DE2340911A1

DE2340911A1 - Tetanus-antigen und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2340911A1
Application number: DE19732340911
Authority: DE
Inventors: Philipp Dipl Chem Dr Stein
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1973-08-13
Filing date: 1973-08-13
Publication date: 1975-05-07
Also published as: LU70708A1; CA1030066A; US3968202A; GB1460309A; FR2240740A1; NL7410674A; FR2240740B1; JPS5070516A; BE818797A

Description

Behringwerke Aktiengesellschaft, Marburg (Lahn)

Aktenzeichen: Hoe 73/b 011 - Ma 147

Datum: 10. August 1973

Tetanus-Antigen und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft ein Tetanus-Antigen, ein Verfahren EU neiner Herstellung und.seine Verwendung als.Immunogen in. Tetanus-Impfstoffen oder als Antigen in Diagnostika«

Es sind schon Methoden beschrieben worden gemäss denen das Tetanustoxin mit reduzierenden Agenzien behandelt wird, wobei eine Aufspaltung in Untereinheiten stattfinden soll. Diese Spaltung ist Jedoch schwierig zu reproduzieren, ausserdem können die Spaltprodukte noch nicht zu einem Impfstoff verarbeitet werden, sondern müssen noch inaktiviert werden.

Es ist schon 'versucht worden, die durch Tetanus-Vaccinen hervorgerufenen Impfreaktioneii und Unverträglichkeiten, die durch Aggregationen als Folge der Formaldehydinaktivierung bedingt sein können, durch Behandlung des inaktivierten Tetanustoxins, des sogenannten Tetanustoxoids, mit Pepsin zu beseitigen.

Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung eines Tetanus-Iwpfstoffes gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass Tetsnustoxin zur Inaktivierung mit einem Alkalisalz der Oxymethansulfinsäure behandelt, gegebenenfalls mittels eines cJcy-Lisrenden Agens stabilisiert, sterilfiltriert und gegebenenfalls mittels eines Adjuvans zu einem Impfstoff aufgearbeitet wird. Das so behandelte Tetanustoxin kann allein als monovalente Vaccine oder mit anderen Immunogenen in Kombi-

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nationsimpfstoffen sowie als Antigen in Diagnostika verwendet werden*

Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemässe Verfahren verwendet man Tetanustoxin, das auf bekannte Weise durch Züchten von Tetanusbazillen und anschliessende Isolierung gewonnen wird. Durch die Einwirkung eines Alkalisalzes der Oxymethansulfinsäure - vorzugsweise verwendet man das Natriumsalz tritt eine, Änderung der Sedimentationskonstante des Toxins ein.

Impfstoffe, die aus dem erfindungsgemäss behandelten Tetanustoxin hergestellt werden, sind gut verträglich. Sie sind insbesondere auch für die Boosterung geeignet. Ein Vorteil ist darin zu sehen, dass der erfindungsgemäss gewonnene Impfstoff bei der Herstellung von Kombinationsimpfstoffen in hoher Konzentration zugesetzt werden kann, so dass es nicht zu unerwünschten Verdünnungen der anderen Komponenten kommt.

Das zur Behandlung des Toxins verwendete OxymethansulfinaL (OMS) ist beispielsweise (als Na-SaIz) im Handel als "Rongalit" erhältlich. Es besitzt die chemische Formel CHp(OH)-S(^Na und ist auch unter der Bezeichnung Fornialdehyd-Sulfoxylsäure-Na-SaIz und Oxymethansulfinsäure-Na-Salz bekannt.

Das OMS wird zweckmässig in der Konzentration 0,005 Mol/l bis 5,0 Mol/l, vorzugsweise 0,25 Mol/l eingesetzt. Je höher die Konzentration, um so schneller verläuft die Reaktion zur Inaktivierung des Tetanustoxins. Es kann als feste Substanz oder in Lösung oder auf besonders schonende Weise durch Dialyse zu der Tetanustoxinlösung gegeben werden.

