DE2318650A1 - Verfahren zur herstellung von deacetylcephalosporin c - Google Patents

Description

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHON WALD DR.-ING. TH. MEYER DR.FUES DIPL.-CHEM. AL EK VON KREISLER DIPL.-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH DIPL.-ING. 5ELTING

KÖLN 1, DEICHMANNHAIJS

Köln, den 12.April 3 K3 /Ax/Bt

TAKE)DA CHEMICAL INDUSTRIES, Ltd.,

27, Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka, Japan

Verfahren zur Herste]Dung von Deacetylcephalosporin C

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen / Herste]3ung von Deacety]cephalosporin C (nachstehend auch kurz a]s DCPC bezeichnet).

Die von DCPC abgeleiteten Cephalosporinverbindungen, z.B. Cephalothin und Cephaloridin, sind klinisch hochgeschätzt als Antibiotika, die gegen Infektionen mit grampositiven oder gramnegativenBakterien, insbesondere gegen Krankheiten wirksam sind, die von Bakterien, die Resistenz gegen verschiedene Antibiotika erworben haben, verursacht v/erden. Deacety]cephalosporin C ist sehr wichtig als Ausgangsmaterial für die Synthese solcher Cephalosporinverbindungen. Neue Cephalosporinderivate, z,B. J-Forrnylcephalosporinderivate wie 3-Formy] -7-phenyl acetylamido-ceph-2~ein~4-carbonsäure und 3-Pormyl •^-phenylacetyjarniöo-ceph-^-err.-^- carbonsäure leiten sich ebenfalls von DCPC ab. Ferner ist das DCPC wertvoll als Ausgangsmater·iaj in der Synthese von 3-Chloraeetoxyrnethyl -cephalosporind erivaten oder 3 "Met h oxymethyl-cephalosporin C. Mit der Ausnutzung von DCPC alt Ausgangsmaterial für die Synthese der verschiedemsten J-substituierten Cephal osporinverblndungen ist somit me>ir denn je zu rechnen.

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Bisher wurde DCPC durch enzymatische Deacetylierung von Cephalosporin C (nachstehend auoh kurz als CPC bezeichnet) hergestellt, das durch Fermentation beispielsweise'unter Verwendung von Cephalosporium acremonium CMI-49137 oder seines Mutanten 8650(ATCC-]45J3)hergestel1t wird. Die enzymatische Deacetylierung wird durch Behandlung von CPC mit einem Enzym durchgeführt, das durch einen Mikroorganismus, der beispielsweise zur Gattung Streptomyces oder Bacillus gehört, gebildet wird (beschrieben in der USA-Patentschrift 5 304 2^6). Diese Verfahren haben jedoch bei der großtechnischen Durchführung den Nachteil, daß zwei Fermentationsstufen, nämlich die Herstellung von CPC und die Deacetylierung des hierbei gebildeten CPC, notwendig sind..

Es wurde zwar berichtet, daß eine Spurenmenge von DCPC in dem bei der CPC-Fermentation erhaltenen Kulturmedium gefunden wird, jedoch ist klar zu stellen, daß das DCPC durch nicht-enzymatische Hydrolyse von CPC gebildet wird (F.M. Huber und Mitarbeiter, Applied Microbiology 1_6 (3968), 1011-1014). Um DCPC direkt in großer Menge herzustellen, ist es somit notwendig, das Problem von einer von dem bekannten Verfahren völ1 ig verschiedenen Konzeption aus anzugehen.

In v/eiteren umfassenden Untersuchungen der Anmelderin wurde nun gefunden, daß gewisse Mikroorganismen, die zur Gattung Cephalosporium gehören, DCPC im Kulturmedium in großer Menge direkt zu bilden vermögen.

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß die Herstellung von DCPC nach einem großtechnisch vorteilhaften Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus der zur Gattung Cephalosporium gehört und Deacetylcephalosporin C direkt zu bilden vermag, in einem Kulturmedium

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züchtet, bis DCPC in wesentlicher Menge angehäuft worden ist, und das angehäufte Deacety]cephalosporin C aus dem Kulturmedium isoliert.

