DE2106139A1 - Die Herstellung von Peptiden - Google Patents
Die Herstellung von PeptidenInfo
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Description
Kennzeichen 2255
Dr. F. Zumstein sen. - Dr. E. Assmann
Dr. R. Koenigsberger - Dipt. Phys. R. Holzbauer
Dr. F. Zamstein jun.
Patentanwalt·
8 München 2, Rräuhaujstraß· 4/III
Die Erfindung betrifft die Herstellung von Peptiden aus Aminosäuren
durch stufenweisen Aufbau der gewünschten Aminosäurekette unter Anwendung eines
polymeren Trägers, an den während dieses Aufbaus der Aminosäurekette eine Aminosäure
gebunden ist, welche Bindung nach Bildung der gewünschten Aminosäurekette
unterbrochen wird. Unter Aminosäure sind hier zugleich Aminosäureverbindungen zu
verstehen, welche eine Aminogruppe und eine Carboxylgruppe enthalten.
Bekanntlich (siehe z.B. "Recent progress in Hormone Research" J23 1967,
Seite 454-465 und "Die Makromolekulare Chemie" 12Jl,. 1969, Seiten 87-101) lässt
sich ein solches Verfahren in der Weise durchfuhren, dass die Aminosäure, welche
im herzustellenden Peptid die Stelle am Carboxylende einnehmen soll, mit der Carboxylgruppe an den polymeren Träger gekuppelt und die Aminosäurekette anschliessend
durch Reaktion einer freien Aminogruppe der zuletzt gekuppelten Aminosäure mit einer freien Carboxylgruppe einer nächsten zu verknüpfenden Aminosäure aufgebaut
wird. Die Aminogruppe der zu kuppelnden Aminosäure ist dabei mit einer Schutzgruppe versehen, die nach dem Kupplungsvorgang wieder abgetrennt wird, um
mit einer freien Carboxylgruppe einer nächsten Aminosäure reagieren zu können. Nach Anbau der letzten Aminosäure wird die Aminoschutzgruppe abgetrennt und die
Bindung zum Träger unterbrochen. Mit dieser Methode ist der grosse Nachteil verbunden,
dass beim Aufbau verschiedener Peptide diese Kupplungsreaktionen unvoll-
standig vorlaufen. 1Q9834/1626
Genäss einer anderen bekannten Ausführungshorn (siehe Journal of Amer.
Chem. Soc. Ji£, 1963, Seite 3045 und JJ6, 1964, Seite 5163) wird die Aminosäure,
welche im herzustellenden Peptid die Stelle as Anino-Ende einnehmen soll, mit
der Aminogruppe an den polymeren Trager gekuppelt und erfolgt der Aufbau dieser
Aminosäurekette anschliessend durch Kombination einer Carboxylgruppe der zuletzt
verkuppelten Aminosäure mit einer Aminogruppe der nächsten zu kuppelnden Aminosäure,
Bei dieser Ausfuhrungsform wird die Carboxylgruppe der zu verkuppelnden
Aminosäure in Form von Methyl, Äthyl oder Benzylester geschützt. Nach dem Kupplungsvorgang wird die Schutzgruppe von der Carboxylgruppe abgetrennt, damit letztere
mit der Asinogruppe der nächsten zu verkuppelnden Aminosäure reagieren kann. Es
ist aber zum Abspalten einer solchen Schutzgruppe notwendig, eine alkalische verseifung
anzuwenden. Eine solche Verseifung hat aber den grossen Nachteil, dass
sich bei optisch aktiven Aminosäuren eine Racemisierung einstellt. Ferner zeigen
auch bei dieser AusfUhrungsform die Kupplungsreaktionen bein Aufbau verschiedener
Peptide einen unvollständigen Verlauf und wird bein Abspalten der Schutzgruppe von
der Carboxylgruppe die Bindung an den polymeren Trager teilweise unterbrochen.
Wegen dieser Nachteile hat diese bekannte Ausführungsforn bisher keine praktische
Bedeutung erlangt.
