DE3322643C2

DE3322643C2 - Verfahren zur Herstellung eines Latextestreagenz zum Nachweis und zur Differenzierung von Humanhämoglobin, Humanhämoglobinbestandteilen oder Humanhämoglobinvarianten

Info

Publication number: DE3322643C2
Application number: DE19833322643
Authority: DE
Inventors: Brigitte Dr. Ebener; Uwe Dr. 6233 Kelkheim Ebener
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1983-06-23
Filing date: 1983-06-23
Publication date: 1986-07-10
Also published as: DE3322643A1

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Latextestreagenz aus anti-Humanhämoglobin-Antikörpern oder aus anti-Humanhämoglobinbestandteil-Antikörpern, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man 1. aus Flüssigkeiten, welche diese Antikörper oder Fragmente dieser Antikörper enthalten, diese mit Ammoniumsulfat ausfällt und abzentrifugiert, 2. die abzentrifugierten Feststoffe, nach ihrer Resuspendierung in einem zweiten wäßrigen Medium, in diesem bis zur Sulfatfreiheit dialysiert, 3. die dialysierte Antikörper (bzw. Antikörperfragment-)fraktion mit einer wäßrigen Suspension von Polystyrol-Latexteilchen vermischt und 4. vorzugsweise bei einer Temperatur von 0°C bis 100°C stehen läßt und 5. anschließend die Mischung mit einem oberflächenaktiven Mittel der allgemeinen Formel $F1 worin R einen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit etwa 8 bis 22 C-Atomen und a, b und c jeweils eine ganze positive Zahl bedeuten, wobei die Summe von a, b und c vorzugsweise 5 bis 200 ist, und gegebenenfalls Polyvinylpyrrolidon. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung eines derart hergestellten Latextestreagenz zum Nachweis und zur Differenzierung von Humanhämoglobin, Humanhämoglobinbestandteilen oder Humanhämoglobinvarianten.

Description

R¹ —CON

60

wobei R¹ ein Wasserstoffatom, ein niederer Alkylrest oder eine Aminogruppe bedeutet, die mit einem niederen Alkylrest substituiert sein kann und R² und R³ jeweils ein Wasserstoffatom oder ein niederer Alkylrest ist, und Di-niederalkylsull'oxide. Als repräsentative Beispiele für diese Verbindungen werden Harnstoff, N,N-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Diethylsulfoxid u. a. benannt. Dieses Reagenz soll einem diagnostischen Mittel, das sensibilisierte Latexteilchen enthält, zugesetzt werden oder dem Verdünnungsmittel der Testprobe beigemischt werden. Nachteilig ist hierbei insbesondere die noch zu geringe Testsensitivität. Ferner wird dessen Anwendung nur für Körperflüssigkeiten, wie Urin, Serum oder Plasma, beschrieben.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung von einem Verfahren zur Herstellung eines Latextestreagenz, mit dem der Nachweis von Humanhämoglobin bzw. dessen Bestandteile oder Varianten zuverlässig nicht nur in Körpeiflüssigkeiten sondern auch im Stuhl und m Extrakten, die aus Stoffen oder von Flächen entfernter Materialien gewonnen wurden, ermöglicht wird.

Neben einer großen Empfindlichkeit beim Nachweis von Humanhämoglobin sollen ferner weitere Vorteile durch das erfindungsgemäß erhaltene Latexreagenz erreicht werden, wie z. B. eine außerordentlich gute Spezifitäi und eine einwandfreie Negativkontroiie. Dabei sollen die genannten Vorteile auch nach einer Lagerung von vielen Monaten erhalten bleiben.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines Latexreagenz aus anti-Humanhämoglobin-Antikörpern oder anti-Humanhämoglobinbestandteil-Antikörpern, otfer aus deren Fragmenten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

aus Flüssigkeiten, welche diese Antikörper oder Fragmente dieser Antikörper enthalten, diese mit Ammoniumsulfat ausfällt und abzentrifugiert,
die abzentrifugierten Feststoffe, nach ihrer Resuspendierung in einem zweiten wäßrigen Medium bis zur Sulfatfreiheit dialysiert,
die dialysierte Antikörper{bzw. Antikörperfragment)-fraktion mit einer wäßrigen Suspension von Polystyrol-Latexteilchen vermischt und
vorzugsweise bei einer Temperatur von 0⁰C bis 100⁰C stehen läßt und

anschließend die Mischung mit einem oberflächenaktiven Mittel der allgemeinen Formel

O
H₂C ^CH-CH₂-COOR

! I

HO(C₂H₄O)₁-HC

CH-(OC₂H₄J₄-OH

worin R einen aliphatischen Kohlenwasserstoffrjst mit etwa 8 bis 22 c-Atomen und α, b und r jeweils eine ganze positive Zahl bedeuten, wobei die Summe von α, b und c vorzugsweise 5 bis 200 ist, versetzt.