Die Mikroorganismen, die für die Zwecke der Erfindung verwendet werden können, werden aus der Gattung Cephalosporlum ausgewählt und vermögen DCPC direkt zu bilden. Diese Mikroorganismen können von natürlichen Quellen isoliert und von den KuItursammelInstituten bezogen werden. Ferner können beliebige Mutanten, die künstlich durch mutagene Behandlungen aus CPC-bildenden Stämmen induziert werden können, verwendet werden, so lange sie die vorstehend genannte Fähigkeit erworben haben.

Zur Feststellung, ob ein Mikroorganismus DCPC zu bilden vermag, eignet sich beispielsweise die folgende Methode:

Bekanntlich hat Alcaligenes faecal is ATCC-8750 nur eine geringe Empfindlichkeit gegenüber DCPC, jedoch eine hohe Empfindlichkeit gegenüber CPC. Andererseits wird sowohl CPC als auch DCPC durch Cephalosporinase leicht zersetzt,und dann läßt sich daraus, ob ihre UV-Absorptionen bei 260m/U verschwunden sind oder nicht, leicht feststellen, ob sie zersetzt worden sind oder nicht. Der gewünschte Stamm, der DCPC zu bilden vermag, kann daher durch Auswahl beliebiger Mikroorganismen erhalten werden, die eine Substanz, die sehrschwäcbe Aktivität gegen Alcaligenes faecal is ATCC-8750 zeigt, deren UV-Absorption bei 260m/U jedoch bei Behandlung mit Cephalosporinase verschwindet, zu synthetisieren vermögen. Forner können DCPC-bildende Stämme durch Prüfung der Elektrophoregramme ihrer Kulturmedien identifiziert werden. Wenn beispielsweise eine solche Kulturprobe der Elektrophorese beispielsweise auf Filterpapier Toyo Nr. 51A (Toyc Kagalcu Sangyo Co. Ltd.) in einem Phosphatpuffer (pH 6,5;

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1/5 M) bei einem Spannungsgradienten von 45 V/cm für 1,5 Stunden unterworfen wird, ist DCPC durch die UV-Absorption nachzuweisen, d.h. CPC und DCPC ergeben unter UV-Licht getrennte Flecken. Es ist demzufolge möglich, die selektive Bildung von DCPC im Kulturmedium eines DCPC-bildenden Stammes zu identifizieren.

Als typische Beispiele von Mikroorganismen, die sich für die Zwecke der Erfindung eignen, sind Cephalosporium acremonium C-I28, Cephalosporium acremonium Nr. 1J2 und Cephalosporium sp. C-28 zu nennen. Sie bilden im wesentlichen kein CPC oder nur eine geringe Menge CPC, die aus dem Endprodukt, d.h. DCPC, ohne ein spezielles Trennverfahren entfernbar ist. Von diesen Mikroorganismen v/erden zweckmäßig Cephalosporium sp. C-28 und Cephalosporium acremonium Nr. 132 für. die Zwecke der Erfindung verwendet. Cephalosporium sp. C-28 ist beim Institute for Fermentation, .Osaka, Japan, unter der Zugangsnummer IFO-95J7 und beim Fermentation Research Institute, the Agency of Industrieal Science and Technology, Chiba, Japan unter der Zugangsnummer Ferm-P Nr. 14^0 hinterlegt. Bei der American Type Culture Collection, Maryland, USA, sind Cephalosporium sp. C-28 unter der Nummer ATCC-20570 und Cephalosporium acremonium Nr. I32 unter der Nummer ATCG-20371 hinterlegt.

Cephalosporium sp. C-28 hat die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften:

I) Eigenschaften auf Agar-Medien

1) Malzextrakt-Agar

schlechtes Wachstum, Oberfläche unregelmäßig faltig, farD-los bis hellbraun. Rückseite der- Kolonie ist farblos bin heJlbraun. Luftmycel spärlich. Lösliches Pigment wird nicht gebildet.

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2) Kartoffel-Glucose-Agar

sch3 echtes Wachstum, begrenzt und erhaben, färb]os bis hellbraun. Rückseite ist farblos bis hellbraun. Spärliches Luftmycel. Kein lösliches Pigment.

