DE2039223C3

DE2039223C3 - Parenteral injizierbares pharmazeutisches Präparat mit einem gehalt an einem parenteral verträglichen Trägermaterial und einem Desensibilisierungsmittel gegen Allergien

Info

Publication number: DE2039223C3
Application number: DE19702039223
Authority: DE
Inventors: Brian George Dorking Surrey Overell
Original assignee: BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Current assignee: BEECHAM GROUP Ltd BRENTFORD MIDDLESEX GB
Priority date: 1969-08-06
Filing date: 1970-08-06
Publication date: 1981-04-30
Also published as: BE754523A; JPS4935413B1; IE34433B1; DE2039223A1; NO135015B; AT297930B; DK127954B; NO135015C; ES382486A1; IE34433L; NL7011548A; NL168419B; NL168419C; CH570418A5; CH569743A5; CA950358A; DE2039223B2; SE396694B

Description

Die Erfindung betrifft ein Desensibilisierungs- oder Immunisierungsmittel zur Behandlung von Hypersensibilisierungserscheinungen und Allergien.

Es ist bekannt, daß manche Menschen gegen Allergene, wie Pollen, Zimmerstaub, Katzenfelle, Getreide und vielen anderen Substanzen, überempfindlich sind. Diese Menschen können unter akuten Beschwerden infolge ihrer allergischen Reaktionen leiden, die sich in Krankheiten, wie Asthma, Heuschnupfen, Ekzemen, Dermatitis oder Migräne, äußern.

Ein zur Behandlung allergischer Erscheinungen angewendetes Verfahren ist die sogenannte Desensibilisierungstherapie. Dem zu behandelnden Patienten werden wiederholte, allmählich ansteigende Dosen eines Extrakts des Allergens oder der Allergene verabreicht, gegen das bzw. gegen die er empfindlich ist. Am Ende der Behandlung ist gewöhnlich die natürliche Abwehrkraft des Patienten gegen das Allergen stark angestiegen, vermutlich als Folge des Aufbaus von Antikörpern im Organismus, der durch den verabreichten Extrakt angeregt wird. Diese Desensibilisierungstherapie hat gewisse Nachteile. Beispielsweise kann versehentlich eine ge^rährlich hohe Dosis des Allergens verabreicht werden, was /u einer anaphylaktischen Reaktion beim Patienten führ' Zur Lösung dieses Problems wurde bereits vorgeschlagen, das Allergen wenn möglich derart zu modifizieren, daß die Allergiewirkung gegenüber den Desensibilisierungs- und/oder Immunisierungseigensehaften vermindert wird.

Aufgabe der Erfindung war es, das Allergen oder den allergenhaltigen Stoff für den empfindlichen Patienten unschädlich oder zumindest weniger schädlich zu machen, wobei jedoch die Fähigkeit der Allergene zur Anregung der Antikörperbildung beibehalten wird. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Desensibilisierungsmittel gegen Allergien aus einem modifizierten allergenen Protein oder Glykoprotein, gegebenenfalls in Verbindung mit Adjuvantien, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das allergene Protein oder Glykoprotein bzw. deren Fraktionen intermolekular und/oder intramolekular mit einem Polyaldehyd, Epihalogenhydrin oder einem anorganischen Cyanat vernetzt worden ist.

Das erfindungsgemäß zu modifizierende allergenhaltige Ausgangsmaterial erhält man in an sich bekannter

ίο Weise aus allergenhaltigen Pflanzen oder Pollen durch Extrahieren mit einem Lösungsmittel, im allgemeinen Wasser. Der erhaltene allergenhaltige Extrakt besteht hauptsächlich aus Proteinen oder Glykoproteinen, die gewöhnlich mit freien Kohlenhydraten verunreinigt

is sind. Der Extrakt wird hierauf gewöhnlich durch Abtrennung der Verunreinigungen, z. B. mittels Dialyse, Ausfällung oder Gelfiltration, gereinigt und wird anschließend mit einem Polyaldehyd, Epihalogenhydrin oder einem anorganischen Cyanat vernetzt. Eine eingehendere Beschreibung einiger der üblichen Methoden findet sich in dem Aufsatz von J. N. Newell, Journal of Allergy, Bd. 13,1942, S. 177 bis 203, insbesondere S. 187. Gemäß einem anderen brauchbaren Extraktionsverfahren wird das allergenhaltige Ausgangsmaterial oder dessen wäßriger Extrakt mit einer wäßrigen Phenollösung behandelt und der allergenhaltige Extrakt aus der Phenolphase abgetrennt

Beispiele für erfindungsgemäß verwendete Polyaldehyde sind Dialdehyde und höhere Aldehyde.