Das erfindungsgemäße Verfahren geht von Humanhämoglobin-Antikörpern oder Hunianhämoglobinbestandteil-Antikörpern bzw. F(ab)'-Fragmenten dieser Antikörper aus. Wenn auch Verfahren zur Herstellung dieser-Ausgangsmaterialien allgemein zum.Stand der Technik .'gehören, solle die wichtigsten Gesichtspunkte bei der Herstellung von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, wie sie bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewendet werden können, im folgenden kurz angegeben werden:

Antikörper gegen Humanhämoglobin können beispielsweise durch entsprechende Immunisierung von

Tieren erhalten werden. Dabei sind in der Praxis eine Vielzahl von Tieren geeignet, wie beispielsweise Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Katzen, Hunde, Kinder, Schafe, Schweine, Pferde, Affen, Ziegen, Enten, Hühner und auch Fische, z. B. Karpfen etc. Wegen der günstigen Haltungskosten werden dabei insbesondere Kaninchen, Ziegen und Mäuse bevorzugt.

Geeignete Immunisieiungsverfahren mit den genannten Τϊτεη sind beispielsweise von Adams, EC, Layman, KM: in »Imniunochemical Confirmation of ίο Gastrointestinal bleeding: Annals of Clinical and Laboratory Science 4 (1974) 343 ff.« und von Burton, RM et al.: in »Appearance, Properties and Origin of altered Human Hemoglobin in Feces; Laboratory Investigation 35 (1976) ff.« beschrieben worden.

Allgemein gilt, daß die Tiere durch Injektion in Kontakt mit dem Antigen (d. h. Humanhämoglobin und Humanhämoglobinbestandteile) kommen, wobei fast immer mehrere Injektionen benötigt werden. Die zeitlichen Abstände zwischen den einzelnen Injektionen, zweckmäßige Antigenrfiengen, die Art der Injektion und die gegebenenfalls zusätzliche Verwendung eines Adjuvanten kann von jedem Fachmann anhand des vorliegenden Einzelfalles ohne weiteres bestimmt werden.

Neben dieser »in vivo-Immunisierung« sind auch Methoden der »in vitro-Immunisierung« bekannt, wobei nicht das Tier sondern Zellen eines Tieres oder sogar eines Menschens direkt in der Zellkultur mit dem Antigen in Kontakt gebracht werden. Bei dem letztgenannten Verfahren entnimmt man Zellen z. B. aus nicht immunisierten Tieren und bringt sie in der Zellkultur erstmals mit dem Antigen zusammen, so daß also die primäre Immunantwort in vitro ausgeführt wird. Derartige Methoden wurden beispielsweise in folgenden Literaturstellen beschrieben: von Mishell, RJ, Dutton RW in: »immunization of dissociated spleen ce!! cultures from normal mice; J. Exp. Med. 126 (1967) 423 ff.«; von Marbrook, J: in »Primary immune response in cultures of spleen cells; Lancet II (1967), 1279 ff.« und von Lefkovits, 1 in : »Induction of antibody forming cell clones in microcultures; Europ. J. Immunol. 2 (1972), 360 ff«.

Bei den in diesen Literaturstellen beschriebenen Kulturmethoden werden Nährmedien benutzt, die durch spezielle Zusatzstoffe und foetales Kälberserum (FCF) ergänzt worden sind, und man die Zellen nach Zugabe des Antigens für einige Tage bei einer Temperatur von z. B. 37°C inkubiert, wobei sehr oft eine CO₂-Begasung durchgeführt wird. Die Zellen werden anschließend von toten Zellen und vom Antigen in an sich bekannter Weise gereinigt. Sie können auch in geeigneten Fällen fusioniert werden, wie dieses nachfolgend noch beschrieben wird.

Zellkulturen können aber auch zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern verwendet werden. Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Humanhämoglobin und Humanhämoglobinbestandteile ist bekannt und beispielsweise von Stamatoyannopoulos et al. in: »Mapping of antigenic sites on human haemoglobin by means of monoclonal anitbodies and , !.haemoglobin ,variants«; Lancet II (1981) 952 ,ff. ''beschrieben. Zur Durchführung dieser Methode kann beispielsweise wie folgt Vorgegangen werden:

Zunächst werden Mätuse mit Humanhämoglobin immunisiert. Nach erfolgreicher Immunisierung, die sich durch einen hohen Spiegel an anti-Humänhämoglobin-Antikörpern im !!Serum anzeigt, werden die Mäuse getötet und Milz und Lymphknoten entfernt.

Die in den Geweben dieser Organe enthaltenen Zellen werden isoliert und mit einer 8-Azaguariin-resistetiten genetisch identischen Myelomzeilinie fusioniert, in dem sie in zweckmäßigen Konzentrationen unter Zugabe von Polyäthylenglykol zusammengegeben werden. Anschließend werden die Zellen in einem Selektivmedium aufgenommen. Nach etwa 10 bis 14 Tagen werden die ersten Kolonien für das bloße Auge sichtbar, und es kommt zu einer pH-Wert-Verschiebung im Nährmedium der Zellen. Man kann die Überstände der Zellkulturen aus der Kulturplatte abnehmen und auf Antikörperaktivität überprüfen. Wenn die Überstände die gewünschten Antikörper enthalten, werden die entsprechenden Zellen der Kulturplatte in Platten und Kulturflaschen weiter vermehrt.

