DE2423762A1 - Verfahren zur fermentativen herstellung von protein - Google Patents

Description

• Verfahren zur fermentativen Herstellung von Protein Es sind biosynthetische Verfahren bekannt, in denen Mikroorganismen, z.B. bestimmte Bakterienstämme, in einem synthetischen Nährmedium, welches als einzige Kohlenstoff-Quelle Methanol enthält, fermentatit vermehrt werden. Solche verfahren können sowohl diskontinuierlich als auch kontinuierlich durchgeführt werden. Die so gewonnenen Bakterienzellen enthalten im soge nannten "Rohprotein" (errechnet durch Multiplizieren dos elementaranalytisch gefun.denen Wertes für Stickstoff mit dem emprischen Faktor 6,25) üblicherweise 40 - 75 Gewichts Aminosäuren und 8 -- 16 Gewichts-% Nukleinsäuren. Ein so hoher Anteil an Nukleinsäuren ist jedoch unerwünscht, da aus ihnen insbesondere im menschlichen Organismus Harnsäure entsteht, die Gicht verursacht. Außerdem wird die Flora des Magen-Darm-Traktes ungünstig beeinflußt.
• Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von Bakterien mit Methanol als Kohlenstoff-Quelle und einer Stickstoffqueiie unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert zwischen 4,0 und 9,0 gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Bakterienstämme der Gattungen Bacillus, Pseudomonas und Flavobacterium, deren Mutanten oder Varianten so fermentiert, daß die Konzentration an Methanol in der Phase des logarithmischen Wachstums der Bakterienzellen zwischen 5 und 200 ppm, bezogen auf die Kultursuspension, liegt.
• Bevorzugt wird eine Konzentration an Methanol, die zwischen 10 und 150 ppm liegt.
• Das Verfahren wird zweckinäßig in Fermentationsreaktoren durchgeführt, welche ein Nährmedium enthalten, das neben dem erwähnten Methanol als Stickstoffquelle Salze wie Kaliumnitrat, Ammonsulfat, Ammonphosphat oder Ammoniak, Harnstoff oder Sojamehl enthalten. Außerdem enthält es Phosphate wie Kaliumdihydrogenphosphat oder Dinatriumhydrogenphosphat sowie Magnesium- und Kalium-Salze und Spurenelemente, wie sie z.B.
• auch im Leitungswasser enthalten sind. So sind z.B. Eise-, Kupfer- Molybdänsalze in Spuren vorhanden.
• Es kann zweckmäßig sein, insbesondere den Vorkulturen Nährstoffe wie Hefeextrakt, Fleischextrakt, Leberextrakt, Glucose oder andere zuzusetzen.
• Das Verfahren wird zweckmäßig bei Temperaturen zwischen 200 und 450C, vorzugsweise zwischen 300 und 370C durchgeführt.
• Als Bakterienstämme werden Bacillus-Arten verwendet, insbesondere so bekannte Bacillus-Stämme wie B, subtilis oder B.polymyxa, weiterhin Pseudomonas-Arten, wie Pseudomonas aeruginosa. Auch Flavobakterien können verwendet werden.
• Die Kultursuspension im Reaktor wird mit 0,1 bis 1,5 1 Luft pro Liter Kulturlösung und Minute (vvm), vorzugsweise mit 0,3 bis 0,6 turm, belüftet. Um eine gute Aufnahme des Sauerstoffs durch die Zellen zu gewährleisten kann intensiv gerübrt werden; es können auch Emulgatoren zugesetzt werden.
