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DE2449749A1 - Verfahren zur entgiftung von saponinen - Google Patents

Verfahren zur entgiftung von saponinen

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DE2449749A1
DE2449749A1 DE19742449749 DE2449749A DE2449749A1 DE 2449749 A1 DE2449749 A1 DE 2449749A1 DE 19742449749 DE19742449749 DE 19742449749 DE 2449749 A DE2449749 A DE 2449749A DE 2449749 A1 DE2449749 A1 DE 2449749A1
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Germany
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saponin
aqueous solution
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toxins
extract
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DE19742449749
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DE2449749C2 (de
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Gordon Lee Dorn
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Wadley Technologies Inc Dallas Tex Us
Original Assignee
Jk And Susie L Wadley Research Institute And Blood Bank
Wadley Res Inst & Blood Bank
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Publication of DE2449749C2 publication Critical patent/DE2449749C2/de
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
    • B01D61/145—Ultrafiltration

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  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

DR. J.-D. FRHR. von UEXKÜLL
OR. ULRICH GRAF STOLBERG DIPL.-ING. JURGgN SUCHANTKE
J.K. und Susie L. Wadley (Prio: 10. Dezember 1973
Research Institute and Blood Bank US 423 447 - 11744)
9000 Harry Hines Boulevard
Dallas, County of Dallas, Texas, U.S.A.
Hamburg, den 16. Oktober 1974
Verfahren zur Entgiftung von Saponinen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entgiftung von handelsüblichen Saponinextrakten.
Saponine sind häufig in Pflanzen auftretende Glykoside, die wäßrige öleittulsionen bilden und als Schutzkolloide wirken. Jedes Saponinmolekül enthält ein Sapogenin als Agluconanteil und einen Zucker.
Das Sapogenin ist entweder ein Triterpenoid gewöhnlich mit einer pentazyklischen Struktur wie z.B. Quillajasäure oder eine Ver- · bindung mit einer Steroidstruktur gewöhnlich mit einer Spiroaeetalseitenkette, wie z.B. in Diosgenin. Der Zuckeranteil des Saponinglucosids besteht aus einem oder mehreren Zuckern wie Glucose, Sucrose, Xylose, einer Pentose oder Methylpentose oder anderen Zuckern. Die Hydrolyse des Saponins ergibt also das Sapogenin und einen oder mehrere dieser Zucker.
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Im Handel erhältliche Saponine sind weiße bis braune, amorphe, scharfe Puder mit einem unangenehmen Geschmack und Geruch. Dieses Pulver ist sehr gut in Wasser löslich und schäumt beim Schütteln mit Wasser sehr stark.
Handelsübliche Saponine werden hergestellt, indem Pflanzen mit Wasser und/oder organischen Lösungsmitteln wie Alkohol extrahiert werden und das Saponin durch Ausfällung, Rekristallisation und ähnliche Verfahren gewonnen wird. Saponine sind in Pflanzen weit verbreitet. Besonders in den zu der Familie der Caryophyllaceae gehörenden Pflanzen treten Saponine auf. Spezielle Beispiele für Saponinquellen sind Seifenrinde, Panamaholz, Seifenbeere, Lakritze und ähnliche. Ein spezielles Beispiel für ein Verfahren zur Herstellung handelsüblichen Saponins wird in Kinzette's Chemical Encyclopedia, D.H. Hey, 9. Ausgabe 1966 beschrieben. Es wird sowohl die Extraktion von gepulverter Seifenride (Quillaja-Saponaria) mit heißem Alkohol als auch das Kochen des gepulverten trocknen wäßrigen Extrakts einer solchen Seifenrinde mit Alkohol beschrieben. Beim Abkühlen des heißen Alkohols kristallisiert das Saponin aus.
Bei oraler Einnahme sind Saponine für Menschen praktisch ungiftig. Bei Injektion in die Blutbahn allerdings wirken sie als starke Hämolyten und lösen die roten Blutkörperchen auf. Wegen dieser Eigenschaft sind in hämatologischen Laboratiorien immer dann Saponine in herkömmlicher Weise zur Entfernung der roten Zellen verwendet worden, wenn deren Gegenwart in irgendeiner Weise störend, war, z.B. bei Hämoglobinbestiranungen und Auszählungen der weißen zellen. 5Ο982Ϊ/0919
Wenngleich Saponine in häiuatologischen Laboratorien bei solchen Verfahren wie Hämoglobinbestimraungen und Auszählungen von weißen Zellen zur Entfernung von roten Blutzellen verwendet worden sind, sind sie jedoch nicht bei herkömmlichen Blutkulturverfahren verwendet worden, die die Entfernung von korpuskularen Bestandteilen des Bluts erfordern, wie z.B. bei der herkömmlichen Ultrafiltration bzw. Mikroporenfiltration, weil die handelsüblichen Saponinpräparate im allgemeinen sehr toxisch sind in bezug auf die ■ im Blut unter Umständen vorhandenen mikrobischen Bestandteile.
