DE2439923A1 - Verfahren zum fixieren von enzymen auf traegermaterialien - Google Patents

Description

Beschreibung
zu der Patentanmeldung

rhOne-frogil, s.a.

25, Quai Paul-Doumer, 92408 Courbevoie, Frankreich

betreffend:

Verfahren zum Fixieren von Enzymen auf Trägermaterialien

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Fixieren von
Enzymen auf Trägern in organischenrMedium sowie die dabei erhaltenen komplexe Träger-Enzym.

Bekanntlich ist die technische Verwertbarkeit von Enzymen eingeschränkt durch die Unbeständigkeit der Enzyme, durch die häufig benötigten großen Mengen an Enzym und infolgedessen durch die hohen Gestehungskosten.

Um die Enzyme rationeller auswerten zu können, wurde be- . reits versucht, sie auf Trägermaterialian zu immobilisieren und zwar durch Adsorption, Einschluß in unlösliche Gele,
Vernetzung ©der durch Ausbildung kovalenter Bindungen zwischen Träger und Enzym. Diese letztere Arbeitsweise ist die
häufigste, auf Grund der Eigenschaften der dabei erhaltenen Enzymderivate; allgemein wird hierzu ein in Wasser löslicher ' oder unlöslicher Träger und das Enzym in einem vollständig

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oder teilweise wässrigen Medium bei einer Temperatur unterhalb 50⁰C und bei einem pH-Wert, bei welchem das Enzym beständig und aktiv ist, miteinander in Berührung gebracht.

Die Fixierungsreaktion verläuft jedoch langsam, es treten während dieser Reaktion Adsorptionserscheinungen auf, die erhaltenen Komplexe Träger-Enzym sind noch nicht ausreichend beständig und ihre Aktivität ist gering. Außerdem konkurrieren im Verlauf der Fixierungsreaktion häufig die Enzymmoleküle und die Wassermoleküle beim Besetzen der ieaktionsfreudigen Stellen des Trägermaterials; hierdurch wird die Menge an fixiertem aktivem Enzym eingeschränkt.

Aufgabe der Erfindung ist es, diese Nachteile zu vermeiden und mit Hilfe einer raschen Fixierungsreaktion ohne besondere Bedingungen hinsichtlich des pH-Wertes Träger-Enzym Komplexe zu erhalten, auf denen eine größere Menge aktives Enzym fixiert ist und die den üblichen Denaturierungsfaktoren wie Aufbewahren, Temperatur und pH-Wert TÄüerstehen und außerdem aktiver sind als die bekannten Komplexe.

Erfindungsgemäß werden Enzyme auf Trägermaterialien in wasserfreiem organischem Medium bei einer Temperatur von 30 bis 120⁰C fixiert. Für dieses Verfahren kommen folgende Enzyme in Frage:

a) Oxydoreduktasen wie Glukoseoxydase, Glutaminsäuredehydrogenase, Äpfelsäuredehydrogenase, Milchsäuredehydrogenase, Peroxydase und Katalase;

Transferasen wie

b) Aspartat-aminotransferase, Histaminmethyltransferase,

Glycin-aminotransferase, Aspartat-acetyltransferase , E-Lysin-acetyltransferase -, Hexokinase und Fructokinase;

c) Hydrolasen wie Lipase, Phospholipase, Acetylcholinesterase, Pectinase, Phosphatase, dL- und ß-Amylase, Maltase, Cellulase, Invertase, Acylase, Pepsin, Papain, Rennin, Trypsin, Chymotrypsin, Asparaginase, Urease, Arginase und Ribonuclease;

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d) Lyasen wie Aspartat-decarboxylase, Glutamat-decarboxylase, Malatsynthase, Citratlyase, Fumarat-hydratase;

e) Isomerasen wie Alaninracemase, Methioninracemase, Glutamatracemase, Lactatracemase und Glukosephosphat-isomerase;

f) Ligasen wie Asparagin-synthetase, Glutamin-synthetase, Glutathion-synthetase und Pyruvat-synthetase. .