Erfindungsgemäß werden vorzugsweise Dialdehyde, d.h. solche mit 2 bis etwa 24 Kohlenstoffatomen im Molekül, verwendet. Die Dialdehyde können aliphatisch, cycloaliphatisch, heterocyclisch oder aromatisch und verzweigt oder unverzweigt sein, wie z. B. Glyoxal, 1,3-Propandial, 1,4-Butandial, Glutaraldehyd und α,ω-Dialdehyde mit 14 bis 24 Kohlenstoffatomen im Molekül. Erfiiidungsgemäß besonders bevorzugt ist Glutaraldehyd.

Der Ausdruck »Epihalogenhydrin« bedeutet Verbindüngen der allgemeinen Formel 1

CH₂

CH₂-CH₃-X

(I)

in der X ein Halogenatom, vorzugsweise ein Chlor- oder Bromatom ist. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist Epichlorhydrin.

Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare anorganische Cyanate sind Alkalimetallcyanate, insbesondere Kaliumcyanat, und Erdalkalimetallcyanate.

In der Regel sind Allergenproteine gegenüber einer Denaturierung ziemlich widerstandsfähig. Sie können daher gewöhnlich auf relativ hohe Temperaturen erhitzt werden, ohne daß sie denaturieren.

Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemä-

bo Ben Desensibilisierungsmittel kann daher innerhalb eines verhältnismäßig breiten Temperaturbereichs durchgeführt werden. In der Praxis ist es jedoch meist nicht notwendig bzw. erwünscht, oberhalb 100⁰C zu arbeiten. Bei Verwendung von Dialdehyden wird

b5 vorzugsweise unterhalb 37⁰C gearbeitet, und in der Praxis wird die Reaktion in allen Fällen vorzugsweise bei Raumtemperatur, d.h. bei etwa 20 bis 25°C durchgeführt. Bei Verwendung von Dialdehyden müs-

sen nämlich extreme Reaktionsbedingungen vermieden werden, um die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten, z. B. durch Selbstkondensation der Aldehyde, zu verhindern.

Bei Verwendung von Polyaldehyden ist es nicht kritisch, bei welchem pH-Wert die Umsetzung durchgeführt wird. Man arbeitet vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 8, insbesondere bei etwa 5. Sehr niedrige pH-Werte sind zur Verhinderung der Selbstkondensation der Aldehyde zu vermeiden.

Bei Verwendung von Epihalogenhydrinen kann die Umsetzung ebenfalls bei beliebigem pH-Wert durchgeführt werden, vorzugsweise sind jedoch extreme pH-Werte zu vermeiden. Bei Verwendung eines Epihalogenhydrins verläuft die Reaktion im alkalischen pH-Bereich glatt, vorzugsweise bei etwa pH 8.

Die Umsetzung des allergenen Proteins mit einem anorganischen Cyanat muß erfindungsgemäß bei sauren pH-Werten, vorzugsweise bei etwa pH 5, durchgeführt werden.

Die erfindungsgemäß verwendeten Reaktionsteilnehmer wirken gegenüber dem Allergen als Vernetzungsmittel und verursachen intermolekulare und/oder intramolekulare Vernetzungen. Daher sind zwar die erfindungsgemäß verwendeten allergenhaltigen Ausgangsstoffe wasserlöslich, die erfindungsgemäß modifizierten Produkte jedoch im allgemeinen nur schwer löslich. Die Löslichkeit der modifizierten Produkte scheint vom Vernetzungsgrad abzuhängen, der wiederum von Art und Menge des verwendeten Reaktionsteil-.nehmers und den Reaktionsbedingungen abhängt. Bisher ist keine empirische Methode zur Vorherbestimmung der Löslichkeitseigenschaften der modifizierten allergenen Produkte bekannt. Die erforderlichen Reaktionsvariablen zur Herstellung eines Produkts mit der gewünschten Löslichkeit müssen daher durch einfache Vorversuche ermittelt werden.

Arzneipräparate können die Desensibilisierungsmittel der Erfindung sowie einen parenteral verträglichen Träger, wie eine isotonische Salzlösung, eine Pufferlösung oder ein öl, oder einen anderen bekannten Trägerstoff, enthalten. Sie können außerdem ein Adjuvans, wie Tyrosin, Aluminiumoxid, Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat, enthalten. Das Desensibilisierungsmittel wird im allgemeinen subcutan injiziert. Die Höhe der verabreichten Dosis hängt von dem allergischen Zustand des Patienten ab.