Es wurde nunmehr gefunden, dass diese Äusführungsform beträchtlich verbessert
werden kann. Die Erfindung verschafft dazu ein Verfahren zu der Herstellung von Peptiden durch stufenweisen Aufbau der gewünschten Aminosäurekette, wobei die
Aminosäure, welche im herzustellenden Peptid die Stelle des Amino-endes einnehmen
soll, mit der Aminogruppe an den polymeren Träger gekuppelt wird, de» Aufbau der
Aminosäurekette anschliessend erfolgt durch Kombination einer Carboxylgruppe der
zuletzt gekuppelten Aminosäure mit einer Aminogruppe der nächsten zu kup%pelnden
Aminosäure unter Schutz der Carboxylgruppe der zu kuppelnden Aminosäure und Abspaltung
der Schutzgruppe nach Beendung der Kupplungsreaktion und schliesslich nach Herstellung der gewünschten Aminosäurekette- die Verknüpfung mit dem polymeren
Träger unterbrochen wird, welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass man
die Carboxylgruppe einer zu kuppelnden Aminosäure in Fom eines tert.- Alkyl-Esters
schützt und diesen Schutz nach Beendung der Kupplungsreaktion durch saure Hydrolyse
beseitigt. Es zeigt sich, dass sich beim erfindungsgemässen Verfahren die tert.-Alkyl-Gruppe
durch saure Hydrolyse abtrennen lässt, so dass die bei alkalischer Verseifung auftretende Racemisierung vermieden werden kann. Ferner zeigt sich,
dass bei der Abtrennung der tert.-Alkyl-Gruppe die Bindung an den polymeren Träger
ganz beibehalten werden kann und dass bei den Kupplungsreaktionen eine fast vollständige
Umsetzung möglich ist. Vorzugsweise wird als tert.-Alkyl-Eater der tert.-
109834/162©
Butyl-Ester verwendet, weil dieser Ester von Aminosäuren weitaus billiger herzustellen
ist als die anderen tert.-Alkyl-Ester. Die tert.-Butyl-Ester können auf
■ verschiedene bereits bekannte Weisen hergestellt werden, z.B. durch Veresterung
der freien oder N-geschützten Aminosäure Hit Isobutylen und Schwefelsaure als
Katalysator oder Bit tert.-Butyl-Acetat und Perchlorsäure als Katalysator oder
mit tert.-Butanol und Phosphoroxychlorid. Wird dabei von der N-geschUtzten
Aminosäure ausgegangen, was für einige Aminosäuren vorzuziehen ist, so muss selbstverständlich
der N-Schutz nach der Veresterung wieder aufgehoben werden.
Die Bindung der Aminosäure, welche in herzustellenden Peptid die Stelle
am Amino-ende einnehmen soll, an den polymeren Träger kann z.B. auf die bekannte
Weise durch Reaktion der Aminogruppe deFTüainösäure~mit dem Oxycarbonylderivat .
eines Styrolpolymeren stattfinden (siehe z.B. Journal of Amer.Chem.Soc. JB5^, 1963, ^
Seite 3045 und 86, 1964 Seite 5163). Vorzugsweise erfolgt diese Bildung aber %
gemäss der nicht vorveröffentliehten niederländischen Anmeldeschrift 6916122 (auf
Namen der Anmelderin der vorliegenden Anmeldung) und zwar durch Reaktion der
Aminogruppe der betreffenden Aminosäure mit einem polymeren Träger, der mit reaktiven
Chlorsulfonsäuregruppen versehen ist, wodurch eine besonders geeignete
Sulfonamidbindung erhalten wird.
Die Kupplung der Carboxylgruppe der zuletzt verkuppelten Aminosäure mit
dem tert.-Alkyl-Ester der nächsten zu kuppelnden Aminosäure kann auf verschiedene
Weisen erfolgen, z.B. in Methylenchlorid oder Dimethylformamid als Lösungsaittel
unter Anwendung von Dicyclohexylcarbodi-imid oder eines Gemisches dieser Verbindung
mit N-hydroxysuccinimid als Kondensationsmittel oder durch Umsetzung der zu kuppelnden Carboxylgruppe in eine Säurechloridgruppe ait anschliessender Reaktion
dieser Gruppe mit der Aminogruppe des tert.-Alkyl-Esters der zu kuppelnden Aaino- Jj
säure.