Das eingesetzte Trägermaterial kann anorganisch, organisch oder gemischt anorganisch-organisch sein und ist in organischem Medium unlöslich; es muß aktiv sein, das heißt eine oder mehrere funktionelle Gruppen besitzen, die mit anderen Gruppen wie Amino-, Carboxyl-, Sufhydril- oder Hydroxylgruppen, über welche die Enzyme sich fixieren können, reagieren. Desitzt das Trägermaterial selbst nicht diese funktioneilen Gruppen, so muß es in diesem Sinne modifiziert werden.

Als Trägermaterial kommen in Frage: Backstein, Kieselsäure bzw. Kieselerde, Tonerde bzw. Aluminiumoxid, Tone, Sand, Agarose, Stärke, Polydextran, Cellulose, polymere Stoffe wie Polybutadien, Polystyrol, gegebenenfalls vernetzt und Copolymere der Methacrylsäure sowie Copolymere aus Maleinsäureanhydrid und Äthylen.

Die Modifizierung oder Aktivierung des Trägermaterials besteht darin, daß man es derart behandelt, 'daß es die funktioneilen Gruppen erhält, welche mit dem Enzym reagieren. Diese Modifizierung erfolgt nach beliebig bekannten Arbeitsweisen und hängt ab von der Beschaffenheit des eingesetzten Trägermaterials sowie von der Beschaffenheit des Enzyms, das fixiert werden soll. Zu diesen Aktivierungsreaktionen, die von klassischen chemischen Reaktionen wie Diazotieren, Halogenieren und Sulfonieren Gebrauch machen, gehören die Reaktionen zwischen Trägermaterial und beispielsweise einem SuIfurylhalogenid, Cyanurylhalogenid, Halogencyan oder Thionylhalogenid; das Aufpfropfen auf das Trägermaterial, vor allem auf Polymere von hydrolisierbaren Silanen mit mehreren

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funktioneilen Gruppen oder von Carbonylgruppen.

Diese Träger liegen allgemein als granulierte Stoffe vor, deren Korngrößenverteilung meistens oberhalb 100 /Um liegt und sehr unterschiedlich sein kann. Sie müssen selbstverständlich vollständig frei sein von allen Stoffen, die das Enzym hemmen oder denaturieren und dürfen keinerlei Wasserspuren enthalten.

Als organisches Medium, welches das Enzym nicht löst, werden aliphatische, cycloaliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffe gewählt, die gegebenenfalls noch Chloratome oder Heteroatome wie Sauerstoff und/oder Schwefel enthalten. Hierzu gehören: Hexan, Benzol, Toluol, Xylol, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dichloräthan, Trichloräthan, Trichloräthylen, Perchloräthylen, Dioxan, Tetrahydrofuran und Dimethylsulfoxid. Diese Nicht-Lösungsmittel für das Enzym werden einzeln oder im Gemisch miteinander eingesetzt.

Erfindungsgemäß werden das aktive Trägermaterial und ein oder mehrere Enzyme gleichzeitig oder nacheinander in dem organischen Medium dispergiert und dann auf die Reaktionstemperatur erwärmt, vorzugsweise auf die Siedetemperatur des Mediums, während der zum Fixieren des Enzyms erforderlichen Zeitspanne.

Das Enzym soll stets im Überschuß vorliegen, bezogen auf die funktionellen Gruppen des Trägermaterials. Die Menge des organischen Mediums hängt ab von der Beschaffenheit des Trägermaterials und der Beschaffenheit des Enzyms; sie soll ausreichen, um eine gute Dispersion zu erhalten, die eine innige Berührung zwischen aktivem Trägermaterial und Enzym ermöglicht.

Die Reaktionstemperatur liegt im Bereich von 30 bis 120⁰C und wird je nach Beschaffenheit von organischem Medium

*enthalten,

^Verbindungen, die ₅₀981 2/ 1 085

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und Beschaffenheit des Enzyms im speziellen Fall eingestellt.

Es war außerordentlich überraschend, daß bei derart hohen Temperaturen die Fixierung von Enzymen möglich ist, ohne daß die Enzymaktivität wesentlich verringert wird; es wurde vielmehr bisher angenommen, daß bei Temperaturen oberhalb 40 bis 5O⁰C die Enzyme denaturieren würden.

