[go: up one dir, main page]

DE2235600A1 - Verfahren zur reinigung von gammaglobulin - Google Patents

Verfahren zur reinigung von gammaglobulin

Info

Publication number
DE2235600A1
DE2235600A1 DE2235600A DE2235600A DE2235600A1 DE 2235600 A1 DE2235600 A1 DE 2235600A1 DE 2235600 A DE2235600 A DE 2235600A DE 2235600 A DE2235600 A DE 2235600A DE 2235600 A1 DE2235600 A1 DE 2235600A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
gamma globulin
solution
acrinol
globulin
stroma
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE2235600A
Other languages
English (en)
Other versions
DE2235600B2 (de
DE2235600C3 (de
Inventor
Donald Arthur Dahlgren
John William Nelson
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pharmacia and Upjohn Co
Original Assignee
Upjohn Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Upjohn Co filed Critical Upjohn Co
Publication of DE2235600A1 publication Critical patent/DE2235600A1/de
Publication of DE2235600B2 publication Critical patent/DE2235600B2/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2235600C3 publication Critical patent/DE2235600C3/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/828—Cancer
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/829—Blood
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/829—Blood
    • Y10S530/83—Plasma; serum
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/837—Lymph; lymph-glands; thymus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/838—Marrow; spleen

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

RECHTSANWÄLTE V . , · > 2 23JLB Ö O DR; JUR-DfPL-CHEM. WALTER BBl Jg. JUU WZ ALFRED HOEPPEHER - DR. JUR. DIPL-CHEM. H-J. WOLFP ; DR. JUR. HANS CHR, BEIL _.
*23 FtAWKFURT AM MAIN-HÖCHST {
Unsere Nr, 18 021
The Upjohn'Company
Kalamazöo, Mich., V. St. A .;■
Verfahren zur Reinigung von Gamma-Globulin.!
Die vorliegende Erfindung betrifft ein,Verfahren zur Reinigung von Gamma-ßlobülin, insbesondereein Verfahren zur Adsorption^ bestimmter -.Antikörper" gegen, menschliche· Blutbestandteile, die das aus Pferden gewonnene ßämma-GlobulinV das gegen Lymphocyten beim'Menschen wirksam ist, verunreini- -gen/ " , ... _ -"---' '-- '-;_; : / - :' -:.-:'"/:-\- -- . :■'-
Gamma-Globulin ist bekanntlich die Blut-Proteinfraktion, .. die die Hauptmenge der als Antikörper bekannten Antigene inaktivierenden Agentien aufweist♦ Diese Antikörper unterstützen ein Wirtstier bei der Bekämpfung krankhafter Zustände. Die Antikörper-Bildung wird durch die Anwesenheit von Antigenen im Tier stimuliert. Bei der Herstellung von
20 98 857133 3
gegen Lyraphocyten beim Menschen wirksamem Gamma-Globulin, das kurz als ALG bezeichnet wird, in einem Tierkörper, vorzugsv/eise beim Pferd, werden auch andere, aus dem menschlichen Körper stammende Substanzen, die nicht vollständig vom Lymphocytengewebe abgetrennt wurden, dem Tier injiziert. Von besonderer Bedeutung sind andere Blut- und Gewebebestandte'ile, beispielsweise Erythrocyten, Thrombocyten, Albumin, Alpha- und Beta-Globulin und dgl. Auf diese Weise werden Antikörper gegen diese Fremdstoffe wie auch gegen die Lymphocyten gebildet. Wird ein aus einem so behandelten Pferd gewonnenes Gamina-Globulin einem Menschen verabreicht, so kann eine unerwünschte Antigen-Antikörper-Wechselwirkung beispielsweise aufgrund der vorhandenen Antikörper gegen menschliche Erythrocyten und Thrombocyten neben der erwünschten Wirkung gegen Lymphocyten eintreten. Um das aus Pferden gewonnene Gamma-Globulin gegen menschliche Lymphocyten so spezifisch wie möglich zu machen, werden unerwünschte Antikörper im ALG gewöhnlich adsorbiert und im allgemeinen aus dem ALG entfernt, indem man das Gamma-Globulin mit menschlichen Erythrocyten oder deren Stroma bzw. Gerüstgewebe, menschlichen Thrombocyten oder deren Stroma in Berührung bringt und/oder an menschlichem Serum oder Plasma absorbiert. Dabei werden nicht nur die unerwünschten Antikörper, die immunologisch von dem Gamma-Globulin gegen menschliche Lymphocyten verschieden sind, inaktiviert, sondern es werden auch gegen verschiedene Antigene des menschlichen Blutes Überkreuzreaktionen liefernde Antikörper auf diese Weise entfernt.
Obgleich diese bekannten Verfahren theoretisch einfach sind, ergeben sich in der Praxis zahlreiche schwerv/iegende Probleme. Bei Verwendung von Serum oder Plasma zum Absorbieren verunreinigender Antikörper werden die Antigen-Antikörper-Komplexe gewöhnlich nicht präzipitiert. Ferner gibt es
