DE2129384A1

DE2129384A1 - Diagnostische Zubereitung zur Identifizierung von sshaemolytischer Streptococci

Info

Publication number: DE2129384A1
Application number: DE19712129384
Authority: DE
Inventors: Kronish Donald P; Zuriff Lee S
Original assignee: Warner Lambert Co LLC
Current assignee: Warner Lambert Co LLC
Priority date: 1970-07-13
Filing date: 1971-06-14
Publication date: 1972-01-20
Also published as: IT943592B; GB1290642A; DK125484B; AU2831871A; CA937140A; US3699003A; SE364986B; FR2097950A5; JPS524604B1; CH557166A

Description

Dr. F. Zumstein sen. - Dr. E. Assmann Dr. R. Koenlgsberger - Dlpl.-Phys. R. Holzbauer - Dr. F. Zumsteln Jun.

PATENTANWÄLTE

TELEFON: SAMMEL-NR. 225341 TELEGRAMME: ZUMPAT POSTSCHECKKONTO: MÜNCHEN 91139

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8 MÜNCHEN 2,

Case 54 277

WAHBER-LAMBEHT COMPANY, Morris Plains, New Jersey, USA

Diagnostische Zubereitung zur Identifizierung von ß-hämolytischer Streptococci

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zubereitung zur biochemischen Identifizierung von ß-hämolytischer Streptococci in serologische Gruppen, d.h. in Gruppen A, B, C, D. Diese Zubereitung enthält einen Trägerstoff, d.h. einen schwammförmigen Streifen, der eine Glycerinreagenzbande, eine Salicinreagenzbande und und eine Äsculinreagenzbande, enthält. In den Glycerin- und Salicinreagenzbanden sind ebenfalls pH-Indikatorsysteme enthalten. Die Äsculinbande enthält eine Verbindung, die mit den Asculinabbauprodukten reagiert und einen Farbwechsel ergibt. Diese Banden werden voneinander durch hydrophobe Grenzschichten getrennt. Beim Gebrauch wird eine Menge des ß-hämolytisehen Streptococcus, dessen serologische Identifikation bestimmt werden soll, auf jede der drei Reagenzbanden gebracht. Ein Tropfen Salzlösung oder Wasser wird zu der Salicinfläche und zu der Äsculinflache gegeben. Der Streifen wird in eine Röhre gegeben, die 0,3 ml Salzlösung oder Wasser enthält, um die Glycerinbande zu benetzen. Der mit Reagenz imprägniert Streifen wird bei ungefähr 37⁰C während 2 bis 4 Stunden inkubiert. Die Zuckerfermentation wird durch einen Indikatorfarbwechsel und die Äsculinhydrolyse durch Bildung einer grauschwarzen Farbe gemessen. Die

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Gruppe A Streptococci, die die meisten klinischen Symptome ausmachen, wie rheumatisches Fieber und Nephritis, sind äsculinnegativ, glycerinnegativ und salicinpositiv. Streptococci der Gruppen B und C können bei Krankheiten vorkommen, aber sie sind im allgemeinen ein Teil der normalen Flora bei der primären Isolierung von Blutplättehen, die ß-Hämolyse zeigen. Es ist wichtig, dass man zwischen diesen Gruppen und der Gruppe A eine Unterscheidung treffen kann. Die Streptococci der Gruppe D, die als Enterococci bekannt sind, treten oft bei der Infektion des urinären Traktes auf und eine schnelle Identifizierung dieser Organismen ist ebenfalls klinisch wichtig.

Streptococci sind grampositive Organismen, die eine runde oder ovale Form besitzen und die Tendenz aufweisen, Ketten zu bilden. Diese Streptococci, die primäre Pathogenität für Menschen und Tiere besitzen, gehören zu der Unterklasse der hämolytischen Streptococci. Diese Unterteilung ist auf der Beobachtung basiert, dass diese Streptococci Lysis der roten Blutzellen bewirken, eine Eigenschaft, die zur Initialidentifizierung dieser Organismen in Kulturmaterial nützlich ist. In einem Blutplättchen, das eine klare Zone zeigt, die durch Lysis der roten Blutzellen bedingt ist, wird der Organismus als ß-hämolytisch bezeichnet. Andere Arten von Hämolyse wurden ebenfalls beschrieben.