Die Abspaltung der Schutzgruppe nach der Kupplungsreaktion durch saure
Hydrolyse kann sehr zweckmassig mit Trifluoressigsäure, p-Toluolsulfonsaure oder
mit in Methylenchlorid gelöstem Chlorwasserstoff stattfinden.
Sowohl für die Kupplungsreaktion wie für die Abspaltung der Schutzgruppe
sind Temperaturen zwischen 15 und 35 C sehr geeignet. Temperaturen ausserhalb dieses Bereichs bringen keine Vorteile mit sich.
Nach Aufbau der gewünschten Aminosäurekette kann die Bildung an den
polymeren Trager auf die bekannte Weise mit Hilfe eines Reduktionsmittels, z.B.
mit Natrium in flüssigem Aaaoniak oder mit Bromwasserstoff in Eisessig und Phenol
oder mit Phosphoniumjodid und Jodwasserstoff oder mit Phosphoniuejodid und Eis-
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essig unterbrochen werden. Falls eine zu kuppelnde Aminosäure ausser der Aminogruppe
und/oder der Carboxylgruppe - beide Gruppen gehen eine Amidbildung ein noch
andere funktioneile Gruppen enthalt, so ist es möglich, diese anderen
Gruppen auf bekannte Weise zu schützen und diesen Schutz vor, wahrend oder nach
der Unterbrechung der Bindung an den polymeren Träger auch wieder wegzunehmen. Falls die zu schützende funktionelle Gruppe eine Carboxylgruppe ist, so kann
z.B. diese Gruppe in Form eines Methyl-, Äthyl- oder Benzyl-Esters geschützt
werden und dieser Schutz kann nach Unterbrechung der Bindung an den polymeren Träger aufgehoben werden. Ist die zu schützende funktionelle Gruppe eine Aminogruppe,
so kann z.B. diese Gruppe mit einer Benzyloxycarbonylgruppe geschützt
werden und lässt sich dieser Schutz gleichzeitig mit der Unterbrechung der Bindung
an den Träger durch eine Behandlung mit Bromwasserstoff in Eisessig wieder beseitigen.
Bei Anwendung einer Sulfonamidbindung an den Träger kann eine Aminogruppe,
welche keine Amidbindung eingehen soll, z.B. auch mit einer Tosylgruppe geschützt
werden und dieser Schutz kann auch wieder zusammen mit der Unterbrechung der Sulfonamidbindung
durch Behandlung mit Phospheniumjodid und Jodwasserstoff aufgehoben
werden.
Das erfindungsgemäss Verfahren, das unter Anwendung mehrerer an sich
bekannter Methodiken auf dem Gebiete der Peptidchemie durchgeführt werden kann, wird in nachfolgenden Beispielen erläutert, ohne dass dadurch diese Beispiele
eingeschränkt werden.
In einen, mit einem Rührer versehenen Kolben (Inhalt £ Liter) werden
15 g polymerer Träger, 100 ml Dioxan, 50 ml Wasser und 9,5 g L-Valin-tert.-Butyl-Ester
eingebracht. Als polyraerer Träger dient ein Polystyrol, das mit 2 Gew.-% Divinylbenzol vernetzt ist, je Gramm 1,74 mMol Chlorsulfonsäure enthält
und eine Teilchengröße von 40 bis 80 β aufweist. Das Gemisch im Kolben
wird 20 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt, und das pH wird durch Zusatz von Lauge Bit Hilfe eines automatischen Titriergefässes auf einem Wert von 9,2
gehalten. Der Feststoff wird anschliessend abfiltriert und gewaschen. Diese
Waschung erfolgt zuerst mit eine« Gemisch von Tetrahydrofuran und Wasser und dann
mit Tetrahydrofuran. Nach Trocknung im Vakuum bilden sich 18 g Produkt mit 2,0 Gew..-% Stickstoff und 4,7 Gew.-% Schwefel.