Beim Ultrafiltrationsverfahren zur Bestimmung mikrobischer Krankheitserreger werden zuerst die ..Blutkörperchen einer Blutprobe durch herkömmliche Verfahren wie Zentrifugieren oder Auflösen vom Serum abgetrennt. Anschließend wird das zurückgebliebene Serum durch ein Mikroporenfilter gegeben, das Teilchen mit einer Größe von Bakterien oder größer zurückhält. Die Filter werden dann auf eine Agarnährbodenplatte gelegt und Bedingungen ausgesetzt, die das Wachsen der Mikroorganismen erlauben. Die Anwesenheit von Mikroorganismen auf der Platte ergibt sich durch das Auftreten von einzelnen Mikroorganismuskolonien innerhalb von etwa 24 Stunden. Da jedoch die meisten handelsüblichen Saponinextrakte toxisch auf mikrobische Krankheitserreger wirken, sind solche Extrakte niemals als Reinigungsmittel bei solchen Verfahren verwendet worden, die einen Kontakt von Reinigungsmittel und Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen ohne Zerstörung derselben erfordern.
SO9824/091 9
2Ä49749
Es wurde nun überraschend gefunden, daß unter bestimmten Bedingungen gereinigte Saponine auf mikrobische Krankheitserreger und andere Mikroorganismen nicht toxisch wirken. Ferner wurde gefunden, daß die meisten handelsüblichen, durch Extraktion von Pflanzen hergestellten Saponinpräparate deswegen toxisch sind, weil sie Bestandteile enthalten, die in wäßriger Lösung ein scheinbares Molekulargewicht von nicht mehr als etwa 600, z.B. ein scheinbares Molekulargewicht zwischen etwa 140 und etwa 600 besitzen. Wenn diese Bestandteile aus den handelsüblichen Saponinpräparaten entfernt sind, wirkt das zurückbleibende Saponin als starker Hämolyt, ist aber nicht mehr toxisch für Mikroorganismen.
Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Saponin aus einem Pflanzenextrakt, bei welchen eine saponinreiche, rote Blutkörperchen hämolysierende Komponente aus dem Pflanzenextrakt angereichert wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man antimikrobische, toxische Bestandteile, die in wäßriger Lösung ein scheinbares Molekulargewicht kleiner als etwa 600 besitzen, aus dem Saponinextrakt entfernt.
Im Hinblick auf das bisherige Wissen über das Verhalten von Saponinen ist es überraschend, daß erfindungsgemäß gereinigte Saponinpräparate zur Entfernung der roten Blutkörperchen im Blut bei Blutkulturverfahren verwendet werden können, ohne daß die zu züchtenden mikrobischen Krankheitserreger zerstört oder schädlich beeinflußt werden«
4/091 9
Gemäß eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung v/erden handelsübliche Saponinextrakte von Pflanzen entgiftet, indem eine wäßrige Lösung dieses Saponinextrakts hergestellt wird und anschließend die Lösung durch ein Mikroporenfilter filtriert wird, dessen mittlere Porendurchmesser nicht kleiner als etwa 11 A und nicht größer als etwa 24 A sind. Die antimikrobisehen Gifte befinden sich dann in wäßrigem Filtrat. Dieses UltrafLltrationsverfahren wird vorzugsweise als kontinuierliches Verfahren durchgeführt, bei dem entsprechend der durch den Filter durchgetretenen Lösüngsmenge reines wäßriges Lösungsmittel zu der wäßrigen, das Saponin enthaltende Lösung zugegeben wird, bis die antimikrobischen Gifte vollständig aus der das Saponin enthaltenden Lösung entfernt sind.
Handelsübliche Saponine sind im allgemeinen in·drei Reinheitsgraden erhältlich, nämlich roh, gereinigt und hochrein, üblich sind auch die Bezeichnungen chemisch rein, gereinigt und analysenrein. Im allgemeinen schwankt sowohl das Auflösungsvermögen als auch der prozentuale Gehalt an extrahierbaren Bestandteilen einschließlich mikrobischer Giftstoffe dieser handelsüblichen Saponine, die eine zusammengesetzte Mischung darstellen und aus verschiedensten pflanzlichen Quellen stammen« Es wurde gefunden, daß praktisch alle dieser handelsüblichen Saponine Gifte für Mikroorganismen enthalten und diese Gift in wäßriger Lösung ein scheinbares Molekulargewicht von nicht mehr als etwa 600 und in allgemeinen zwischen etwa 150 und 600 besitzen» Weiterhin wurde gefunden, daß Saponine, obwohl sie ein Molekulargewicht zwischen 1000
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und 2000 besitzen, in wäßriger Lösung ein sehr viel größeres scheinbares Molekulargewicht besitzen und deshalb leicht in wäßriger Lösung von mikrobischen Giftstoffen abgetrennt v/erden können. Es.ist nicht ganz klar, warum die Saponine in wäßriger Lösung ein verhältnismäßig hohes, viel größeres als ihr wirkliches, scheinbares Molekulargewicht besitzen. Da Saponine nichtionische Reinigungsmittel sind, wird angenommen, daß sie möglicherweise in Lösung als Mizellen vorliegen, d.h. als aus Molekülen oder Ionen gebildete Struktureinheiten.