Um die Reaktion zu beschleunigen, kann unter leichtem Druck gearbeitet werden.

Anders als bei den bekannten Verfahren bleibt der pH-Wert des Fixierungsmediums ohne Einfluß auf die Eigenschaften des fixierten Enzyms.

Die Reaktionszeit beträgt allgemein wenige Minuten bis zu 2 Stunden; dies stellt eine beträchtliche Zeitersparnis gegenüber den bekannten Verfahren dar.

Nach dem Fixieren läßt sich das organische Mediun leicht abtrennen und der erhaltene Träger-Enzym Komplex wird mit ■ einer Pufferlösung gewaschen, die sich nach dem Enzym richtet und deren pH-Wert und Zusammensetzung keinen nachteiligen denaturierenden Einfluß auf den Komplex ausüben. Hier-' durch wird das nicht umgesetzte Enzym.und das auf dem Trägermaterial einfach adsorbierte Enzym abgetrennt und zurückgewonnen und kann in einer weiteren Fixierungsreaktion eingesetzt werden,,

Die erhaltenen Komplexe aus Trägermaterial und Enzym bestehen somit aus einem oder mehreren Enzymen fixiert auf dem Trägermaterial. Enthält der Komplex mehrere Enzyme, so werden diese entweder gleichzeitig oder nacheinander fixiert oder es werden zwei getrennt voneinander hergestellte Komplexe mit jeweils einem Enzym miteinander vermischt.

Wieviel Enzym mittels kovalenter Bindung fixiert wird, hängt ab von der Beschaffenheit des Enzyms sowie von der Beschaffen-

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heit und der Struktur des Trägermaterials. Ss v/ira aeutlrcn mehr Enzym fixiert, als bei den bekannten Verfahren in wässrigem Medium.

Die erfindungsgemäß hergestellten Komplexe aus Trägermaterial können bei höheren Temperaturen eingesetzt werden als die in wässrigem Medium hergestellten Komplexe, sowie kontinuierlich während ziemlich langer Zeitspannen ohne ihre Aktivität zu verlieren oder bei nur sehr geringem Ak.tivitätsverlust. Sie werden als Katalysatoren mit. hoher spezifischer oder gesteuerter Aktivität eingesetzt und zwar auf dem Gebiet der Medizin, der Pharmazie, in der chemischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und in der Gerberei.

Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Fixierung von Pectinase auf Backstein

Der Backstein wurde zerkleinert und gesiebt, um eine homogene Korngrößenverteilung, das heißt ein Korn mit Durchmesser 0,5 bis 0,8 mm zu erhalten; dieses Pulver wurde mit destilliertem Wasser, darauf mit einer 1n-Salzsäure und schließlich nochmals mit destilliertem Wasser gewaschen und 15 h bei 700⁰C unter Sauerstoffatmosphäre gehalten. Darauf wurde der Backstein ohne Begleitstoffe aktiviert: 2 g Backstein wurden in 40 ml einer 10 %igen Lösung aus Sulfurylchlorid in wasserfreiem Benzol gegeben. Die erhaltene Suspension wurde unter Rühren auf die Siedetemperatur des Gemisches erhitzt und diese Temperatur 20 h beibehalten. Danach wurde der gebildete aktivierte Backstein abgetrennt.

0,5 g handelsübliche Pectinase und darauf 2 g aktivierter Backstein wurden mittels Schallbehandlung in 50 ml wasserfreiem Benzol dispergiert. Die erhaltene Dispersion wurde auf Siedetemperatur erwärmt und diese Temperatur 1 h lang beibehalten.

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' ORIGINAL INSPECTED

Nach dem Abkühlenlassen wurde die feste Substanz abgeschleudert, zum Vaschen 15 h lang bei 4⁰C mit 20 ml einer 1n-Kochsalzlösung in Berührung gehalten, zentrifugiert und getrocknet; der Waschvorgang wurde 7 x wiederholt. Mit seiner Hilfe wurde das auf dem Trägermaterial adsorbierte Enzym desorbiert und konnte dann einer erneuten Verwendung zugeführt werden.