Im allgemeinen sollen die Desensibilisierungsmittel der Erfindung eine geringere Löslichkeit als das Ausgangsmaterial aufweisen, jedoch in vivo so weit löslich sein, daß sie in gewünschter Weise freigesetzt werden. Es wurde festgestellt, daß sich dies bei Verwendung eines nur in geringem Maße löslichen, modifizierten und an Aluminiumoxid oder -hydroxid oder ähnlichen Stoffen adsorbierten Allergens erzielen läßt. Der Löslichkeitsgrad des vernetzten Allergens kann durch Adsorption an Aluminiumoxid verändert werden. Durch Routineversuche lassen sich die optimalen Freisetzungseigenschaften ^;n vivo ermitteln.

Bei parenteraler Verabreichung des erfindungsgemäßen Desensibilisierungsmittels an Tiere wurde festgestellt, daß sich beträchtliche Mengen von Antikörpern mit Kreuzspezifität für das nichtmodifizierte allergenhaltige Material bilden. Die Untersuchten erfindungsgemäß modifizierten Allergene verursachten auch bei überempfindlichen Tieren keine anaphylaktischen Reaktionen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung eines unlöslichen
Allergen-Derivats mit Glutaraldehyd

5 ml eines teilweise gereinigten Extraktes aus Bandgraspollen (Dactylis glomerata), der 10 mg Protein/ml in 0,1 m Natriumacetatpuffer vom pH-Wert 5,3 enthält, wird mit 5 ml einer 0,5prozentigen Glutaraldehydlösung umgesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die entstandene Fällung wird abzentrifugiert und zur Abtrennung des löslichen Rückstands mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Lösung wird schließlich in einer Phenol-Kochsalzlösung suspendiert und gelagert

Allergiewirkung

Die Suspension des unlöslichen Pollens wird in einer Konzentration von 10 mg/ml gegen Gras empfindlichen allergischen Patienten intradermal injiziert. Gleichzeitig wird das Ausgangsmaterial und die Phenol- Kochsalzlösung getrennt in andere Hautbereiche der gleichen Patienten injiziert Nach 10 Minuten werden die Quaddelgebiete gemessen, sie sind in Tabelle 1 in mm² angegeben. Es zeigt sich, daß das unlösliche Allergenpräparat bei der 200fachen Konzentration des Ausgangsmaterials knapp 10% von dessen Allergieivirkung aufweist. Die beibehaltene Allergiewirkung ist daher gegenüber der des Ausgangsmaterials vernachlässigbar.

Immunisierungswirkung

Das unlösliche Material und das Ausgangsmaterial werden jeweils im vollständigen Freundschen Adjuvans emulgiert, so daß sich eine Konzentration von 1 mg/ml ergibt. Gruppen von Meerschweinchen werden jeweils 0,5 ml der einen bzw. der anderen Emulsion subcutan injiziert. Nach 22 Tagen werden die Tiere an den Flanken kahlgeschoren. In die kahlen Stellen werden jeweils 0,1 ml einer Verdünnungsreihe des gereinigten Bandgraspollenextrakts intradermal injiziert. 0,4 ml einer 5prozentigen Lösung von Pontamin-Himmelblau wird sofort anschließend intravenös injiziert. Nach 20 Minuten werden die Durchmesser der entstandenen Quaddeln gemessen; sie sind in Tabelle II angegeben.

Es zeigt sich, daß das mit Glutaraldehyd modifizierte Pollenallergen die Bildung von Antikörpern bewirkt, die mit dem Ausgangsmaterial reagieren, jedoch besitzt das modifizierte Allergen eine bessere Immunisierungswirkung als das Ausgangsmaterial.

Tabelle I

Patient-Nr.	55	1	Unlöslicher	Gereinigter	Phenol-
		2	Bandgras	Bandgras	Kochsalz
60 3	pollenextrakt	pollenextrakt	lösung
4	10 mg/ml	50 μ§/'ιη1
Gesamt	21	84	12
Gesamt minus	16	32	9
65 Summe für	13	57	23
Phenol-Koch	15	51	4
salzlösung	65	224	48
17	176



Die Zahlen bedeuten die Fläche	der Quaddeln	(mm²).

Tabelle II

Meer- Immunisierender Stoff

schweinchen (0,5 mg)

Nr.