Zur Herstellung von besonders hochkonzentrierten Antikörperlösungen appliziert man die Antikörper-produzierenden Zellen in den Bauchraum von Mäusen, wobei diesen vorzugsweise wenige Tage zuvor ein für diesen Zweck im Handel angeboten :s Mineralöl in den Bauchraurn gespritzt worden ist. Nach einigen Wochen entwickelt die Maus eine große Menge an Aszites (= Bauchraumflüssigkeit), Tumorzellen und oft auch solide Tumore, an denen die Maus meistens zugrundegeht. Die Aszites-Flüssigkeit enthält die gewünschten Antikörper in sehr hoher Konzentration.

Bei der Kombination von der »in vivoTmmunisierung« mit der »in vitro-Immunisierung« wird das Tier in oben beschriebener Weise immunisiert, und anschließend werden die Zellen von Milz und Lymphknoten zusätzlich in der Zellkultur mit dem Antigen inkubiert.

Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte tierische Serum, der Zellkulturüberstand oder die Aszites-Flüssigkeit enthalten neben den Antikörpern bzw. Antikörperfragmenten weitere Proteine, so daß es zweckmäßig ist, eine mit Antikörpern angereicherte Fraktion auszufällen. Diese Ausfällung kann erfindungsgemäß mit festem Ammoniumsulfat vorgenommen werden. Nach einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens gibt man zu diesem Z- /eck in der Kälte bei etwa 0° bis 4°C dieses Salz hinzu, bis eine zweckmäßige Konzentration erreicht ist. Es ist aber auch möglich, eine gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung in Wasser tropfenweise zuzugeben. Gute Ergebnisse werden mit einer Konzentration zwischen 106 bis 291 g, insbesondere etwa 187 g Ammoniumsulfat pro Liter Antikörper-haltiger Flüssigkeit erhalten. Diese Werte entsprechen etwa einer Endkonzentration von 20% bis 50%, insbesondere von 33% Sättigung.

Nachdem das Ammoniumsulfat vollständig in Lösung gegangen ist, ist es vorteilhaft, die Flüssigkeit für weitere 0,5 bis 2^Λ Stunden, vorzugsweise 1 bis 2 Ständen zu rühren. Die Temperatur, bei der die Ausfällung mit Ammoniumsulfat vorgenommen wird, ist nicht entscheidend und kann über einen weiten Bereich variieren. Einerseits wird in der Wanne eine größeie Proteinmenge ausgefällt als in der Kälte, andererseits wird bei einem Arbeiten in der Kälte die enzymatisch Aktivität von gegebenenfalls anwesenden ProJeinasen verringert. Anschließend wird der Antikörper-haltige Niederschlag zweckmäßig hochtpurig abzenirifugiert und der Überstand dekantiert und verworfen.

Dei; Niederschlag wird zweckmäßig in einem Bruchteil des Volumens der Ausgangsflüssigkeit (beispielsweise ein Fünftel) in einem wäßrigen Medium im einfachsten Fall in Aquä dest. gelöst. Dieses kann vorzugsweise an sich bekannte Puffer, Salze bzw. Serurm-Albumin, 'Casein oder Gelantine enthalten und einen pH-

Wert von 5 bis 10, vorzugsweise von 7,2 ± 0,8 aufweisen, wobei die Molarität zweckmäßig höchstens 2 Mol/Liter beträgt. In an sich bekannter Weise wird dieses wäßrige Medium bis zur Sulfatfreiheit gegen ein wäßriges Medium dialysiert. Es wird bevorzugt, daß dieses wäßrige Medium Puffer, vorzugsweise Phosphatpuffer nach Sörensen enthält und einen pH-Wert von 5 bis 10, vorzugsweise 7,2 ±0,8 und eine Salzkonzentration von maximall Mol/Liter,vorzugsweiseunterö,l Mol/Liter aufweist. Die Zusammensetzung der zu dialysierenden Lösung und der wäßrigen Lösung gegen die die Dialyse erfolgt, kann dabei identisch sein.

Durch die Maßnahme der Stufe 3 des erfindungsgemäßen Verfahrens kommt es zu einer unspezifischen Anlagerung von den anwesenden Proteinen an der Oberfläche von den anwesenden Polystyrol-Latexteilchen. Es hat sich als zweckmäßig herausgestellt, die Latexteilchen in Form einer wäßrigen Suspension zu verwenden, wie sie im Handel ist.

Nach einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt im fertigen Latextestreagenz eine Polystyrolsuspension vor, welche etwa 0,1 bis 12 Gew.-% Feststoffteilchen enthält. So gibt es handelsübliche Polystyrolsuspensionen mit 10% Festbestandteilen, weäche ggf. auch kleine Mengen an Hilfsstoffen, wie beispielsweise Stabilisatoren, Antioxidationsmittel usw. enthalten können, und diese können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren unverändert eingesetzt werden.