3) Hafermehl-Agar

Wachstum mäßig, diffus, farblos. Rückseite ist farblos. Luftmycel spärlich. Keine Bildung von löslichem Pigment.

4) Glucose-BouDlon-Agar

mäßiges Wachstum, diffus, farblos bis hellbraun. Rückseite ist farblos bis hellbraun. Luftmycel spärlich. Kein lösliches Pigment.

II . Mikroskopische Merkmale

Lufthyphen 1,5 bis J>,Oax breit, verzweigt und glasklar. Konidiophoren richten sich von Lufthyphen oder vegetativen Hyphen im rechten Winkel auf, J5O bis 70/U lang und 1,5 bis 2,0/U breit. Eine Masse von Konidien von 8 bis 14/u Durchmesser bildet sich an der Spitze. Die Konidien sind elliptisch, an jedem Ende etwas spitz, einzellig, glasklar, 2 bis J) Ai mal 8 bis 13/U.

Auf Malzextrakt-Agar, Kartoffel-Glucose-Agar und Hafermehl Agar ist nur reduzierte Konidienbildung festzustellen. Auf Glucose-Bouillon-Agar ist die Entwicklung von Konidien reichlich.

Die Mutanten, die für die Zwecke der Erfindung geeignet sind, können beispielsweise von Cephalosporium polyaleurum Y-5O5 (ATCC-2O3i6O; Ferm.Pr-Nr.3l6O) oder Cephal osporiurn sp. ATCC-]4553, die beide CPC-bilderide Stämme sind, erhalten werden. Zur Gewinnung des gewünschten Mutanten können beliebige physikalische oder chemische Behänd!ungen, die für

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die kUristJiche Mutation von Mikroorganismen üblich sind, z.B. UV-Bestrahlung oder Behandlung mit geeigneten Chemikalien wie Natriumnitrit oder N-Methyl -N'-nitro-N-nitrosoguanidin, angewandt werden.

Von Cephalosporin acremonium ATCC-I4$53 abgeleitetes Cephalosporium acremonium Nr. 132 hat die gleichen mikrobiologischen Merkmale wie Cephalosporium acremonium ATCC-34553-■ :

Der Mikroorganismus kann auf einem festen oder einem flüssigen Medium gezüchtet werden. Für die Großherstellung ist die Verwendung eines flüssigen Mediums zu empfehlen. Bei Verwendung des flüssigen Mediums kann die Kultivierung unter aeroben Bedingungen unter Schütteln oder Rühren durchgeführt werden.

Das erfindungsgemäß verwendete Nährmedium enthält Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff, Quellen von verwertbarem Stickstoff, anorganische Salze und Stimulationsfaktoren. Für die Zwecke der Erfindung eignen sich beliebige Kohlenstoff quell en, z.B. Glucose, Saccharose, Stärke, lösliche Stärke, Endmelasse, η-Paraffine, Essigsäure, Äthanol, Glycerin und Sorbit.

Als Stickstoffquell en eignen sich für die Zwecke der Erfindung beispielsweise Naturprodukte oder ihre verarbeiteten Materialien (z.B. Pepton, Fleischextrakt, Kasein, Maisquellwasser, entfettetes Sojabohrienmehl. Trockenhefe, Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Baumwol 1 saatmehl, Reiskleie und Weizenkleie), Ammoniumsalze von organischen Säuren (z.B. Ammoniumsuccinat, Ammoniumtartrat und Ammoniumacetat), anorganische Stickstoffverbindungen (z.B. Armnoniumchlprid, Ammoniumsulfat und Ammoniumphosphat) und organische Stickstoffverbindungen (z.B. Harnstoff).

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Als anorganische S-J ze können für die Zwecke der Erfindung beispie]sweise Meta]1 sal ze wie Sulphate, Nitrate, Chloride, Carbonate und Phosphate von Kalium, Magnesium und Calcium verwendet werden.

Als " Stimulationsfaktoren eignen sich für die Zwecke der Erfindung beispielsweise Methionin, Cystein, Cystin, Thiosulfat, Methyl öl eat und Specköl. Von diesen Faktoren fördert Methionin hervorragend das Bildungsvermögen für DCPC.

