DE2351443A1 - Verfahren zur herstellung von glucoseisomerase und zur verwendung derselben zwecks umwandlung von glucose in fructose - Google Patents

Description

- A 1399 -

Anheuser-Busch, Inc, St, Louis, Missouri, V,St.A.

Verfahren zur Herstellung von Glucose-isomerase und zur Verwendung derselben zwecks Umwandlung von Glucose in Fructose

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Glucose-isomerase unter Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Aotinoplanes sowie die umwandlung von Glucose in Fructose unter Verwendung dieser Iso-? nierase.

Fructose wird allgemein als wesentliph süßer eingeschätzt als Glucose* Aber Glucose ist schnell zugänglich aus billigen Quellen, Ein praktisches und wirtschaftliches Verfahren zur Umwandlung von Glucose in Fructose ist daher wünschenswert. Die Alkali-lsomerisierung von Glucose zu Fructose gibt entweder niedrige Ausbeuten pder neigt zur Erzeugung unerwünschter Webenprodukte in Ausbeuten van mehr als 3o %. Eine Alternative zur Verwendung von Alkali ist der Einsatz von Enzymen, um diese Umwandlung zu bewirken; erhebliche Anstrengungen wurden gemacht, um dies in wirtschaftlicher und wirksamer Weise zu erreichen.

Es gibt mehrere Enzyme, welche D-Glucose in D-Fructose überführen, was eine oder mehrere chemische Zwischenstufen (z.B, D-Glucose-ß-phosphat) einschließt, diese scheinen jedoch zur Zeit ohne praktischen Wert zu sein.

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_₂_ 235U43

Mehr versprechen Enzyme, üielche D-QlucDse in D-Fructose direkt umwandeln. Eine Anzahl dieser Enzyme ist aus Mikroorganismen der Gattung Lactobacillus, Pseudomonas, Pasteurellla, Leuconostoc, Streptomyces und Aerobacter hergestellt worden (siehe Zusammenfassung von Yamaka in Biochem. Biophys. Acta 154. 67o - 68o (196B) ). Damit eine bedeutende Menge Glucose-isomerase durch einen der obigen Mikroorganismen gebildet wird, muß zur Induzierung deB Enzyms im Züchtungsmedium Xylose oder Xylan zugegen sein. Reine Xylose ist relativ teuer; wenn Xylan im Züchtungsmedium verwendet wird, muß der Mikroorganismus auch Enzyme produzieren, die das Xylan hydrolysieren können.

Um die Ausgaben für eine_: Züchtung des Mikroorganismus in einem Xylose oder Xylan enthaltenden Medium zu umgehen, sind Anstengungen unternommen morden, um ein Bakterium zu erhalten, das das Enzym grundsätzlich produziert. Lee, Hayes und Long (US-PS 3 645 848) haben berichtet, daß bestimmte Mikroorganismenstämme, die zur Gattung Arthrobacter gehören, zur Erzeugung von Enzymen befähigt sind, welche direkt Glucose oder Xylose in die entsprechende Ketose überführen, uienn sie in einem Medium gezüchtet werden, in welchem Xylose oder Xylan fehlt. Unglücklicherweise werden verhältnismäßig kleine Mengen Isomerase produziert und das Züchtungsmedium erfordert verhältnismäßig teure Stickstoffquellen, wie Hefeextrakt und Fleischprotein· "

Demzufolge ist eines der Hauptziele der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Auswahl und Züchtung von Mikroorganismen zu vermitteln, welche Enzyme zur Umwandlung von Aldosen in Ketosen besitzen. Ein spezielleres Anliegen dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Isomerisierung von Aldosen, wie Glucose und Xylose, zu den entsprechenden Ketosen unter Verwendung von Enzymen, die von Bakterienzellen produziert werden.

Es wurde gefunden, daß Mikroorganismen der Gattung Actinoplanes, von Erzeugung von Glucose-isomerase fähig sind, wenn sie in einem Medium bei vollständiger Abwesenheit von Xylose oder Xylan gezüchtet werden. Zudem können verhältnismäßig große Mengen an Glucose-isomerase durch Actinoplanes in einem Medium produziert werden, das aus Maisquellflüssigkeit, Salzen und Leitungswasser besteht.