Die zweckmäßige Menge an Latexteilchen im JO gebrauchsfertigen Testreagenz hängt davon ab, daß es im allgemeinen vorteilhaft ist, daß eine Agglutination, welche bei der bestimmungsmäßigen Verwendung des Reagenz Humanhämoglobin bzw. Humanhämoglobinbestandteile anzeigt, mit dem bloßen Auge festgestellt werden kann.

Die Teiichendufchmessef des PoiysiyroHatex variieren über einen sehr weiten Bereich. So können entsprechende Latexpartikel mit einem Durchmesser von 0,0018 bis zu einem Durchmesser von 100 Mikrometer verwendet werden, wobei ein Latexteilchen-Durchmesser von 0,005 bis 5 (insbesondere bis 1) Mikrometer bevorzugt wird. Auch in dieser Hinsicht ist es zweckmäßig, auf einen Durchmesserbereich der Latexteilchen zurückzugreifen, welcher in leicht verfügbaren Handelspräparaten gegeben ist.

Es liegt in der Natur der Sache, daß die für die Ablagerung der Proteine verfügbare Oberfläche der suspendierten Polystyrolteilchen von deren Teilchengrößenbereich abhängt Je kleiner die Größe der Polystyrolteilchen ist, desto mehr Oberfläche der Teilchen steht zur Verfügung. Für einen Fachmann ist es dabei ohne weiteres möglich, für einen gegebenen Teilchengrößenbereich durch einfache Vorversuche eine für die gewünschte Anlagerung der Proteine ausreichende Menge der Polystyrolteiichen zu bestimmen. Wird beispielsweise ein Polystyrollatex mit Teilchengrößen von 0,305 Mikrometern oder 0,312 Mikrometern (wie sie bei bestimmten Handelspräparaten) gegeben sind) eingesetzt, so werden mit 5 ecm Suspension mit einem Gehalt von 2 Gew.-% Feststoffteilchen für 0,5 ecm einer Antikörperfraktion mit etwa 10-20 mg Proteingehalt außerordentlich gute Ergebnisse erhalten. Es können zum Beispiel bei den oben angegebenen Teilchengrö-Sen der Polystyrolteiichen auch etwa 10 can der Suspension mit 1% des Teilchengehalis verwendet werden, um beispielsweise 33 mg Protein in 1 ecm Antikör-Derfraktion zu binden.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Polystyrollatex-Suspension mit einer geeigneten Pufferlösung verdünnt oder das Suspensionsmedium durch diese vollständig ersetzt. Als Lösungs- oder Verdünnungsmittel für das erfindungsgemäße Verfahren werden in der Regel blutisotone Systeme verwendet. Als einfachstes Lösungs- bzw. Verdünnungsmittel ist 0,9%ige Kochsalzlösung zu nennen, weiche gegebenenfalls einen geeigneten Puffer, wie Phosphatsalz oder Glycin oder Tris-HCl enthält.

Vorzugsweise werden an dieser Stelle des erfindungsgemäßen Verfahrens Glycin-gepufferte Kochsalzlösungen eingesetzt, wobei die pH-Werte von 5 bis 10 besonders bevorzugt werden. Die Pufferlösungen können zweckmäßig Salze, Albumin und/oder Gelatine bzw. Casein enthalten. Niedermolare Tris-HCI-Puffer oder Phosphatpuffer, welche bereits bekannt sind, können erfindungsgemäß ebenfalls angewendet werden.

So kann zur Verdünnung der Polystyrolsuspension beispielsweise eine Glycin-gepufferte Kochsalzlösung verwendet werden, welche eine Molarität von 0,001 bis 2 Mol/Liter, vorzugsweise von 0,01 bis 1,5 Mol/Liter Glycin und NaCl, insbesondere von 0,1 bis 0,9 MoI/ Liter Glycin und von 0,1 ±0,05 Mol/Liter NaCl aufweist.

Wie bereits oben angegeben, können als Polystyrollatices handelsübliche Präparate verwendet werden. Insbesondere sokne mit einem Anteil an Festbestandteilen von 10% sind erfindungsgemäß außerordentlich gut geeignet. Unter dem Begriff »Polystyrol« sollen sowohl Homo- als auch Mischpolymerisate von Polystyrol und Polystyrolderivaten verstanden werden. So sind beispielsweise Lactices aus Mischpolymeren von Styrol und Butadien, insbesondere in einem Verhältnis von etwa 95 : 5 bis 60 : 40 Gew.-%, aus t.-Butylstyrol und Vinyltoluol, und aus Styrol und Divinylbenzol (beispielsweise in einem Verhältnis von 95 : 5 Gew.-%) erfindungsgemäß sehr gut verwendbar.

