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CH498805A - Verfahren zur Herstellung von Cystinrest-haltigen Peptiden - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Cystinrest-haltigen Peptiden

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Publication number
CH498805A
CH498805A CH699968A CH699968A CH498805A CH 498805 A CH498805 A CH 498805A CH 699968 A CH699968 A CH 699968A CH 699968 A CH699968 A CH 699968A CH 498805 A CH498805 A CH 498805A
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CH
Switzerland
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cys
tri
tbu
mmol
Prior art date
Application number
CH699968A
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English (en)
Inventor
Bruno Dr Kamber
Werner Dr Rittel
Original Assignee
Ciba Geigy
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Publication date
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Description


  
 



  Verfahren zur Herstellung von Cystinrest-haltigen Peptiden
Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von Cystinrest-haltigen Peptiden.



   In der Natur kommen verschiedene Cystinresthaltige Peptide vor, in welchen die Disulfidbrücke des Cystins in einem Ring liegt, z. B. Oxytocin, Vasopressine, Vasotocin, Isotocin, Mesotocin, Wachstumshormon, Thyrocalcitonin, Insulin. Anderseits kann die Disulfidbrücke des Cystins aber auch geradlinige   Aminosäureketten    miteinander verbinden, wie dies z. B.



  bei den beiden Disulfidbrücken zwischen der A- und B-Kette des Insulins oder beim Glutathion der Fall ist.



  Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Synthese solcher Disulfidbrücken enthaltender Peptide bekannt.



  Ausser natürlichen Peptiden mit Disulfidbrücken wurden auch bereits eine grössere Zahl von aktiven Analogen, z. B. Desamino-oxytocin, Ser4-Oxytocin,   Asn-Oxytocin,    Val8-Oxytocin,   Tyr"(O-Methyl)-Oxytocin,      PheS-Arg8-    Vasopressin,   PheS-Lys8-Vasopressin,      Phe2-Orn8-Vaso-    pressin,   Ile3-Arg8-Vasopressin,    Asn4-Lys8-Vasopressin, synthetisiert.



   Nach den bekannten Verfahren werden zur Herstellung der Disulfidbrücke zunächst aus einer die beiden zu verbindenden Cysteinreste enthaltenden Aminosäuresequenz, in welcher die Mercaptogruppen geschützt sind, beispielsweise durch Carbobenzoxy- oder Benzylgruppen oder durch die Tritylgruppe, die Mer   capto-Schutzgruppen    abgespalten, Benzyl beispielsweise mit Natrium in flüssigem Ammoniak, Trityl, z. B.



  mittels Mercuriacetat, und Schwefelwasserstoff oder mit   10n    Salzsäure, und dann wird das die freien Mercaptogruppen enthaltende Peptid zum Disulfid oxydiert, beispielsweise mit   1 ,2-Dijodäthan    oder mit Sauerstoff.



  Dieses Verfahren hat den Nachteil, dass die. genannten Abspaltungsmethoden Nebenreaktionen veranlassen, insbesondere bei empfindlichen Peptiden, und dass die Ausbeute dementsprechend beeinträchtigt wird. Beim Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung erhält man   Cystinrest-haftige    Peptide in einfacherer Weise und besserer Ausbeute. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man entsprechende Cysteinreste enthaltende Peptide, in denen die Mercaptogruppen durch Tritylgruppen geschützt sind, mit Jod behandelt.



  Die Umsetzung findet bei Zimmertemperatur statt, kann aber auch, je nach der Art des Peptids, bei niedriger oder höherer Temperatur ausgeführt werden, z. B. bei Temperaturen von 0 bis   60 .    Vorzugsweise führt man die Reaktion in einem Lösungsmittel, in welchem Jod und das Peptid wenigstens teilweise löslich sind, vorzugsweise in einem Alkohol wie einem niederen Alkanol, z.B. Äthanol oder insbesondere Methanol oder einem Gemisch eines Alkohols mit einem organischen Lösungsmittel, in welchem das Peptid löslich ist, wie Essigester, Dimethylformamid, Methylenchlorid, oder in Eisessig durch. Zweckmässig sorgt man für einen jeweiligen Überschuss an Jod, z. B.



  durch Arbeiten in verdünnten Lösungen und Zugabe der Peptidlösung zur Jodlösung. Dabei wird ausschliesslich das gewünschte Monomere erhalten. Wird hingegen umgekehrt vorgegangen, z. B. die Jodlösung in eine   Peptidlösung    eingetropft, so werden beträchtliche Mengen Polymere gebildet. Aus der erhaltenen Lösung kann das überschüssige Jod beispielsweise mit Thiosulfat entfernt werden.



   Bei der Reaktion werden als Ausgangsstoffe Peptide verwendet, in denen die freien   Aminogruppen    zweck   mässig    geschützt sind. Auch freie Hydroxyl- und Carboxylgruppen können, wenn erwünscht, in geschützter Form vorliegen. Als Amino-Schutzgruppen sind beispielsweise zu nennen Benzyl, Trifluormethyl, Phthaloyl, p-Toluolsulfonyl, oder vor allem von der Kohlensäure sich ableitende Gruppen wie gegebenenfalls im aromatischen Rest durch Halogenatome, Niederalkyl- oder Niederalkoxy- oder Niedercarbalkoxygruppen substituierte Carbobenzoxygruppen, farbige Benzyloxycarbonylgruppen wie p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl und   p-(p'-Methoxy-phenylazo)-benzytoxycarbonyl,    Tolyloxycarbonyl, 2-Phenyl-isopropyloxycarbonyl, 2-Tolyl-isopropyloxycarbonyl- und vor allem 2-p-Diphenyl-isopropyloxycarbonyl (vgl. franz.

  Patent Nr. 1 554 051), ferner aliphatische Oxycarbonylgruppen, wie z. B. Allyl     oxycarbonyl,    Cyclopentyloxycarbonyl, tert.-Amyloxy carbonyl, Adamantyloxycarbonyl und in erster Linie tert.-Butyloxycarbonyl.



   Die Carboxylgruppen können, wenn erwünscht, z. B. durch Amidierung oder Veresterung geschützt sein. Als Ester   sind    z. B. diejenigen von Methanol,   Methanol,    Benzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol, 2,4,5 Trichlorphenol, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxy phthalimid, oder vor allem von tert.-Butanol zu nennen.



  Hydroxygruppen, z. B. von Serin- oder Tyrosinresten, können z. B. durch Verätherung, beispielsweise mit Benzylalkohol oder vorzugsweise mit tert.-Butanol geschützt sein. In Argininresten kann die Guanidinogruppe beispielsweise durch die Tosylgruppe geschützt sein.



  Die bei dem vorliegenden Verfahren erhaltenen, Schutzgruppen aufweisenden Disulfid-Peptide können direkt für die Synthese von Peptiden mit längerer Aminosäurekette verwendet werden oder, wenn erwünscht, können die Schutzgruppen in bekannter Weise durch Hydrolyse oder Hydrogenolyse abgespalten werden.