Die Methioninmenge im Nährmedium beträgt vorzugsweise 0,05 bis J>,0%, insbesondere 0,1 bis 2,0 % (Gew./Vo].). Das Methionin ist sowohl in der D-Porm als auch in der L-Form für die Produktion von DCPC wirksam.

Die Kultivierungsbedingungen, z.B. die Temperatur, der pH-Wert des Mediums und die Kultivierungsdauer, werden in geeigneter Weise so gewählt, daß der verwendete Mikroorganismus DCPC maximal anhäufen kann. Beispielsweise wird die Kultivierung vorteilhaft bei einer Temperatur von 15° bis 45°C, vorzugsweise l8° bis 38⁰C, und bei einem pH-Wert von 2 bis 10, vorzugsweise von 4 bis 9> für eine Zeit von 10 bis 560 Stunden, vorzugsweise 96 bis 240 Stunden durchgeführt.

Die Abtrennung von DCPC vom Kulturmedium erfolgt zweckmäßig nach üblichen Methoden, z.B. durch Filtration des Kulturmediums, Waschen der Zellen mit Wasser und Isolierung von DCPC vom Gemisch des Filtrats mit der Waschflüssigkeit. Zur Reinigung des angehäuften DCPC von der das DCPC enthaltenden Flüssigkeit können beliebige bekannte Methoden angewandt werden. Geeignet sind beispielsweise die Chromatographie an Harzen oder Aktivkohle und die Gelfiltration.

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Beispielsweise wird Penicil]inase zum Fi] trat gegeben, urn das Cepha]osporin N zu zersetzen. Das Fi] trat wird auf eine Säu]e eines schwach-basischen Ionenaustauscherharzes aufgegeben, an dem DCPC adsorbiert wird. Das adsorbierte DCPC wird mit einem geeigneten Lösungsmitte], z.B. einer Ammoniumacetatpufferlösung, eluiert, und die das DCPC enthäutende Fraktion wird aufgefangen. Die DCPC-Fraktion w.ird unter vermindertem Druck eingeengt und zur Adsorption des DCPC auf eine Aktivkoh]ensäu3e aufgegeben. Nach einer Wäsche mit Wasser wird DCPC mit einem geeigneten Lösungsmitte], z.B. einem Gemisch von Aceton und Wasser im Volumenverhältnis von ]:], eluiert. Die DCPC-entha]tende Fraktion wird aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt, worauf Aceton im Überschuß zugesetzt wird. Auf diese Weise wird ein rohes Pulver von DCPC erhalten.

Gegebenenfalls können einige Stufen dieses Verfahrens wiederholt werden. Abschließend wird NaOH-Lösung der Fraktion zur Neutralisation zugesetzt. Dann wird Äthanol zugegeben, wodurch das Natriumsalz von DCPC in Kristall form abgetrennt werden kann.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. Hierin verstehen sich die Teile als Gewichtsteile, falls nicht anders angegeben. Gewichtsteile verhalten sich zu Raumteilen wie Gramm zu ml. Die Prozentsätze beziehen sich auf Gewicht/Volumen ( g/]00 ml), falls nicht anders angegeben.

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Beispie] 3

In einen Fermenter mit einem Fassungsvermögen von 2000 Räumte!] en werden 500 Raumtei3e eines Impfkulturmediums gegossen, das 3,0$ Saccharose, 1,5$ F]eischextrakt, 0,5$ Maisque]]wasser und 0,3 5$ CaCO-, enthä]t. Nach der Sterilisation wird das Medium mit Cepha]osporium sp. C-28 (ATCC-20570) geimpft. Das geimpfte Medium wird 72 Stunden 'bei 28⁰C unter Schütte]η bebrütet.