Quaddeldurchmesser (mm) bei verschiedenen Konzentrationen von intradermal injiziertem dermal injiziertem BandgraOpoIlenextrakt

100 μg 10 ug

1 V-S

0,1

0,01 μg 0,001 μο

1	Gereinigter Bandgras	15	0	0	0	0	0
2	pollenextrakt	16	0	0	0	0	0
3		17	0	0	0	0	0
4		16	0	0	0	0	0
5	mit Glutaraldehyd	14	0	0	0	0	0
6 7	modifizierter Bandgras	12 14	10 13	9 12	0 12	0 10	0 8
8	pollenextrakt	16	14	12	11	10	8
9		12	10	0	0	0	0
10 J	12	9	0	0	0	0

Beispiel 2

Herstellung eines
Allergen-Derivats mit Glutaraldehyd

Ein Kreuzkrautextrakt (2,5 mg/ml) wird mit 0,5 Gewichtsprozent je Volumen Glutaraldehyd 2 h bei Raumtemperatur und bei einem pH 7,0 umgesetzt. Die Reaktionslösung wird anschließend gegen eine mit Phosphat gepufferte Natriumchloridlösung und anTabelle III

schließend gegen destiJiiertes Wasser gründlich dialysiert und schließlich gefriergetrocknet

Allergiewirkung

Es wird die RAST-Methode angewendet. Die erhaltenen RAST-Hemmwerte für den mit Glutaraldehyd modifizierten Extrakt sind in der nachstehenden Tabelle 111 angegeben.

Material

RAST-Hemmung (Konzentration in μg/ml, die zu einer 5O°/oigen
Hemmung erforderlich ist

a*) b c d

Natürlicher Extrakt 6,8

Modifiziertsr Extrakt 145,2

*) Verwendeiis Serum.

1,0
13,0 10,0
98,1

4,3
51,7

Verhältnis von modifiziertem Extrakt (gemittelt ± Fehlergrenze)

14,1+2,6

Aus Tabelle III ist ersichtlich, daß das modifizierte Material über lOmal weniger allergieerzeugend als das unmodifizierte Material ist.

Immunisierungswirkung

Es wird die Fähigkeit des modifizierten Materials untersucht, bei Ratten einen Anti-Kreuzkraut-Antigen E-Antikörper zu erzeugen. Alle Ratten werden mittels subcutaner Injektion von 1 mg des Immunogens in vollständigem Freundschen Adjuvans am ersten Tag behandelt. Am 35. Tag wird eine weitere wäßrige Dosis von 1 mg subcutan verabreicht. Aus der nachstehenden Tabelle IV sind die Reaktionen am 14. und 42. Tag aufgezeichnet.

Tabelle	IV	Antikörper-Reaktion	42. Tag
Serum	Material	(ng AgE, gebunden je	58,2
Nr.		10μ1 Serum)	96,9
		14. Tag	34,5
		1,9	38,9
1		9,1	5,0
2		1,2	54,9
3	natürlicher Kreuz	2,0
4	krautextrakt	0,9
5		1,0
6

Serum
Nr.

Material

45

50

60

65

13
14
15
16
17
18

Antikörper-Reaktion (ng AgE, gebunden je 10 μ! Serum) 14. Tag 42. Tag

mit Glutaraldehyd

modifizierter

Kreuzkrautextrakt

0,5

0,7

<0,5

0,6

<0.5

<0,5

67,9 142,7 14,9 34,1 37,7 63,1

weitere Zugabe

Diese Ergebnisse zeigen, daß das modifizierte Material seine Immunisierungskraft beibehält.

Beispiel 3

50 mg eines Extrakts verschiedener Graspollen, der zur Abtrennung der Kohlenhydrate und niedermolekularen Stoffe teilweise gereinigt worden war, wird in 5 ml einer 0,01 m Phosphatpufferlösung vom pH 8,0 gelöst. ! ml l-Chlor-2,3-epoxypropan wird langsam zugegeben, und das Gemisch wird 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die entstandene Fällung wird abzentrifugiert, mit einer Phosphatpufferlösung gewaschen und in einer wäßrigen Phenol-Kochsalzlösung suspendiert.

Allergiewirkung

Eine Suspension des vorstehenden modifizierten Extraktes und eine Lösung des Ausgangsmaterials, beide in wäßriger Phenol-Kochsalzlösung, und das

Medium selbst werden jeweils gegen Gras empfindlichen allergischen Patienten intradermal injiziert. Nach 10 Minuten werden die Flächen der entstandenen Quaddeln gemessen. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle V angegeben.

Tabelle	V	Extrakt ver	mit Epichlorhydrin	Phenol-
Patient	schiedener	modifizierter Extrakt	Kochsalz
Nr.	Graspollen	verschiedener Gras	lösung
		pollen, lmg/ml
	62	0	0
1	15	1	0
2	12	V	0
3	8	2	0
4	3	0	0
5	12	0	0
6

Gesamt 112 3 0

Die Zahlen bedeuten die Quaddelflächen (mm²).