   Die als Ausgangsstoffe verwendeten Cysteinresthaltigen Peptide sind bekannt oder können nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden. Unter Cysteinrest-haltigen Peptiden sind auch Peptide zu verstehen, in denen funktionelle Gruppen wie z. B. Aminogruppen, Carboxylgruppen, Hydroxygruppen mit den oben genannten oder anderen für die Peptidsynthese bekannten Schutzgruppen versehen sind, ferner Verbindungen, die statt eines oder beider zu verbindenden Cysteinreste Desaminocysteinreste enthalten.



   In den nachfolgenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben. In der Dünn   schichtchromatographie    werden die folgenden Systeme verwendet: System 43A: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser    (100:40:10)    System 43C: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser    (51:21: 28)    System 45: sek.-Butanol-3 %iges wässriges Ammo niak (70: 30) System 52: n-Butanol-Eisessig-Wasser  (75 : 7,5 : 21) System 53: n-Butanol-Ameisens äure-Wasser    (60 : 0,75 : 39)    System 70:   Äthylacetat-Pyridin-Wasser       (40:20:40)    System 101: n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser    (38 : 24: 8 : 30)    System   1 02E:    Essigester-Methyläthylketon-Eisessig
Wasser   50 : 30:10:10)    System 121A:

  Isopropanol-Ammoniak (26 %ig)-Was ser   (85 : 5:10).   



   Folgende Abkürzungen werden verwendet:
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl; TRI = Trityl.



   Beispiel 1 zeigt die Herstellung der geschützten N-terminalen Sequenz 1-9 des Thyrocalcitonins mit   Disulfidrilìg;    die Beispiele 2 und 8 zeigen die Disulfidverknüpfung des geschützten Fragments 20-21 der A-Kette mit dem geschützten Fragment 18-21 bzw.



  19-21 der B-Kette des Insulins; die Beispiele 3, 7 und 9 zeigen die Herstellung von geschützten Peptid Dimeren mit Disulfidbrücke; die Beispiele 4-6 zeigen die Herstellung von Oxytocin, Lys8-Vasopressin und   Phe-4,    Lys8-Vasopressin nach dem neuen Verfahren.



  Beispiel 1
EMI2.1     


<tb>   BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser-(tBu)-Thr(tBu)-Cys-    <SEP> 
<tb>  <SEP> Val-Leu-OH
<tb> 
Zu einer gerührten Lösung von 3,73 g (14,78 mMol) Jod in 500 ml Methanol werden bei Zimmertemperatur 2,50 g (1,478 mMol)   BOC-Cys(TRl:)-Ser-(tBu)-Asn-      Leu-Ser(tBu)-ThrftBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-OH    in 500 ml Methanol innert 45 Minuten zugetropft. Nach beendetem Eintragen rührt man 1 Stunde weiter und entfärbt dann die Lösung bei   0    mit 1,0n wässriger Thiosulfatlösung (26,05 ml in Thiosulfat). Die klare Lösung wird am Wasserstrahlvakuum bei 300 auf etwa 100 ml eingeengt. Dann gibt man 1,5 Liter Wasser zu, filtriert das ausgefallene Produkt und wäscht es mit Wasser.



  Nach dem Trocknen über Kaliumhydroxyd wiegt das Rohprodukt 2,32 g. Es wird zweimal mit Petroläther verrieben und zur Reinigung einer Gegenstromverteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetra   chlorkohlenstoff    (10 :   3 : 5 :    4) entworfen. [Puffer:   28,6    ml Eisessig; 19,25 g Ammoniumacetat, mit Wasser auf 1 Liter aufgefüllt.] Nach 135 Schritten befindet sich das Hauptprodukt in den Elementen 39-68   (rrn..ix 53;    K =0,65). Der Inhalt dieser Elemente wird zusamrnen am Hochvakuum (400) zur Trockne eingedampft und das Ammoniumacetat absublimiert.

  Das
EMI2.2     


<tb> erhaltene <SEP>    B <SEP> QC-Cys <SEP> - <SEP> Ser(tBu) <SEP> -    <SEP> Asn <SEP> - <SEP> Leu <SEP> - <SEP>    Ser(tBu) <SEP> -    <SEP> Thr
<tb> (tBu)-Cys-Val-Leu-OH <SEP> (1,49 <SEP> g <SEP> = <SEP>    83 <SEP> S    <SEP> der <SEP> Theorie)
<tb>  erweist sich im Dünnschichtchromatogramm (Silicagel) als einheitlich.   Ruf45    = 0,42;   Rfl2lA    = 0,70; Rf70 = 0,75;   Ruf5?      =    0,43;   Rf.SA    = 0,22.   [Cr]2,3    =   160    (c = 2 in Chloroform). Das als Ausgangsmaterial verwendete geschützte Nonapeptid kann wie folgt hergestellt werden: 1.

  H-Thr(tBu)-OMe
12,92 g (40 mMol) Z-Thr(tBu)-OMe werden in 200 ml Eisessig und 3 g Pd-Kohle   (10%)    bei Zimmertemperatur hydriert. Die Aufnahme von Wasserstoff ist nach einer Stunde beendet. Die Lösung wird vom Katalysator abfiltriert und am Wasserstrahlvakuum bei 350 eingedampft. Nach dem Trocknen am Hochvakuum bei 350 resultieren 7,3 g eines Öls, das gemäss Dünnschichtchromatogramm einheitlich ist und direkt weiter verwendet wird.



  2. DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-OMe
19,3 g (38,6 mMol)   DPC-Ser(tBu)-OH,    Cyclohexylaminsalz werden in 500 ml Chloroform aufgenommen und bei   0     dreimal mit 25 ml   1n    Zitronensäure und fünfmal mit 40 ml halbgesättigter Kochsalzlösung ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen der Lösung über Natriumsulfat wird eingedampft und der erhaltene Schaum in 250 ml Essigester aufgenommen. Man gibt 5,36 ml (38,6 mMol) Triäthylamin zu, kühlt die Lösung auf   -10     ab und versetzt unter Rühren mit 5,13 ml (38,6 mMol) Isobutylchlorocarbonat. Es wird 10 Minuten bei   -10     gerührt und dann die auf   -120    gekühlte Lösung von 7,3 g (38,6 mMol) H-Thr(tBu)-OMe in 100 ml Essigester so zugetropft, dass die Reaktionstemperatur   -10     nie übersteigt. 

  Nach beendetem Eintragen wird noch eine Stunde bei   -100    gerührt und dann über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen.



  Die Lösung wird vom ausgeschiedenen Triäthylamin Hydrochlorid abfiltriert und bei   0     dreimal mit je 20 ml in Zitronensäure und fünfmal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft.  