209885/1333
"^■"'■v, : ■■■;■.'::■ ^3 ~ ; : '■. 2235M0,
keine -praktische. Methode .zur Abtrennung des im absorbierenden Plasma oder Serum.enthaltenen Gamrüa-Globulins VOm1ALG. Das Gamma-Globulin des absorbierenden Plasmas O'der "Serums verunreinigt das Endprodukt... Als Folge wird nicht nur das , ALG des*Patienten verabreicht, sondern gleichzeitig erhält er eine große Menge an nicht notwendigem und. . möglicherweise antigenhaltigem Protein. Neben der Schwierigkeit, die dem Körper die Verarbeitung der großen Menge an zusätzlichem Protein bereitet, scheint die Verabreichung eines derartigen Proteingemisohs in manchen Fällen auchimmunkomplex-Krankheiten zu verursaeheno Ein weiterer Nachteil der Verwendung des gesamten Blutserums oder Plasmas zur Absorbierung xmerwünschter Antikörper ist die I wendigkeit zeitraubender Tests zur Feststellting d maßes an verunreinigendem Protein,'welches im ALG zurückbleibt. -" -"'".-.."■■ . . ' "■""■'■'
Gemäß einem weiteren bekannten Verfahren'zur Reinigung"von ALG wird Erythrocyten-Stroma verwendet, um Antikörper gegen menschliche Erythrozyten aus dem Gamma-Globulin zu adsorbieren. Ehe man das ALG' mit dem Erythroeyten-Stroma in Berührung bringt, müssen lysierendes Medium und Hemoglobin, d.h. das Menstruum, die das Stroma yerunreini-· «Jen, zunächst'entfernt werden. Dies erfolgt im ailgemeineny indem man das Stroma von der verunreinigenden Flüssigkeit durch Zentrifugieren und Waschen befreit. Dabei ergeben' sieh jedoch große Schwierigkeiten, da das. Stroma, ins- - besondere Stroma aus überaltertem Blut, sich nicht leicht vom Menstruum abtrennt. .
Die oben erwähnten und weitere Schwierigkeiten Werden durch das erfindungsgemäße Verfahren beseitigt.
Gegenstand vorliegender Erfindung ist ein Verfahren.zum Reinigen von gegen heterologes Antigen-Material hervorge-
209885/133
bracht een Gamma-Globulin, wobei das Antigen-Material durch antigenhaltige Blutbestandteile aus der gleichen Tierart wie das Antigen-Material verunreinigt ist. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine lösung des Gamma-Globulins mit festem Plasma-Protein in Berührung bringt, das im wesentlichen von Gamma-Globulin frei und aus der gleichen Tierart wie das Antigen-Material gewonnen ist. Antikörper gegen Blutbestandteile, die die genannte Gamma-Globulinlösung verunreinigen, v/erden dabei auf dem festen Plasma-Protein adsorbiert. Die Lösung eines gereinigten Gamma-Globulins wird dann vom festen Material abgetrennt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Gamma-Globulinlösung mit festem Plasma-Protein und zusätzlich mit Erythrocyten-Stroma in Berührung gebracht. Es wurde ferner gefunden, daß durch Zusatz von Acrinol zu einer Suspension lysierter Erythrocyten die Abtrennung des Stromas vom Menstruum erleichtert wird.
Die Erfindung wird im einzelnen am Beispiel des aus Pferden gewonnenen und gegen Einschliche Lymphocyten wirksamen Gamma-Globulins erläutert, beschränkt sich jedoch keineswegs auf dieses Material. Andere geeignete Antigen-Materialien sind beispielsweise carcino-embryonische Gewebe. Geeignete Quellen für lymphocytisches Antigen-Material sind Milz-Lymphocyten, Thymocyten, Blut-Lymphocyten, Lymphocyten des Lymphgewebe-Hauptstamms und gezüchtete menschliche Lymphocyten, vorzugsweise Thymocyten. Die Tiere, aus denen das antigenhaltige Material stammt, können Schimpansen, Affen, Kaninchen, Ratten, Hunde, Schweine und dgl. sein, vorzugsweise wird menschliches Antigen-Material verwendet. Die Tiere, deren Gamma-Globulin gegen dieses Antigen-Material hervorgebracht wird, sind Pferde, Ziegen,
209885/1333
Kühe, Schafe, Kaninchen, Schimpansen, Affen,. Ratten, wobei Pferde "bevorzugt wenden.. ' . - ·.
Besteht das Antigen-Material aus Lyraphocyten, so besitzt das (jamma-Globulin bei Verabreichung an die (Dierart, aus -;■ ■ der das Antlgen-Materlal genommen wurde* immunosupressive Wirkung. Durch das Gamma-Globullii wird beispielsweise· das Überleben homologer und heterologer Organ- und Hauttransplantate einschließlich Niere, Leiber, Herz; Lunge, Knochenmark und Haut bei Menschen und_Tieren wie Schimpansen und Äffen gesteigert* . V ' .