Erfindungsgemäß werden handelsübliche, für Mikroorganismen toxische Saponinpräparate gereinigt, indem zuerst eine wäßrige Lösung des Saponinpräparats hergestellt wird und anschließend diejenigen Bestandteile entfernt v/erden, die in wäßriger Lösung ein scheinbares Molekulargewicht kleiner als etwa 600 besitzen und im allgemeinen von einem mikroporen Sieb mit einem mittleren Porendurchmesser zwischen etwa 11 und 24 A nicht zurückgehalten werden.
Wie schon oben angegeben, besitzen die in handelsüblichen Saponinpräparaten vorhandenen antimikrobischen Giftstoffe in Lösung ein Molekulargewicht größer als etwa 150 und kleiner als etwa 600. Diese Materialien können von wäßrigen Saponinlösungen mit Hilfe jedes herkömmlichen Trennungsverfahrens xtfie z.B. Gelfiltration, Dialyse und Ultrafiltration abgetrennt werden. Im allgemeinen wird eine kontinuierliche ultrafiltration bevorzugt.
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Zum besseren Verständnis soll die Erfindung im folgenden anhand der anliegenden schematischen Zeichnung einer kontinuierlich arbeitenden Ultrafiltrationsanlage zur Entfernung von antimikrobischen Giftstoffen aus handelsüblichen Saponinpräparaten beschrieben werden.
Mit der in der Zeichnung dargestellten Anordnung wird der Ultrafiltrationskessel 10 durch eine Mikroporen-Filtermembran 14 in einen oberen Teil 10a zur Aufnahme der wäßrigen Lösung 12 des Saponinextrakts und einen unteren Teil 10b zur Aufnahme des die Giftstoffe enthaltenden Filtrats geteilt.
Die Mikroporenfiltermembran 14 kann jede herkömmliche Ultrafiltrationsmembran mit einem mittleren Porendurchmesser nicht kleiner als etwa 11 A und nicht größer als etwa 24 A sein. Geeignete Membranen dieser Art werden von der Scientific Systems Division of Amicon Corporation of Lexington, Massachusetts unter den Warenzeichen UMO5, UM2, UM10, PM10, PM30 und ähnlichen verkauft. Der Ultrafiltrationskessel 10 kann eine Amicon Standardultrafiltrationszelle mit einem Rührer sein, die ebenfalls von der Scientific Systems Division of Amicon Corporation of Lexington, Massachusetts vertrieben wird.
Die obere Kammer 10a ist mit einem Rührer 16 ausgestattet und besitzt eine geeignete Probenzuleitung 18 und über Leitung 20 einen Lösungsmitteleinlaß. Rührer 16 kann direkt mit einem Motor oder mit einem in Block 16a befindlichen Rotationsmagneten be-'.eben werden. Zur Entfernung des giftstoff haltigen Filtrats
besitzt die Kammer 10b über Leitung 22 einen Auslaß.
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BAD ORiGtNAL
Leitung 20 verbindet Öffnung 24 der Absperrvorrichtung 26 und den Einlaß in die obere Kammer des ültrafiltrationskessels 10. Absperrvorrichtung 26 besitzt die Öffnungen 24, 28, 30 und 32. Bei Stellung 1 ist Öffnung 28 verbunden mit den Öffnungen 3 2 und 24. In Stellung 2 ist Öffnung 28 mit Öffnung 32 und Öffnung 30 mit Öffnung 24 verbunden. Leitung 3 4 verbindet den oberen Teil des Lösungsmitteltanks 3 6 mit Öffnung 32. Leitung 38 verbindet Öffnung 30 mit dem unteren Teil des Inhalts von Lösungsmitteltank 36, Leitung 40 verbindet eine geeignete Preßgasquelle, z.B. eine Quelle für Preßluft oder komprimierten Stickstoff mit Öffnung der Absperrvorrichtung 26. Absperrvorrichtung 26 kann einen Konzentrations/Dialyse-Sektor CDS 10 enthalten, der von der Scientific Systems Division of Amicon Chemical Corporation of Lexington, Massachusetts vertrieben wird.
Lösungsmitteltank 36 kann irgendein Druckkessel sein und besitzt eine Einlaßvorrichtung 42 zur Aufnahme von größeren Lösungsmittelmengen und weitere mit Leitung 34 und 38 verbundene Eintrittsöffnungen.
Bei der Durchführung des schematisch dargestellten Verfahrens unter Verwendung der schematisch dargestellten Anlage wird zuerst eine wäßrige Lösung eines handelsüblichen Saponinextrakts hergestellt. Die Lösung kann etwa 5 bis 50 und vorzugsweise etwa 20 bis 40 % des handelsüblichen Saponinextrakts enthalten. Die Saponinlösung kann z.B. mit, destilliertem Wasser oder mit einer normalen Salzlösung hergestellt werden. Diese Lösung wird dann über Einlaßvorrichtung 18 in das Innere der Kammer 10a des Ultrafiltrations- ·
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kesseis 10 gegeben und befindet sich somit über der Mikroporenfiltermembran 14.