Als Ergebnis ausgedehnter serologischer Untersuchungen wurden die ß-hämolytischen Streptococci weiter in eine. Anzahl von serologischen Gruppen geteilt, die sich unterscheiden und die auf gewisse Weise mit der natürlichen Art des Vorkommens und der Pathogenität des Organismus verwandt sind. Die serologische Identifizierung wurde daher bei der Identifizierung von pathogenen Streptococci ein wichtiger Schritt. Es ist im allgemeinen bekannt, dass hämolytische Streptococci, die zu den serologischen Gruppen A und D gehören, nicht nur für akute streptococca-Ie Krankheiten beim Menschen verantwortlich sind, sondern dass sie auch andere Krankheiten, wie rheumatisches Fieber, Nephrititis, -Bakteriurie und andere, verursachen. Dementsprechend ...... Ϊ098Γ8ΤΠ87Τ

ist es wichtig, dass der Kliniker die serologische Gruppe, zu der der Organismus gehört, kennt, wenn ß-hämoIytische Streptococci isoliert werden, so dass eine geeignete Behandlung initiiert werden kann. Wenn beispielsweise ein Arzt in einer Kultur aus dem oberen Respirationstrakt ß-hämoIytische Streptococci entdeckt und er die isolierten Streptococci nicht typisieren kann, so wird er häufig ein Antibiotikum über längere Zeit verabreichen, um mögliche Folgekrankheiten zu vermeiden. In vielen Fällen, wenn der Organismus nicht ein Streptococci der Gruppe A ist, ist eine antibiotische Behandlung nicht erforderlich. " ..-■··

In den serologischen Gruppen, wie sie von Lancefield ( Journal of Experimental Medicine 57: 571-595, 1933) beschrieben sind, ist die Identifizierung eine Funktion der Anwesenheit bestimmter Gruppen von zellulare" Antigenen. Diese Antigene werden durch Präzipinumsetzungen zwischen Lösungen der Extrakte der unbekannten Streptoeoeeuskultur und Antisera entdeckt, die hergestellt wurden,indem man Kaninchen mit in der Wärme abgetöteten Suspensionen von Streptococci immunisierte. Es ist leicht zu glauben, dass ein solches Verfahren viel Zeit verbraucht und dass man Personal zur Verfügung haben muss, das gut geschult ist.

Es wurde nun ein Verfahren gefunden, gemäss dem ß-hämolytische Streptococci leicht in serologische Gruppen durch ein schnelles und positives biochemisches Verfahren identifiziert werden können. Unter Bezugnahme auf die beiliegende Zeichnung wird die vorliegende Erfindung näher erläutert.

Allgemein gesagt, enthält die erfindungsgemässe Zubereitung einen 5Frägerstoff, der typischerweise ein Streifen aus einem schwammförmigen Material ist, der eine Vielzahl begrenzter Flächen enthält.

Die Fläche 1 ist mit Glycerin, einem pH-Indikatorsystem imprägniert und enthält gegebenenfalls Nährmedium und sie besitzt

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'! einen pH-Wert, der unter Bezugnahme auf den verwendeten pH-Indi-• kator auf dessen alkalischer Seite liegt.

; Die Fläche 2 ist eine hydrophobe Grenzschicht, die in der Lage

: ist zu verhindern, dass die Bestandteile migrieren. Irgendeine

, Substanz, die eine wasserdichte Grenzschicht bildet, kann mit

j Vorteil verwendet werden. Geeignete Materialien schliessen bei-

. spielsweise ein Wachse, Lacke und farblose acrylische Harze,

I die als KRYLON 150 CRYSTAL CLEAR bekannt sind. Dieses Krylon-

I -

j material ist besonders bevorzugt. Es steht in einem Kohlenwas- ! serstoffträgermittel zur Verfugung und kann zur leichteren Ani wendung mit Toluol oder anderen Kohlenwasserstofflösungsmitteln, ! beispielsweise mit Methyl-, Äthyl- oder Isopropylalkohol, verj dünnt werden.

' Die Fläche 3 ist mit Salicin, einem pH-Indikatorsystem imprägniert und enthält gegebenenfalls ein Nahrmedium und hat einen I pH-Wert, der auf der alkalischen Seite des verwendeten pH-In- ; dikators liegt.