&amma-Globuliη kann nach verschiedenen konventionellen Methoden weitgehend aus Blutserum oder Plasma abgetrennt, werden, wobei die jeweilige Methode für die Zwecke vorliegender Erfindung unerheblich ist«Als Beispiele für' Reagentlen, die die'Abtrennung bewirken,- selen Seutralsalze einschließlich Sulfate, Thiosulfate, Phosphate, Halogensalze der Alkalimetalle, des Ammoniums oder Magnesiums, In geeigneter Konzentration eingesetzte Metallionen," nicht-ionisierbare Polymere hohen Molekulargewichts, Polyanlonen, wasserlösliche organische Lösungsmittel,. ζ.B. Äthano1, Methanol, Isοprο panο1, ο rgäni s ehe'Kat ionen,' z.B. Acrinol und andere Acridine einschließlieh. Trypaflavin, 5-Affiinoacridin (Clinica,Chimica Acta 6 (1961) 782-795) ■genannt^. Der all diesen Methoden gemeinsame kritische Paktor besteht darin, daß das Gämma-Globülln im wesentlichen von der Hauptmenge des Serumproteins abgetrennt, sein muß und somit nicht das heterolog hervorgebrachte Gamma-Giobulin verunreinigen kann^wenn man das feste Plasmas-Protein zur Adsorption unerwünschter Antikörper 'verwendet« Die Methode v/ird am Beispiel der Verwendung von Äcrinol dargestellt, das den weiteren Vorteil ergibt, daß" es Gamma- ■ Globulin wirksam sowohl aus gesamtem Blut wie auch aus
20 9885/13 33
- β
Serum oder Plasma abtrennt. Die Maßnahme ist besonders geeignet zur Abtrennung von Gamma-Globulin aus gesamtem Blut von Kühen, da die Rinder-Erythrocyten sich nicht so rasch wie menschliche Erythrocyten abscheiden.
Blutplasma tierischen Ursprungs, das als Antigen-Quelle dient, wird mit einer wässrigen Acrinol-Lösung behandelt, die etwa o,1 bis etwa 5 f° Acrinol enthält, wobei die vom Gamma-Globulin verschiedenen Blutproteine ausgefällt werden. Zu diesen Proteinen gehören Albumin, Alpha- und Beta-Globulin und dgl. Das Plasma liegt bei seinem normalen pH-Wert von etwa 7-8 vor, kann jedoch auch durch Zusatz geeigneter Reagentien wie In-Natriumhydroxydlösung, o,8m-Natriumbicarbonatlösung, im-lTatriumcarbonatlösung oder 1n-Salzsäure oder Essigsäure auf pH etwa 7,6 eingestellt werden. Die Ausfällung erfolgt gewöhnlich bei etwa 25°C, obgleich man auch bei höheren oder niedrigeren Temperaturen arbeiten kann. Pro Volumenteil Plasma werden 3,5 bis 5 Volumenteile, vorzugsweise etwa 4 Volumenteile, einer o,4$igen wässrigen Acrinollösung zugegeben.
Man läßt die Ausfällung oder Präzipitation unter Absetzen. und Ausflockung beim Stehen, vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 4 C während etwa 15 Minuten bis über Nacht oder langer vor sich gehen. Das Präzipitat wird von der überstehenden Flüssigkeit, die das Gamma-Globulin enthält, abgetrennt, beispielsweise durch Filtrieren, Dekantieren oder Zentrifugieren. Das Präzipitat, v/elches das in Acrinol unlösliche Blutplasma-Protein enthält, wird mit einer o,1 bis 5^igen wässrigen Acrinollösung gewaschen, dann wird das Präzipitat in eine Lösung übertragen, die gegen das Antigen aus heterologer Quelle hervorgebrachtes Gamma-Globulin enthält und wenige Minuten bis mehrere Stunden bei etwa 4 bis etwa 4o°C, vorzugsweise bei etwa 250C
20988 571333
gerührt, so daß die in der Gamma-Globulinlösung entliaitenen Antikörper gegen,-Plasmä-Protein au£ ;dem festen Plasma» . Protein absorbiert v/erden. In der Suspension wird eine ."-·."" ausreichende Menge eines G-amma-GlolDulln abscheidenden' , Reagenses aufrecht erhalten,, .so daß die Bedingungen der ...- : Multiphasen-Adsorption vorliegen» Das feste Pla'smäi-Proteinmit den daran .adsorbieri;en Antikörpern gegen. Plasma-Protein wird dann abgetrennt, beispielsweise durch Dekantieren, . Filtrieren oder Zentrifugieren. Der Adsorptionsvorgang kann so oft wiederholt werden, wie zur Reduktion des Gehalts an verunreinigenden Antikörpern auf den-gewünschten
■Wert erforderlich. Die-aus Oj öl bis 5 oder mehrliitern Plasma erhaltene Menge an festem Plasma-Proteinwird zur Adsorption der Antikörper gegen Plasma-Protein aus hetero—
·■ log;hervorgebrachtem. Gamma^Globulin. gegen menschliche ; Lymphocjten verwendet, das aus 1 1-Plasma erhalten wforden war. Diese Art der Adsorption ist "insbesondere .vorteilhaft:, wenn man als Mittel zum; Abtrennen des Gamma-Globulins ..-.,' Asrinol verwendet, da pffenbar Hepatitis-Viren gleichzeitig mit dein Plasma-Protein präzipitiert werden, so daß die .Möglichkeit einer Verunreinigung des Endprodukts durch HepatitiS'-Viren vermindert wird. : ;