Dann wird das zur Herstellung der wäßrigen Saponinlösung verwendete Lösungsmittel z.B. destilliertes Wasser oder normale Salzlösung über die Einlaßvorrichtung 42 in den Lösungsmitteltank 36 gegeben. Im allgemeinen ist das Volumen des in den Lösungsmitteltank 36 eingefüllten Lösungsmittels mindestens doppelt und vorzugsweise mindestens 5 mal so groß wie das der wäßrigen Saponinlösung in Kammer 10a des Ultrafiltrationskessels 10. Anschließend wird die Absperrvorrichtung 26 in Stellung 1 gebracht, so daß öffnung 28 mit öffnung 32 und öffnung 24 mit' öffnung 30 verbunden sind u d der Gasdruck über der Oberfläche des Lösungsmittels 40 im Lösungsmitteltank 36 und der Oberfläche der wäßrigen Saponinlösung 12 in Kammer 10a des Ultrafiltrationskessels 10 gleichmäßig ist». Der angewandte Gasdruck ist im allgemeinen größer als der Atmosphärendruck und kann in Abhängigkeit von der Porosität der Mikroporenfiltermembran 14 schwanken, liegt im allgemeinen aber zwischen etwa 2 und 10 Atmosphären. Bei Verwendung der oben beschriebenen PM10-Membran, die entsprechend einem mittleren Porendurchmesser von 18 Ä Moleküle zu einem Molekulargewicht von 10.000 durchläßt, kann z.B. bei Raumtemperatur ein Druck von 3„52 Atmosphären angewandt werden.
Nachdem sich im Lösungsmitteltank 36 und im Ultrafiltrationskessel 10 der erhöhte Druck eingestellt hat„ wird Absperrvorrichtung 26 in Position 2 gebracht, so daß öffnung 28 mit öffnung
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und öffnung 30 mit öffnung 24 verbunden sind. Der Rührmechanismus 16 wird so betrieben, daß die an die obere Oberfläche der Mikroporenfiltermembran 14 angrenzende Flüssigkeit dauernd in Bewegung ist.
Der überdruck in Kammer 10a des Ultrafiltrationskessel 10 bev/irkt, daß das die niedermolekularen Bestandteile, zu denen alle normalerweise im handelsüblichen Saponinextrakt enthaltenen mikrobischen Giftstoffe gehören, enthaltende Lösungsmittel übergeht in Kammer 10b des Ultrafiltrationskessels 10. Die Flüssigkeit aus Kammer 10b wird in einen Vorratsbehälter überführt und über Leitung 22 verworfen.
Da der Druck im Lösungsmitteltank 36 und in der Kaminer 10a des Ultrafiltrationskesselp 10 gleich groß ist, wird das aus der Kammer 10a austretende Lösungsmittel über Leitung 38, Absperrvorrichtung 26 und Leitung 20 aus dem Lösungsmitteltank 36 durch eine gleich große Lösungsmittelmenge ersetzt. Dieses Verfahren wird solange durchgeführt, bis die gewünschte Menge Lösungsmittel aus dem Lösungsmitteltank 36 in die Kammer 10a des Ultrafiltrationskessels 10 überführt worden ist. Im allgemeinen wird mindestens das doppelte Volumen und vorzugsweise mindestens das 5-fache Volumen der anfänglichen wäßrigen Saponinlösung in Kammer 10a an Lösungsmittel über Leitung 20 in die Kammer 10a überführt. Wenn dies geschehen ist, ist die wäßrige Saponinlösung 12 frei von Giftstoffen und kann aur Auflösung von roten Blutkörperchen in einer Serumprobe, die später z.B. einem Bakterienzuchtverfahren unterworfen wird, verwendet v/erden.
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Im allgemeinen kann das Verfahren mit einer Mikroporenfilternembran durchgeführt werden, die Moleküle mit einem Molekulargewicht von etwa 600 bis 30.000 durchläßt. Dies ist, wie oben erklärt, etwas seltsam, weil Saponine normalerweise nur ein Molekulargewicht zwischen 1000 und 200O besitzen. Es kann jede geeignete Mikroporenfiltermembran verwendet werden, die die Giftstoffe mit einem scheinbaren Molekulargewicht in wäßriger Lösung von etwa 150 bis 600 wirksam abtrennt.
Wie schon oben erwähnt, kann erfindungsgemäß auch jedes andere geeignete Verfahren wie z.B. die Gelfiltration zur Abtrennung der Giftstoffe vom Saponin verwendet werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können mehr als 99 % der Giftstoffe vom Saponin abgetrennt werden. Das resultierende Saponin kann als Auflösemittel zur Blutpräparierung für Blutkulturverfahren z.B. das oben beschriebene Mikrofiltr at ionsverfahren verwendet werden. Es kann auch, wertvoll sein, für die Desaggregation von Bakterien und Pilzzellen zur genauen Bestimmung der in der Lösung anwesenden lebensfähigen Zellen. Weiterhin kann es bei der Zellenmembrananalyse eingesetzt werden, die ein mildes, nicht-toxisches Reinigungsmi-ttel erfordert.