• In anderen Reaktorsystemen als Rührkesseln muß entsprechend für eine genügende Luftmenge gesorgt werden, wobei bei der Flüchtigkeit des Methanols eine Rückführung der Luft günstig ist. In konventionellen Systemen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, einen oder besser noch zwei oder mehrere Rührer in einem Fermentationskessel zu verwenden. Weiterhin ist es vorteilhaft, zwei Rührer, insbesondere Lochscheibenrührer, so im Fermentationske.s sei anzuordnen, daß die Rührerabstände etwa einen Rührerdurchmessc." betragen. Das Verhältnis von Rührerdurchmesser zu Kesseldurchmesser liegt zweckmäßig zwischen 0,35 und 0,65, vorzugsweise zwischen 0,45 und 0,55. Die Umlaufgeschwindigkeit der Kultursuspension beträgt zweckmäßig mehr als 7 m/s Falls Schaumbildung eintritt, empfiehlt sich eine chemische oder mechanische Schaumbekämpfung, zum Beispiel durch Zusatz von 0,01 bis 0,1 Gewichts-% eines Entschäumers wie Octanol, Ester der Ölsäure und Laurinsäure Init Glykol, Glycerin oder Sorbit, alkoholische Cholesterinlösung oder Silikone wie Polydimethylsiloxan.
• Die Methanol-Konzentration zwischen 5 und 200 ppm, vorzugsweise zwischen 10 und 150 ppm, kann kontinuierlich durch verschiedene Maßnahmen gesteuert werden, z.B. durch Messung des Stickstoffverbrauchs, des Zellmasseauteils oder vorzugsweise durch Messung des Kohlendioxidausstoßes. Hierbei ist eine feine Dosierung der Methanolzugabe mit schneller Reaktion auf den bei Kohlenstoffmangel absinkenden Kohlendioxidausstoß möglich.
• Vorzugsweise kante diese Steuerung über die Messung des gasförmigen Methanols mitt eis Flammenionisationsdetektor erfolgen.
• Wenn der pH-Wert der Kultursuspension unter den vorgeschriuenen Wert sinkt, wird er durch Zugabe von Alkali, z.B. Natronlauge oder Kalilauge wieder auf den vorgeschriebenen Wert gebracht. Ebenso wird ein zu hoher pH-Wert durch Zugabe von Säure, z.B. Salzsäure oder Schwefelsäure reguliert.
• Zur Kontrolle des Verfahrens werden aus der Kultursuspension Proben entnommen, um das Trockengewicht und den Stickstoffgehalt in der Bakterienzeilmasse zu bestimmen. Danach können die Wachstumsrate und die Verdopplungszeit der Zellmasse bestimmt werden. Wenn das Trockengewicht der Zellen bei aufein ander folgenden Probe entnahmen nicht mehr logarithmisch zunimmt, wird die Fermentation bei Chargenfahrweise beendet. Bei kontinuierlicher Fahrweise wird über die Verdünnungrrate die Biomasseproduktion im Reaktor kontrolliert.
• Die Abtrennung der Bakterienmasse erfolgt in üblicher Weise durch Zentrifugieren unter mehrmaligem Waschen mit Wasser.
• Auch haben sich Verfahren bewährt, wobei durch Flocculation mit Salzen bei bestimmtem pH-Wert die Zellmasse konzentriert werden kann. Man erhält so eine pastenartige Bakterienzellmasse, die noch 75 bis 90 Gewichts-°» Wasser enthält. Die Trocknung kann auf verschiedene Weise erfolgen, z.B. durch Walzentrocknung, Wirbelbettrocknung oder Sprühtrocknung. Das so getrocknete Produkt enthält lediglich 2 - 5 Gewichts-% Wasser und 60 bis 80 Gewichts-% Rohprotein. In diesem Rohprotein beträgt der Anteil an Aminosäuren 90 bis 95 Gewichts-%.
• Dabei ist bemerkenswert, daß nicht nur dieser Anteil an Aminosäuren allgemein, sondern insbesondere der Gehalt an essentiellen und semiessentiellen Aminosäuren höher'alls bei vergleichbaren Produkten nach dem Stand dor Technik liegen.