Zum Abspalten der tert.-Butyl-Gruppe werden 17 g des so erhaltenen
. Produktes 1 Stunde lang mit 150 ml Trifluoressigsäure bei Zieeertemperatur gerührt
und danach abfiltriert, gewaschen mit Tetrahydrofuran und getrocknet. Die Analyse
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ergibt, dass nach dieser Behandlung je g Produkt 1,42 mMol Stickstoff und 1,44 hjMoI
Schwefel anwesend sind und dass der Stickstoff völlig als Valin vorliegt.
Beispiel II, Anbau des Peptids Valin-phenylalanin-leucin-Alanin an dem polymeren
TrSger.·
In einen mit Rührer versehenen Kolben (Inhalt 250 ml) werden 3 g Valinpolymeres
(gebildet gemäss Beispiel I), 2,9 g L-Phenylalanin tert,-butyl-ester
und 75 ml Methylenchlorid eingebracht. Das Gemisch wird 30 min lang bei Zimaertemperatur
in einer Stickstoffatmosphäre gerührt. Anschliessend wird eine Lösung
von 2,7 g Dicyclohexylcarbodi-imid in 25 ml Methylenchlorid zugegeben, wonach
dieses Gemisch 22 Stunden gleichfalls bei Zimmertemperatur und in einer Stickstoffatmosphäre gerührt wird. Das so erhaltene Produkt wird abfiltriert und gewaschen. J
Zuerst wird dreimal mit 100 ml Tetrahydrofuran gewaschen und danach auf dieselbe
Weise der Reihe nach mit Eisessig, Dimethylformamid, Äthanol und Dimethylformamid
und schliesslich sechsmal mit 100 ml Tetrahydrofuran. Das gewaschene Produkt wird
zum Schluss bei etwa 30 0C in Vakuum getrocknet. Es bilden sich 3,6 g Produkt »it
3.2 Gew.% Stickstoff und 3,6 Gew.% Schwefel entsprechend 2,28 «Mol Stickstoff und
1,12 mMol Schwefel je g Produkt« Aus einer Aminosäureanalyse ergibt sich, dass
1,14 nMol Valin und 1,14 jnMol Phenylalanin je g Produkt anwesend sind.
Zum Abspalten der tert.-Butyl·-Gruppe werden 3 g des Produktes eine Stunde
lang mit 25 ml Trifluoressigsäure bei Zimmertemperatur gerührt und danach abfiltriert,
gewaschen, mit Tetrahydrofuran und schliesslich getrocknet.
Anschliessend findet eine Kupplung zwischen L-leucin-tert.-butyl-ester
und dem Phenylalanin stat. Dies geschieht mit 3,1 g L-leucin-tert.-butyl-ester und
zwar auf gleiche Weise wie der vorangehende Anbau des Phenylalanin-tert.-butyl- ■
esters am Valin. Es bilden sich 3,2 g Produkt, das je g 3,07 nMol Stickstoff und
1.03 mMol Schwefel enthält. Eine Aminosäureanalyse ergibt, dass je g Produkt 1,01
nMol Valin, 1,04 isMol Phenylalanin und 1,01 mMol Leucin anwesend sind. Zum Abtrennen
der tert.-Butyl-Gruppe werden anschliessend 2,5 g des Produktes 50 «in
lang mit 20 ml Trifluoressigsäure bei Zimmertemperatur gerührt und danach abfiltriert,
dreimal gewaschen mit 50 ml Methylenchlorid und letzten Endes getrocknet.
Es wird dann L-alanin-tert.-butyl-ester mit dem Leucin verkuppelt. Dies
erfolgt mit 2 g L-alanin-tert.-butyl-ester, wobei man auf dieselbe Weise vorgeht
wie bei den zwei vorangehenden Kupplungen.