Anhand der folgenden Beispiele soll die Erfindung näher erläutert werden.
Beispiel 1
Es wurden verschiedene handelsübliche Saponinpraparate auf ihre
%iolyse Fähigkeit als auch auf ihre Toxizität für Mikroorganismen geprüft. Für diesen Zweck wurden jeweils wäßrige Saponinlösungen
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hergestellt. Dann wurde die Hämolyse aller Proben untersucht. Die Hämolysebestimmung basierte auf der hämolytischen Ringgröße, die auf Blutnährbodenplatten erzeugt wurde. Die Blutnährbodenplatten enthielten 5 % Schafblutzeilen und tryptischen Sojanährboden. Es v/urde jeweils ein halber Milliliter der wäßrigen Saponinlösungen auf eine Blutnährbodenplatte gegeben. Beim kreisförmigen Auseinanderdefondieren hämolysierten die Lösungen die auf den Platten befindlichen Blutzellen. Nach einer Inkubationszeit von einer Nacht bei Raumtemperatur wurde die Hämolyseflache bzw. die Ringgröße bestimmt. Weiterhin wurden Proben aller wäßrigen Saponinlösungen auf ihre bakterielle Toxizität geprüft. Diese Prüfung basierte auf der Messung auf Nährbodenplatten, die mit Staphylococcus aureus versetzt waren. Diese Staphylococcus aureus enthaltenden Nährbodenplatten wurden wie folgt hergestellt:
(a) Es wurde eine Nährbodenmischung hergestellt, in dem 10 g einer im Handel erhältlichen, Nährbrühe, 10 g Casaminosäure und 1 g destilliertes Wasser miteinander vermischt wurden. Mit 10 ml dieser Nährbodenmischung wurde eine sterile Platte beschichtet. Die Schicht wurde dann härten gelassen;
(b) 2 ml einer über Nacht gezüchteten Staphylococcus aureus Kultur wurden mit 100 ml der oben beschriebenen Nährbodenmischung vermischt. Die oben beschriebene, inzwischen auf der Platte angetrocknete Schicht wurde mit 7 ml dieser Lösung überschichtet. Dann wurden kleine Mulden in die Probeplatten geschnitten und
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mit jeweils 0,1 ml der wäßrigen Saponinlösungen gefüllt. Nach einer Nacht bei 35 C wurden die Ringgrößen gemessen.
Die Ergebnisse der Hämolyse- und bakteriellen Toxizitatsversuche sind in Tabelle 1 wiedergegeben.
S038K/-Q91
Tabelle I
Toxizität verschiedener, im Handel ererhältlicher Saponine
Probe Hr<
Marke
Reinheit
Charge Nr.
Ringgröße (mm)
Hämolyse Wachstumshemmung
CaI Bio Chem
Nutritional Biochemical Corp.
Coulter Diagnostic Corp.
Nutritional Biochemical Corp.
Nutritional Biochemical Corp.
Baker Chemical Co. Eastman Chem.Co. Sigma Chem. Co.
analysenrein 200615
analysenrein 7148
analysenrein 113
analysenrein 7123
chem. rein 6356
gereinigt 35395
ehem. rein 711A
analysenrein g2C-OO5O
24,15 mm 42,0 mm
24,0 mm 37,0 mm
26,0 mm 36,0 mm
26,0 mm 34,0 mm
19,0 mm 20,1 mm
21 ,0 mm 1 6 ,0 mm
25,0 mm 9,0 mm
23,0 mm 9,0 mm.
Aus Tabelle 1 ergibt sich, daß die im Handel erhältlichen Saponinpräparate Blut verschieden stark hämolysieren und alle einen gewissen Toxizitätsgrad gegenüber mikrobischen Organismen besitzen. Besonders auffällig ist, daß auch die analysenreinen Präparate einen erheblichen Gehalt an antimikrobischen Giftstoffen besitzen. Diese Toxizität verhindert, daß diese im Handel· erhältlichen Saponine bei Blutkulturverfahren verwendet werden können.
Beispiel 2
Die acht in Tabelle 1 aufgeführten wäßrigen Saponinlösungen wurden verschiedenen Gelfiltrationstrennverfahren unterworfen. Dann wurden die abgetrennten Bestandteile sowohl auf hämolyse als auch auf bakterielle Toxizität untersucht.
Zuerst wurden drei Säulen hergestellt. Die erste Säule wurde mit Sephadex G-10, einem vernetzten Dextran der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Inc., gefüllt. Sephadex G-10 ist durchlässig für Moleküle zu einem Molekulargewicht von etwa 700. Die zweite Säule wurde mit Sephadex G-7 5, einem vernetzten Dextran der Firma Pharmacia Fine Chemicals gefüllt. Dieses Material ist durchlässig für Moleküle bis zu einem Molekulargewicht von etwa 50.000. Die dritte Säule wurde mit Bio-Gel P2, einem vernetzten Acrylamid der Firma Bio-Rad, Inc. hergestellt. Bio-Gel P2 ist durchlässig, wofür Moleküle mit einem Molekulargewicht bis zu etwa 1.800.