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Als pH wählt man einen Wert im Bereich von pH 5,0 bis 11,0, vorzugsweise wird pH 8,5 verwendet. Der pH-Wert wird mittels eines üblicherweise in der Biochemie verwendeten Puffers, z.B. mit einer 0,1 molaren Lösung aus Dinatriummonohydrogenphosphat und Monokaliumdihydrogenphosphat eingestellt. Je höher der pH-Wert der Lösung, um so schneller verläuft die Reaktion zur Inaktivierung des Toxins.

Die für das erfindungsgemässe Verfahren geeignete Temperatur liegt zv/isehen O⁰C und 4O⁰C", vorzugsweise wird die Reaktion bei 4°C ausgeführt. Je höher die Temperatur gewählt wird, um so schneller verläuft die Reaktion mit dem Alkalisalz der Oxyniethansulf insäure.

Die Dauer der Reaktion hängt von den angewandten Reaktionsbedingungen ab. Sie liegt zwischen 1 Stunde und 36 Tagen, bei den angegebenen Vorzugsweise-Maßnahmen dauert die Reaktion 12 .Tage.

Das Ende der Reaktion kann durch eine Toxizitätsprüfung, z.B. an Mäusen oder Meerschweinchen ermittelt werden.

Die Toxinfreiheit wird jeweils an insgesamt 10 Mäusen geprüft. Dabei wird das auf 30 Lf/ml verdünnte Tetanus-Antigen mit fallenden Konzentrationen von Tetanusantitoxin (Serum eines mit Tetanustoxoid immunisierten Pferdes) mindestens 10 Minuten bei 20⁰C inkubiert. Jeweils 2 Mäusen werden je 0,4 ml der Antigen-Antitoxin-Gemische subcutan in die Leistenbeuge injiziert. Zwei Tiere erhalten nicht mit Antitoxin behandeltes Antigen. Überleben bis zum 4. Tag alle Mäuse, so gilt das Präparat als nicht toxisch.

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Die Verträglichkeit der Verfahrensprodukte wird mit einem Haut-Test am Meerschweinchen und mit einem Anaphylaxie-Test am Uterushorn vom Meerschweinchen nachgewiesen.

Cutane Empfindlichkeit am Meerschweinchen:

10 mit Tetanustoxoid immunisiertmMeerschweinchen werden die EU charakterisierenden Präparate subcutan injiziert. Die Grosse des Reaktionshofes an der Injektionsstelle gibt ein Maß für die Verträglichkeit des zu untersuchenden Präparates.

Anaphylaktische Empfindlichkeit am Uterushorn vom Meerschweinchen:

Bei jeweils 5 mit Tetanustoxoid immunisierten Meerschweinchen werden die isolierten Uterushörner auf Empfindlichkeit gegen das zu charakterisierende Tetanus-Immunogen unverdünnt und in den Verdünnungen 1 : 5 und 1 : 23 im Organbad geprüft und die Kontraktion am Kymographen registriert. Sie ist ein Maß für die anaphylaktische Reaktion des zu untersuchenden Präparates. Als Ergebnis wird die Zahl der Tiere, bei denen eine Kontraktion gemessen wird, im Verhältnis zu der Zahl der eingesetzten Tiere angegeben. Die Kontraktilität der -ELterushörner wird mit Oxytocin nachgeprüft.

Die Immunogenität der Verfahrensprodukte wird am Meerschweinchen nachgewiesen. Dazu werden 10 Meerschweinchen mit 2 ml des auf 0,66 Lf/ml verdünnten Tetanus-Immunogens subcutan immunisiert. Nach 4 Wochen werden die Tiere mit 20 dim, das ist das 20-fache der kleinsten tödlichen Dosis Tetanustoxin belastet. Die den 5. Tag nach der Intoxikation überlebenden Tiere werden als geschützt angesehen.