Das- gegen das Antigen-Material hervorgebrachte •Gamma-Globulin wird nach an sich bekannten Methoden hergestellt. Eine , ; Tierart,"vorzugsweise ein Pferd, wird, beispielsweise, mit lymppidem Gewebe einer anderen Tierart, vorzugsweise vom Menschen,, inokuliert. Die lymphoeyten werden;in bekannter Weise hergestellt, beispielsweise durch' Zonenze'ntrifugierung, wobei eine Trennung von Lymphoeyten und Blutplättchen von' den Granulocyten.undErythrocyten erfolgt..Zur.TrennungNder Lymphocyten von den Blutplättchen kann dann eine isopyeni-· sehe Zonensedimentation ^afogev/andt' werden., Obgleieh man -auf >.. diese V/eise eine weitgehend re'ine lymphocytenpopulation er- . ·
209 8 85/133 3
hält, ist das resultierende Lymphοcyten-Präparat noch durch verschiedene Blutbestandteile verunreinigt, von denen die laenschlichen Erythrocyten und andere antigenhaltige Blutbestandteile am wichtigsten sind. Das Tier wird dann mit dem Lymphocyten-Präparat inokuliert. Nach einer geeigneten Zeitspanne wird das Tier enfblutet und die Gamma-Globulin-Fraktion wird nach den vorstehend beschriebenen Methoden isoliert.
Wie bereits erwähnt, sollen bei der Herstellung eines gereinigten Gamma-Globulins zur inneren Anwendung die Antikörper gegen Erythrocyten vom Gamma-Globulin entfernt werden. Dies erfolgt zweckmäßig, indem man die Gamma-Globulinlösung mit Erythrocyten oder vorzugsweise mit dem Stroma von Erythrocyten in Berührung bringt. Die Zubereitung des Stromas zur Behandlung des Gamma-Globulins erfolgt in bekannter Weise, wobei jedoch Maßnahmen einer Isolierungsstufe, die nachstehend beschrieben v/erden, neu sind: Nach der Lysis der Erythrocyten und vor der Behandlung des Gamma-Globulins mit dem Stroma muß das Menstruum soweit als möglich vom Stroma abgesondert werden. Durch Zugabe v geringer Mengen an Acrinol zu den lysierten Erythrocyten wird die Abtrennung des Strcmas vom Merstruum gefördert, und nur 2 oder 3 Waschungen und Zentrifugierungen bei relativ niedrigen Geschwindigkeiten von 2ooo Umdrehungen pro Minute während 1o bis 15 Minuten reichen zur Abtrennung aus. Demgegenüber waren bisher 1o oder mehr Waschungen und Zentrifugierungen bei 3ooo Umdrehungen pro Minute während 3o Minuten erforderlich. Eine befriedigende Abtrennung wird gemäß der obigen neuen Verfahrensvariante häufig erzielt, 'indem man lediglich über Nacht in der Kälte absitzen läßt und anschließend abdekantiert. Das Stroma ist von Hemoglobin hinreichend frei, sobald die charakteristische Färbung der suspendierenden Flüssigkeit
209885/1333
.praktisch verschwunden ist, 'was visuell-oder &pektrophoto-v metrisch "bei 555-""i^'-'S^itt!eli.--werdßii;;-"känii,. Die .Acrinoimenge liegt zwischen etwa 1 und 5 g pro later ursprünglich ge- -""-. packter Erythrocytenund.vorzugsweise "bei etwa 5 bis 5 g pro liter* ' - ; . . - \ ' · ; :. : '^- "-.:■- : Λ-.;., ' ' ■-■ '■;-...:": :-^ :, ., ■■ -:,- '■■■
Die vorausgehenden Stufen : deip, Stroina-Herstellüng;; sind bekannt ^1 Dem Erythrocyten-Eräzipität wird eine gleiche Volumeniiienge* Q»9/^iger Natriumehlori^älösung zuge'setzt, die Süsjpension ; wird dann vermischt undzentrifugiert,„worauf die'Eederhäut ("buffy coat) entfernt:wird. Die gewaschenen Erythrocyten werden dann nach Standardverfähren lysieft', "beispielsWeise durch: Digitonin, Wasser-, ^Einfrieren und; Auftauen.■ Das : . : Siroma wird von der Suspension mit Aerinol wie vorstehend ■beschrle"ben abgetrennte Durch Auswahl e;iner Aerinollosung ' -., " von.geeignetem Tonus kann äas Erythrocyten-Stroma durch .; ^ ^sin einziges Reagens "iysiert und ,abgetrennt werden;, so daß · die eigene lysis-Stufe entfällt,.- .. v; ;'-... ;.?/ :_-:-, . -." " :
Das Stroma wird dann der iösung des gegen das; heffeerologe .Antigen, hervorgebrachten Gamma-Giobulins zugesetzt,. v so daß Adsorption der Antikörper gegen Erythrocyten auf dem Stroma erfolgen kann«! Dieser Vorgang wird sp ;οΐΦ wie ; χ zur Adsorption der Antikörper gegenErythrocyten erforderlieh durchgeführt. ZuΓ^■Ä.d■sCϊ■r5■tion..d■0r^Ani;ilE·öip;ex^geg.en-:. . : Erythrocyten aus heterolog hervorgebrachtem Gamma-Globulin aus 11 Plasma verwendet man etwa o,o%- bis 5 odermehr: . ■ Mt er gepackte Erythrocyteni'ODie iiultiphasenrAdsqrpitiqn ■ wird durch geeignete Mengen.des Gammä-Globulin^Abtrenn-mitt eis /sichergestellt;. ·:;; - :' ^;. ;":VV V '■/■';' ." ..." -\ ;
"Die Strom>Adsorption kanti vor, gleichzeitig oder nach der Adsorption auf dem Plasma-Protein durchgeführt werderu
20 9885/133
Beispiel 1
Herstellung von Gamma-Globulin gegen menschliche Lymphocyten,