• Außerdem liegt der Rohaschegehalt der erfindungsgemäß erhaltenen getrockneten Zellmasse deutlich niedriger als der bekannter Produkte. Das erfindungsgsmäß erhaltene Rohprotein enthält weiterhin nur 5 bis 10 Gewichts- Nukleinsäuren, während bekannte Produkte 8 bis 16 oder mehr Gewichts- Nukleinsäuren enthalten.
• Die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltene trockene Bakterienmasse ist daher in besonderem Maße geeignet, als Eiweißquello in Lebensmitteln und Tierfutter zu dienen.
• Beispiel t: Der Stamm Pseudomonas sp. FH-B-5163, der auf Schrägagarröhrchen der Zusammensetzung 2,5 % Fleischextrakt 1,0 % Methanol 5,0 % Hefeextrakt 0,2 % NaN03 10,0 % Fleischpepton 0,02 % MgSO4 # 7H2O 10 % 10,0 % Glucose + 90 % 0,02 % Ma2HPO4 10,0 % NaCl 0,009 % NaH2PO4 2,5 % Agar 0,004 % KCl 0,00015% CaCl2 0,0001 % FeS04 7H20 Spuren CuSO4 # 5H2O " H3BO3 " MnSO4 # 5H2O sI ZnSO4 " 7H20 " Na2HOO4 # 2H2O (pH 6,6) gehalten wird, wird mit 4 ml destilliertem Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung abgeschwemmt und in einen 2 1 Erlenmeyerkolben steril überimpft, der 250 ml Vorkultur-Nährlösung folgender Zusammensetzung enthält: 0,53 % (NH4)2SO4 0,4 % KH2PO4 0,2 % Na2HPO4 12 H20 0,02 % MgSO4. 7 H20 0,02 % KCl 1,5 % Methanol und 0,1 % Spurenelemente (pH 6,8) Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einem 14 Liter fassenden Fermentationskessel ausgeführt, der mit 10 Litern der nachstehenden Nährlösung beschickt ist: 1 % (NH4)2So4 0,4 % KHSPOi 0,2 % NazHPO4 12 H2O 0,02 % MgSO4 # 7H2O 0,02 % KC1 Der pH-Wert der Nährlösung beträgt 6,8. Sie wird 45 Minuten lang bei 1210C sterilisie-rt. Außerdem werden 50 g (0,5 Gewichtsprozent) Methanol vor dem Beimpfen der Hauptkultur der Nährlösung zugesetzt.
• Zum Beimpfen der Nährlösung werden unter sterilen Bedingungen 2 x 250 ml der Vorkultur, die 24 - 48 Stunden lang bei 300C gesch ttelt wurde, verwendet. Die so beimpfte Nährlösung wird bei Chargenfahrweise 24 - 36 Stunden lang bei 30 0C unter Belüftung mit 0,6 vvm Luft mit einem Turbinenrührer gerührt.
• Eine pH-Wert-Korrektur erfolgt nötigenfalls durch Zugabe von 2 n steriler HCl. Während der logarithmischen Phase der batch-Fermentation sowie bei kontinuierlicher Fahrweise wird eine Konzentration von Methanol zwischen 5 bis 150 ppm Gewichts-5' eingehalten, Dazu werden bei einer Verminderung des CO2.
• Ausstoßes der Zellen weitere Anteile Methanol automatisch zudosiert, bis der CO -Ausstoß wieder ansteigt. Dies kann ebenso durch Messung des gasförmigen Methanolanteils in der Abluft durch ein FID (Flammenionisationsdetektor) geschehen.
• Das Fortschreiten-des Verfahrens wird durch Probeentnahmen zur Bestimmung des Trockengewichts und des Stickstoffs der Bakterienzellmasse kontrolliert.
• Nach Beendigung der logarithmischen Wachstumsphase wird die Aufarbeitung in üblicher Weise durch Zentrifugieren oder Flocculieren, Waschen der Zellen mit Wasser und anschließende Sprühtrocknung vorgenommen. Das so erhaltene Produkt hat einen Rohproteingehalt von 71,87 Gewichts-%, einen Aminosäuregehalt von 66,55 Gewichts-% und einen Nukleinsäureanteil von 9,8 Gewichts-%. Die essentiellen und semiessentiellen Aminosäuren machen allein 46,47 Gewichts-% (mit Glycin) aus.
• Ausführliche Angaben finden sich in der nachstehenden Tabelle i.
• TABELLE t