; Die Fläche 4 ist eine hydrophobe Grenzschicht, die die gleiche ist, wie die, die zuvor für die Fläche 2 beschrieben wurde.

ι Die Fläche 5 ist. mit Ä'sculin und einem Eisen(III)-salz, bei-

spielsweise Eisen(III)-chlorid, Eisen(III)-ammoniumcitrat, j Eisen(III)-nitrit, Eisen(III)-citrat oder einem Aluminiumsalz, j beispielsweise Aluminiumammoniumsulfat,oder einem Bleisalz, ! beispielsweise Bleiacetat oder Bleinitrat, imprägniert.

I
i
'■ Die Fläche 6 ist eine hydrophobe Grenzschicht, die die gleiche

; ist, wie sie zuvor für die Fläche 2 beschrieben wurde.

; Die Fläche 7 liegt nur gegebenenfalls vor und kann mit irgend- : einem hydrophoben Material, wie es zuvor für die Fläche 2 beschrieben wurde, und irgendeinem geeigneten Farbstoff, der zu ' Identifikationszwecken dient, imprägniert sein. j ' '

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Die Reihenfolge der Reagenzflächen auf dem Streifen ist nicht ; kritisch, solange wie jede Fläche durch eine hydrophobe Grenz- ·' schicht abgetrennt ist, aber die beschriebene Anordnung ist ; bevorzugt. j

Das Indikatorsystem für die Flächen 1 und 3 enthält Indikatoren, die zwischen einem pH-Wert von ungefähr pH 9 bis ungefähr pH 5 einen Farbwechsel ergeben. Beispiele dieser Indikatoren sind Chlorphenolrot, Bromkresolpurpur, Bromphenolrot, Bromthymolblau, Neutralrot, ^-Naphtholphthalein- und Phenolrot. Beispiele von Nährmedien sind solche, die üblicherweise zur Kultur \ von Bakterien verwendet werden, beispielsweise Pepton, Trypton, Proteose, Tryptose, Hefeextrakt usw, \

Schwammförmige Materialien, unter diesem Begriff sollen auch . schwammige und aufsaugende Materialien verstanden werden, die. als Trägerstoffe verwendet werden können, sind beispielsweise Materialien, die durch kapillare Wirkung eine Flüssigkeit aufwärtsziehen, oder Materialien, wie Filterpapier, Filz, poröse keramische Streifen, gewebte Glasfasern oder Glasfasern, die in Matten vorliegen und ähnliche. ;

Alternativ kann jedes absorbierend wirkende Material mit den aktiven Bestandteilen imprägniert werden und dann auf einem Träger, beispielsweise einem Kunststoffstreifen bzw. einem ' plastischen Streifen, angebracht werden. ;

Für die Verwendung wird eine Öse voll Organismen, die auf ei- ; ner Agarplatte mit Blut ß-Hämolyse zeigen, auf dem unteren Teil der Fläche 1 und auf den Flächen 3 und 5 verrieben. Ein Tropen Salzlösung oder Wasser wird ebenfalls auf die Flächen 3 und 5 ^: gegeben. Das entstehende System wird dann in ein Reagenzglas . mit einer Grosse von 13 x 100 mm oder einer ähnlichen Grosse, das 0,3 ml Salzlösung enthält, gegeben und dann bei 37⁰C während 2 bis 4 Stunden inkubiert.

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Wird Phenolrot als Indikator verwendet, so wird eine positive Reaktion in den Flächen 1 und 3 durch die Bildung einer gelben Farbe angezeigt. Eine negative Reaktion wird durch das Bleiben der roten Farbe angezeigt. Die positive Reaktion ist das Ergebnis der Fermentation der Zucker und der daraus resultierenden Azidität.

Eine positive Reaktion in der Fläche 5 wird durch die Entwicklung einer grau-schwarzen Farbe angezeigt, wohingegen eine negative Reaktion durch die Abwesenheit eines Farbwechsels angezeigt wird. Wieder ist die positive Reaktion das Ergebnis der Fermentation von Ä'sculin und die Umsetzung der Hydrolyseprodukte mit Eisen(lll)-salzen oder anderen Verbindungen, die eine Färbung ergeben.