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Das Enzym zeigt einen .hohen Grad an Temperaturstabilität, da Temperaturen bis; zu. Bq, -85- °C. bei der Isomerisierung angewendet-werden können ahne bedeutenden- Aktivitätsverlust. Es können entuieder ganze Zellen oder zellfreie Extrakte zur Durchführung der Isomerisierung verwendet werden.

Zuchtkulturen werden im allgemeinen in einem Medium kultiviert, welches Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff (gewöhnlich Maisquellflüssigkeit) und anorganische Salze enthält· Die Impfkultur kann hergestellt werden, indem man'die Organismen in diesem Medium auf einer Drehschüttelmaschine bei etwa 25 - 3o ^DC in Gegenwart wan Luft 1 - Z Tage züchtet. Dig Impfkultur, die 3 bis 1o % des Endvalumens des Fermentars ausmacht, wird in das sterile, in einem geeigneten Fermentor- enthaltene Medium überführt. Das beimpfte Medium wird, unter Bewegung bei 16 bis ko ⁰C, vorzugsweise 25 - 3o °C_t inkubiert, während ein Luftstram von einem Vialumen pro Minute 1 bis 7 Tage aufrechterhalten wird. Der Luftstrom kann von o,3 bis. 1',5 "Volumina pro Minute reichen. Für maximale Enzymausbeuten sollte das pH der Fermentation zwischen 6,α und 8,5, vorzugsweise, zwischen 6,4 und 7,5, gehalten werden. Eine maximale Isomeraseaktivität wird unter diesen Bedingungen in 3 bis 5 Tagen erreicht. Die ganzen Zellen werden dann gewonnen und als solche verwendet oder das Enzym kann alternativ aus den Zellen unter Anwendung bekann ter Techniken extrahiert werden.

Akävitätsspiegel von annähernd 3d Einheiten pro Milliliter Hulturbrühe sind in 3 Tagen erreicht worden. Eine Aktivitätseinheit ist definiert als jene Enzymmenge, welche 1 Mikrömol Fructose aus Glucose in 1 Minute bei 75 ^DC^in 1,5 M Glucose, ο,o3rM Phosphat-Puffer pH 7,o, o,oo3 M Magnesiumsulfat und D,ooo3 M Hobaltsulfat produziert.

Die bei der praktischen Durchführung dieser Erfindung erhältlichen Isomeraseaktivitätsspiegel variieren je nach dem speziell verwendeten 9amm und Züchtungsmedium. Aktivitätsspiegel von 5d Einheiten.pro ml Kulturbrühe sind im Falle von Actinoplanes missouriensis WRRL B-3342, kultiviert in Maisquellflüssigkeit, beobachtet worden. ^;. .

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Die folgenden Beispiele erläutern die praktische Durchführung dieser Erfindung; selbstverständlich soll die Erfindung nicht durch diese beschränkt werden:

Es ist speziell erwünscht und beabsichtigt, Subkulturen, natürliche Mutanten, Varianten und ähnliche, wie auch Mutanten einzubeziehen, welche künstlich aus den vareruiähnten Organismen mittels Bestrahlung mit Röntgenarahlen oder ultraviolettem Licht, Behandlung mit Chemikalien und ähnlichen produziert werden.

Beispiel I

Dieses Beispiel erläutert die Herstellung Maines Glucose-isomerisierenden Enzyms aus einer Reihe von Actinoplanes-Arten,, nämlich Actinoplanes missouriensis NRRL Β-3342; Actinoplanes philippinensis ATCC 12 427, Actinoplanes armeniacus ATCC 15 676 und Actinoplanes sp. ATCC 23 3*t2.

Diese Mikroorganismen werden getrennt in Zuchtkulturen auf Schrägen aufbewahrt, welche aus 1,7 % Tryptone, o,3 % Soytone, α,25 % Glucose und 2,ο % Agar zusammengesetzt sind, Die Impfkultur wird hergestellt durch Überführen der Mikroorganismen van der Zuchtkultur in ein Testrahr, das 8 ml sterilisiertes Medium, bestehend aus 1,7 % Tryptone, o,3 % Soytone, o,25 % ViJAPU, und o,25 % Glucose, enthält. Die Impfkultur wird in diesem Testrohr bei 28 C 2 - 3 Tage unter Schütteln kultiviert. Diese Impfkultur wird dann einem der folgenden Züchtungsmedien eingeimpft, um ein ßlucose-ieameriaierendes Enzym herzustellen.