  Rohprodukt   (Ö1):    22,07 g. Zur Reinigung wird 1 g an einer Silicagelsäule (2,5 cm, 30 cm) chromatographiert. Mit Petroläther-Essigester (1:1) werden nach einem Vorlauf von 110 ml 787 mg reines Produkt eluiert.



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Toluol-Aceton   (7 : 3)    ist Rf = 0,51.



  3. Z-Val-Leu-OMe
Man löst 19,9 g (110 mMol) H-Leu-OMe,   HC1    in 120 ml Dimethylformamid und gibt bei   0     14,6 ml (105 mMol) Triäthylamin zu. Das ausgeschiedene Tri äthylamin-Hydrochlorid wird abfiltriert, das Filtrat zu einer Lösung von 25,1 g (100 mMol) Z-Val-OH in 200 ml Dimethylformamid (00) gegeben und dann 22,6 g (110 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid trocken zugefügt. Nach einer Stunde Rühren bei   0     und Stehen über Nacht im Kühlschrank wird filtriert und die Lösung am Hochvakuum bei 400 eingedampft. Der ölige Rückstand wird in 30 ml Essigester aufgenommen, die Lösung auf   0     abgekühlt und vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff befreit. Nach Zugabe von n-Hexan kristallisiert das Produkt aus dem Filtrat über Nacht aus.

  F.   102-10150;      [a12n0 : 410    (c = 2,88 in Methanol).



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol   (98 : 2)    ist Rf = 0,55 und in Toluol-Aceton   (7 : 3)    ist Rf = 0,60.



  4.   DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-NH-NH2.   



   4,253 g (7,4 mMol) DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-OMe in 18 ml Methanol werden mit 5,55 ml (etwa 110 mMol) Hydrazinhydrat versetzt und 10 Stunden bei Zimmertemperatur und 2 Stunden bei 400 stehengelassen. Die Reaktionslösung wird in 450 ml Essigester aufgenommen und viermal mit halbgesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen der Lösung über Natriumsulfat wird auf etwa 15 ml eingeengt und mit etwa 5 ml Petroläther versetzt. Über Nacht kristallisieren 3,17 g des Hydrazids vom F.   132-1340    aus.



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in
Toluol-Aceton   (7 : 3)    ist Rf = 0,40.



   5. H-Val-Leu-OMe,HCl
5,66 g (15 mMol)   Z-Val-Leu-OMe    werden in
75 ml Methanol in Gegenwart von 15 mMol Salzsäure und 850 mg Pd-Kohle   (10 %)    bei Zimmertemperatur hydriert. Die Aufnahme von Wasserstoff ist nach
3 Stunden beendet. Es wird vom Katalysator abfiltriert und die Lösung auf etwa 15 ml eingeengt. Bei Zugabe von Äther kristallisiert das Produkt aus. F.   136-1390.   



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in
Chloroform-Methanol (9:1) ist Rf =   0,45;    in Toluol Aceton (1:1) ist Rf = 0,43.



   6. TRI-Cys(TRI)-Val-Leu-OMe
7,13 g (10 mMol)   TRI-Cys(TRI)-OH,    Diäthylaminsalz werden in Chloroform bei   0     mit   1n    Zitronensäure und halbgesättigter Kochsalzlösung gewaschen, die Lösung getrocknet, eingedampft und der erhaltene Schaum in 50 ml Essigester aufgenommen. Dazu gibt man eine mit 1,4 ml (10 mMol) Triäthylamin versetzte Lösung von 3,22 g (10 mMol) H-Val-Leu-OMe, Hydrochlorid in 40 ml Essigester von 00, aus der man das ausgefallene Triäthylamin-Hydrochlorid abfiltriert hat.



  Dann versetzt man bei   0     mit 2,26 g (11 mMol) trokkenem Dicyclohexylcarbodiimid, rührt 21/2 Stunden bei   0     und lässt über Nacht im Kühlschrank stehen. Der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und die Lösung bei   0     mit   1n    Zitronensäure,   1n    Natriumbicarbonat und halbgesättigter Kochsalzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wird auf etwa 20 ml eingeengt, auf   0     gekühlt und von weiterem Dicyclohexylharnstoff abfiltriert.



  Eindampfen zur Trockne ergibt 8,53 g Ester. Zur Reinigung wird das Rohprodukt an einer Silicagelsäule (5 cm; 55 cm) chromatographiert. Nach einem Vorlauf von 400 ml wird das Hauptprodukt mit 300 ml Petroläther-Essigester (1:1) in reiner Form eluiert.



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol (99:1) ist Rf = 0,43.



  7. H-Cys(TRI)-Val-Leu-OMe
11,08 g (13,3 mMol) TRI-Cys(TRI)-Val-Leu-OMe werden in 75 ml Essigester gelöst und 12,3 ml Wasser tropfenweise zugegeben, so dass stets eine klare Lösung bleibt. Nach einer Stunde Rühren bei Zimmertemperatur gibt man zur klaren Lösung 64 ml Wasser, filtriert den Niederschlag ab und wäscht mit kalter 50 %iger Essigsäure. Das Filtrat wird am Hochvakuum bei 400 zu einem Öl eingedampft, dieses in 250 ml Essigester aufgenommen und bei   0     mit ln Natriumbicarbonat und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen.



  Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft, wobei 7,07 g eines weissen Produktes erhalten werden. Das Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System Chloroform-Methanol   (98 : 2)    zeigt beim Besprühen mit Reindel-Hoppe-Reagenz einen Fleck vom Rf-Wert 0,30.



  8.   DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-GMe   
Zu 13,6 g (23,8 mMol) DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu) NH2 in 220 ml Dimethylformamid werden bei   -120    32,26 ml Salzsäure in Essigester   (1,84n;    59,25 mMol) und 3,26 ml (28,55 mMol) tert.-Butylnitrit gegeben.



  Nach 15 Minuten bei   -100    lässt man dann die auf   -100    gekühlte Lösung von 14,03 g (23,8 mMol) H-Cys (TRI)-Val-Leu-OMe und 8,315 ml (59,25 mMol) Tri äthylamin in 100 ml Dimethylformamid derart zutropfen, dass die   Reaktionstemperatur -90    nie überschreitet.



  Es wird noch eine Stunde bei 100 gerührt und dann über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen. Es wird vom ausgeschiedenen Triäthylamin-Hydrochlorid abfiltriert, das Filtrat am Hochvakuum bei 400 eingedampft, der ölige Rückstand in 500 ml Essigester aufgenommen, mit   1n    Zitronensäure,   1n    Natriumbicarbonat und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet, auf etwa 40 ml eingeengt und mit etwa 10 ml Petroläther versetzt. Über Nacht kristallisiert der geschützte Pentapeptidester vom F.   177-1780    aus.

 

   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol   (98 : 2)    ist Rf = 0,45; in Toluol Aceton   (7 : 3)    ist Rf = 0,57.