  Produkt Bakterien

  FH-B-5163

  Rohprotein (N x 6,25) % 71,87

  Wassergehalt %

  Rohasche %

  Rohfett %

  Rohfaser

  Aminosäuregehalt 5' 66,55

  Aminosäuren g/16 g N N

  Asp 9,50

  Thr 4,63

  Ser 3,08

  Glu 11,57

  Pro 4,15

  Gly 6,05

  Ala 8,41

  Cys n.b.

  Val 6,19

  Met 3,85

  Ile 3,92

  Leu 7,45

  Tyr 2,09

  Phe 3l55

  His 1,89

  Lys 5,90

  Arg. 7,33

  Try n.b.

  Nukleinsäuregehalt % 9,8

  Beispiel 2: Der Stamm Pseudomonas aeruginosa FH-N-845 wird wie in Beispiel 1 angezüchtet. Weiter werden in einen 14 1 fassenden Fermentationskessel 9 1 Nährlösung der in Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung gegeben und 0,5 Gewichts-% Methanol hinzugefügt. Die Nährlösung wird wie in Beispiel 1 angegeben beimpft und bei 30C unter Belüftung mit 0,6 VVm Luft mit einem Turbinenrührer mit 210 Upm gerührt. Der pH-Wert wird gegebenenfalls durch Zugabe von steriler HC1 bei pH 8,0 gehalten.
• Während der logarithmischen Phase der Fermentation wird eine Konzentration von Methanol zwischen 50 und 100 ppm eingehalten.
• Die Regelung dieser Konzentration, die Kontrolle des Verfahrens sowie die Abtrennung und Aufarbeitung der erhaltenen Zellmasse erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben. Nach Sprühtrocknung erhält man ein Produkt mit einem Rohproteingehalt von 75,8 Gewichts-%, einem Aminosäuregehalt von 67,0 Gewichts-% und einem Nukleinsäuregehalt von 8,5 Gewichts-%.
• Beispiel 3: Der Stamm Klavobacterium Sp. FH-B-5108 wird wie in Beispiel 1 beschrieben zunächst in einem 10 1 fassenden Fermentationskessel angezüchtet. Die so erhaltene Kultursuspension wird dann in einen 200 1 fassenden Fermentationskessel übertragen, der mit 150 1 der nachstehenden Nährlösung beschickt ist: 1 5' (NH4)2S04 0,4 % KH2PO4 0,2 5' K2HP04 0,2 % Na2HPO4 # 12 H2O 0,02 % NaCl 0,02 % MgSO4 # 7 H2O 0,5 % Methanol Der pH-Wert der Nährlösung wird mit halbkonzentrierter Phosphorsäure auf 6,5 eingestellt. Anschließend sterilisiert man bei 1200C und 1,4 atü 20 Minuten lang. Nach dem Sterilisieren beträgt der pH 6,7. Methanol wird getrennt zugegeben.
• Anschließend wird die Kultur 24 bis 36 Stunden lang bei 35 C unter Belüftung von 1,1 vvm bei einem Druck von 0,3 atü unter Rühren mit 2 Rührern mit 250 Upm fermentiert. Während der logarithmischen Phase der Fermentation wird eine Konzentration von Methanol zwischen 50 und 120 ppm eingehalten, in dem bei einer Verminderung des Kohlendioxidausstoßes weitere Anteile Methanol zugegeben werden, bis der Kohlendioxidausstoß wieder ansteigt. Der pH-Wert wird durch Zugabe steriler HC1 zwischen 7,9 und 8,4 gehalten. Das Fortschreiten des Verfahrens und der Zeitpunkt seiner Beendigung werden wie in Beispiel 1 angegeben bestimmt.
• Die so erhaltene Kultursuspension wird als Impfmaterial für einen 2000 1 fassenden Fermentationskessel verwendet. Die Nährlösung hat die glciche Zusammensetzung und den gleichen pH-Wert wie vorstehend für die zuletzt geschilderte Fermentation angegeben. Der Fermentationsreaktor wird 20 Minuten lang bei 1200C und 1,4 atü unter Rühren mit 210 Upm sterilisiert.
• Nach der Sterilisation beträgt der pH-Wert 6,8.
• Die anschließende Fermentation wird bei 35°C, Belüftung mit 0,6 vvm, einem Druck von 0,3 atü und 2 Rührern mit 210 Upm durchgeführt. Der pH-Wert wird während der Fermentation mit steriler HC1 zwischen 7,9 und 8,4 gehalten.
• Das Fortschreiten des Verfahrens wird durch Probeentnahmen zur Prüfung der Sterilität, zur pH-Messung, zur Bestimmung des Trockengewichts und des Stickstoffs der Bakterienzellmasse überwacht.
• Die Konzentration an Methanol wird während der logarithmischen Wachstumsphase zwischen 10 und 150 ppm gehalten und wie sorstehend beschrieben nach Maßgabe des Kohlendioxidausstoßes ergänzt.
• Nach Beendigung der logarithmischen Wachstumsphase wird die Kultursuspension kurze Zeit auf SOC erhitzt und dann auf 180C gekühlt. Der pH-Wert liegt zwischen 8,0 und 8,5.
• 2000 1 der so erhaltenen Kultur suspension mit einem Gehalt von 20 g pro 1 Trockenmasse werden in einer Röhrenzentrifuge bei 15 000 g mit einem Durchsatz von 400 l/h zentrifugiert.
• Die so abgetrennten feuchten Bakterienzellen werden in entsalztem Wasser zu einer Suspension mit einem Gehalt von 10 bis 15 Gewichts-0o' Trockenmasse aufgeschwemmt und in einem geeigneten Behälter bei 15 bis 180C kräftig gerührt. Dabei werden während etwa einer Stunde Begleitstoffe und Bestandteile der Nährlösung herausgewaschen. Nach erneutem Zentrifugieren wird mit entsalztem Wasser eine 20 bis 25 Gewichts-5'ige Bakterieususpension hergestellt, diese unter den gleichen Bedingungen gerührt und wieder zentrifugiert. Die so gewaschenen Bakterienzellen werden zu einer 40 bis 50 Gewichts-%igen Suspension aufgeschweirinit und der Sprübtrocknung unterworfen.
• Man erhält so 37 kg eines hellen, geruchlosen Zellproduktes, das 73,7 Gewichts-% rohprotein, 61,0 Gewichts-% Aminosäuren - davon 49,0 Gewichts-5' essentielle Aminosäuren - ferner 10,5 Gewichts-% Nukleinsäuren enthält.