Menschliche Lymphocyten werden in an sich bekannter Weise hergestellt und einem Pferd injiziert. Sobald der gewünschte Antikörper-Gehalt erreicht ist, wird das Pferd entblutet, das Serum wird vom Gesamtblut abgetrennt und durch Zugabe von o,8m-Natriumbicarbonatlösung auf pH etwa 7,6 eingestellt. Dem Serum wird dann unter Rühren eine wässrige Lösung mit etwa o,4$ Acrinol langsam zugesetzt, um die vom Gamma-Globulin verschiedenen Blut-Proteine auszufällen. Um vollständige Ausfällung sicherzustellen, wird die Acrinollösung im Überschuß angewandt. Man läßt die Fällung über Nacht bei etwa 4°C absitzen, dann wird die überstehende, das Gamma-Globulin enthaltende Lösung abdekantiert.
Beispiel 2
Absorption von Antikörpern gegen menschliches Plasma-Protein unter Verwendung des ganzen Serums (Verfahren gemäß Stand der Technik).
Zu der Gamma-Globulinlösung gemäß Beispiel 1 wird eine gleiche Volumenmenge menschliches Gesamtserum zugegeben. Das Gesamtserum inaktiviert die menschlichen Blutprotein-Antikörper im Gamma-Globulin gegen Pferdelymphocyten. Das menschliche Gamma-Globulin wird jedoch mit dem aus Pferden gewonnenen Gamma-Globulin gegen menschliche Lymphocyten vermischt und die beiden können nur unter großen Schwierigkeiten, wenn überhaupt, voneinander getrennt werden.
209885/1333
Adsorption von Antikörpern- gegen Plasma-Protein mit fest.em Plasma-Protein* ■"'"■-" ; ■· "-" "· -\'.'.-■ "■- ' ..
Es wird eine solclie Menge einer ^iassrigen* etwa o,4/«i,gen Acrinoilösung langsam' unter Rührenyzu \rorgängig mit,. ο,em'-ilatrium'bicar'bönat.. auf pH etwa -7,6 .eingestelltem menschlicliem Plasma zugegeben,, daß die. in" Acrinol unlösliGlien Proteine ausgefäHt vier.den« Die resultierende Fällung wird durch Zentrifugieren von der überstehenden ---' Flüssigkeit; abgetrennt. Aus o,2 1 mensehliehern Plasma erhaltenes, festes Plasma-Protein v/ird zu einer Lösung von ' aus 1 1 Plasma gemäß Beispiel 1 Tiergestelltem ALG zugegeben. Die resultierende Suspension wird stetig 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann über Nacht gekühlte Die das von verunreinigenden Antikörpern.gegen menschliches Plasma-Protein gereinigte ALG enthaltende überstehende Flüssigkeit wird durch'Zentrifugieren bei 2oop Umdrehungen pro Minute'Während 1o Minuten abgetrennt. Das so erhaltene ALG ist'praktisch ohne Verunreinigungen durch schädliche.
- ■■-"■" ■ · "· / -1 menschliche Blutplasma-Proteine oder lösliche Antigen- ."■
Antikörper-Komplexe. -.".'■
Beispiel. 4 · . v
Adsorption von Antikörpern gegen menschliche Erythroeyten (Verfahren gemäß S'tand der Technik).' .
Zu einem Volumenteil gepackter .menschlicher ErytTaroeyten ■■ wird eine gleiche VOlumenmenge- Viässriger ö,Seiger Natriumchloridlösung zugegeben. Dann wird gemischt und bei 5ooo Um·
209885/133 3
drehungen pro Minute und 2°C 3o Minuten zentrifugiert, anschließend v/erden die überstehende Flüssigkeit und lederige Haut ("buffy coat) verworfen. Pro Liter gepackter Erythrocyten werden 1o Volumenteile destilliertes Wasser zugegeben und die Zellen werden durch 1/2-stündiges Stehen lysiert. Das Stroma wird gewaschen und 1o χ mit 3ooo Umdrehungen/liinute 3o Minuten lang zentrifugiert, um das Hemoglobin auf befriedigende Werte zu vermindern. Etwas Stroma geht beim Waschen verloren. Stroma von o,1 Volumenteil gepackten Erythrocyten wird zukem aus 11 Plasma gemäß Beispiel 1
ο erhaltenen AIG zugegeben, dann wird 3 Stunden bei 2 C gerührt. Das Stroma wird von der ALG--Lösung abzentrifugiert und die Lösung wird noch 2 χ mit weiterem Stroma behandelt -, um den Gehalt an Erythrocyten-Antikörpern auf einen erträglichen Wert zu senken.
Beispiel 5
Adsorption von Antikörpern gegen menschliche Erythrocyten aus ALG mit durch Zusatz von Acrinol hergestelltem Stroma.
Das Verfahren von Beis-piel 4 wird wiederholt bis zur Lysis der Erythrocyten mit destilliertem Wasser. Dann wird die lysierte Erythrocytenlösung mit 2 1/2 Volumenteilen V/asser, berechnet auf Basis des ursprünglichen gepackten Erythrocytenvolumens.verdünnt. Sodann werden 5 g Acrinol pro Liter des ursprünglichen gepackten Erythrocytenvolumens zugegeben. Die Suspension wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann über Nacht gekühlt. Dann wird 1o Minuten mit 2ooo Umdrehungen pro Minute zentrifugiert und die ALG-Lösung wird vom Stroma abgetrennt. Zwei weitere Adsorptionsvorgänge mit frischem Stroma werden au£ obige Weise durchgeführt, dabei wird der Anti-Erythrocytengehalt auf einen befriedigenden Wert gesenkt.
209885/ 1333