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Unter If/ml = Limes flocculationes versteht man diejenige Menge Antigen, die eine Internationale Einheit (I.E.) Antiserum ausflockt.

Durch das erfindungsgemäss durchgeführte Verfahren wird das spezifische Flockungsverhalten des Toxins mit Tetanus-Antitoxin nicht geändert.

Der Ausdruck dim 1st die Abkürzung für dosis letalis minima.

Die Haltbarkeit des inaktivierten Toxins kann durch einen Zusatz von acylierenden Agenzien wesentlich-erhöht werden. Als solche kommen in Frage Säurechloride oder Säureanhydride, z.B. Essigsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid, Citraconsäureanhydrid. Die beste Stabilisierung wird mit Diketen erzielt. Zu einem Mol inaktivierten Tetanustoxins(entsprechend 130.000 g Protein) werden 20 bis 2.000 Mol Diketen gegeben, vorzugsweise werden zu den Reaktionsprodukten aus einem yuMol Tetanustoxin 150/uMol Diketen zugesetzt. Durch Diketen wird die immunogene Wirksamkeit de"s inaktivierten Toxins nicht verändert.

Das erfindungsgemässe Tetanus-Antigen kann sowohl nach entsprechender Verdünnung zur Immunisierung von Tieren zur Gewinnung von antitoxischen Seren als auch nach einer auf bekannte Weise vorgenommenen Entsalzung durch Dialyse, Ultrafiltration oder mittels Molekularsieben, vorzugsweise nach einer Fraktionierung auf einer Molekularsiebsäule wie Sephadex G-100^ ', als Immunogen für Tetanus-Impfstoff beim Menschen Anwendung finden. So hergestellte Impfstoffe können nach Sterilfiltration in bekannter Weise als Fluid-Impfstoff oder mit Adjuvantien, vorzugsweise Aluminiumhydroxid versehen, injiziert werden.

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Auch als Antigen in der serologischen Diagnostik zum Nachweis von Tetanusantikörpern, z.B« im Flockungstest, kann das erfindungsgemass hergestellte Präparat verwendet werden.

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Beispiel 1

In 10/UMol auf bekannte Weise gewonnenem Tetanustoxin (entsprechend 1,3 g Eiweiß) mit- einer Aktivität von 1.600 Lf/ml, suspendiert in 400 ml 0,1 molarem Phosphatpuffer pH 8,5," werden bei 4⁰C 11,9 g OMS gelöst. Dabei wird eine OMS-Konzentration von 0,25 Mol erreicht. Der Ansatz bleibt · ■ 12 Tage bei 4⁰C stehen.-

Die Toxinfreiheit des erhaltenen Produkts wird an insgesamt 10 Mäusen geprüft. Dabei wird das auf 30 Lf/ml verdünnte Produkt mit fallenden Konzentrationen Tetanusantitoxin (Serum eines immunisierten Pferdes) mindestens 10 Minuten bei 20⁰C inkubiert. Jeweils 2 Mäuse werden je 0,4 ml der Toxin-Antitoxin-Gemische subcutan in die Leistenbeuge injiziert. Zwei Tiere erhalten nicht mit Antitoxin behandeltes Antigen. Alle Mäuse überleben bis zum 4. Tag, das Präparat ist somit nicht mehr toxisch. ;

Das Produkt wird sodann mit 63,6 Liter isotonischer Kochsalzlösung im Volv.=Verhältnis 1:60, somit auf 10 Lf/ml, verdünnt und sterilfiltriert. Diese Lösung stellt einen Tetanus-Impfstoff dar und kann zur Immunisierung gegen Tetanus am Menschen oder am Tier angewandt werden.

Ein Parallel-Ansatz wird mit 57,2 1 isotonischer Kochsalzlösung verdünnt, sterilfiltr.iert und mit 6,40 1 1%igem Aluminiumhydroxid-Gel versetzt. Dieser Tetanus-Impstoff enthält 10 Lf/ml und ist ebenfalls zur Immunisierung gegen Tetanus anwendbar.