Indem man die Anwesenheit oder Abwesenheit der biochemischen Wechsel beobachtet, wird die serologische Identifizierung der ß-hämolytischen Streptococci gleich aus der folgenden Tabelle erhalten:

	Streptococcus-Gruppe	A	B	G	D	G
Ä'sculin Glycerin . Salicin	+	+ d*	+ d*	+ + d*	-

! d* bedeutet variabel

Die Vorteile und die Zweckdienlichkeit der vorliegenden Erfindung sind im Hinblick darauf augenscheinlich, dass die Identifizierung von ß-hämolytischen Streptococci leicht innerhalb von 2 bis 4 Stunden erfolgen kann.

Weitere Gruppenidentifizierung kann durch die Verwendung anderer serologischer Mittel, die zuvor bei den Versuchen erforderlich waren, wie der Präzipitintest, erfolgen·

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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränken.

Beispiel 1

!Teil A - Herstellung von Glycerinreagenzlösung

Bestandteile

1. Glycerin USP

2. Pepton

3. Phenolrot

.4. destilliertes Wasser qs 5. 5,On NaOH

für jeweils 100 ml ungefähr 10-2Og ungefähr 1 - 2g

200 mg

100 ml

qs

Die Bestandteile 1, 2 und 3 werden in 90 ml destilliertem Wasser unter konstantem Rühren gelöst. Mit dem Bestandteil Nr. wird der pH-Wert auf 11,0 eingestellt. Dann fügt man soviel Washinzu, -bis -man 100 ml Reagenz lösung -erhält.

geil B - Herstellung von Salicinreagenzlösung

Bestandteile für .jeweils 100 ml

ungefähr 10-2Og ungefähr 1 — 2g 200 mg
100 ml

Salicin Pepton Phenolrot destilliertes Wasser qs

5. 5,On NaOH . qs

60 ml destilliertes Wasser wurden auf 70⁰C erwärmt. Dazu wurden 1, 2 und 3 zugefügt und unter konstantem Rühren gelöst. Der pH-Wert wurde mit 5 #uf 10,0 eingestellt. Das Volumen mit 4

• auf 100 ml eingestellt und dann wurde die Mischung auf 7O⁰C erwärmt.

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I ■ - 8 - ,

Teil C - Herstellung von Äsculinreagenzlösung ^: Bestandteile * für .jeweils 100 ml

• 1. Äsculin 2 - 5 g

2. Eisen(III)-ammoniumcitrat 1 - 2,5 g ι 3. Wasser qs

¹ 4. 1n-Natriumhydroxydlösung qs

ι 80 ml Wasser wurden auf 7O⁰C. erwärmt. Dazu fügte man 1 und 2 hinzu

■ und löste diese Verbindungen unter konstantem Rühren. Die Temperatur wurde bei 50⁰C - 70⁰C gehalten. Der pH-Wert wurde mit j 4 bei 70⁰C auf 4,3 eingestellt. Da die Äsculin-Eisen(III)- ; Ammoniumeitratmischung lichtempfindlich ist, sollte die Mi-I schung vor Licht geschützt werden.

I . ■ ■

Teil-D - Anwendung auf schwammiges Material

ί Zur Herstellung der Teststreifen stellt man zuerst die Grenz-, flächen 2 und 4 her, die ein Wandern der Reagenzlösungen, die anschliessend aufgebracht werden, verhindern sollen. Diese s Grenzzonen werden auf einen geeigneten Träger, vorzugsweise Eaton-Dikeman Nr. 623 - Filtrierpapier, angebracht, indem man eine Lacklösung verwendet, die eine wasserundurchlässige Schicht ergibt. Nachdem man die Lacklösung trocknengelassen hat, werden . auf die Flächen 1, 3 und 5 die Glycerinreagenzlösung, die j Salicinreagenzlösung und die Äsculinreagenzlösung, die gemäss den oben beschriebenen Verfahren hergestellt worden waren, angebracht. Man lässt die so gebildeten Flächen trocknen. Das Filterpapier wird dann in Streifen geschnitten.

Beispiel 2

Das folgende ist ein Beispiel für die Verwendung des Reagenzstreifens, wobei bemerkt werden soll, dass es noch viele andere Verwendungsmöglichkeiten gibt.