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Sephadex G-10 und Bio-Gel P2 vmrden 3 Stunden in entionisiertem Wasser quellen gelassen. Sephadex G-75 wurde in 0,9 %-iger Natriumchloridlösung quellen gelassen. Es wurden 10 %-xge Lösungen verschiedener Eichstoffe für die Säulen hergestellt und 0,2 ml dieser Lösungen auf die Säulen gegeben. Die Arbeitsbedingungen und die verwendeten Standards zur Eichung der Säulen sind in Tabelle II wiedergegeben.
Tabelle II Sephadex G-10 Sephadex G-7 5 Bio-Gel P-2
Höhe
Durchmesser
Durchsatz
ο (Blaues Dextran)
CoCl.
1,450 (Bacitracin)"1*
23,0 cm
,5 cm
0,8 ml/min
8,5 ml
40,6 ml
20,0 ml
19,0 ml
V12,500 (Cytochrom C)+
V17,8OO (Myoglobin)*1"
V25,OOO ( -Chymotrypsin)+
27,0 cm 1,5 cm 0,3 ml/min
13,0 ml 48,0 ml 33,0 ml 39,0 ml 36,0 ml 24,0 ml 22,0 ml 21,0 ml
54,0 cm 0,9 cm 0,5 ml/min
9,5 ml 34,0 ml 17,8 ml 30,0 ml
V = freies Zwischenvolumen, bestimmt aus dem Maximum des Peaks mit blauem Dextran
S0382Ü/0919
~ 17 ~
V. = Säulenvolumen
V. = berechnetes Volumen für einen vollständig absorbierten Stoff V.
(V.-V-) x (Wr . d : 1 + Wr) Wr = zurückgewonnenes Wasser, d = Dichte
Ausschlußvolumen (Volumen der aus der Säule austretenden Lösung, die die Verbindung mit dem im Index angegebenen Molekulargewicht enthält.)
Alle acht handelsüblichen Saponinpräparate gemäß Beispiel 1 wurden über die drei Säulen laufen gelassen. Die Saponinproben bestanden aus ungefähr 0,2 ml einer 40 %-igen Lösung des jeweiligen Saponins in dem zum Quellen der Säulenfüllung verwendeten Lösungsmittel. Zum Eluieren wurde ebenfalls das zum Quellen verwendete Lösungsmittel verwendet. Das Eluat wurde in einem LKB-Ultrafraktionssammler aufgefangen und ein 2 80 mu-Profil wurde automatisch aufgezeichnet. Nach Durchsatz von V (freies Volumen) wurden jeweils Fraktionen von einem halben Milliliter aufgefangen und nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 auf ihre hämolytische Wirksamkeit und ihre Fähigkeit, das Wachstum von Bakterien zu hemmen, untersucht» Tabellen 3 und 4 geben die Ergebnisse wieder.
509824 /09 1 9
Tabelle 3
K^ und ungefähre Molekulargewichte der antimikrobisehen Giftstoffe in verschiedenen handelsüblichen Saponinpräparaten.
ulargewic ht Kd Probe Nr. Säule
165 0,75 2 G-10
190 0,67 ? G-10
180 0,70 4 G-10
175 0,72 1 G-10
175 0,72 1 G-10
180 0,70 1 G-10
150 0,80 3 G-IO+4"
580 0,10 6 G-10
145 0,87 4 P-2
162 0,84 3 P-2
155 0,86 1 P-2
Sephadex
Bio Gel
Der Verteilungskoeffizient für einen gelösten Stoff zwischen dem Wasser im Gel und dem umgebenden Wasser wird mit K, bezeichnet.
Eine Substanz mit einem K, = 0 kann nicht in die Poren des Gels
eintreten und eine Substanz mit einem K, = 1 hat freien Zugang zu dem sich in den Gelporen befindenden Wasser. K, = V - VQ
wobei V das Elutionsvolumen der betreffenden Substanz ist; e
V. ist das Wasservolumen innerhalb der Gelporen und V ist das Wasservolumen außerhalb der Gelporen.
mit 0,9 %-iger Natriumchloridlösung.
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Tabelle 4
K, und ungefähre Molekulargewichte verschiedener handelsüblicher Saponinpräparate
Probe Nr. Sephadex G-10 Sephadex G-7 5 Bio-Gel P-2
Molekulargew. K, Molekular gew. K, Molekulargew. K,
2 700 0,0 000 1 800 0,0
4 700 ■ 0,0 30 000 0,10 1 800 0,0
1 700 0,0 50 000 0,0 1 800 0,0
3 000 0,6
3 700 0,0 50 000 0,0 1 800 0,0
8 700 0,0 10 000 0,2 1 800 0,0
6 700 0,0 50 000 0,0 1 800 0,0
7 700 0,0 ' 50 000 0,0 1 800 0,0
5 700 0,0 50 0,0 1 800 0,0
Wenngleich die Gelfiltration keine genaue Bestimmung des Molekulargewichts erlaubt, kann die Molekülgröße der Saponine und der mikrobischen Giftstoffe in vernünftiger Weise durch Vergleich mit den Standards mit bekannten Molekulargewichten abgeschätzt werden. Aus Tabelle 3 geht hervor, daß die antimikrobischen Giftstoffe in den meisten Proben ein ungefähres Molekulargewicht zwischen etw 140 und 200 besitzen. Probe 6 enthielt einen Giftstoff mit einem beträchtlich größeren Molekulargewicht, z.B. etwa 550 bis 600.