  9. DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-OH
2,830 g (2 mMol) DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys (TRI)-Val-Leu-OMe werden in 60 ml 75 %igem Dioxan gelöst und mit 3 ml 2n Natronlauge (6 mMol) versetzt.



  Nach 11/2 Stunden bei Zimmertemperatur wird das Dioxan am Wasserstrahlvakuum bei 400 abgedampft, Essigester und Wasser zugegeben und bei   0     mit   1n    Zitronensäure auf pH 3 gestellt. Die Essigester-Phase wird mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft. Es resultiert ein Produkt, das gemäss Dünnschichtchromatogramm an Silicagel einheitlich ist.



  Rf in Chloroform-Methanol (7: 3) = 0,40;   Rf45    = 0,55.  



  10.   H-Ser(tBu)-Thr(tBu) -Cys (TRI)-Val-Leu-OH   
2,22 g (2 mMol)   DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-    Val-Leu-OH werden in 20 ml Methylenchlorid gelöst und 12 ml Chloressigsäure in Wasser (aus 75 g Chloressigsäure und 25 ml Wasser) zugegeben. Die klare Lösung wird 15 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt, auf   0     gekühlt und dann werden 70 ml Wasser zugegeben. Mit konzentriertem Ammoniak wird auf pH 6,5 eingestellt, wobei das Produkt ausfällt. Die wässrige Lösung wird abdekantiert und der Rückstand noch dreimal mit Wasser verrieben und dann lyophilisiert. Dreimaliges Verreiben des Produktes mit   Äther    liefert ein weisses Pulver, welches laut Dünnschichtchromatogramm einheitlich ist. Es wird in dieser Form weiter verwendet.



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist   Rfl,    =   0,48;      Rfloz    = 0,65;   Ruf52    = 0,75.



  11. Z-Asn-Leu-OMe
16,7 g H-Leu-OMe und 46,0 g ZAsn-ONP werden in 100 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst.



  Die Lösung wird 19 Stunden bei 250 stehengelassen.



  Hierauf gibt man 1,2 Liter Wasser zu und nutscht die kristalline Fällung ab. Das Dipeptidderivat wird bei   40D    im Vakuum getrocknet und dann zweimal aus Methanol-Wasser umkristallisiert. F.   180-1810;      [a]      +    90 (c = 2,05 in Chloroform).



  12. H-Asn-Leu-OMe
15,0 g Z-Asn-OMe werden in 400 ml t-Butanol Wasser   (9:1)    gelöst und in Gegenwart von 2 g Palladium-Kohle   (10S    Pd) hydriert. Nach Beendigung der Hydrierung wird vom Katalysator abgenutscht und bei 400 eingedampft. Der Rückstand wird direkt weiter verwendet.



  13. Z-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe
8,90 g H-Asn-Leu-OMe und 11,0 g Z-Ser(tBu)-OH werden in 100 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf   0     gekühlt und mit 3,90 g N-Hydroxysuccininimid und dann mit 8,70 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 30 Minuten Stehen bei   0'    und 18 Stunden bei 250 wird vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff abgenutscht und das Filtrat in 800 ml Eiswasser gegossen. Der dabei ausfallende, kristalline Niederschlag wird im Vakuum bei   40     getrocknet und dann aus Methanol-Wasser umkristallisiert. Das dabei in analysenreiner Form erhaltene   Z-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe    schmilzt bei F. 202 bis 2050;   [ce]2D    =   -180    (c = 1,05 in Eisessig).



  14. H-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe
6,3 g Z-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe werden in 600 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1,2 g Palladium-Kohle   (10X    Pd) hydriert. Nach 1,25 Stunden wird vom Katalysator abgenutscht und im Vakuum bei 300 Badtemperatur zur Trockne eingedampft. Das dabei erhaltene kristalline Tripeptidderivat zeigt bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten im System Chloroform-Methanol (90:10) Rf = 0,11.



  15. BOC-Cys(TRI)-Ser-(tBu)-Asn-Leu-OMe
5,0 g H-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe und 6,7 g BOC Cys(TRI)-ONP werden in 30 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst. Die gelbe Lösung wird 42 Stunden bei 260 stehengelassen. Hierauf wird durch Zugabe von 500 ml Eiswasser gefällt und das ausgefallene Produkt abgenutscht. Es wird in Essigester gelöst und die Lösung mit 5 % Zitronensäurelösung, und dann mit Wasser gewaschen. Hierauf wird unter Eiskühlung zur Entfernung von p-Nitrophenol fünfmal mit einem Gemisch von je 1 Volumteil 5   %Liter    Kaliumcarbonat- und   5 %Der    Kaliumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen. Die Essigesterlösung hinterlässt nach Trocknen und Eindampfen ein harzartiges Produkt. Dieses wird viermal aus Aceton und Petroläther umgefällt.

  Das dabei als festes Pulver erhaltene Teteapeptidderivat zeigt F.   181-1820;    [a]2D   110    (c = 2,09 in Methanol).



   Bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten ist   Rfg3z    = 0,57; Rf in Essigester = 0,10; Rf in Toluol-Aceton   (7 : 3)    = 0,05; Rf in Chloroform Methanol   (9:1) =    0,45.



  16.   BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-NHNH2   
7,0 g BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe werden in 70 ml Methanol gelöst und die auf   0     gekühlte Lösung mit 7 ml   Hydrazinhydrat    versetzt. Nach 16 Stunden bei 20 wird eine eiskalte Lösung von 600 ml 2n Essigsäure zugegeben, die gallertige Fällung gut zerrieben, abgenutscht und mit viel Wasser neutral gewaschen. Das erhaltene Pulver wird bei 400 im Vakuum getrocknet und dann in 100 ml Acetonitril suspendiert. Nach Zerreiben wird abgenutscht und bei 400 im Vakuum getrocknet. Das erhaltene BOC Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-Hydrazid zeigt F. 216 bis 2180.



   Bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten weist es die folgenden   Rf-Werte    auf: Rf = 0,55 in Dioxan-Wasser   (98 : 2);    Rf = 0,52 in Chloroform Methanol   (8 : 2);      Rflo2F    = 0,70.



  17.   BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)   
Thr(tBu)-Cys(TRI) -Val-Leu-OH
Bei   -150    werden zu 1,075 g (1,26 mMol) BOC   Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-NH-NH2    in 15 Dimethylformamid 1,71 ml Salzsäure in Essigester (I,84n; 3,15 mMol) und 0,174 ml (1,51 mMol) tert.-Butylnitrit (1,74 ml aus einer Lösung von 1 ml tert.-Butylnitrit mit Dimethylformamid auf 10 ml aufgefüllt) gegeben. Die Lösung wird 15 Minuten bei   -100    gerührt und dann die auf   -120    gekühlte Lösung von 1,104 g (1,26 mMol)   H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRl)-Val-Leu-    OH und 0,61 ml (4,41   mMol)    Triäthylamin in 15 ml Dimethylformamid zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde bei   -100    und vier Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. 