Immunisierungswirkung

25

Eine Gruppe von Meerschweinchen wird immunisiert, indem man den Tieren eine Emulsion, die den vorstehenden modifizierten Extrakt im vollständigen Freundschen Adjuvans enthält, subcutan injiziert. Eine ähnliche Gruppe von Meerschweinchen wird mit dem nichtmodifizierten Ausgangsmaterial im gleichen Adjuvans auf die gleiche Weise immunisiert. Nach 3 bis 4 Wochen werden die Tiere an den Flanken kahlgeschoren. In die kahlen Stellen werden jeweils 0,1 ml einer Verdünnungsreihe des Ausgangsmaterials und schließlich 0,1 ml 1 η-Kochsalzlösung intradermal injiziert.

0,4 ml einer 5prozentigen Lösung von Pontamin-Himmelblau werden sofort anschließend intravenös injiziert. Nach 20 Minuten bilden sich an einigen inlradermalen Injektionsstellen blaugefärbte Quaddeln, die die Anwesenheit von Antikörpern anzeigen, die für das Ausgangsmaterial spezifisch sind. Die Quaddeldurchmesser werden gemessen. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle VI angegeben.

Tabelle VI	Immunisierender Stoff	Quaddeldurchmesser (mm) bei dermal injiziertem Extrakt aus 100 μ§ 10 μg 1 μΒ	13 14 13 12	10 12 10 10	verschiedenen verschiedenen ; ο.¹ μί	Konzentrationen von intra- Graspollen ; 0,01 μg 0.001 μ\|
Meer schweinchen Nr.	Extrakt verschiedener Graspollen (5 mg)	14 16 14 14	2 111	I I I I	10 9 9	9 9 8 - 8 8
1 2 3 4	mit Epichlorhydrin modi fizierter Extrakt verschiede ner Graspollen (5 mg)	12 10 10	9 12 11 12	9 9 9	I I I I	I I I I I I I I
5 6 7 8	Extrakt verschiedener Graspollen (0,5 mg)	12 14 12 14	8 8	I I I I	I I I I	I I I I I I I I
9 10 11 12	mit Epichlorhydrin modifi zierter Graspollen extrakt (0,5 mg)	10 10		I I I I	I I I I I I I I
13 14 15 16

Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß durch die Immunisierung mit Allergenen, die mit Epichlorhydrin modifiziert wurden, nachweisbare Mengen von Antikörpern produziert werden, während die Allergiewirkung auf ein vernachlässigbares Maß reduziert wird.

. Beispiel 4

50 mg eines Extrakts aus Bandgraspollen werden in 10 ml einer 0,01 m Phosphatpufferlösung vom pH 8,0 gelöst 1 τη] l-Brom-23-epoxypropan wird langsam zugegeben und das Gemisch 8 Stunden bei Raumtempe-

ratur gerührt. Die entstandene Fällung wird abzentrifugiert, mit einer Phosphatpufferlösung gewaschen und in einer Phenol-Kochsalzlösung suspendiert.

Die Ergebnisse der biologischen Versuche sind in den nachstehenden Tabellen VII und VIIII angegeben. Die

to

Testmethoden sind identisch mit denen von Beispiel 3. Durch die Immunisierung bilden sich nachweisbare Mengen von Antikörpern, während die Allergiewirkung vernachlässigbar ist.

Tabelle VII

Meerschweinchen
Nr.

Immunisierender Stoff Quaddeldurchmesser (mm) bei verschiedenen Konzentrationen von intradermal injiziertem Extrakt aus verschiedenen Graspollen

100

Bandgraspollenextrakt (0,5 mg)

mit Epibromhydrin modifizierter Bandgrasextrakt
(0,5 mg)

16
16
16

14
14
15 10

0.1

0,01 μg

0,001 μg

10
10
10

Tabelle VIII

Allergiewirkung von mit Epibromhydrin modifiziertem Allergen

Patient
Nr.