Claims (6)

  1. Patentansprüche;
    Verfahren zur Reinigung von Gamma-Globulin, das gegen, , ein heterologes Antigen-Mäteriäi erzeugt wurde, wobei das Antigen-Materialdurch Antigen-Blutbestandteile verunreinigt ist,die von der gleichen Spezies stammen wie das Antigen-Material, dadurch gekennzeichnet, daß man
    a) eine 'Lösung des Gamma-Globulins mit festem Plasma-Protein in Berührung bringt, das im wesentlichen frei von Gämma-Globulin ist und von der gleichen Spezies stammt wie das Antigen-Material, sodaß die in der Gamma-Globülinlösung enthaltenen yerunreinigenden Antikörper gegen Blutbestandteile von dem festen Plasma-Protein adsarbieri werden, und
    b) die Lösung des gereinigten Gamma-Globulins vom festen Material abtrennt. : \
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1> dadurch gekennzeichnet, daß das gegen ein heterologes Antigen-Material· erzeugte Gamma-Globulin Pferde-Gamma-GlobuliTi ist und das Antigen-Material aus menschlichen Lymphocytenbesteht.
  3. 3. YerfahrennachAnspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gamma-Globulinlösung Acrinol enthält.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das feste Plasma-Protein aus menschlichem Plasma durch , Ausfällen mit Acrinol erhalten wurde. . -
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das feste Plasma-Protein aus menschiicheB Erythrocyten- -: Stroma besteht, das dadurch erhalten wurde, daß man eine Erythrocyteh-Suspension mit Acrinol in Berührung brachte und das Stroma vom Menstruum trennte.
    209885/1333
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Erythrocyten vor der Behandlung mit Acrinol lysiert wurden.
    Für
    The Upjohrf'Company
    (Dr. H.J. Wolff) Rechtsanwalt
    \
    209385/1333
DE2235600A 1971-07-23 1972-07-20 Verfahren zur Reinigung von Γ-Globulin Expired DE2235600C3 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16569771A 1971-07-23 1971-07-23