Tryptone Saytone

Medium I	7 %
	3 96
ο,	25
Oi

D-Xylose 1,o

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aufgefüllt auf Volumen mit Leitungwasser.

Das pH des Hulturmediums wurde auf etwa 7, ο eingestellt. Zucker und andere Nährstoffe wurden getrennt sterilisiert und dann zugemischt.

Medium II

Das Medium uird uiie Medium Nr. I hergestellt, jedoch wurde anstelle der gesamten D-Xylose, o,25% D-Glucose eingesetzt.

. Medium	III	3	%
Maisquellflüssigkeit		α	,1 mM
CoSO^		O	,o5 mM
CuSD,

Die Herstellung des Züchtungsmediums aus Maisquellflüssigkeit ist in Beispiel II dargelegt, welches nachfolgend gegeben ist.

Das pH der Kultur uiar in allen Fällen o,7.

Andere geeignete Medien enthalten lösliche Schlempe (distiller's solubles), Pepton-Hefeextrakt, Caseinhydrolysat, Sojabohnenhydrolysat'und Fischproteinhydrolysat. Selbstverständlich können Gemische der oben beschriebenen Medien verwendet werden. .

Die Züchtung wurde mit Zugabe von 5 ml der entsprechenden Impfkultur zu 75 ml Tryptone-Soytone-Medium oder zu 95 ml Maisquellflüssigkeit»Medium in einem 25o ml-Etlenmeyer-Halben begonnen. Die Zellen wurden 9S Stunden bei 28 ⁰C unter Schütteln auf einem G-25 I\Iew Brunswick Scientific Gyrotary shaker bei 28n Upm fikubiert.

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"" O —

Die.Zellen wurden gesammelt durch Zentrifugieren von 3o ml Kultur bei 15 DOD Upm für 1o Minuten. Die Zellen wurden einmal mit Leitungswasser gewaschen und in 14 ml o,12 M Phosphatpuffer (pH 7,o) suspendiert. Die Zellsuspension wurde dann bei 4 C 4 Minuten im Branson Sonifier J-17A sonifiziert und dann bei 15 ooo Upm 15 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde als Rohquelle für das Glucose-aisomerisierende Enzym verwendet. Die Aktivität der Glucose-isomerase uurde wie folgt bestimmt: zu 3,o ml 2,ο M Glucose-, α,αο4 M MgSD,- und o,ooo4 M Co93,-Lösung uurde eine Rohenzymlösung mit o,12 M Phosphatpuffer pH 7,ο bis zu einem Endvolumen von 4,o ml gegeben. Die Reaktion wurde bei 75 ^DC durchgeführt. Aliquote Teile wurden nach 1o, 15, Zq und 25 Minuten entnommen und mit α,ο2 Μ HCL verdünnt.

Der Fructosegehalt der Proben wurde in einem automatischen Analysator unter Benutzung der Skatol-HCl-Methode, bestimmt, die von Pogell beschrieben wurde CJ. Biol. Chem. 2I₁I : 143 (1954) ). Die Farbentwicklung wurde bei 52 ⁰C anstatt bei 37 ^DC durchgeführt. Die Aktivität des Glucose-isomerisierenden Enzyms wurde aus der Steigung berechnet und in Einheiten (U) ausge-, drückt. Eine Aktivitätseinheit ist definiert als jene Enzymmenge, welche 1 Mikromol Fructose aus der Glucose in 1 Minute bei 75 °C unter den im vorherigen Absatz genannten Bedingungen erzeugt.

Die Herstellung des Glucose-isomerisierenden Enzyms durch verschiedene Arten von Actinoplanes-Mikrooroanismen nach Züchtung im Tryptone-Soytone-Medium oder in Maisquellflüssigkeit ist in Tabelle I wiedergegeben. Alle diese Mikroorganismen vermögen Glucose-isomerisierendes Enzym in Gegenwart oder Abwesenheit von D-Xylose in dem Züchtungsmedium zu produzieren. Die anwesenheit von D-Xylose erhöht jedoch die Erzeugung dieses Enzyms tedeutend.