Die dialysierte Antikörper- bzw. Antikörperfragmentfraktion enthält normalerweise einen beträchtlichen Anteil an Begleitproteinen, wie beispielsweise Globuline und Albumine. Sofem das nicht der Fall ist, ist es zweckmäßig, der für die Beschichtung verwendeten Antikörperfraktion bzw. Antikörperfragmentfraktion geeignete Proteine hinzuzugeben, wofür beispielsweise ein Rinderserumalbuminzusatz vorteilhaft ist. Der Anteil der Begleitproteine, bezogen auf die Antikörperfraktionen, kann über 20%, beispielsweise etwa 20-30% betragen.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die mit der Polystyroisuspension versetzte Antikörperfraktion zunächst 30 Minuten bis etwa 24 Stunden (beispielsweise II ±3 Stunden) bei Zimmertemperatur belassen, wobei es zweckmäßig ist, zumindest während eines Teiles dieser Zeit mechanische Maßnahmen, wie Rütteln, Schütteln oder Schwenken vorzusehen. Danach ist es zweckmäßig, die Mischung unter Abkühlung beispielsweise auf 4°C für wenigstens 8 Stunden stehen zu lassen. Dieses Stehenlassen unter Abkühlung kann durch ein Abzentrifugieren und Abdekantieren nach der oben angegebenen halbstündigen bis 24stündigen Handlung ersetzt werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird nun die Mischung, weiche den Folystyrülläiex mit der Antikörperfraktion enthält, mit einer ein oberflächenaktives Mittel der allgemeinen Formel

U₂C CH-CH₂-COOR

I I

HO(C₂H₄O)^HC

CH-(OC₂H₄)4-OH

woifii R einen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit etwa 8 bis 22 C-Atomen und a, b und c jeweils eine ganze positive Zahl bedeuten, wobei die Summe von α, b und c vorzugsweise 5 bis 200 ist, enthaltenden Lösung versetzt. Die Menge dieses oberflächenaktiven Mittels kann bis 1 Vol-%, vorzugsweise von 0,0001 bis 0,2 Vol-%, insbesondere 0,015 ± 0,1 Vol-%, bezogen auf das Volumen der Gesamtlösung betragen.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als oberflächenaktives Mittel der obengenannten Formel ein solches verwendet, bei dem R einen Laurylrest bedeutet und die Summe der Indizes a, b und c etwa 20 ist.

Es ist sehr vorteilhaft, wenn die oben beschriebene Lösung auch Polyvinylpyrrolidon enthält. Dieses wird in einer Menge verwendet, daß das Polyvinylpyrrolidon in einer Konzentration von 0,0001 Gew.-% bis 5 Gew.-%, insbesondere von etwa0,1 oderO,2 Gew.-% in dem Latexreagenz vorhanden ist.

Auch das Polyvinylpyrrolidon ist in erfindungsgemäß geeigneter Form als Handelsprodukt erhältlich. Es kommen insbesondere Materialien mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 400 000 in Betracht. Insbesondere können Vinylpyrrolidonpolymere mit einem /i-Wert von 10 bis 90, beispielsweise 30 bis 90 ganz speziell mit einem K-Wert von 40 mit gutem Erfolg eingesetzt werden.

Es wurde bereits oben daraufhingewiesen, daß es vorteilhaft ist, wenn die bei dem erfindungsgemäßen Verzugsweise Puffer enthalten. Dabei ist es vorteilhaft, Salzmengen von 0,001 bis 1,0 Mol bezogen auf die Gesamtlösung des Polyvinylpyrrolidons zu verwenden. Auch in diesem Falle gibt ein Phosphatpuffer, welcher -der Lösung einen pH-Wert von 5-10, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,6 vermittelt, sehr gute Ergebnisse.

Im übrigen gelten für den Salzzusatz und die Puffermittel diejenigen Ausführungen, welche bereits oben für andere Behandlungslösungen des erfindungsgemäßen Verfahrens gemacht worden ist.

Die Lösung mit der Antikörperfraktion bzw. Antikör-■perfragmentfraktion, dem oberflächenaktiven Mittel und gegebenenfalls dem Polyvinylpyrrolidon ist das gebrauchsfertige Latexreagenz, welches die bereits oben genannten Vorteile gegenüber entsprechenden Reagenzien nach dem Stand der Technik aufweist. Es ist über Monate bzw. sogar Jahre hinweg lagerungsfähig.

Das erfindungsgemäß hergestellte Latextestreagenz kann zum Nachweis und zur Differenzierung von Humanhämoglobin, Humanhämoglobinbestandteilen oder Humanhämoglobinvarianten in einer Vielzahl von verschiedenen Materialien durchgeführt werden. So sind entsprechende Untersuchungen von praktisch allen physiologischen Körperflüssigkeiten, wie z. B. Serum, Plasma, Urin, Speichel, Tränenflüssigkeit, Magensaft, Duodenalsaft, Galle, Pankreasekret, Schweiß, Liquor, Gelenkpunktate (Synovialsekret), Fruchtwasser, Lymphe, Ejakulat, Muttermilch und Sputum möglich, insbesondere ist aber der zuverlässige Nachweis von Blut im Stuhl zur medizinischen Diagnose außerordentlich wichtig. Mit gutem Erfolg ist auch die gewünschte Bestimmung in allen Körperspülflüssigkeiten, svie Bronchiallavage-Flüssigkeit, Magenspülflüssigkeit, Drainageflüssigkeit, aber auch in pathologischen Körperflüssigkeiten, wie Eiter, seröse Wund-S sekrete, Aszites, Perikard und sonstige Ergüsse, Abszess- und sonstige Punktate von Zysten, Erbrochenes, Inhalt von blasenartigen Hauterkrankungen, inklusive eier Schleimhaut, möglich. Schließlich kann der Nachweis und Differenzierung von Hämoglobin und den !'oben genannten Hämoglobin-artigen Stoffen auch in angefertigten Extrakten, welche z. B. in der Gerichtsmedizikn aus Stoffen oder von Flächen entfernten Materialien gewonnen werden, mit dem erfindungsgemäß hergestellten Latextestreagenz vorgenommen werden.