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Beispiel 2

10/uMoi Tetanustbxin (entsprechend 1_f3 g Eiweiß) mit 16.000 Lf/ml in 40 ml 0,1 molarem Phosphatpuffer pH 8,5 werden bei 4°C gegen 1 Liter 0,25 molarer OMS-Lösung in 0,1 molarem Phosphatpuffer pH 8,5 48 Stunden dialyiert. Dabei erreicht die Tetanustoxinlösung eine Rongalitkonzentration von 0,25 Mol. Der Ansatz bleibt danach 12 Tage bei 4⁰C stehen.

Die Toxinfreiheit des Produkts wird in einer Verdünnung auf 30 Lf/ml an 10 Mäusen geprüft. Keine der Mäuse zeigte-nach 4 Tagen irgendwelche Symptome von Tetanus.

Das Produkt (40 ml) wird sodann mit 60 ml 0,1 molarem Phosphatpuffer pH 8,5 verdünnt und dreimal in Abständen von jeweils 30 Minuten mit 0,5 ml Diketen versetzt. 2 Stunden nach der letzten Zugabe von Diketen wird das nicht umgesetzte Diketen durch Dialyse gegen isotonische Kochsalzlösung entfernt. Für die Gewinnung des Endproduktes v/ird die erhaltene Lösung mit isotonischer Kochsalzlösung auf 10 Lf/ml verdünnt und sterilfiltriert.

Je 10 ml eines in einem Parallelansatz unter denselben Bedingungen gewonnenen Produktes werden vor und nach der Behandlung mit Diketen 3 Monate bei 20°C gelagert. Dabei werden folgende Lf-Werte erhalten:

	ohne Diketen	mit Diketen
Produkt	1.600 Lf/ml	1.600 Lf/ml
nach 3 Monaten bei 20°C	100 Lf/ml	1.600 Lf/ml

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Die erhaltenen Werte zeigen, dass ohne Diketenbehandlung die Aktivität auf 100 Lf/ml abgesunken ist, während das mit Diketen behandelte Präparat seine Aktivität beibehalten hat.

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Beispiel 3

Gemäss Beispiel 2 wird Tetanustoxin mit OMS gespalten und anschliessend mit Diketen versetzt. Das entstandene Reaktionsprodukt wird mittels Gelfiltration auf einer Säule mit Sephadex G-100 fraktioniert. Dabei werden im Eluat bei einer V7ellenlänge von 280 nm zwei Adsorptionsgipfel registriert.

Beide Fraktionen, von·denen die erste etwa 2/3, die zweite etwa 1/3 des eingesetzten Toxins enthält, werden gemäss •Beispiel 1 getrennt- zu Vaccinen aufgearbeitet. · ·

Die beiden Verfahrensprodukte werden auf Verträglichkeit geprüft. Im Cutan-Test am Meerschweinchen ergeben beide Präparate Reaktionshöfe der durchschnittlichen Grosse von 12 mm. Ein zum Vergleich mitgeführtes Tetanustoxoid lieferte einen Reaktionshof von 15 mrn.

Im Anaphylaxie-Test wurden die folgenden Werte gemessen:

	Kontraktion	bei 0,1 1	nl	1:25 ·
	unverdünnt	1:5
Mit Formaldehyd			1/5
inaktiviertes Tetanustoxoid	4/5	2/5	0/5
Fraktion I Antigen	3/5	1/5	0/5
Fraktion II Antigen	3/5	1/5

Nach beiden Bestimmungsmethoden konnte nachgewiesen werden, dass die Verfahrensprodukte eine bessere Verträglichkeit besitzen als das miigjführte gemäss dem Stand der Technik durch Forrnaldehydinaktivierung erhaltene Tetanustoxid.