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■ ■ 235H43

Tabelle I

Herstellung von Glucose-isomerase durch mehrere Arten von .·■■-■ Actinoplanes

Spezifische Aktivität tJ/mg Protein

Mikroorganismus Züchtungsmedien

Medium Nr.1 Medium Nr.2 Medium Nr.3

Actinoplanes

missouriensis

NRRL B-33^2 ■ 15,2 2o,6 17,8

Actinoplanes ' -

philippinensis

ATCC 12 if27 * o,87 2,ο , ο,29

Actinoplanes

armeniacus .

ATCC 15 676 o,1o o,82 a,2if

Actinoplanes

ATCC 23 3*t2 o,ifB 1,7o o,*t1

Maisquellflüssigkeit kann als Züchtungsmedium verwendet werden, um, das Glucose-isomerisierende Enzym in Abwesenheit von D-Xylose zu produzieren. Die stärkste Produktion an Glucose-isomerisierender Aktivität.wurde bei der Art Actinoplanes missouriensis IMRRL B-33it2 beobachtet. Alle folgenden Beispiele wurden unter Einsatz dieses speziellen Mikroorganismus durchgeführt.

Beispiel ' II Das Verfahren zur. Herstellung der Maisquellflüssigkeit hat eine bedeutende

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Wirkung auf die Produktion des Enzyms mit Actinoplanes missouriensis . Es wurden verschiedene Methoden zur Neutralisierung der Maisquellflüssigkeit untersucht. Wach Neutralisierung auf pH 7,ο mit Alkali wurde die Maisquellflüssigkeit filtriert, um den Schlamm zu entfernen, der größtenteils aus Phytaten bestand, und zur Züchtung nach dem Verfahren von Beispiel I unter Zugabe von Kobaltsulfat und HupferClDsulfat in entsprechenden Konzentrationen von o,1 mM und o,o5 mM verwendet.

Die Verwendung von Natriumhydroxid in Vergleich zu gelöschtem Kalk oder Ammoniumhydroxid ergibt die beste Enzymproduktinn, uie in Tabelle II angegeben ist. Kaliumhydroxid ist ebenfalls ein brauchbares Alkali.

Tabelle II

Effekt der Neutralisierungsmittel für Maisquellflüssigkeit für die Erzeugung von Glucose-Kisomerase

Neutralisierungsmittel Enzyrngroduktian U/ml Kulturbrühe

gelöschter Kalk 17,2

NH^OH 23,3

NaDH 27,8

Die Entfernung des Schlamms nach Neutralisation ist wesentlich, tuie man anhand der Ergebnisse in Tabelle III ersieht. Maisquellflüssigkeit wurde auf ein pH von 7,ο neutralisiert und in einem 1-Liter-Erlenmeyerkolben auf 5do ml aufgefüllt, was 3 % Feststoffen äquivalent war, Die Berechnung der Prozent Feststoffe basiert auf den ursprünglichen Feststoffen, wie sie vom Hersteller beschrieben sind. Feststoffe, die durch Filtration entfernt werden können, sind bei Berechnung des Endfeststoffgahältes nicht in Rechnung gezogen worden. Kobalt- und Kupfersalze wurden wie oben zugegeben. Die Zellen wurden bei Umgebungstemperaturen 4 Tage auf einem New Brunswick B-5o Shaker bei 28d Upm gezüchtet.

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Tabelle III

Effekt der Schlammentfernung aus Maisquellflüssigkeit für die Produktion von Glucose-isomerase aus Actinoplanes missouriensis

Züchtungsmedium · Enzymproduktion (U/ml Hulturbrühe)

Schlamm nicht.entfernt 2,5 "