Wie aus Tabelle 4 hervorgeht, verhalten sich die Saponine, als ob ihr scheinbares Molekulargewicht größer als 700 in der Sephadex. G-10-Säule und größer als 2000 in der Bio-Gel P-2-Säule ist. -.' der Sephadex G-7 5-Säule verhalten sich alle Saponine der
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Proben 2 bis 7, als ob sie ein Molekulargewicht größer als 10000 besitzen. Bei Probe 1 verhielt sich der Hauptanteil des Saponins (80 %) , als ob es ein scheinbares Molekulargewicht größer- oder gleich 50000 besäße, und ein geringerer Anteil (20 %) verhielt sich, als ob es ein scheinbares Molekulargewicht zwischen 2000 und 4000 besäße.
Die obigen Gelfiltrationswerte zeigen also eindeutig, daß der Großteil der Saponinmoleküle in wäßriger Lösung ein scheinbares Molekulargewicht größer als 10000 besitzt und daß die in diesen handelsüblichen Präparaten enthaltenden antimikrobisehen Giftstoffe ein Molekulargewicht zwischen 140 und 600 besitzen.
Beispiel 3
Es wurde eine der in der anliegenden Zeichnung gezeigten Anlage sehr ähnliche Anlage aufgebaut, in der der ültrafiltrationskessel 10 eine mit einem Rührer versehene ültrafiltrationszelle (Model Amicon) und die Absperrvorrichtung 26 ein Konzentration-Dialyse- Selektor CDS 10 (Amicon) waren. Es wurden Lösungen von 3" im Handel erhältlichen Saponinen hergestellt. Die Konzentration betrug 20 %. Die Ultrafiltrationsguelle war mit einem 2 Liter . Lösungsmitteltank 36 verbunden. Es wurde ungefähr 1 Liter normale, Salzlösung in den Lösungsmitteltank 36 gegeben. Dann wurden ver- , schiedene Versuche mit 20 ml Proben der oben beschriebenen Lösungen von handelsüblichen Saponinen gemacht. Bei jedem Versuch wurde
509824/0919
ein Druck von 3,52 Atmosphären mit Preßluft erzeugt und die Anlage wie oben in Verbindung mit der anliegenden Zeichnung beschrieben, solange betrieben, bis das 5-fache Volumen (100 ml) das System durchströmt hatte und über Leitung 22 verlassen hatte. Die Versuche v/urden mit verschiedenen Mikroporenfiltermembranen 14 durchgeführt. Es v/urden speziell die in Tabelle 6 angegebenen Membranen verwendet.
Tabelle 6
Membrantyp ungefährer mittlerer
Porendurchmesser A
UM05 11
UM 2 12
PM10 18
PM30 24
Durchlässigkeitsgrenze (Molekulargewicht)
500
1 000
10 000 30 000
Sowohl die aus Leitung 2 2 austretende Lösung als auch die in Kammer 10a des Ultrafiltrationskessels 10 zurückbleibende Läsung wurden gemäß Beispiel 1 auf ihre hämolytische >lirk sänke it geprüft, Daraus wurde der Prozentsatz des Saponinverlustes während der Dialyse bestimmt. Die Empfindlichkeit dieser Bestimmung war auf Verluste größer oder gleich 5 % beschränkt. Tabelle 7 gibt die Ergebnisse wieder.
509824/0919 „ rnpY
BAD ORKStNAL C0PY Tabelle 7
% Saponinverlust bei der Dialyse mit verschiedenen Ultrafiltrationsmembranen
Reinheitsgrad UMO5 UM2 PH10 PM30
CaI Bio Chem analysenrein 5 % 5 % 5 % 5 %
Nutritional Bio
chemical Corp.		 analysenrein 5 % 5 % 5 % 5 %
Coulter Chemical Co. analysenrein 5 % 5 % 5 % 7,5
Wie aus Tabelle 7 hervorgeht, wird die Hauptmenge der Saponinmoleküle von der Membran PM10 nicht durchgelassen und auch bei der Membran PM30 scheint nur eine geringe Menge durchgelassen zu v/erden. Da die Membran PM1O eine Durchlässigkeitsgrenze von ungefähr 10000 und die Membran PM3O von ungefähr 30000 hat, ergeben diese Werte eindeutig, daß Saponine in wäßriger Lösung bei Verwendung dieser Ultrafiltrationsmembranen ein scheinbares Molekulargewicht zwischen 10000 und 50000 besitzen.