Bandgraspollenextrakt,
100/1

Mit Epibromhydrin
modifizierter Bandgraspollenextrakt,
00/Ι

Phenol-Kochsalz lösung

19 0 0

2 18 0 0

3 22 0 0

4 21 0 0

Gesamt 70 0 0

Beispiel 5

Herstellung von mit Cyanat
modifizierten Allergenen

Ein wäßriger Extrakt aus verschiedenen Graspollen (Straußgras, Bartgras, Bandgras, Kammgras, falscher Hafer, Schwingelgras, Fuchsschwanzgras, Raigras, Timotheusgras, Ruchgras etc.) wird teilweise gereinigt, indem man ihn mit wäßrigem Phenol behandelt und hierauf das Protein aus der Phenolphase ausfällt, um möglichst viel Kohlenhydrate und niedermolekulare Stoffe abzutrennen. 50 mg des erhaltenen, teilweise gereinigten allergenen Proteinmaterials werden in 5 ml Wasser gelöst und mit Natriumhydroxidlösung auf pH 8 eingestellt. Hierauf wird der pH-Wert mit Essigsäure auf 5,0 eingestellt, und es werden 0,2 g Kaliumcyanat zugegeben. Das Gemisch wird hierauf 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt Die entstandene Fällung wird mehrfach mit einer Phosphatpufferlösung vom pH 8 gewaschen und hierauf in einer wäßrigen Phenol-Kochsalzlösung suspendiert

Allergiewirkung

Eine Suspension des wie vorstehend beschrieben hergestellten modifizierten Allergens, eine Suspension des nichtmodifizierten, teilweise gereinigten Allergenextraktes, beide in einer wäßrigen Phenol-Kochsalzlösung, und die Phenol-Kochsalzlösung selbst werden jeweils gegen Gras empfindlichen allergischen Patienten intradermal injiziert Nach 10 Minuten werden die 25

Flächen der entstandenen Quaddeln gemessen. Sie sind in nachstehender Tabelle IX in mm² angegeben. Es zeigt sich, daß das mit Cyanat modifizierte Allergen gegenüber dem nicht-modifizierten Allergen nur eine vernachlässigbare Allergiewirkung aufweist.

Tabelle IX

Patient Extrakt aus Mit Cyanat modifi- Phenol-Nr. verschiedenen zierter Extrakt aus Kochsalz-Graspollen, verschiedenen Gras- lösung 50 μg/ml pollen, lmg/ml

1 12 4 0

2 3 2 0

3 8 6 0

4 12 3 0

5 15 5 0 6 62 24 0

Gesamt 112 44 0

Immunisierungswirkung

45

Eine Gruppe von Meerschweinchen wird immunisiert, indem man den Tieren eine Emulsion, die das mit Cyanat modifizierte Allergen im vollständigen Freundschen Adjuvans enthält, subcutan injiziert Eine ähnliche Gruppe von Meerschweinchen wird mit dem nichtmodifizierten Ausgangsmaterial in dem gleichen Adjuvans auf die gleiche Weise immunisiert Nach 3 bis 4 Wochen werden beide Gruppen von Tieren an den Flanken kahlgeschoren. In die kahlen Stellen werden jeweils 0,1 ml einer Verdünnungsreihe des Ausgangsmaterials und schließlich 0,1 ml I η-Kochsalzlösung intradermal injiziert

0,4 ml einer 5prozentigen Lösung von Pontamin-Himmelblau werden unmittelbar darauf intravenös

bo injiziert Nach 20 Minuten entstehen an einigen intradermalen Injektionsstellen blaugefärbte Quaddeln, die die Anwesenheit von Antikörpern anzeigen, die für das Ausgangsmaterial spezifisch sind. Wiederum werden die Quaddeldurchmesser gemessen. Sie sind in nachstehender Tabelle X angegeben. Es zeigt sich, daß das mit Cyanat modifizierte Allergen die für das Ausgangsmaterial spezifische Immunisierungswirkung beibehält

11

Tabelle X

Meer- Immunisierender Stoff

schweinchen

Quaddeldurchmesser (mm) bei verschiedenen Konzentrationen von intradermal injiziertem Extrakt aus verschiedenen Graspollen

100 10

HS

0,1 μg

0,01 μg 0,001 μg

Extrakt aus verschiedenen Graspollen (5 mg)

mit Cyanat modifizierter Extrakt aus verschiedenen Graspollen (5 mg)

Extrakt aus verschiedenen Graspollen (0,5 mg)

14 14 16 14

12 12 10 12

14 12 14 12 12
13
14
13

9
9

12

11

12

10
10
12
10

7 7

Beispiel

Zur Bestätigung der Ergebnisse der biologischen Versuche wird das Verfahren von Beispiel 5 wiederholt. Die Ergebnisse des Allergieversuchs mit dem modifizierten Allergen sind in nachstehender Tabelle XI und die Ergebnisse der Immunitätsversuche mit dem mit Cyanat modifizierten Allergen sind in nachstehender Tabelle XII angegeben.

Tabelle	XI	Extrakt aus verschiedenen Graspollen, 100 μ§/ΐτι1	Mit Cyanat modifi zierter Extrakt aus verschiedenen Gras pollen, 2 mg/ml	Phenol- Kochsalz lösung
Patient	23 6 2 19	1 0 0 0	1 0 0 0
1 2 3 4

Tabelle XlI

Gesamt 50 1 1

Die Zahlen bedeuten die Quaddelflächen (mm²).