Schlamm entfernt 23,2

Beispiel III

Die Menge der durch den Mikroorganismus erzeugten Glucose-isomerase wird beeinflußt durch die organische Stickstoffquelle, die im Medium vorliegt, wie man aus der Tabelle IM ersehen kann. Die Werte in Tabelle IM wurden ■ bei Züchten des Mikroorganismus in 1oo ml Brühe in einem 25o ml-Erlenmeyerkolben für 3 Tage auf dem G-25 New Brunswick Shaker bei 28 ⁰C und 28a Upm erhalten. Die Konzentration an organischen Stickstoff-Feststoffen wurde auf 2 % eingestellt, dann wurde neutralisiert und filtriert und mit 25o mg Glucose, 22 mg HLHPO, und 11 mg MgSO, .7H„0 versetzt und mit Leitungswasser auf Volumen aufgefüllt. Das Medium wurde 15 Minuten bei 121 ^DC sterilisiert. Die Zellen wurden gewonnen, sonifiziert und die Aktivität des Enzyms gemessen. Die Ergebnisse sind ausgedrückt in Aktivitätseinheiten pro Milliliter Hulturbrühe. .

Maisquellflüssigkeit zeigte die größte Aktivität und ist die bevorzugte organische Stickstoffquelle.

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- 1ο Tabelle IU

Effekt der organischen Stickstoffquelle für die Produktion van Glucoseisomerase

Organische Stickstoffguelle

Herkunft

Aktivität
U/ml Kultur

Maisquellflüssigkeit O.M.-PeptDn

Anheuser-Busch 17,8 Amber Lab. 13,4 '

1oo 75

Caseinhydrolysat (Amber EHC)	Amber Lab.	13,o	5,8	73
Bacto Saytone	Difco Lab.	11,8	5,2	66
Hefeextrakt (BYF-I00)	Amber Lab.	1o,3	Μ'	58
Schlempelösliches (getrocknet)	National Distiller's Products 7,9	2,5	kk
Hefeextrakt (BYF-300)	Amber Lab.	1,1	33
Bactopeptone	Difco Lab.		29
Hefeextrakt (BYF 5o X)	Amber Lab.	24
Malzextrakt	Difco Lab.	14
Atlantisches Menhaden- pepton	Haynie products	6
	Beispiel IV/

Die optimale Konzentration an van neutralisiertem Schlamm (als Feststoffe) entfernter Maisquellflüssigkeit zur Herstellung von Enzym luurde zu 3 % gefunden, Die in Tabelle M gezeigt wird. Die Konzentration kann von o,5 % bis etwa 7 % Geui.-% des Mediums variieren. Die Züchtungsbedingungen uaren uiie in Beispiel III angegeben, mit der Ausnahme, daß das Züchtungsmedium nicht GIu-

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? 3-5H43

case enthiElt und mit 2,5 mg CoSD,»7H„0 ergänzt wurde. Die ΖεΙΙεπ wurden k TagE gezüchtetj gewonnen und nach dEr Prozedur von Beispiel I analysiert.

Tabelle υ

Effekt der Konzentration von MaisquellflüssigkBit für die Enzymproduktion

% Maisguellflüssigkeit Enz^rmgroduktian U/ml Kultur

o,5 ' 9,6 ■

1,0 ' 22,3

2,ο 23,6

3,0 . 29, if :

4,ο 23,4

5,ο 23,4

6,ο 2g_?8

Beispiel

Die lilirkung verschiedener KohlEnhydratquEllen auf die Erzeugung von Glucoseisomerase aus Actinoplanes misspuriensis wurde untsrsucht« Ein mäßig stimulierEndEr Effekt uurde im Falle der Fructose beobachtet. Etuia o,1 bis Geiü.-% Fructose dss Mediums ist ύβτ bevorzugtE Bereich, ωεππ Fructose zugegeben uiird. Die Werte in Tabelle UI wurden erhalten bei Zugabe von o,25 % u/v KohlEnhydrat zum Züchtungsmedium, das 3 % Maisquellflüssigksit und andere Nährstoffe Enthielt, unter den Bedingungen wie in Beispiel

TabellE UI

^d^-^e Enzj^mgroduktion

Enzymaktivität U/ml Kultur

kein . 28,ο

D-Fructnse . 35,2

D-Xylose ' 3o ο

D-Galactose 409817/1 D42, _ 3^5

Wie aus Tabelle UI ersehen werden kann, ist D-Xylose nicht für die Herstellung von Glucose-isomerase notwendig und ihr geringer stimulierender Effekt würde wahrscheinlich nicht ihre technische Verwendung rechtfertigen.