In einen Fermentationstank mit einem Fassungsvermögen von 50 000 Raumtei3en werden JO 000 eines Fermentationsmediums gegossen, das 3,0$ Saccharose, 3,2$ rohes Sojabohnenmehl, ' 0,5$ DL-Methionin und 0,3 5$ CaCO-, enthä3t. Das Medium wird dann steri3isiert und geküh3t. Es wird aseptisch mit der oben genannten Impfku3tür geimpft und bei 28⁰C unter Rühren und Belüften (3 00$ V/V Luft pro Minute; 200 UpM) bebrütet. Nach 332 Stunden wird das Ku3turmedium fi3triert. Hierbei werden 26 000 Raumtei3e Fi3trat erhalten. Der Geha3t an CPC und DCPC im Filtrat wird nach dem fo3genden Prinzip und nach der fo3genden Methode bestimmt:

Wenn CPC und.DCPC der E3ektrophorese unter den oben beschriebenen Bedingungen unterworfen werden, wandern sie etwa 3 5 cm bzw. 3 7 cm zur Anode. Nach der E]ektrophorese werden die CPC- und DCPC-Zonen des Fi3terpapiers ausgeschnitten und getrennt mit Wasser extrahiert. Die Extrakte werden dann auf Extinktionen bei 260 rn/u untersucht. Aus den hierbei ermittelten Extinktionen wird festgeste3 3t, daß das Fi]trat 1900 /ug DCPC/ml und keine Spur von CPC enthält.

Zu 26 000 Raumteilen des vorstehend genannten Filtrats wird Penici]]inase (Herste!ler Schwarz/Mann Biochemicals) gegeben, um Cephalosporin N vollständig zu zersetzen. Unmitte3 bar anseh.3 ießend wird das Fi3trat auf eine Säu3e des Ionenaustauscherharzes "Amber3ite IRA-9OO" (Acetatform, Rohm & Haas Co.) aufgegeben, an der das DCPC adsorbiert wird. 309844/1053

- ίο -■

Das adsorbierte DCPC wird mit Ammoniumacetatpuffer (pH 5,0; 0,2 mo]ar) eluiert. Die das DCPC enthaltende Fraktion wird aufgefangen. Sie wird unter vermindertem Druck auf IJ 000 Raumtei3e eingeengt. Das Konzentrat wird mit einer ■Raumströmungsgeschwindigkeit von 1,0/Stunde durch eine Säule geleitet, die mit ]800 Raumteilen chromatographischer Kohle gefüllt ist.(hergestellt durch Verkohlung von Sägemehl und anschließende Aktivierung mit Wasserdampf; Korngröße etwa 0,42 mm, Oberfläche l460 m²/g). Die Säule wird mit Wasser gewaschen, worauf das adsorbierte DCPC mit 9000 Raumteilen 50$igem wässrigem Aceton eluiert wird. Die DCPC-Praktionen werden zusammengegossen und unter vermindertem Druck eingeengt, worauf Aceton im Überschuß zugesetzt wird. Hierbei wird rohes pulverförmiges DCPC erhalten. Das rohe Pulver wird in Wasser gelöst, am Ionenaustauscherharz Dowex 1x2 (Acetatform, Dow Chemical Co.) adsorbiert und mit 1000 Raumteilen des oben genannten Ammoniumacetatpuffers eluiert. Das Eluat wird in der gleichen Weise wie bei der vorstehend beschriebenen Behandlung durch eine Säule geleitet.

Die DCPC-Fraktionen werden zusammengegossen und unter vermindertem Druck eingeengt. Nach Neutralisation des Konzentrats mit NaOH-Lösung v/ird Äthanol in einer solchen Menge zugesetzt, daß die Konzentration 70 Vol.-% beträgt, wobei das Natriumsalz von DCPC in Kristallform ausgefällt wird. Die Kristal Je werden abfiltriert und getrocknet, wobei 13,0 g Kristalle von DCPC erhalten werden. Das kristalline Produkt wird weiter umkristallisiert und das umkristallisierte Produkt mit einer DCPC-Probe verglichen, die durch enzymatische Umwandlung von CPC erhalten worden ist.

Die erfindungsgemäß hergestellten Kristalle stimmen im antibakteriellen Spektrum, Papierchromatogramm, DünnschichtchromatograiT;m, UV-Spektrum, Infrarotspektrum, kernmagnetischen Resonanzspektrum usw. mit der authentischen Probe

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vö33ig überein. Die E3ementaranaJyse des Produkts (C 36,9, H 5,6, M 9,3, S 7,0) ist ebenfa3 3s in guter Übereinstimmung mit den Vierten., die in Bioehem. J. 83_, 593, 1963 (J. D'A. Jeffery und Mitarbeiter) beschrieben sind.