Beispiel 4
Die Versuche gemäß Beispiel 3 wurden wiederholt mit dem Unterschied, daß nur 10 ml der Saponinlösungen in die Ultrafiltrationszelle des Kessels 10 gegeben wurden. Die Anlage wurde solange betrieben, bis das 5-fache Volumen (50 ml) Lösungsmittel die Membran passiert hatte. Die resultierende Lösung in Kammer -10a des Ultrafiltrationskessels 10 und die ausgetretene Lösung wurden dann gemäß Beispiel 1 auf ihre bakterielle Wirksamkeit geprüft. Tabelle 8 gibt die Ergebnisse wieder.
4/0919 original inspected

Claims (1)

  1. % antibakterielle Giftstoffe, die mit verschiedenen Ultrafiltrationsmembranen abgetrennt wurden
    Marke UM05 UM2 PM 10 PM30
    Calbiochera 99 % 99 % 99 % 99 % NBC 99 % 99 %. 99 % 99 % Coulter 99 % 99 % 99 % 99 %
    Die Ergebnisse zeigen deutlich, daß keines der verwendeten Filter die Giftstoffe in feststellbarer Menge zurückhielt. Da die Membran UM05 eine Durchlässigkeitsgrenze entsprechend einem Molekulargewicht von etw 500 besitzt, scheinen die Giftstoffe in wäßriger Lösung ein scheinbares Molekulargewicht kleiner als 500 zu besitzen.
    Es ist klar, daß außer auf die hier beschriebene Art und Weise die Giftstoffe mit einem niederen Molekulargewicht von den Saponinen erfindungsgemäß auch nach verschiedenen anderen Verfahren und mit verschiedenen anderen Anlagen abgetrennt werden können. So kann z.B. jede geeignete ültrafiltrationsanlage verwendet werden,. Anstelle der beschriebenen bevorzugten Ausführungsform einer mit einem Rührer versehenen Ultrafiltrationszelle kann auch ein engporiges Kanalsystem/ wie es von der Scientific Systems Division of Amicon Corporation unter dem Warenzeichen TCF 10 vertrieben wird, verwendet werden.
    S09824/0919
    Ansprüche
    11. Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Saponin aus einem Pflanzenextrakt, bei welchen eine saponinreiche, rote Blutkörperchen hämolysierende Komponente aus dem Pflanzenextrakt angereichert wird, dadurch gekennzeichnet, daß man antimikrobische, toxische Bestandteile, die in wäßriger Lösung ein scheinbares Molekulargewicht kleiner als etwa 600 besitzen, aus dem Saponinextrakt entfernt.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die antimikrobischen, toxischen Bestandteile aus dem Saponinextrakt entfernt, indem man eine wäßrige Lösung des Saponinextrakt s herstellt und anschließend die toxischen Materialien mit einem scheinbaren Molekulargewicht in "Wasser-von weniger als 600 entfernt.
    3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die antimikrobischen, toxischen Bestandteile durch Gelfiltration aus der wäßrigen Lösung entfernt.
    4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man
    die antimikrobischen, toxischen Bestandteile durch Ultrafiltration aus der wäßrigen Lösung entfernt.
    50382-4/0913
    5. Verfahren zur Entfernung von antimikrobischen Giftstoffen aus einem Saponin enthaltenden, rote Blutkörperchen hämolysierenden Pflanzenextrakt, dadurch gekennzeichnet, daß man:
    (a) eine wäßrige Lösung des Saponinextrakts herstellt,
    (b) diese wäßrige Lösung durch eine Filtermembran mit einer mittleren Porengröße nicht kleiner als etwa 11 ä und nicht größer als etwa 24 A filtriert und dadurch die. die Membran passierenden Giftstoffe von den Saponinmolekülen abtrennt und
    (c) die angesammelten Saponinmoleküle von Resten der durch die Membran hindurchtretenden Lösung befreit.
    6. Ultrafiltrationsverfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die während der Filtration durch die Membran hindurchtretende Lösung durch gleiche Volumina des zur Herstellung der wäßrigen Saponinlösung verwendeten Lösungsmittels ersetzt.
    7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung verwendet, die etwa 5 bis 50 % des Saponinextrakts enthält.
    8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als wäßriges Lösungsmittel destilliertes Wasser verwendet.
    9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als wäßriges Lösungsmittel normale Salzlösung verwendet.
    S09824/0919
    10. Verfahren zur Entfernung von antimikrobischen Giftstoffen aus einem Saponin enthaltenden, rot Blutkörperchen hämolysierenden Pflanzenextrakt, dadurch gekennzeichnet, daß mein:
    (a) eine wäßrige Lösung des Saponinextrakts herstellt und
    (b) toxische Materialien mit einem scheinbaren Molekulargewicht in wäßriger Lösung von weniger als 600 aus diesem Extrakt entfernt.
    11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man toxische Materialien mit einem scheinbaren Molekulargewicht in wäßriger Lösung von etwa 140.bis 600 abtrennt,
    12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das Produkt gemäß Anspruch 10 zur Hämolyse roter Blutkörperchen in einer Blutprobe verwendet und anschließend die Blutprobe einem Verfahren zur Züchtung von Bakterien unterwirft.
    ue:ka:bü
    50 9 8 24 /09 19 or,GINal
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