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE2235600A1 true DE2235600A1 (de) 1973-02-01
DE2235600B2 DE2235600B2 (de) 1980-10-02
DE2235600C3 DE2235600C3 (de) 1981-07-30

Family

ID=22600062

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2235600A Expired DE2235600C3 (de) 1971-07-23 1972-07-20 Verfahren zur Reinigung von Γ-Globulin

Country Status (15)

Country Link
US (1) US3745155A (de)
JP (1) JPS5732044B1 (de)
AR (1) AR192808A1 (de)
AU (1) AU461489B2 (de)
BE (1) BE786564A (de)
CA (1) CA971880A (de)
CH (1) CH584126A5 (de)
DE (1) DE2235600C3 (de)
DK (1) DK132689C (de)
FR (1) FR2147100B1 (de)
GB (2) GB1377102A (de)
IL (1) IL39911A (de)
NL (1) NL173918C (de)
SE (2) SE407333B (de)
ZA (1) ZA724738B (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2413641A1 (de) * 1973-03-22 1974-10-03 Michel Fontaine Verfahren zur herstellung von medikamenten zur behandlung von neoplasen, infektionen, zur unspezifischen stimulierung der immunitaet sowie unterstuetzungsmittel bei der aktiven immuntherapie und bei impfungen sowie hieraus herstellbare medikamente

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL7602422A (nl) * 1976-03-08 1977-09-12 Leuven Res & Dev Vzw Trombosetest.
IT1143768B (it) * 1977-10-31 1986-10-22 Boehringer Biochemia Srl Procedimento per la produzione di un anticorpo anti-hcg,particolarmente utile per la diagnosi della gravidanza
US4731336A (en) * 1982-06-14 1988-03-15 Amersham International Plc Immunoassay for complement fragments
US5219578A (en) * 1991-02-25 1993-06-15 Innovet, Inc. Composition and method for immunostimulation in mammals
GB201520903D0 (en) 2015-11-26 2016-01-13 Qbd Qs Ip Ltd Purification method