Meerschweinchen Nr.

100 10 iig

0.1 ."g

0,01 ug

0,001 μg

Extrakt aus verschiedenen Graspollen (0,5 mg)

Mit Cyanat modifizierter Extrakt aus verschiedenen Graspollen (5 mg)

Extrakt aus verschiedenen Graspollen (0,5 mg)

Mit Cyanat modifizierter Extrakt aus verschiedenen Graspollen (0,5 mg)

12	10	9
12	10	7
12	10	8
12	10	9
12	10
12	9
14	12	9
1 Λ IT	in tu
14	IO
12	Il	9
10	9
12	Il	8
12	—
10

Beispiel Modifizierung von Pollenextrakt mit Phenylglyoxal

Eine 3prozentige Lösung von Phenylglyoxal-hydrat in einer 0,1 m Phosphatpufferlösung vom pH 8 wird zu einem gleichen Volumen von 50 mg eines Extrakts aus Bandgraspollen gegeben, der vorher mit Phenol gereinigt worden war und in der gleichen Pufferlösung gelöst ist. Die Umsetzung wird 24 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die entstandene Fällung wird mehrfach mit einer Phosphatpufferlösung vom pH 8 gewaschen und hierauf in einer wäßrigen Phenol-Kochsalzlösung suspendiert.

Allergiewirkung

Eine Suspension des wie vorstehend hergestellten, mit Phenylglyoxal modifizierten Extrakts, eine Suspension des nichtmodifizierten, mit Phenol behandelten Bandgrasextrakts, beide in wäßriger Phenol-Kochsalzlösung, und die Phenol-Kochsalzlösung selbst werden jeweils gegen Gras empfindlichen allergischen Patienten intradermal injiziert. Die Flächen der entstandenen Quaddeln werden nach 10 Minuten gemessen. Sie sind in nachstehender Tabelle XIII in mm² angegeben.

Tabelle XIIl

Patient
Nr.

Bandgras- Mit Phenylglyoxal Phenolpollenextrakt, modifizierter Extrakt, Kochsalz-50 μg/ml 1 mg/ml lösung

35
27
19

Gesamt 91

Immunisierungswirkung

Eine Gruppe von Meerschweinchen wird immunisiert, indem man den Tieren eine Emulsion, die den mit Phenylglyoxal modifizierten Extrakt im vollständigen Freundschen Adjuvans enthält, subcutan injiziert. Auf die gleiche Weise wird eine ähnliche Gruppe von Meerschweinchen mit dem nichtmodifizierten Ausgangsmaterial im gleichen Adjuvans immunisiert. Nach

ίο 4 Wochen werden die Tiere beider Gruppen an den Flanken kahlgeschoren. In die kahlen Flächen werden jeweils 0,1 ml einer Verdünnungsreihe des Ausgangsmaterials und schließlich 0,1 ml einer 1 n-Kochsalzlösung intradermal injiziert. Unmittelbar darauf werden 0,4 ml einer 5prozenligen Lösung von Pontamin-Himmelblau intravenös injiziert. Nach 20 Minuten bilden sich an einigen imradermalen Injektionsstellen blaugefärbxe Quaddeln, die 'die Anwesenheit von Antikörpern anzeigen, die für das Ausgangsmaterial spezifisch sind.

Die Flächen der Quaddeln werden gemessen und sind in nachstehender Tabelle XIV angegeben.

Tabelle XIV

Meerschweinchen
Nr.

100 μg

10

0.1

0.01 μg

0,001 μg

Bandgraspollenextrakt (5 mg)

Mit Phenylglyoxal modifizierter Bandgraspollenextrakt (0,5 mg)

14
14
12
12

12
13
12

Beispiel 8

Modifizierung von Pollenextrakt mit Glutaraldehyd und anschließende Adsorption an Aluminiumhydroxid

1 ml einer 5prozentigen Glutaraldehydlösung wird zu 9 ml eines wäßrigen Extrakts aus Timotheuspollen mit einer Konzentration von 1 mg/ml (pH 5,3) gegeben. Das Gemisch wird 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. 6 ml einer 2prozentigen Aluminiumhydroxidlösung werden zugegeben, und das Gemisch wird 1 Stunde gerührt Die Fällung wird abzentrifugiert und zweimal in einer 0,01 m Phosphatpufferlösung vom pH 8 und hierauf dreimal in destilliertem Wasser "ewaschen und schließlich erneut in einer wäßrigen Phenol-Kochsalzlösung suspendiert, so daß sich eine Pollenkonzentration von 1 mg/ml 14
12
11
11