Beispiel UI

Der Zusatz verschiedener Metallionen zu den Züchtungsmedien von Actinoplanes missouriensis beeinflußt die Produktion von Glucose-isomerase, wie gefunden wurde. Zellen wurden nach der Prozedur in Beispiel IU in 3 % Maisquellflüssigkeit gezüchtet, mit der Ausnahme, daß zusätzliche Salze nur zugegeben wurden, wo es in Tabelle Uli angegeben ist.

Tabelle Uli

Wirkung von Metallionen auf die Produktion von Glucose-isomerase aus Actinoplanes missouriehsis

Zusatz Enzv_mp_raduktion U/ml Hulturbrühe

kein 22,a

Co¹⁺(O,1 mM) 27,3

Co⁺⁺(o,1 mM) Mg⁺⁺(o,if5 mM) 27,ο

Co⁺⁺(o,1 mM) Cu⁺⁺(o,o5 mM) 3o,o

Etwa o,o5 mM bis etwa o,5 mM Kobaltionen und etwa o,o1 mM bis etwa o,1 mM Hupferionen können zugegeben werden.

Beispiel Uli

Es wurde gefunden, daß die Herstellung von Glucose-isomerase durch das Anfangs-pH des Züchtungsmsdiums beeinflußt wird. Das optimale Anfangs-pH wurde mit 7,ο gefunden, wie in Tabelle Ulli gezeigt ist. Das Züchtungsmedium wurde zubereitet durch Neutralisierung der Maisquellflüssigkeit mit IMaDH, Filtrieren und nachfolgendes Einstellen auf das gewünschte pH und nach den Bedin-

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gungen in Beispiel IV verwendet.

Tabelle VIII

Effekt das Anfangs-pH das Züchtungsmediums auf die Züchtung und Enzymproduktion -

Anfangs-pH	EnzymprDduktion U/ml Kultur	Züchtung ml lösliches	Protein/ml Kultur
8,5			α,2α
8,α	2,k		o,17
7,5	18,3		1,1if
7,o	27,8		1,8d
6,5	18,7		1,35
6,o	11,0		o,95
5,5	-		ksine Züchtung
5,D			keine Züchtung

Die Proteinbestimmungen uurden nach der Methode von Louery (JLBiol. Chem. 193, 265 (1o951) an Enzymextrakten vorgenommen.

BeispiBl VIII ' .

Es lüurde gefunden, daß Actinoplanes missouriensis über einen breiten Temperaturbereich züchthar ist und die Glucose-isomerase-Aktivität erzeugt. DiE optimale ZüchtungstBmperatur wurde, wie in Tabelle IX gezeigt ist, zu 28 °C gefunden. Die Werte für Tabelle IX uiurden erhalten, indem der Mikroorganismus 2 - k Tage bei 16 ° «-■ k5 ⁰C in dem in Beispiel I beschriebenen Maisquellflüssigkeitsmedium gezüchtet wurde.

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Tabelle IX

Effekt der Züchtungstemperatur auf die Enzymproduktian

Züchtungstemperatur Züchtungsdauer Enzymproduktion Züchtung mg lösliches

16 if 5,2 o,92

2α it 18,if 1,68

2if it 2if,if 2,oif

28 if 29,it 2,ito

32 if 21,if 1_r83

36 2 16,o 1,66

ifO 2 6,6 o,if7

if5 3 keine Züchtung

Beispiel IX

Die Enzymproduktion aus flctinoplanes missouriensis IVRRL B-33if2 wird in einem l\lew Brunswick MF 114-Fermentor mit automatischer pH- und Schaumkontrolle durchgeführt. 1o Liter Medium wurden unter Verwendung von Maisquellflüssigkeit hergestellt, die auf pH 7,ο mit WaGH eingestellt war, filtriert und auf Volumen mit Leitungswasser gebracht. Genügend Maisquellflüssigkeit (5o % Feststoffe) wurde verwendet, um eine Endkonzentration von if % zu erhalten. Ein Verlust an Feststoffen bei Neutralisation und Filtration wurde nicht in Rechnung gestellt, wenn der Endfeststoffgehalt berechnet wurde. Das Medium wurde ergänzt mit o,1 mM Cobaltsulfat und d,o5 mM KupferCII)sulfat und bei 121 ⁰C 3o Minuten sterilisiert. Die Züchtung erfolgte 5 Tage bei 3o ^DC mit einem auf 7,ο dmrch die automatische Zugabe von 2 M H„SD, geregelten pH. Die Rührung betrug 2oo Upm und die Belüftung 1 Volumen pro Minute. Die Fermentation wurde gestartet durch die, Zugabe von 1o % einer 2if-Stunden-Impfkultur, die aus dem gleichen Medium aufgebaut war. Am Ende der Züchtungsperiade enthielt die Kulturbrühe 56 Aktivitätseinheiten pro Milliliter.