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Eine oder zwei Ösen voll Streptococci, die auf einer Agarplatte mit Blut ß-Hämolyse zeigen, werden auf der unteren Seite der Fläche 1 und■auf den Flächen 3 und 5 verrieben. Das so hergestellte Testsystem wird in ein 13 x 100 mm - Reagenzglas, das 0,3 ml Salzlösung enthält gegeben, so dass die Fläche 1 in die Salzlösung eingetaucht ist. Man inkubiert 2 bis 4 Stunden bei 37°C. Die Identifizierung der serologischen Gruppen, zu denen der Organismus gehört, erfolgt gleich an Hand der zuvor' erwähnten Tabelle.

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Claims

Patentansprüche

1. Diagnostische Zubereitung zur Identifizierung serologischer Gruppen von ß-hämolytischen Streptococci, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Träger "besitzt, der enthält:

A ) eine erste Fläche, die mit Glycerin und einem Indikatorsystem imprägniert ist, das in der Lage ist, Wechsel im pH-Wert zwischen ungefähr 9 his ungefähr 5 anzuzeigen;

,B) eine zweite Fläche, die eine hydrophobe Grenzschicht enthält und die die erste Fläche von der zweiten Fläche trennt;

C. ) eine dritte Fläche, die mit Salicin und einem pH-Indikator imprägniert ist, das in der Lage ist, Wechsel im pH-Wert von ungefähr 9 bis 5 anzuzeigen;

D ) eine vierte Fläche, die eine hydrophobe Grenzschicht

enthält und die die dritte von der fünften Fläche : trennt und

E ) eine fünfte Fläche, die mit Äsculin und einem Eisen(III)-salz oder einem Aluminiumsalz oder einem Bleisalz imprägniert ist und

F ) eine sechste Fläche, die eine hydrophobe Grenzschicht enthält·

S

2. Diagnostische Zubereitung gemäss Anspruch 1, dadurch gekenn-

^: zeichnet, dass das Indikatorsystem in der Glycerinflache

j Chlorphenolrot oder Bromkresolpurpur oder Bromphenolrot oder

j Bromthymolblau oder Neutralrot oder (X -Naphtholphthalein

' oder Phenolrot ist. .

j-.
j

;

3. Diagnostische Zubereitung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet ₉ dass das Indikator system in der Salicinf lache

Chlorphenorot oder Bromkresolpurpur oder Bromphenolrot oder Bromthymolblau oder Neutralrot oder crt -Naphtholphthalein '■

oder Phenolrot ist. i

4. Diagnostische Zubereitung gemäss Anspruch 1, dadurch ge- ; kennzeichnet, dass die Glycerinflache und die Salicinflache auch Nährmedien enthalten. |

5. Diagnostische Zubereitung gemäsc Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Eisen(IIl)-salz Eisen(III)-chlorid, Eisen(III)-ammoniumcitrat, Eisen(lII)-nitrat oder Eisen(III)-citrat ist.

6. Diagnostische Zubereitung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Aluminiumsalz Aluminiumammoniumcitrat ist.

7. Diagnostische Zubereitung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Bleisalz Bleiacetat oder Bleinitrat ist.

8. Verfahren zur serologischen Identifizierung ß-hänjciiylfischer Streptococci, dadurch gekennzeichnet, das^-iflan Organismen auf die Glycerinf lache, die Sali£iirfiache und die Äsculinfläche der diagnostischep^Ztibereitung gemäss Anspruch 1 in

kubiert, das enjskefiende System bei 37⁰C während ungefähr 2 bis4>JiHrßnden inkubiert und den Parbwechsel der Flachen >achtet.

1-1

^*" 4. 8. 1971

Betrifft: Patentanmeldung P 21 29 584.5 Warner-Lambert Company

Patentanspruch 8 ?· &' M

Verwendung der diagnostischen Zubereitung nach Anspruch 1 zur serologischen Identifizierung ß-hämolytischer Streptococci, wobei man Organismen auf die Glycerinfläche, HWt die Salicinfläche und die Äsculinfläche der diagnostischen Zubereitung inkubiert, das entstehende System bei yj % . ™ 2-4 Stunden inkubiert und den Farbwechsel der Farbflächen beobachtet.

109884/1873