11
10

50

55

10
8

10
9

10
7
9
9

9 6 7 8

ergibt Das Verfahren wird wiederholt, jedoch ohne Zugabe von Glutaraldehyd, und die erhaltene Suspension wird im Immunisierungsspezifitätsversuch als Vergleichssubstanz verwendet

Allergiewirkung

Gegen Gras empfindlichen allergischen Patienten wird jeweils eine Suspension des vorstehend beschriebenen Stoffes, eine Lösung des nichtmodifizierten Pollenextrakts, beide in einer wäßrigen Phenol-Kochsalzlösung, und die Phenol-Kochsalzlösung selbst, intradermal injiziert Nach 10 Minuten werden die Flächen der entstandenen Quaddeln gemessen. Sie sind nachstehend in Tabelle XV in mm² angegeben.

Tabelle XV

Patient Wäßriger Timotheus-

Nr. pollenextrakt, 50 μg/ml

1 17.

2 2

3 6

Gesamt 25

Mit Glutaraldehyd modifizierter, an Aluminiumhydroxid adsorbierter
Timotheuspollenextrakt,
lmg/ml

2 0 0

Nichtmodifizierter an Phenol-

Aluminiumhydroxid adsor- Kochsalz-

bierter Thimotheuspollen- lösung extrakt,
lmg/ml

6 0

3 0

12 0

Immunisierungsspezifuät

Eine Gruppe von Meerschweinchen wird immunisiert, indem man den Tieren subcutan den mit Glutaraldehyd modifizierten, an Aluminiumhydroxid adsorbierten Extrakt injiziert Eine ähnliche Gruppe von Meerschweinchen wird mit nichtmodifiziertem, an Aluminiumhydroxid adsorbiertem Timotheuspollenextrakt mit einer Pollenkonzentration von 1 mg/ml immunisiert. Nach 21 Tagen wird die Injektion wiederholt, und 10 Tage darauf treten bei den Tieren Blutungen auf.

Mit den Seren wird der passive cutane Anaphylaxie-Test durchgeführt, indem man einer Gruppe von Meerschweinchen Reihenverdünnungen in die kahlgeschorenen Flanken intradermal injiziert. 5 Stunden später wird den Tieren als Reiz der nichtmodifizierte Timotheuspollenextrakt zusammen mit jeweils 0,4 ml einer Lösung von Pontamin-Himmelblau intravenös injiziert. Die Ergebnisse bei verschiedenen Antigenkonzentrationen sind in Tabelle XVI für das modifizierte Material bzw. in Tabelle XVII für die Vergleichssubstanz ohne Glutaraldehyd angegeben.

Tabelle XVI

Meerschweinchen Nr.	Gefriergetrockneter, wäßriger modifizierter Timotheuspollenextrakt	Quaddeldurchmesser (mm) bei 1 1 1 5 25 125	20 17 18	•16 13	verschiedenen 1 625	Serumkonzentrationen 1 Kochsalz- 3125 lösung	I I I I
1 2 3 4 Tabelle XVlI	1 mg/ml 100μg/ml 10μg/ml 5 μg/ml	22 20 20 14	Quaddeldurchmesser (mm) bei 1 1 1 5 25 125	Ξ I I I	I I I I	Seramkonzentrationen 1 Kochsalz- 3125 lösung
Meerschweinchen Nr.	Gefriergetrockneter, wäßriger Timotheus pollenextrakt	verschiedenen 1 625

1 mg/ml

100 μg/ml

10 μg/ml

5 μg/ml

25 20

16

130 218/34

Claims

Patentansprüche:

1. Parenteral injizierbares pharmazeutisches Präparat mit einem Gehalt an einem parenteral vei träglichen Trägermaterial und einem Desensibilisierungsmittel gegen Allergien aus einem modifizierten allergenen Protein oder Glykoprotein, gegebenenfalls in Verbindung mit Adjuvantien, dadurch gekennzeichnet, daß das allergene Protein oder Glykoprotein bzw. deren Fraktionen intermolekular und/oder intramolekular mit einem Poiyaldehyd, Epihalogenhydrin oder einem anorganischen Cyanat vernetzt worden ist.

2. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mit Glutaraldehyd oder Phenylglyoxal vernetzt worden ist.

3. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mit Epichlorhydrin oder Epibromhydrin vernetzt worden ist.

4. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mit Kaliumcyanat bei saurem pH-Wert, vorzugsweise pH = 5, vernetzt worden ist.