Es wurde bereits darauf hingewiesen, daß mit dem erfindungsgemäß hergestellten Latextestreagenz die Anzahl falscher Ergebnisse, d. h. fehlende Anzeige von Hämoglobin, sowohl dieses im zu uniersuchenden Material vorhanden ist oder das Auftreten von Agglutination trotz fehlendem Hämoglobin oder Hämoglobinartigen Stoffen, beträchtlich reduziert werden kann. Diese volle Spezifität und einwandfreie Negativkontrolle bleibt auch nach einer Lagerung von vielen Monaten erhalten.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Aus dem Serum des Blutes einer gegen Humanhämoglobin immunisierten Ziege wurden die Antikörper in folgender Weise aufbereitet:

Die Antikörper wurden durch Zugabe von Ammoniumsulfat zum Serum bis zu einer Endkonzentration von 33% der Sättigung ausgefällt und abzentrifugiert.

T*lJö aitcftafäUta A i^fitKrrMarfroIrtirYn tuiirHA /Janfl/Ή in

a-rtv UUi>QVlUllk\f lllltlnwipviliunliw·. ..üsvv »«.-iuv-i iLL 52 mM einer Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 aufgelöst und gegen denselben Puffer bis zur Sulfatfreiheit dialysiert.

Eine handelsübliche Polystyrol-Latexsuspension, bei der der Durchmesser der Latexteilchen etwa 0,305 μιη betrug, wurde in einem Volumensverhältnis von 1 (Latexsuspension) zu 4 (gepufferte Kochsalzlösung) mit einer Glyzin-gepufferten Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 8,75 gut vermischt. Diese Glyzin-gepufferte-Kochsalzlösung war vorher hergestellt worden, indem 467 ecm einer 2 m Glyzinlösung in Wasser zunächst mit 100 ecm einer 1 m Natriumlauge vermischt wurden. Diese Mischung wurde dann im VoIumenverhältnis von 1 : 1 mit 0,9%iger Kochsalzlösung gemischt.

Zu 5 ecm der verdünnten Polystyrollatex-Suspension wurden nun 0,5 ecm der oben erhaltenen Lösung der Antikörperfraktion zugegeben, wobei in dieser 16,5 mg Protein in den verwendeten 0.5 ecm der Lösung enthalten waren. Es wurde wiederum gut gemischt.

Die so erhaltene Mischung wurde zunächst 12 Stunden bei Raumtemperatur und danach weitere 12 Stunden bei 4°C stehengelassen.

Danach wurden die 5,5 ecm der beschichteten Latexsuspension mit der gleichen Volumenmenge einer GIyzin-gepufferten-Kochsalzlösung verdünnt, die sowohl Polyvinylpyrrolidon als auch ein bestimmtes oberflächenaktives Mittel enthielt.

Diese Lösung war dadurch erhalten worden, daß man zu der bereits oben beschriebenen Glyzin-gepufferten-Kochsalzlösung 0,1 Vol/Vol.-% eines oberflächenakti-

11

ven Mittel der obenstehenden Formel I, bei dem R einen Laurylrest bedeutet und die Summe der Indizes o, b und c etwa 20 ist, zugab. Des weiteren wurde zu der Pufferlösung auch noch 0,2 Gew./Vol.-% an Polyvinylpyrrolidon mit einem /c-Wert von 40 zugefügt.

Die so erhaltene Lösung ist ein Latextestreagenz, welches zum Nachweis und zur Differen2ierung von Humanhämoglobin, Humanhämoglobin-Bestandteilen oder Humanhämoglobin-Varianten mit großem Erfolg verwendet werden kann.

Beispiel 2

Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, wobei jedoch ein Polystyroüatex verwendet wurde, bei dem der Durchmesser der Polystyrollatexteilchen 0,312 μΐη

μ betrug.

~ Beispiel 3

20

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde als Glyzin-gepufferte-Kochsalzlösung eine solche mit einem pH-Wert von 8,2 verwendet, welche 7,505 g Glyzin; Ig NaN₃; 5,846 g NaCl auf 2 Liter Wasser enthielt. Die Konzentration des Kochsalz war also 0,1 molar.

Beispiel 4

Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch betrug die Konzentration an Polyvinylpyrrolidon in der Glyzin-gepuffertekn-Kochsalzlösung 0,1 Gew./Vol.-%.