Nach jedem Waschgang des Komplexes aus Trägerund Enzym, bei welchem das Enzym durch kovalente Bindung an das Trägermaterial gebunden 1st, wurde die enzymatische Aktivität wie folgt bestimmt:

1 g Komplex wurde in 10 ml einer 0,4 gew.-%igen Lösung aus Polygalacturonsäure in 0,01 m Acetatpuffer van. pH-Wert 4 gelöst. Die Dispersion wurde 30 min lang auf 35⁰C erwärmt. Nach dem Abkühlen und Absitzenlassen wurden 5 ml Lösung entnommen und durch Zugabe von 0,3 ml wässriger 0,9 %iger Zinksulfatlösung und 0*3 ml wässriger 1n-Sodalösung geklärt«, Nach dem Zentrifugieren wurden die in der überstehenden Flüssigkeit vorhandenen reduzierenden Verbindungen mit Dinitrosalicylat titriert.

Zum Vergleich wurde der Versuch wiederholt, die Fixierung jedoch in wässrigem Medium mit einer Lösung aus 0,5 mg Pectinase in 50 ml Wasser, mit 2 g aktiviertem Backstein, bei 4°C während 7 h durchgeführt.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt; angegeben wird die prozentuale Aktivist des Komplexes, bezogen auf die Enzymaktivität vor der Fixierung.

Tabelle 1:

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INSPECTED

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Tabelle 1

gewaschen mit

ImNBCl 12 3 4 5 6

?nRP 69 50 47 47 47 47 47 Aktiv!- ^{in oenzo±}

^tät ii^XH^e0^Ung ^5 39 36 32 28 27,5 24

Der Vergleich zeigt, daß die Fixierung des Enzyms in benzolischem Medium wesentlich schneller erfolgt als in wässrigem Medium und daß die in organischem (Benzol) Medium fixierte Pectinase sehr viel beständiger ist als die in wässrigem Medium fixierte Pectinase.Im Falle der Fixierung in organischem Medium tritt zwar zunächst eine leichte Verringerung der Aktivität ein, die aber nach dem dritten Waschgang konstant bleibt; die Aktivität der in wässrigem Medium fixierten Pectinase nimmt hingegen ständig ab. Hieraus schließt man, daß in organischem Medium erheblich mehr Enzym kovalent gebunden wird als in wässrigem Medium.

Beispiel 2

Fixierung von Papain auf Backstein

2 mg Papain und 2 g aktiver Backstein gemäß Beispiel 1 wurden in 20 ml Hexan suspendiert; die erhaltene Suspension wurde unter Rückfluß 1 h lang erhitzt. Nach dem Abkühlenlassen wurde der Feststoff abgetrennt, mit Wasser, 20 ml 1m Kochsalzlösung und erneut, mit Wasser gewaschen.

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Die Enzymaktivität des Komplexes aus Trägermaterial und Enzym wurde wie folgt gemessen: Der Komplex wurde in 1 ml Wasser suspendiert; darauf wurden 9" ml einer Caseinlösung -0,3 Gew.-# in 0,025 m Phosphat-Citratpuffer - vom pH-Wert 7 zugegeben; die Suspension 10 min auf 37°C erwärmt. Nach dem Abkühlen und Absitzenlassen wurde 4 ml Lösung entnommen und mit 4 ml einer wässrigen, 10 gew.-%igen Lösung aus Trichloressigsäure versetzt; das überschüssige Casein wurde ausgefällt, abfiltriert und darauf im Filtrat der Peptidgehalt nach der Methode Lowry bestimmt.

Der Komplex aus Trägermaterial und Enzym wurde erneut mit V/asser, mit 1m NaCl und mit Wasser gewaschen und erneut seine enzymatische Aktivität gemessen. Diese Maßnahmen wurden mehrere Male wiederholt.

Zum Vergleich wurde die Fixierung von Papain auf dem gleichen Trägermaterial in wässrigem Medium bei 4⁰C während 7 h vorgenommen. Nach dem Waschen wurde die Enzymaktivität, wie oben beschrieben bestimmt.