  Nach Eindampfen am Hochvakuum auf ein kleines Volumen und Zugabe von Wasser erhält man ein pulveriges Produkt, welches zweimal mit Wasser verrieben und dann am Hochvakuum über Kalilauge getrocknet wird. Dieses Rohprodukt wird durch Umlösen aus Methanol gereinigt.



  Aus einer bei 500 gesättigten methanolischen Lösung scheidet sich über Nacht bei   0     ein weisses Pulver aus, welches sich im Dünnschichtchromatogramm als einheitlich erweist.



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist   Rf43c    = 0,54;   Rf1tÄ    = 0,65;   Rf45    = 0,50; Rf70 = 0,75; Rf in Chloroform-Methanol   (8 : 2)    = 0,40.



   Beispiel 2
EMI4.1     

Zu 172 mg (0,2 mMol)   EOC-Val-Cys(TRI)-Gly-      Glu(OtBu)    und 128 mg BOC-Cys(TRI)-Asn-OtBu in  5 ml Essigester und 2 ml Methanol gibt man 254 mg (1 mMol) Jod in 5 ml Methanol und lässt die Lösung eine Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Bei   0     wird dann mit ln Thiosulfatlösung entfärbt, das Reaktionsgemisch in 200 ml Essigester aufgenommen und dreimal mit Wasser gewaschen. Bei Einengen der (mit Natriumsulfat getrockneten) Essigesterlösung fällt [BOC   Cys-Asn-OtBu]2    kristallin aus (32 mg, F.   194-1960)    und wird abfiltriert. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand   zweimal    mit Petroläther verrieben. Aus dem unlöslichen Rückstand erhält man durch Säulenchromatographie an Silicagel 90 mg (I).



  Dieses zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel Rf = 0,25, im System Chloroform-Methanol   (95 : 5)    und Rf = 0,30 im System Toluol-Aceton   (1:1).   



   Als zweites Produkt erhält man bei der Säulenchromatographie 54 mg   [BOC-Val-Cys-Gly-Glu(OtBu)l;;    Rf (an Silicagel) im System Chloroform-Methanol (9:1) = 0,55. Das oben erwähnte kristalline Dimere vom F.   194-1960    zeigt folgende Rf-Werte (an Silicagel): in Chloroform-Methanol (9:1) Rf = 0,25; in Toluol Aceton (1:1) Rf = 0,18.



   Die beiden Ausgangspeptide können wie folgt hergestellt werden: 1. Z-Asn-OtBu
Man löst 32 g (120 mMol) Z-Asn-OH in 600 ml Dioxan und leitet bei   -300    300 ml Isobutylen in die Lösung. Nach Zugabe von 12 ml konzentrierter Schwefelsäure wird der Kolben verschlossen und unter gelegentlichem   -Schütteln    20 Stunden bei   0     stehengelassen, wobei eine klare Lösung erhalten wird. Diese wird bei Zimmertemperatur weitgehend vom überschüssigen Isobutylen befreit. Zu der erhaltenen Lösung gibt man bei   0     eine wässrige Lösung von 44 g Kaliumbicarbonat, dampft dann auf ein kleines Volumen ein und nimmt in Essigester auf. Die organische Phase wird mit   1n    Bicarbonat und dann mit Wasser neutral gewaschen.



  Beim Einengen der mit Natriumsulfat getrockneten Essigesterlösung beginnt das Produkt auszukristallisieren. Man fügt noch n-Hexan zu und filtriert ab. F. 100 bis 1020.   [a]2r3      :-160    (c = 2 in Methanol).



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist der Rf-Wert in Toluol-Aceton   (7 : 3)    = 0,27; in Essigester = 0,43.



  2. H-Asn-OtBu
23,6 g (73,2 mMol) Z-Asn-OtBu werden in 200 ml Essigester in Gegenwart von 2 g Pd-Kohle   (10%)    hydriert. Nach 1 Stunde wird kein Wasserstoff mehr aufgenommen. Man filtriert vom Katalysator ab. Beim Einengen des Filtrates kristallisiert das Produkt aus F. 96-980;   [a]D:    + 20 (c = 2,1 in Methanol).



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist   Rf.,2    = 0,30;   Rf < 5    = 0,50.



  3. BOC-Cys(TRI)-Asn-OtBu
Man gibt zu 18,52 g (40 mMol) BOC-Cys(TRI)-OH und 5,6 ml (40 mMol) Triäthylamin in 200 ml Tetrahydrofuran bei   -10     5,32 ml (40 mMol) Isobutylchlorocarbonat und rührt 10 Minuten bei dieser Temperatur. Eine auf   -100    gekühlte Lösung von 7,52 g (40 mMol) H-Asn-OtBu in 150 ml Tetrahydrofuran wird zugetropft und das Gemisch 1 Stunde bei   -100    und über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen.



  Dann filtriert man vom ausgeschiedenen Triäthylaminhydrochlorid ab, dampft das Filtrat zur Trockne ein, nimmt den Rückstand in Essigester auf und wäscht mit   1n    Zitronensäure, ln Natriumbicarbonat und Wasser. Bei Einengen der Essigesterlösung und Zugabe von Petroläther kristallisiert das Produkt aus. F. 155 bis 1570.   [cc]2D3    .   +    340 (c = 2,1 in CHC13).



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Toluol-Aceton (1:1) ist Rf = 0,45; in Chloroform Methanol   (95 : 5)    = 0,33;   Rf:3.,    = 0,65.



  4.   Z-Gly-Glu(OtBu)2   
Man gibt zu einer Lösung von 23,2 g (0,11 Mol) Z-Gly-OH und 15,54 ml (0,11 Mol) Triäthylamin in 200 ml Tetrahydrofuran bei   -100    14,97 ml (0,11 Mol) Isobutylchlorocarbonat und lässt 10 Minuten bei 100 stehen. Ein Gemisch von 28,52 g (96,5 mMol) H-Glu   (OtBu)2,      HC1    und 13,5 ml (96,5 mMol) Triäthylaminhydrochlorid in 300 ml Tetrahydrofuran wird vom Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert, das Filtrat auf   -10     gekühlt und dann bei   -100    in obige Lösung getropft. Man rührt noch 1 Stunde bei   -100    und 2 Stunden bei Raumtemperatur, filtriert vom ausgeschiedenen Triäthylaminhydrochlorid ab und dampft das Filtrat zur Trockne ein.

  Das erhaltene   Öl    wird in Essigester aufgenommen und mit   1n    Zitronensäure, ln Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Nach Abdampfen des Essigesters erhält man das Peptidderivat, das aus Essigester-n-Hexan kristallisiert. F. 74 bis   760;      [iD3    : 170 (c = 2,2 in Methanol).