Beispiel 5

35

Das Verfahren nach Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde 1 ecm dsr PciystyroHateX'Suspension rr.it 9 ecm der 0,1 m Glyzin-gepufferten-Kochsalzlösung vermischt. Dazu wurden dann 1 ecm Antikörperfraktion gegeben, welche also 33 mg Protein enthielten.

Beispiel' 6

(Nachweis von Humanhämoglobin im Stuhl)

45

1 ecm der in Beispiel 1 verwendeten Glyzin-gepufferten Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 8,75, ·■· welche 0,005% des in Beispiel 1 genannten oberflächenaktiven Mittels enthielt, wurden zu 0,1 bis 0,2 g Stuhl ■hinzugefügt. Nach gründlichem Vermischen wurde zen-'trifugiert und der Überstand nochmals durch ein Filter mit 0,45 μηι Porenweite filtriert. Das Filter war vorher mit Glyzin-gepufferter-Kochsalzlösung, welche einen Zusatz von 1% Albumin enthielt, vorgespült worden.

10 ecm Stuhl Suspension wurden danach mit 10 ecm eins Latexreagenz nach den Beispielen 1-5 vermischt. Bei Anwesenheit von Hämoglobin war nach 1 -2 Minuten die Agglutination mit dem bloßen Auge festzustellen.

Es ist ersichtlich, daß es vorteilhaft ist, wenn die zu untersuchenden Materialien in einer isotonen Lösung, beispielsweise einer gepufferten Kochsalzlösung, die ein oberflächenaktives Mittel der Formel I zweckmäßig in einer Menge bis zu 1 Vol.-%, gelöst oder suspendiert werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Latextestreagenz aus anti-Humanhämoglobin-Antikörpern oder aus anti-Humanhämoglobinbestandteil-Antikörpern oder aus deren Fragmenten, dadurch gekennzeichnet, daß man

aus Flüssigkeiten, welche diese Antikörper oder Fragmente dieser Antikörper enthalten, diese mit Ammoniumsulfat ausfallt und abzentrifugiert,

die abzentrifugierten Feststoffe, nach ihrer Resuspendierung in einem zweiten wäßrigen Medium, in diesem bis zur Sulfatfreiheit dialysiert,

die dialysierte Antikörper(bzw. Antikörperfragment)-fraktion mit einer wäßrigen Suspension von Polystyrol-Latexteilchen vermischt und vorzugsweise bei einer Temperatur von 0⁰C bis 100⁰C stehen läßt und

H₂C

I
HO(C₂H₄O)₁-HC

O
κ \

CH-CH₂-COOR

CH-COC₂RO₁₃-OH
C"H-(OC₂H₄)₄-OH

25

30

worin R einen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit etwa 8 bis 22 c-Atomen und a, b und c jeweils eine ganze positive Zahl bedeuten, wobei die Summe von a, b und c vorzugsweise 5 bis 200 ist, versetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung zusätzlich mit Polyvinylpyrrolidon versetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Resuspendierung der abzentrifugierten Feststoffe in einem wäßrigen Medium erfolgt, dem gegebenenfalls an sich bekannte Puffer, Salze bzw. Albumin oder Gelatine oder Casein beigemischt sind, und welches einen pH-Wert von 5-10, vorzugsweise von 7,2 ± 0,8 aufweist und eine Molarität von höchstens 2 Mol/l besitzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zu dialysierende Lösung gegen ein wäßriges Medium dialysiert wird, welches Puffer, vorzugsweise Phosphatpuffer (nach Sörensen), enthält und einen pH-Wert von 5 -10, Vorzugsweise 7,2 ± 0,8, und eine Salzkonzentration von maximal 1 Mol/Liter, vorzugsweise unter 0,1 Mol/ Liter, aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 3 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Dialyse gegen denselben ^Puffer bzw. dasselbe Salz, wie es in der zu dialysierenden Lösung anwesend ist, vorgenommen wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Polystyrol-Latexteilchen mit einem Durchmesser von 0,0018 Mikrometer bis 100 Mikrometer, vorzugsweise mit einem Durchmesser von 0,005 bis 5 (insbesondere bis 1) Mikrometer, verwendet werden.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Suspension von Polystyrol-Latexteilchen verwendet wird, die mit einer geeigneten Pufferlösung, insbesondere mit einer Glycin-gepufferten-Kochsalzlösung, mit einem pH-Wert von 5-10, insbesondere von 8,8 + 0,4, sowie einer Molarität von 0,001 bis 2 Mol/Liter, vorzugsweise von 0,01 bis 1,5 Mol/Liter Glycin und NaCl und insbesondere von 0,1 bis 0,9 Mol/Liter Glycin und von 0,1 ± 0,05 Mol/Liter NaCl, verdünnt worden ist

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumen-Verhältnis zwischen Polystyrollatex-Suspension und gepufferter Verdünnungslösung so gewählt wird, daß eine Laiexsuspension entsteht, die 2 ± 0,5% Feststoffteilchen enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die mit der Suspension von Polystyrol-Latexteilchen versetzte Antikörperfraktion gegebenenfalls unter Rütteln, Schütteln bzw. Schwenken bei Zimmertemperatur über einen Zeitraum von 30 Minuten bis zu 24 Stunden, vorzugsweise für 11 ± 3 Stunden stehengelassen wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Stehenlassen der Antikörperfraktion-Latexmischung in Stufe 4 gegebenenfalls im Anschluß an die Maßnahmen von Anspruch 9 bei etwa 4°C und wenigstens für 8 Stunden erfolgt.