Die Ergebnisse, ausgedrückt in /Ug freigesetzte Peptide je ml und je min sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengefaßt: '

	Tab	eil	e	Z	: 1 0	10	15
Anzahl der	Waschgänge	5				,6 ,2.	1 0,1
Aktivität	Fixierung in Hexan Fixierung in H2O	3 0	,2 ,3

Der Vergleich zeigt, daß die Fixierungszeit für Papain in Hexan sehr viel kürzer ist und daß weiterhin 10 χ mehr Enzym

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fixiert werden als beim Arbeiten in Wasser.

Beispiel 3

Fixierung von Trypsin auf Backstein

Es wurde wie in Beispiel 2 gearbeitet mit Trypsin anstelle von Papain. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengefaßt.

Tabelle 3

Anzahl der Waschgänge 5 10 15

Fixierung in
Aktivität

Hexan	in	4	,8	2,	6	1	Λ
Fixierung H2O	O	,6	O,	3	O	,1

Dieses Beispiel zeigt, daß die Fixierungszeit für Trypsin in Hexan sehr viel kürzer ist als in Wasser, daß weiterhin sehr viel mehr Enzym in organischem Medium fixiert wird und daß dieses sehr viel beständiger ist als beim Arbeiten in V/asser.

Der in Hexan hergestellte Komplex aus Trägermaterial und Enzym ist verhältnismäßig beständig, trotz der aufeinanderfolgenden Waschgänge, die den Komplex nachteilig beeinflussen. Diese Beständigkeit ist größer, wenn der Komplex •kontinuierlich benützt wird: 50 g Komplex aus aktivem Backstein und Trypsin, hergestellt wie oben, wurden in eine Säule gegeben und dort bei 37°C gehalten. Eine 0,3 %ige . Caseinlösung in einem 0,025 m Phosphat-Citratpuffer, pH-Wert 7» wurde kontinuierlich während 15 Tagen durch die Säule_fcgeschickt, mit einer Geschwindigkeit von 60 ml/h.

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Alle 24 h wurden wie oben beschrieben Aktivitätsmessungen durchgeführt. Nach 15 Tagen hatte die Aktivität nur um 5 % abgenommen.

Dies zeigt sehr gut die Beständigkeit der erfindungsgemäß hergestellten Komplexe.·

Beispiel h

Fixierung von Ribonuclease auf Polybutadien ·

Polybutadien wurde durch Reaktion mit Acetylchlorid aktiviert. »

20 mg Enzym wurden in 50 ml Benzol suspendiert und mit 2 g aktiviertem Polybutadien versetzt; die erhaltene Suspension wurde zum Sieden erhitzt und 1 h bei dieser Temperatur gehalten.

Die Fixierung des Enzyms ließ sich IR-spektroskopisch verfolgen. Die Absorptionsbande bei 1720 cm der Carbonylgruppe, die das aktivierte Polybutadien enthielt, verschwand im Verlauf der Fixierungsreaktion; stattdessen trat eine andere Absorptionsbande bei 1640 cm auf, die der Iminogruppe zugeschrieben wurde.

Der abgetrennte Komplex wurde mit 20 ml Garbonatpuffer vom pH-Wert 10,5 gewaschen, um das lediglich adsorbierte Enzym zu entfernen. Anschließend wurde die Aktivität des fixierten Enzyms gegenüber einem gereinigten Präparat aus Ribonucleinsäure (= ARN) gemessen.

Hierzu wurden 20 mg Komplex aus Trägermaterial und Enzym in einem Gemisch aus 1 ml Tris-Puffer 0,2, .mit pH-Wert 7,8 enthaltend 0,02 m Athylendiaminotetraessigsäure, 1 ml Wasser und 1 ml ARN gelöst in Wasser entsprechend einer

*tris(llydroxymethyl)aminomethan bzw. 2-Amino-2-

Hydroxymethyl-propandiol-1 ,J „_

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Konzentration von 3,3 mg ARN je ml Gemisch, dispergiert.