Bei der Prüfung auf Immunogenität am Meerschweinchen waren beide Fraktionen als wirksam gefunden'.

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- 11 - * Beispiel 4

Ein gemäss Beispiel 3, jedoch mit der Reaktionsdauer von 20 Tagen ausgeführter Ansatz lieferte die beiden Fraktionen im Mengenverhältnis 1:1.

Beispiel 5

Mit dem gemäss Beispiel 2 gewonnenen Tetanusantigen, das mit isotnnischer Kochsalzlösung auf 875 Lf/ml verdünnt wurde, v/erden Kombinationsimpfstoffe folgender Zusammensetzung gegen' Tetanus, Diphtherie und Pertussis sowie gegen Tetanus, . ......... Diphtherie, Pertussis, Masern und Poliomyelitis hergestellt:

6,2 ml Tetanusantigen (875 Lf/ml) 5,0 ml Diphtherietoxoid (3.000 Lf/ml) 80,0 ml Keime des Bordetella pertussis (300 χ 10⁵ K/ml)

zu der auf 800 ml mit isotonischer Kochsalzlösung aufgefüllten Mischung werden 200 ml eines- 1 %igen Aluminiumhydroxid-Gels gegeben

sowie ...

6,2 ml Tetanusantigen (875 Lf/ml) 5,0 ml Diphtherietoxid (3.000 Lf/ml)

80,0 ml Keime von'Bordetella pertussis (300 χ 1θ" K/ml) 200,0 ml Masernviren, Stamm Nr. 1677, Enders(5000 HAE/ml) 200,0 ml Poliomyelitisviren I,II,III,jeweils 5 x 107GKIDc₀/ml

zu der auf 800 ml mit isotonischer Kochsalzlösung aufgefüllten Mischung werden 200 ml eines 1?oigen Aluminiumhydroxid-Gels gegeben.

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Für die Prüfung der Wirksamkeit des erfindungsgemassen Tetanusantigens in den Impfstoffen werden 50 Meerschweinchen mit 2 ml des Impfstoffes immunisiert und nach vier Wochen mit 20 dlnTTetanustoxin belastet. Für die Wirksamkeitsprüfung des Diphtherietoxoids werden ebenfalls 50 Meerschweinchen mit 2 ml des Impfstoffes immunisiert, für die nach vier Wochen vorgenommene Intoxikation.werden 16 dim Diphther.ietoxin verwendet. Die Wirksamkeit der Pertussiskomponente wird an 3 x 18 Mäusen geprüft, die mit fallenden Dosen des Impfstoffes immunisiert und mit 100 IA-q intracerebral belastet werden. Die Wertigkeit der Masernviren wird durch Haemagglutination, die der Poliomyelitisviren durch ihre Gewebekulturinfektiosität bestimmt. Bei den Auswertungen wird jeweils ein Standard-Präparat mitgeführt. Die in den Testen gemessenen Wirksamkeiten entsprechen den in den Vorschriften der National Institutes of Health geforderten Wertigkeiten.

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Claims

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Patentansprüche

λ· Verfahren zur Herstellung eines Tetanus-Antigens durch Inaktivieren eines Tetanustoxins, dadurch gekennzeichnet, dass das Tetanustoxin mit Oxymethansulfinat "behandelt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das inaktivierte Toxin anschliessend mit einem acylierenden Agens behandelt wird. . .
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als acylierendes Agens Diketen verwendet.
4. Verfahren zur Herstellung eines Tetanus-Impfstoffs, dadurch gekennzeichnet, dass man ein gemäss Ansprüchen 1-3 erhaltenes Tetanus-Antigen in an sich bekannter Weise zu einer Vaccine aufarbeitet.
5.) Tetanus-Impfstoff, gekennzeichnet durch ein mit Oxymethansulfinat inaktiviertes Tetanustoxin.
6. Verwendung eines Impfstoffes gemäss Anspruch 5 zur Tetanus-Prophylaxe.

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