Beispie3 2

In einen Fermenter mit einem Fassungsvermögen von 200 Raumtei3en werden 30 Raumtei3e eines Impfku3turmediums gegossen, das 3,0$ Saccharose, 3,5$ F3eischextrakt, 0,5$ Maisque31-wasser und 0.3 5$ CaCO, enthä3t und nach der Steri3isation mit ■Cepha3osporium acremonium Nr.332i(ATCC-2O373 ),das von Cephalosporium acremonium ATCC-14553 durch Be,strah3ung mit UV-Licht erhalten worden ist,geimpft wird.Der geimpfte Fermenter wird 72 Stunden bei 28⁰C unter Rühren bebrütet.

In einen Fermenter mit einem Fassungsvermögen von 200 Raumtei3en werden 20 Raumtei3e eines Fermentationsmedium gegossen, das 3,0$ Saccharose, 3,2$ rohes So jabohnenmeb.3, 0,5$ DL-Methionin und 0,3 5$ CaCO., enthält. Das Medium wird dann in üblicher Weise steri3isiert und geküh3t. Die oben genannte Impfkultur wird aseptisch in den Fermenter überführt, worauf die Ku3tivierung 3 44 Stunden bei 28⁰C vorgenommen X'rird. Das Ku3turmedium wird fi3triert und das Fi3trat nach der in Beispie3 1 beschriebenen Methode untersucht. Hierbei wird festgeste331, daß das Fi3trat 3 300/Ug DCPC/m3 und keine Spur von CPC enthä3t.

Die Ku3tivierung wird mit Cepha3osphorium sp. C-28 (ATCC-20370) und Cepha3osporiurn acremonium Nr. 332 (ATCC-20371) In der g3eichen Weise, wie in Beispie3 2 beschrieben, durchgeführt, wobei jedoch die Methioninmenge verändert wird. Die erha3tenen Ku3turmedien werden fi3triert und die Fi3-trate der in Beispie3 1 beschriebenen Bestimmung unterworfen. Die Beziehung zwischen der verwendeten Methioninmenge und der gebildeten Menge an Deacety3cepha3osporin C ergibt

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sich aus den Werten in der folgenden Tabelle. Wie diese Werte zeigen, steigert DL-Methionin die Produktion von DCPC erheblich.

DL-Methionin Cephalosporium Cephalosporium

im Kultur- sp. C-28 acremonium

medium, g/l 00 ml Nr. 132

0 unter 100/Ug/ml unter 100/Ug/ml

0,05 450/Ug/ml 250/Ug/ml

0,1 1100/Ug/ml 600,ug/ml

0,2 1550/Ug/ml 1000/Ug/ml

0,5 l800/Ug/ml 1250/Ug/ml

1,0 l'450/ug/ml 850/Ug/ml

2,0 . 1000 /Ug/ml 700/Ug/ml

3,0 700/Ug/ml 45OyUg/ml

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Claims (6)

1. Patentansprüche

   f\ Verfahren zur Herstellung von Deacety]cepha]osporin C, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus, der zur-Gattung Cepha]osporium gehört und Deacety]cephalosporin C zu bilden vermag, in einem Nährmedium züchtet, bis das Deacety]cepha]osporin C in erheblicher Menge angehäuft worden ist, und das Deacety]cepha]osporin C aus dem Kulturmedium isoliert.
2. 2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mutant, der Deacety]cephalosporin C bildet und von Cephalosporin C bildenden Stämmen abgeleitet ist, als Mikroorganismus verwendet wird.
3. 3) Verfahren nach Anspruch I₃ dadurch gekennzeichnet, daß Cepha]osporium acremonium C-128 verwendet wird.
4. 4) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Cepha]osporium sp. C-28 (ATCC-2Q37O) verwendet wird.
5. 5) Verfahren nach Anspruch ], dadurch gekennzeichnet, daß Cepha] osporium acremonium Nr. 132 (ATCC .20371) verwendet wird.
6. 6) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß ein Nährmedium verwendet wird, das 0,05 bis 3,0 g Methionin pro 100 ml enthält.

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