Es bilden sich 2,75 g Produkt, das je 3,65 nMol Stickstoff und 0,93 mMol
Schwefel enthält. Aus einer Aminosäureanalyse ergibt sich, dass je g Produkt
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0,91 nMol Valin, 0,92 mMol Phenylalanin, 0,91 wMol Leucin und 0,90 mMol Alanin
anwesend sind.
Die tert.-Butyl-Gruppe wird darauf durch Hydrolyse ext Trifluoressigsaure wieder
abgetrennt.
Beispiel III, Unterbrechung der Bindung zwischen de» Peptid und dem polymeren
Trager
In einen mit einem MagnetrUhrer versehenen Kolben von 25 ml Inhalt werden
2 g des gemäss Beispiel II erhaltenen Tetra-peptidpolyaeren, 4 g Phenol und 7,5 ml
einer Losung von Bromwasserstoff in Eisessig (36 Gew.% Bromwasserstoff) eingebracht,
wonach der Kolben abgeschlossen wird. Anschliessend wird das Gemisch 6 Stunden lang
bei 60 0C gerührt. Nach Kühlung wird das Polymere abfiltriert und mit Eisessig
gewaschen. Filtrat und Waschflüssigkeit werden zusammengebracht und die so erhaltene
Lösung bei 35 0C in Vakuum konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird, unter Rühren,
in trocknen Äther ausgegossen und der dabei gebildete Niederschlag unter Ausschluss
von Luft abfiltriert und in Vakuum über Kaliumhydroxyd getrocknet.
Es bilden sich 0,35 g Bromwasserstoff des Tetrapeptide Valin-phenylalaninleucin-alanin.
Aus der Stickstoff- und Schwefelanalyse des abfiltrierten Polymeren ergibt sich, dass 70 % des Tetrapeptide von diesem Polymeren abgetrennt ist. Die
Aminosäureanalyse des Peptide zeigt, dass bei der Abspaltung nahezu keine Unterbrechung
der Carbonamidbindungen aufgetreten ist.
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Claims (7)
- PATENTANSPRÜCHE< Verfahren zu der Herstellung von Peptiden durch stufenweisen Aufbau der gewünschten Aminosäurekette, wobei die Aminosäure, welche im herzustellenden Peptid die Stelle am Amino-ende einnehmen soll, über die Aminogruppe mit einem polymeren Träger verkuppelt wird, die Aminosäurekette anschliessend durch Kombination einer Carboxylgruppe der zuletzt gekuppelten Aminosäure mit einer Aminogruppe der nächsten zu kuppelnden Aminosäure aufgebaut wird unter Schutz der Carboxylgruppe der zu kuppelnden Aminosäure und Abspaltung dieser Schutzgruppe nach Beendung der Kupplungsreaktion und nach Bildung der gewünschten Aminosäurekette die Bindung an den polymeren Träger unterbrochen wird, dadurch gekennzeichnet, dass man die Carboxylgruppe einer zu kuppelnden Aminosäure in Form eines tert.-Alky1-Esters schützt und nach Ablauf der Kupplungsreaktion diesen Schutz durch saure Hydrolyse aufhebt.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als tert.-Alky1-Ester einen tert.-Butyl-Ester benutzt.
- 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass man für die saure Hydrolyse Trifluoressigsäure, p-Toluolsulfonsäure oder in Methylenchlorid gelüsten Chlorwasserstoff verwendet.
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet,dass als polymerer Träger ein Polymeres mit Chlorsulfonsäure als reaktive Gruppe verwendet wird und das Sulfonamid an die mit dem Träger zu verkuppelnde Aminosäure gebundenwird. ^
- 5.fVerfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Kupplungereaktionen und die Abspaltungen der tert.-Alkyl-Gruppe bei einer Temperatur zwischen 15 und 35 0C stattfinden.
- 6. aaa maaaa, e a »*· »««>«»H — e
- 7. eta»«8» toi109834/1626
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