Kultur gewinnt.

3. Zusammensetzung, bestehend aus der Glucose-6-phosphatdehydrogenase des Anspruchs 1 und Nikotinamidadenindinucleotid.