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NICHTS ERMITTELT *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2413641A1 (de) * 1973-03-22 1974-10-03 Michel Fontaine Verfahren zur herstellung von medikamenten zur behandlung von neoplasen, infektionen, zur unspezifischen stimulierung der immunitaet sowie unterstuetzungsmittel bei der aktiven immuntherapie und bei impfungen sowie hieraus herstellbare medikamente

Also Published As

Publication number Publication date
DK132689B (da) 1976-01-26
GB1377101A (en) 1974-12-11
CA971880A (en) 1975-07-29
IL39911A (en) 1975-04-25
AU4458272A (en) 1974-01-17
AR192808A1 (es) 1973-03-14
FR2147100B1 (de) 1976-08-06
JPS5732044B1 (de) 1982-07-08
US3745155A (en) 1973-07-10
NL173918B (nl) 1983-11-01
BE786564A (fr) 1973-01-22
SE407333B (sv) 1979-03-26
DE2235600B2 (de) 1980-10-02
SE7809384L (sv) 1978-09-06
DK132689C (da) 1976-07-26
NL7209952A (de) 1973-01-25
ZA724738B (en) 1973-03-28
AU461489B2 (en) 1975-05-29
GB1377102A (en) 1974-12-11
NL173918C (nl) 1984-04-02
SE447339B (sv) 1986-11-10
CH584126A5 (de) 1977-01-31
DE2235600C3 (de) 1981-07-30
IL39911A0 (en) 1972-09-28
FR2147100A1 (de) 1973-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CH627187A5 (de)
CH634334A5 (de) Neues glycoprotein und verfahren zu dessen herstellung.
EP0000134B1 (de) Glykoprotein, Verfahren zu seiner Herstellung, seine Verwendung zur Gewinnung von Antiserum sowie das Antiserum
DE2500076A1 (de) Verfahren zur erhoehung der intravenoesvertraeglichkeit von aus blut oder blutprodukten ausgefaellten gammaglobulinen
EP0060491B1 (de) Protein (PP16), Verfahren zu seiner Anreicherung und Gewinnung sowie seine Verwendung
DE2640387C3 (de) Gewebespezifisches Protein und Verfahren zu dessen Herstellung
DE2127159A1 (de) Verfahren zur Fraktionierung von Plasmaproteinen
EP0009715A1 (de) Neues ubiquitäres Gewebsprotein PP8 und Verfahren zu seiner Anreicherung
DE2235600A1 (de) Verfahren zur reinigung von gammaglobulin
DE2616984C3 (de) Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines plazentenspezifischen Glycoproteins
CH338273A (de) Verfahren zur Herstellung stabiler, hochgereinigter y-Globulinpräparate
DE2644622B2 (de) Extraktion von Mikroorganismen und diese enthaltende diagnostische Mittel
DE3410694C2 (de)
DE1617332C3 (de) Verfahren zum Isolieren eines wasserlöslichen Protein-Metall-Chelats mit antiphlogistischer Wirkung
CH392780A (de) Verfahren zur Herstellung von intravenös anwendbaren Antikörperpräparaten humanen Ursprungs
DE2014957C2 (de) Verfahren zur Reinigung von Proteinen des Blutserums oder -plasmas
DE2748520A1 (de) Hepatitis b-dane-teilchen
DE3322643C2 (de) Verfahren zur Herstellung eines Latextestreagenz zum Nachweis und zur Differenzierung von Humanhämoglobin, Humanhämoglobinbestandteilen oder Humanhämoglobinvarianten
DE10065227A1 (de) Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Eigelb-Antikörpern aus Vogeleiweiß und Verwendung von dadurch erhaltenen Eigelb-Antikörpern
DE2243237A1 (de) Nachweis der immunreaktion gegenueber krebs
DE2353035B2 (de) Verfahren zur Stabilisierung menschlicher oder tierischer Körperflüssigkeiten oder pflanzlicher Extrakte
DE1148037B (de) Verfahren zur Herstellung eines desaggregierten, das Komplementsystem nicht beeinflussenden Gammaglobulins
DE2533183C3 (de) Verfahren zum Herstellen gereinigter Immunglobuline
AT271725B (de) Verfahren zur Gewinnung von Gammaglobulin
DE397551C (de) Verfahren zur Gewinnung spezifischer Impfstoffe

Legal Events

Date Code Title Description
OD Request for examination
C3 Grant after two publication steps (3rd publication)
8339 Ceased/non-payment of the annual fee