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Beispiel X

Die Isomerisierung van Glucose zu Fructose kann erfolgen unter Verwendung entweder ganzer Zeilen ader zellfreier Extrakte» Das pH der Isomerisierung kann von etwa 5,5 bis 9 variieren? jedoch wurde das optimale pH bei 7,ο gefunden, uiie in Tabelle X gezeigt ist* Das Enzym ist bemerkenswert temperaturbeständig, wobei eine merkliche Aktivität bei 9o ⁰C verbleibt. Das bei diesen Versuchen verwendete Enzym staronte von Actinoplanes misBOuriensls, das in dem Tryptone~Saytane~Mediuns ohne D=Xylose, wie in Baispiel I beschrMjen, gezüchtetwurde«

Die EnzymaktivitSt wurde ausgedrückt als Einheiten pro ml Rohenzymlösung, welche nach der in Beispiel I beschriebenen Methode hergestellt war» Die Versuchsbedingungen waren jene der AktivitStsanalyse, außer wa ein geeigneter Phosphatpuffer eingesetzt wurd^, um das in Tabelle X angegebene, gewünschte pH zu erhalten oder die Temperatur wie in Tabelle XI variiert. Die Werte aus Tabelle X sind um die nichtenzymatische Umwandlung korrigiert Horden. Die Glucosekanzentration ist grBSer als etwa o,1 M₀

Tabelle X

pH 5,ο 5,5 6,o G,5 7,ο 7,5 8,ο

Akt.

U/ml 6,5 16,1 28,ο 45,ο 5d_s5 45,g 39,4

Tabelle XI
Glucose-isomerase-Aktivitat als Funktion der Temperatur

Temgeratur_°C

ka . 4,5

5o 9,1

^6d 4O9817/1O42²⁰'⁷

Fortsetzung_Tabelle XI

7ο	-	Beispiel XI	43,5
75		57,5
θο		74,5
85		127,0
9ο		158,4

Zweiwertige Kationen haben eine tiefgreifende Uirkung auf die Aktivität von Glucose-isomerase, die wir beim vorherigen Beispiel hergestellt worden war. Der tiefgreifendste Effekt wurde bei Magnesium und Kobalt festgestellt. Die Tabellen XII und XIII beschreiben die Ergebnisse der Zugabe von Magnesium hu einem zellfreien Enzymextrakt sowie die zusätaliche Aktivitätserhöhung, die durch Kobalt ausgelöst wird. Die Bedingungen der Analyse sind mit Ausnahme der Konzentration der zweiwertigen Kationen die für die Aktivitätsbestimmung beschriebnenen.

Mg wird im Bereich von o,1 mM bis etuia 9 mM, vorzugsweise o,3 mM, zügegeben, Co von etwa o,o5 mM bis o,6 mM, vorzugsweise von o,1 bis o,3 mM, zugefügt.

Tabelle XII

τΐ,.Γ

Effekt von Mg auf die Aktivität des Glucose-isomErisierenden Enzyms

Konzentration^yon^MgSD, CmM) Enzymaktivität U/ml

ο 4,a

o,5 2_5,o

1,o 41,2

2,o 44,3

3,o 43,5

4,o 43,5

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Tabelle XIII

Λ, Α,

Aktivität von Glucose-isomerase als Funktion der Co -Konzentration -in Gegenwart van 3,ο mM MgSO,

Kanzentration von COSO. (mM)