11. Verfahren nach Anspruch 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 5 eine Polyvinylpyrrolidon enthaltende Lösung zugegeben wird, welche eine Endkonzentration (Grammprozent) von PVP im Latextestreagenz zwischen 0,0001 und 5%, vorzugsweise zwischen 0,001% und 1% und insbesondere von 0,05% und 0,1%, bewirkt.

12. Verfahren nach Anspruch 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Polyvinylpyrrolidon einen /f-Wert von K 10 bis K 90, vorzugsweise von K 30 bis K 90, insbesondere von K 40 aufweist.

13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 5 das oberflächenaktive Mittel in einer Menge bis zu 1 Vol-%, vorzugsweise von 0,0001 bis 0,2 Vol-% und insbesondere 0,015 ±0,01 Vol-%, bezogen auf das Volumen der Gesamtlösung, verwendet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß als oberflächenaktives Mittel ein solches verwendet wird, bei dem der Rest R einen Laurylresl bedeutet und die Summe der Indices a, b und c etwa 20 ist.

15. Verfahren nach Anspruch 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyvinylpyrrolidon und das oberflächenaktive Mittel enthaltende Lösung zusätzlich vorzugsweise 0,001 bis 1,0 Mol, insbesondere bis 0,1 Mol eines geeigneten anorganischen Salzes, vorzugsweise einen Puffer, enthält.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer der Lösung eine pH-Wert von 5-10, insbesondere von 8,8 + 0,4 vermittelt.

17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ammoniumsulfatkonzentration, bezogen auf das Endvolumen der Antikörper bzw. Antikörperfragmente enthaltenden Flüssigkeit zwischen 20% und 50% Sättigung, insbesondere bei 33% Sättigung liegt.

18. Verwendung eines nach Anspruch 1 hergestell-

ten Latextestreagenz zum Nachweis und zur Differenzierung von Humanhämoglobin, Humanhämoglobinbestandteilen oder Humanhämoglobinvarianten in allen physiologischen Körperflüssigkeiten sowie insbesondere im Stuhl, sowie in allen Körperspülflüssigkeiten und pathologischen Körperflüssigkeiten sowie Extrakten, die aus Stoffen oder von Flächen entfernten Materialien gewonnen worden sind.

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Latextestreagenz aus anti-Humanhämoglobin-Antikörpern oder anti-Humanhämoglobinbestandteil-Antikörpern oder aus deren Fragmenten, und die Verwendung von diesem zum Nachweis und zur Differenzierung von Humanhämoglobin, Humanhämoglobinbestandteilen oder Humanhämoglobinvarianten.

Es ist bekannt, &aS der Nachweis von Humanhämoglobin durch einen Latex-Agglutinationstest durchgeführt werden kann. Bei diesem Test geht man von entsprechenden Antiseren oder Antikörpern aus, die durch Immunisierung von Kaninchen oder Ziegen gegen Humanhämoglobin erhalten werden können. Bei der Herstellung eines bekannten Latexnstreagenz (E C Adams, K M Layman, Annals of Clinical and Laboratory Science Band 4 (1974) S. 343 ff.) werden zunächst nach einer Erhitzungsstufe des Serums der immunisierten Tiere die heterophilen Antikörper durch Absorption an lyop:.ylisierten, formalinisierten Schafserythrozyten entfernt, und nach der ^ugabe von Rivanol-Lösung zu dem Antiserum-Überstand wird dieser zentrifugiert und der dabei erhaltene Überstand mehrmals mit Aktivkohle und nachfolgendem Zentrifugie-

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philisation des geklärten Überstandes erfolgt. - Das Lyophilisat wird in einer neutralen Kochsalzlösung aufgelöst und diese Lösung mit handelsüblichen Polystyrol-Latexteilchen behandelt, wobei eine Beschichtung der Latexteilchen durch Schütteln erfolgt. Zur Herstellung eines gebrauchsfähigen Testreagenzes wird diese Latex-Lyophilisat-Mischung mit Kochsalzlösung weiter verdünnt.

Eine praktische Anwendung dieses bereits bekannten Testreagenz hat gezeigt, daß es außerordentlich wünschenswert ist, dessen Empfindlichkeit gegenüber dem nachzuweisenden Hämoglobin zu vergrößern.

Aus der DE-OS 30 02 973 ist bekannt, daß die Latexagglutinationsreaktion durch Verwendung eines speziellen Reagenz verbessert werden kann, wobei dieses Reagenz für die Latexagglutinationsreaktion und ein Verfahren zur Durchführung der genannten Reaktion beansprucht wird. Bei diesem Reagenz handelt es sich um eine oder mehrere Verbindungen der allgemeinen Formel