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist der Rf-Wert in Toluol-Aceton (7: 3) = 0,50.



  5.   H-Gly-Glu(OtBu),   
2,7 g (6 mMol)   Z-Gly-Glu(OtBu)    werden in 30 ml Essigester in Gegenwart von 250 mg Pd-Kohle   (102)    hydriert. Nach 4 Stunden ist die Wasserstoffaufnahme beendet. Man filtriert vom Katalysator ab und dampft die Lösung ein. Das Produkt wird als Ö1 erhalten, das dünnschichtchromatographisch einheitlich ist. Die Rf Werte (an Silicagel) sind:
In Toluol-Aceton (7: 3) = 0,27; in Chloroform   Methanol (9:1) = 0,37; RftÄ v = 0,50.   



  6.   TRI-Cys(TRI)-Gly-Glu(OtBu)2   
Man gibt zu 26,6 g (44 mMol) TRI-Cys(TRI)-OH und 13,9 g (44 mMol)   H-Gly-Glu(OtBu)    in 350 ml Essigester bei   0     9,06 g (44 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt 2 Stunden bei   0     und lässt über Nacht im Kühlschrank stehen. Dann filtriert man vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab, wäscht das Filtrat mit ln Zitronensäure, In Natriumbicarbonat und Wasser, trocknet die Lösung, dampft ein. Das Produkt kristallisiert aus Essigester-n-Hexan. F. 107 bis 1100.   [¯r]2,3    :   +    80 (c = 2,0 in Methanol).

 

   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System Toluol-Aceton   (7 : 3)    ist Rf = 0,70; in Chloroform-Methanol   (98 : 2)    ist Rf = 0,78.



  7.   H-Cys(TRI)-Gly-Glu(OtBu)   
Zu 3,156 g (3,5 mMol) TRI-Cys(TRI)-Gly-Glu   (OtBu)     in 20 ml Eisessig werden bei Zimmertemperatur 5 ml Wasser derart gegeben, dass sich der gebildete Niederschlag stets wieder löst. Nach etwa 10 Minuten tritt Trübung und Bildung eines Niederschlags ein. Man rührt 1 Stunde, gibt dann 15 ml Wasser zu und filtriert ab. Das Filtrat wird im Hochvakuum bei   40     eingedampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen und bei   0     mit 0,5n Natriumbicarbonat und   Wasser gewaschen. Der nach dem Eindampfen erhaltene Schaum wird mit Petroläther verrieben.

  Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol   (95 : 5)    Rf = 0,40; in Toluol Aceton   (1:1) Rf    = 0,55;   Rf42A    = 0,60.



  8.   BOC-Val-Cys(TRI)-Gly-Glu(OtBu)2   
Man gibt zu 7,17 g (33 mMol)   BOC-Val-OIH    und 4,62 ml (33 mMol) Triäthylamin in 80 ml Essigester bei   -10     4,4 ml (33 mMol) Isobutylchlorocarbonat und rührt 10 Minuten bei   -100.    Eine auf   -100    gekühlte Lösung von 21,92 g (33 mMol) H-Cys(TRI)-Gly   Glu(OtBu)    in   400    ml Essigester wird zugetropft und das Gemisch noch 1 Stunde bei 100 und 10 Stunden bei Zimmertemperatur gehalten. Dann wird zur Trockne eingedampft, der Rückstand zweimal mit je 200 ml Wasser verrieben und über Phosphorpentoxid getrocknet. Den Rückstand löst man in 450 ml heissem Methanol. Das Produkt kristallisiert über Nacht bei   0     aus.

  F.   213-215.      [a]2D    = + 190 (c = 2,2 in Chloroform).



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System Cyclohexan-Essigester (1:1) ist Rf = 0,18; im System Toluol-Aceton (1:1) ist Rf = 0,65.



   Beispiel 3
Man versetzt 172 mg (0,2 mMol) BOC-Val-Cys   (TRI)-Gly-Glu(OtBu).    in 5 ml Essigester und 2 ml Methanol mit 127 mg (0,5 mMol) Jod in 2,5 ml Methanol und lässt das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Die Lösung wird dann bei 03 mit ln Thiosulfat entfärbt, in 200 ml Essigester aufgenommen und dreimal mit Wasser gewaschen.



  Das nach dem Eindampfen der Essigesterlösung erhaltene Produkt wird zweimal mit Petroläther verrieben.



  Das in   Teiroläther    unlösliche [BOC-Val-Cys-Gly-Glu   (OtBu)-.    ist dünnschichtchromatographisch einheitlich.



  Ausbeute 123 mg (100%).



   Beispiel 4
EMI6.1     


<tb>   BOC-Cys-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2    <SEP> 
<tb> 
Zu einer Lösung von 620 mg Jod in   150    ml Methanol werden bei 250 unter starkem Rühren 500 mg   BOC-Cys(TRI)-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-Cys(TRI)-      Pro-Leu-Gly-NH,    gelöst in 100 ml Methanol, innert 45 Minuten eingetropft. Man rührt eine Stunde weiter, kühlt dann die Lösung auf 50 ab und entfärbt sie durch Zugabe von 1,0n wässriger Natriumthiosulfatlösung. Hierauf wird die Lösung im Wasserstrahlvakuum auf ein Volumen von etwa 5 ml eingeengt und das Produkt durch Zugabe von viel Wasser ausgefällt. Es wird abgenutscht und im Vakuum über Natriumhydroxyd getrocknet. Zwecks Überführung in das freie Oxytocin wird das Produkt in 5 ml eiskalter, konzentrierter Salzsäure suspendiert und unter Rühren gelöst.

  Nach 10 Minuten bei   0     verdünnt man die Lösung mit 20 ml Eiswasser, gibt 5 ml Eisessig zu, filtriert über eine Säule von Merck-Ionenaustauscher Nr. II, schwach basisch, Acetatform, und wäscht mit   20iger    Essigsäure nach. Dann wird im Vakuum bei 30 eingedampft, der Rückstand in Wasser gelöst und die Lösung lyophilisiert. Das so erhaltene rohe Oxytocin kann, falls erwünscht, nach dem Verfahren von Yamashiro (Nature 201, 76 (1964) weiter gereinigt werden.



   Das als Ausgangsmaterial verwendete geschützte Nonapeptidderivat BOC - Cys(TRI) - Tyr(tBu)   - Ile - Gln-      Asn-Cys(TRI)-Pro-Leu-Gly-NH2    kann wie folgt hergestellt werden: 1. TRI-Cys(TRI)-Pro-Leu-Gly-NH2
30 g H-Pro-Leu-Gly-NH2 werden in 500 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst, und die auf 50 gekühlte Lösung wird mit 70 g TRI-Cys(TRI)-OH, 20 g N-Hydroxysuccinimid und 30 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 30 Minuten bei   0     erwärmt man auf Raumtemperatur und lässt 18 Stunden stehen.