α Mt, ο

o,2 " .'■■■■ kS,n o,3 · 51* _ta

O,if 5k,Ώ

Beispiel XII

Ganze Zellen (1,8 g nasse Zellen aus einer Schuttelkolbenkultur von Actinoplanes missouriensis ) wurden in I00 ml 6o % w/v Glucose, 2 ml 18 mM CoSO^, 2 ml o,2 M MgSO^ und 1o ml pH 7,5,·0,32 M-Phosphat(K)puffer suspendiert und in einem Wasserbad bei 75 C k Stunden inkubiert. Die Zellen wurden durch V/akuumfiltration durch üJhatman 1-Filterpapier entfernt, 5o % der Glucose warenin Fructose umgewandelt worden. Die Identifizierung der Produkte erfolgte mittels DünnschichtchrDmatagraphie (JUChromatogr. 3k, 26 - 3k (1968) ). Identifizierung und quantitative Bestimmung vergleich-. barer Umwandlungen wurde bestätigt durch Gaschramatographie der Trimethylsilylderivate (R.L. Whistler und O.i\l. BeMiller, Methods in Carbohydrate Chemistry, Bd. V/I, S.2, Academic Press New York, 1972).

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Claims (15)

1. - A 1399 -

   Patentansprüche

   Qy l/erfahren zur Herstellung υοπ Glucose-isomerase-Enzym aus einem Mikroorganismus der Gattung Actinoplanss, dadurch gekennzeichnet, daß man Adinoplanes in einem Kulturmedium züchtet und hieraus ein GlucDse-isomerisferendes Enzym gewinnt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus aus Actinoplanes missouriensis, Actinoplanes philippinensis, Actinoplanes armeniacus oder Actinoplanes sp. ATCC 23 3^2 ausgewählt ist.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Züchtungsmedium aus Maisquellflüssigkeit, Destillationsschlempe löslichem, Caseinhydrolysat, Sojabohnenhydralysat, Pepton, Hefsextrakt oder Fischproteinhydrolysat ausgewählt ist.
4. U. l/erfahren nach Anspruch' 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Züchtungsmedium Maisquellflüssigkeit ist, von welcher ein wesentlicher Teil des Schlamms entfernt worden und welche nachfolgend mit Alkali neutralisiert worden war.
5. 5. Verfahren nach Anspruch k, dadurch gekennzeichnet, daB die Maisquellflüssigkeit praktisch neutralisiert und die Fällungen hiervon entfernt worden waren.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daB die Maisquellflüssigkeit mit Natriumhydroxid, Calciumhydroxid, Ammoniumhydroxid oder Kaliumhydroxid behandelt wird, um dieselbe im wesentlichen zu neutra-

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   lisieren.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 4, 5 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Maisquellflüssigkeit o,5 bis etwa 7 % Feststoffe enthält, das pH zwischen etwa 6,ο und 8,5 und die Temperatur zwischen etwa 1G C und etwa 4o ⁰C liegt.
8. B. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Züchtungsmedium etwa o,o5 mM bis etwa o,5 mM Kobaltionen und etwa o,o1 mM bis etwa o,1 mM Hupferionen enthält. .
9. 9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation etwa 2k bis 168 Stunden fortgesetzt wird.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß D-Xy-Idsb zum Züchtungsmedium in einer Menge von etwa o,5 bis 1 Gew.-% des Mediums zugegeben wird.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß D-FructDse zum Züchtungsmedium in einer Menge von etwa o,1 bis 2,ο Gew.-% des Mediums zugegeben wird.
12. 12." - Verfahren zur Umwandlung von D-Glunose in D-Fructose, dadurch gekennzeichnet, daß man D-Glucose mit einer Isomerase behandelt, die nach dem Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche hergestellt wurde.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Isomerisierung in Gegenwart von Magnesiumionen xm Bereich von etwa o,1 mM bis 9 raM oder Kobaltionen im Bereich von etwa o,o5 mM bis etwa o,5 mM erfolgt.

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    -_2d- 235 H43
14. 14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Isomerisierung bei einer Temperatur von etwa ka ° bis 9o C und einem pH von etwa 5,5 bis 9 und einer Glucosekonzentration gröBer als etwa o,1 M erfolgt.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 12, 13 oder 1^, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym in Form der ganzen Zellen oder in zellfreier Form eingesetzt

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