Claims (9)

1. Patentansprüche:

   Verfahren zur Herstellung von Protein aus Bakterien mit Methanol als Kohlenstoff-Quelle und einer Stickstoffquelle unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert zwischen 4,0 und 9,0, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterienstämme der Gattungen Bacillus, Pseudomonas und Flavobacterium, deren Mutanten oder Varianten so fermentiert, daß die Konzentration an Methanol in der Phase des logarithmischen Wachstums der Bakterienzellen zwischen 10 und 150 ppm, vorzugsweise zwischen 50 - 100 ppm, bezogen auf die Kultursuspension, liegt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Methanol zwischen 10 und 150 ppm liegt.
3. 3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeicbnet, daß die Kultursuspension mit 0,3 bis 0,6 Volumen Luft pro Volumensuspension und Minute belüftet wird.
4. 4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultursuspension mit 50 bis 210 Umdrehungen pro Minute gerührt wird.
5. 5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation in einem Kessel durchgeführt wird, der wenigstens 2 Lochscheibenrührer enthält, wobei das Verhältnis von Rllhrerdurchmesser zu Kesseldurchmesser zwischen 0,35 und 0,65 liegt und wobei der Abstand zwischen 2 Rührern einen Rührerdurchmesser beträgt.
6. 6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation in Reaktoren durchgeführt wird, die sowohl mechanisch, hydrodynamisch und pneumatisch umgewälzt werden können.
7. 7q Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß Pseudomonas species, deren Mutanten oder Varianten verwendet werden.
8. 8. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis .6, dadurch gekennzeichnet, daß Bacillus species, deren Mutanten oder Varianten verwendet werden.
9. 9. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß Flavobacterium species, deren Mutanten oder Varianten verwendet werden.