  Sodann wird vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff abgenutscht, das Filtrat im Hochvakuum bei 400 eingedampft und der Rückstand mit 1 Liter Petroläther versetzt. Nach gründlichem Zerreiben des ungelösten Produktes dekantiert man die Petrolätherlösung ab.



  Den in Petroläther unlöslichen Rückstand nimmt man in Essigester auf, wäscht die Lösung bei   0     mit verdünnter Zitronensäure, Wasser, Natriumbicarbonatlösung und Wasser, trocknet sie mit Natriumsulfat und dampft zur Trockene ein. Das dabei erhaltene, rohe Tetrapeptidderivat TRI - Cys(TRI) - Pro - Leu - Gly wird zur Reinigung in Methanol gelöst und über eine Säule von Sephadex   LH-20    filtriert. Die erhaltenen Fraktionen werden eingedampft und ihre Reinheit mittels Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten im System Chloroform-Methanol (99:1) geprüft. Die reinen Fraktionen werden vereinigt, eingedampft und getrocknet.



  2.   H-Cys(TRI)-Pro-Leu-Gly-NH.i   
Zur Abspaltung der   N -TRI-Gruppe    löst man 5 g   TRI-Cys(TRI)-Prn-Leu-Gly-NH2    in 100 ml   80 %der    Essigsäure und lässt die Lösung 1 Stunde bei 350 stehen. Dann gibt man 100 ml Wasser zu und lässt 5 Stunden bei   0     stehen. Hierauf werden die Kristalle des ausgeschiedenen Triphenylcarbinols abgenutscht, das Filtrat wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand im Hochvakuum bei 300 getrocknet. Zur Überführung in die freie Base wird das als essigsaures Salz erhaltene   H-Cys(TRI)-Pro-Leu-Gly-NHs    in Chloroform gelöst, die Lösung mit verdünnter Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.



  3. Z-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-OH
4,05 g H-Ile-Gln-Asn-OH werden in 70 ml Wasser und 1,5 ml Triäthylamin gelöst und dann 200 ml Dimethylformamid zugegeben. Hierauf wird mit 8 g Z-Tyr(tBu)-p-nitrophenylester (dargestellt aus Z-Tyr (tBu)-OH und p-Nitrophenol mittels Dicyclohexylcarbodiimid, F.   88-890    aus Methanol-Wasser) versetzt und 72 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann engt man im Vakuum bei 400 auf ungefähr 20 ml ein, gibt 100 ml 0,5n Natriumbicarbonatlösung und 200 ml Äther zu, trennt die   Atherlösung    ab und kühlt die wässrige Phase in Eis. Nach Ansäuern mit 2n Salzsäure wird das ausgeschiedene Z-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-OH abgenutscht und mit Eiswasser gewaschen. Zur Reinigung wird es nochmals aus Dimethylformamidlösung mit Äther gefällt.

 

  4.   H-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-OH   
1,2 g des unter 3 erhaltenen Tetrapeptidderivates werden in 50 ml   90 einer    Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 0,5 g Palladiumkohle (10 % Pd)  hydriert. Nach beendeter Hydrierung wird vom Katalysator abgenutscht, das Filtrat im Vakuum zur Trockne verdampft und der Rückstand im Hochvakuum bei 400 getrocknet.



  5. BOC-Cys(TRI)-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-OH
Das unter 4 erhaltene Produkt wird in 35 ml Dimethylformamid und 0,5 ml Triäthylamin suspendiert und durch Zugabe von Wasser in Lösung gebracht.



  Dann wird 1,0 g   BOC-Cys(TRI)-p-nitrophenylester    zugegeben und das Reaktionsgemisch 48 Stunden bei 280 stehengelassen. Hierauf wird im Hochvakuum bei 350 eingeengt, der Rückstand mit 100 ml eiskalter,   1n    Salzsäure versetzt und das rohe Pentapeptidderivat abgenutscht. Nach Waschen mit Eiswasser und Trocknen wird mehrmals aus   Dimethylformamid-Äther    umgefällt.



  Zur weiteren Reinigung wird in Methanol gelöst und über eine Säule von Sephadex LH-20 chromatographiert.



  6.   BOC-Cys(TRI)-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-Cys(TRI)-       Pro-Leu-Gly-NH2   
2,1 g des unter 2 erhaltenen   Tetrapeptidderivates    und 3,3 g   BOC-Cys(TRI)-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-OH    werden in 50 ml Dimethylformamid unter Zusatz von 1 g N-Hydroxysuccinimid gelöst. Die auf   -200    gekühlte Lösung wird mit 0,9 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 2 Stunden   bei 200    und sodann 48 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, wobei nach 6, 12 und 18 Stunden jeweils noch weitere 200 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben werden. Hierauf wird vom ausgeschiedenen Dicyclohexylcarbodiimid abfiltriert, das Filtrat im Hochvakuum bei 400 Badtemperatur auf ein kleines Volumen eingeengt und das Nonapeptidderivat durch Zugabe von   Ather    gefällt.

  Das Pulver wird abgenutscht, getrocknet, mit Wasser zerrieben, wieder abgenutscht und getrocknet. Das so erhaltene rohe BOC - Cys(TRI) - Tyr(tBu) - Ile-Gln-Asn-Cys(TRI)   Pro-Leu-Gly-NH    wird zur Reinigung einer Gegenstromverteilung im gleichen System wie in Beispiel 1 beschrieben, unterworfen.



   Beispiel 5
EMI7.1     


<tb>   BOC-Cys-Tyr(tBu)-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro    <SEP> 
<tb>  <SEP>    Lys <SEP> (B <SEP> OC) <SEP> -Gly-NH2    <SEP> 
<tb> 
Zu einer Lösung von 1120 mg Jod in 500 ml Methanol wird bei Raumtemperatur unter starkem Rühren eine Lösung von 800 mg BOC-Cys(TRI)-Tyr (tBu) - Phe -   Gln-Asn-cys(TRI)-pro-Lys(Boc)-Gly-NHst    in 500 ml Methanol innert 45 Minuten tropfenweise zugegeben. Dann wird die Lösung auf 20 gekühlt und durch Zutropfen von wässriger   1n    Natriumthiosulfatlösung entfärbt. Hierauf wird im Wasserstrahlvakuum bei 300 Badtemperatur auf ein kleines Volumen eingeengt und das Produkt durch Zugabe von viel Wasser ausgefällt. Es wird abgenutscht und im Vakuumexsikkator getrocknet.