Die Suspension wurde 2 min bei 37°C gehalten; darauf wurden 1 ml Fayden-Reagens zugegeben, das Ganze 15 min bei O⁰C ruhen gelassen und dann 5 min mit 6000 UpM bei 3°C zentrifugiert, um das überschüssige ARN abzutrennen. Die überstehende Lösung wurde abgetrennt und 1 : 30 verdünnt; darauf wurde ihre Absorption bei 260 nm gemessen und mit einem Trägermaterial ohne Enzym verglichen.

Die enzymatische Aktivität entsprach 1,2 mg aktivem Enyzm je g Trägermaterial.

Beispiel 5

Fixierung von Glucoamylase auf Kieselsäure

Eine Kieselsäure mit spezifischer Oberfläche 15 m /g wurde durch Aufpfropfen eines Silans mit Epoxygruppen aktiviert.

1 g aktivierter Träger wurde zu 50 ml einer Dispersion von 20 mg Glucoamylase in Chloroform gegeben. Die erhaltene Suspension wurde 2 h unter Rückfluß erhitzt.

Nach dem Abkühlen wurde der gebildete Komplex durch Absitzenlassen abgetrennt, getrocknet und 3 x mit 20 ml destilliertem Wasser und anschließend 24 h bei 4°C mit 20 ml 2m Kochsalzlösung gewaschen.

Zum Vergleich wurde der gleiche Versuch in wässrigem Medium durchgeführt mit 50 ml einer Acetatpufferlösung 0,1 m, pH-Wert 4,5, enthaltend 20 mg Glucoamylase und 1 g des gleichen aktivierten Trägermaterials; die Berührungszeit betrug 66 h bei 4⁰C unter Rühren. Nach dem Absitzenlassen, Spülen und Waschen wie oben, wurde die Aktivität bestimmt.

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Die erhaltenen Komplexe aus Träger und Enzym wurden in 10 ml einer 3 gew.-^igen Stärkelösung in einem 0,1 m Acetatpuffer von pH-W_prt 4,5 gegeben und 10 min lang bei . 40 C gerührt. Nach dem Abtrennen wurde die Menge der·.-reduzierenden Zucker in der flüssigen Phase colorimetrisch mit 3,5-Dinitrosalicylsäure bestimmt. Es wurde .mehrere Male gewaschen und die Aktivität auf diese Weise bestimmt. Die Ergebnisse, ausgedrückt als optische Dichte, sind in der folgenden Tabelle 4 zusammengefaßt.

Tabelle 4

Fixierunffsmedium Aktivität nach

1 mal Waschen 7 Tagen und 3 mal mit 2m NaCl : Waschen mit 2m NaCl

Chloroform 0,800 0,564

H₂O 0,180 0,120

Der Vergleich zeigt wie in den vorangegangenen Beispielen, daß die Fixierungszeit für Glueoamyläse in Chloroform wesentlich kürzer ist als in Wasser und daß die dabei erhaltenen Komplexe aktiver und beständiger sind als die in Wasser

erhaltenen. "-..-"

Patentansprüche:

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Claims (7)

1. Patentansprüche

   MJ Verfahren zum Fixieren von Enzymen auf einem Trägermaterial, dadurch gekennzeichnet , daß man die Fixierungsreaktion in wasserfreiem organischem Medium bei einer Temperatur von 30 bis 120⁰C durchführt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein in dem organischen Medium unlösliches anorganisches, organisches oder anorganischorganisches Trägermaterial einsetzt, das funktioneile Gruppen besitzt, welche mit den Gruppen reagieren, über die sich die Enzyme fixieren können.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man als Trägermaterial Backstein, Kieselsäure bzw. Kieselerde, Tonerde bzw. Aluminiumoxidhydrat, Tone, Sand, Agarose, Stärke, Polydextran, Cellulose oder Polymere einsetzt.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man das Trägermaterial aktiviert.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß man als organisches Medium aliphatisch«, cycloaliphatische oder aromatische Kohlen- \ Wasserstoffe» die gegebenenfalls Chloratome enthalten ode* Verbindungen,die Heteroatome enthalten, wählt.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man unter leichtem Druclj* arbeitet.

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7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Pixierungszeit von einigen Minuten bis zu 2 Stunden el^^

   ö. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche bis 7 zum Fixieren· von Oxydoreductasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen.

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