  Zwecks Überführung in Lysin8 Vasopressin wird das
EMI7.2     


<tb>   BOC-Cys-Tyr(tBu) <SEP> -Phe-Gln-Asn-    <SEP> 
<tb>    Cys-Pro-Lys(BOC)-Gly-NH    unter Rühren in 10 ml eiskalter, konzentrierter Salzsäure gelöst. Nach 10 Mi nuten bei   0     verdünnt man mit 50 ml Eiswasser und gibt 5 ml Eisessig zu. Hierauf wird über eine Säule von Merck-Ionenaustauscher Nr. II, schwach basisch,
Acetatform, filtriert und das Eluat zur Trockne eingedampft.



   Das als Ausgangsmaterial verwendete geschützte Nonapeptidderivat   BOC - Cys(TRI) -   Tyr(tBu)   - Phe-Oln-      Asn-Cys(TRI)-Pro-Lys(BOC)-Gly-NH2    kann in analoger Weise wie für das geschützte Nonapeptidamid in Beispiel 4 gezeigt durch Kondensation von BOC-Cys (TRI)-Tyr(tBu)-Phe-Gln-Asn-OH mit H-Cys(TRI)-Pro   Lys(BOC)-Gly-NH2    in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid und N-Hydroxysuccinimid hergestellt werden. Die Herstellung der Zwischenprodukte kann ebenfalls analog erfolgen.



   Beispiel 6
EMI7.3     


<tb>   B0 & ys-Phe-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-    <SEP> 
<tb>  <SEP>    Lys(BOC)-Gly-NH.    <SEP> 
<tb> 



   Diese Verbindung kann nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren aus BOC-Cys(TRI)-Phe-Phe Gln - Asn -   Cys(TRI)-Pro-Lys(BOC)-Gly-NH2    hergestellt und in   Phe2,    Lys8-Vasopressin übergeführt werden.



   Beispiel 7
1,524 g   BOC-Cys(TRI)-Gly-Glu(OtBu)3    und 508 mg Jod werden in 25 ml Methanol während einer Stunde bei Zimmertemperatur reagieren gelassen. Durch tropfenweise Zugabe von wässriger   1n    Natriumthiosulfatlösung wird die Reaktionslösung bei   0     entfärbt und das Produkt mit 50 ml Wasser ausgefällt. Das getrocknete Rohprodukt wird dreimal mit je 10 ml Petroläther verrieben. Kristallisation des Rückstandes aus Essigester-Petroläther liefert 945 mg   (91 %)    [BOC   Cys-Gly-Glu(OtBu)2]3    vom F.   150-1520.    Rf = 0,60 (Chloroform-Methanol 9:1).



   Beispiel 8
Die Reaktion von 762 mg (1,0 mMol) BOC-Cys   (TRI)-Gly-Glu(OtBu)r    und 634 mg (1,0 mMol) BOC Cys(TRI)-Asn-OtBu mit 508 mg (2,0 mMol) Jod und die Aufarbeitung werden wie in Beispiel 7 ausgeführt.



  Das Rohprodukt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System Chloroform-Methanol (9:1) drei Flecken: Rf   =    0,60   ([BOC-Cys-GW-Glu(0tBu)2j2    = I), 0,25   ([BOC-Cys-Asn-OtBu]3    = II) und 0,45
EMI7.4     
 Die Trennung gelingt durch Gegenstromverteilung im System   Methanol -0,1- Ammoniumacetat - Chloroform-    Tetrachlorkohlenstoff   (4 : 2:1: 3).    Nach 100 Schritten befindet sich II in den Elementen 56-76   (r,,,    = 65; K =   1,85).    Diese werden geleert, frische untere Phase eingefüllt und weitere 100 Schritte ausgeführt. III befindet sich nun in den Rohren 8-25   (r,nax    = 16; K = 0,09), I in den Elementen 0-5. 

  Eindampfen dieser Fraktionen und Absublimieren von Ammoniumacetat liefert die drei Verbindungen in dünnschichtchromatographisch reiner Form:
I schmilzt nach Umkristallisation aus Essigester
Petroläther bei   150-1520;    Ausbeute 225 mg (sta tistisch: 260 mg);
II schmilzt nach Umkristallisation aus Methanol  Äther bei   194-1960;    Ausbeute 162 mg (sta tistisch 195 mg).



  III ist amorph; Ausbeute 463 mg.



   Wird die Reaktion mit 1 mMol BOC-Cys(TRI)
Gly-Glu(OtBu)2, 2 mMol BOC-Cys(TRI)-Asn    OtBu    und 3 mMol Jod ausgeführt, so werden
580 mg III isoliert (statistisch 606 mg).  

 

   Beispiel 9
Zu 254 mg (1 mMol) Jod in 5 ml Eisessig wird die Lösung von 380 mg (0,5 mMol) BOC-Cys(TRI) Gly-Glu(OtBu)2 und 45 mg (0,55 mMol) Natriumacetat (wasserfrei) in 5 ml Eis essig gegeben und eine Stunde bei Zimmertemperatur gerührt. Durch Zugabe von In Natriumthiosulfat (1,7 ml) wird die braune Lösung entfärbt; man gibt weitere 5 ml Eisessig zu und lyophilisiert. Das resultierende Pulver wird in Wasser aufgenommen, filtriert und der Rückstand gut mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Phosphorpentoxyd werden durch Umkristallisieren aus Essigester Petroläther 205 mg   (80S)      [BOC-Cys-Gly-Glu(OtBu)2]o    vom F.   151-1520    erhalten.

Claims (1)

  1. PATENTANSPRUCH
    Verfahren zur Herstellung von Cystinrest-haltigen Peptiden aus entsprechenden Cysteinrest-haltigen Peptiden, in denen die Mercaptogruppen durch Tritylgruppen geschützt sind, dadurch gekennzeichnet, dass man die die geschützten Cysteinreste enthaltenden Peptide mit Jod behandelt.
    UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reaktion bei Temperaturen von 0-60 ausführt.
    2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reaktion in einem alkoholischen Lösungsmittel ausführt.
    3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reaktion in Methanol ausführt.
    4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reaktion in einem Gemisch von niederem Alkanol und einem anderen organischen Lösungsmittel ausführt.
    5. Verfahren nach Patentanspruch oder einem der Unteransprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff ein Peptid verwendet, in welchem zwei geschützte Cysteinreste enthalten sind, so dass durch die Disulfidbrücke ein cyclisches Peptid gebildet wird.
    6. Verfahren nach Patentanspruch oder einem der Unteransprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass man in verdünnter Lösung umsetzt.
    7. Verfahren nach Patentanspruch oder einem der Unteransprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff ein Peptid verwendet, welches nur einen geschützten Cysteinrest enthält, so dass das Dimere mit Disulfidbrücke gebildet wird.
    8. Verfahren nach Patentanspruch oder einem der Unteransprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoffe zwei verschiedene Peptide verwendet, welche je einen geschützten Cysteinrest enthalten, so dass ein Peptid mit zwei verschiedenen, durch eine Disulfidbrücke verbundenen Aminosäuresequenzen gebildet wird.
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