DE2032169A1 - Verfahren zur kontinuierlichen Kulti vierung von Hefe - Google Patents

Description

DR.-ING. VON KREISLER DR-ING. SCHÖNWALD DR-ING.TH. MEYER DR.FUES DIPL.-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL.-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH

KOiN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 24o6_o1970 Kl/Ax

The British Petroleum Company Limited, Britannic House, Moor Lane, London, E.C.2 (England)

Verfahren -zur kontinuierlichen Kultivierung von Hefe

Die Erfindung betrifft die Kultivierung Von Hefe unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen als Hauptquelle von assimilierbarem Kohlenstoff, ,_v

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Systeme für die kontinuierliche aerobe Kultivierung von Mikroorganismen unter Verwendung von Kohlehydraten als 'Hauptquelle von assimilierbarem Kohlenstoff sind allgemein bekannt. In verhältnismäßig neuerer Zeit sind ähnliche Systeme für die kontinuierliche Kultivierung unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen als Hauptquelle von assimilierbarem Kohlenstoff vorgeschlagen worden. Die Verwendung von Kohlenwasserstoffen, die im wässrigen Mhrmedium achwer löslich sind, erschwert das Problem der Erreichung eines wirtschaftlichen Betriebes„ Ein größerer Paktor bei den Kosten jedes aeroben Fermentationsprozesses sind die Kosten der Belüftung«, Da auf Kohlenwasserstoffen wachsende Mikroorganismen wesentlich mehr Sauer-, stoff erfordern als die Züchtung auf Kohlehydraten, ergibt sich hieraus eindeutig die Forderung nach der Entwicklung des wirksamsten Sauerstoff- und Stoffüber.tragungssystems. Es wurde vorgeschlagen, durch Erhöhung des Arbeitsdruckes des Fermenters die Sauerstoffübertragungsgeschwindigkeiten asu steigern und hierdurch die Ausbeute

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pro Volumeneinheit Fermenterraum "bei kontinuierlichen aeroben Fermentationsprozessen, "bei denen Kohlehydrate als Kohlenstoffquelle verwendet werden, zu verbessern,, Die für diese Prozesse vorgeschlagenen Drücke liegen im Bereich von 10 "bis 20 Atmosphären. Bei großtechnischen Fermentationsprozessen verschlechtern die Kosten der erforderlichen Druckgefäße und die zur Erzeugung und Aufrechterhaltung dieser Drücke notwendige Energie erheblich die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens. Kürzlich wurde ein System zur Durchführung aerober Fermentationen vorgeschlagen, wobei die in der Kulturflüssigkeit gelöste Luft- oder Sauerstoffmenge erhöht wird, indem die luft oder der· Sauerstoff in der Flüssigkeit in einer mit rotierenden Rührern.versehenen Mischkammer unter einem Druck, der größer ist als der durch die Säule der Fermentationsflüssigkeit erzeugte Druck, z.B. unter einem Druck von einigen Kilogramm/cm gelöst und die Fermentation dann in mehreren Rohren durchgeführt wird, die Verengungen, z.B. perforierte Platten.enthalten, die einen Staudruck oder Rückdruck aufrecht erhaltene

Solche Systeme, bei denen mehrere Rohre verwendet werden, in denen die Gärung durchgeführt wird, haben eine Anzahl von Nachteilen. Beispielsweise ermöglichen sie im wesentlichen nur diskontinuierliche Gärführung oder, richtiger gesagt, kontinuierliche Gärung mit Durchfluß der Gärmaische als geschlossene Säule (plug flow), die zwar annehmbar ist, wenn die Entfernung einer Komponente erforderlich ist, jedoch eine kostspielige Konstruktion pro Volumeneinheit Fermenterraum erforderte Angesichts dieser Nachteile hat der üblichere Fermenter vom Behältertyp viel größeren Eingang in der gesamten Gäriadustrie gefunden. Unter "Fermentern vom Behältertyp'⁹ sind Eermenter' zu verstehen, die aus einem geschlossenen hohlen Mantel bestehen, der kapselförraig oder kugelförmig sein tonn. Diese Fermenter sind mit Vorrichtungen zur Einführung von Impfmaterial, Nährsalzen, Quellen von assimilierbarem

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Kohlenstoff und Luft oder Sauerstoff und etwaigen anderen für das jeweilige zu vergärende System wesentlichen Komponenten sowie mit Abnahmestellen für die austretende Gärmaische versehene Die Bewegung des Inhalts des Fermenters kann mit Turbinenrührern mit Propellerflügeln oder mit Belüftungssystemen (air-lift) erreicht werden,.

Soweit der Anmelderin bekannt ist, wurde bisher kein Vorschlag gemacht, erhöhte Drücke bei großtechnischen kontinuerlichen Fermentationen in Fermentern vom Behältertyp, bei denen Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoffquelle verwendet werden, anzuwenden. Bei den bisher vorgeschlagenen kontinuierlichen Fermentationsprozessen unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen als Kohlenstoffquelle wird- mit einem Fermenterdruck' gearbeitet, der bei Normaldruck oder sehr üicr't bei Normaldruck liegt.

Es wurde nun gefunden, daß bei kontinuierlichen Fermentationsprozessen in Fermentern vom Behältertyp unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen als Hauptquelle von assimilierbarem Kohlenstoff überraschende Vorteile erzielt werden, wenn unter einem nur mäßigen erhöhten Fermenterdruck gearbeitet wird. Es ist nicht nur möglich, eine bedeutende Verbesserung der Leistung, ausgedrückt als erhöhtes Gewicht der Trockenzellen, sondern auch eine bedeutende Verbesserung des Ausbeutefaktors im Vergleich zu Betrieb bei oder in der Nähe von Normaldruck zu erreichen. Unter "Ausbeutefaktor¹¹ ist das Verhältnis des Gewichts der Trockenzellen in der Kulturflüssigkeit zum Gewicht der assimilierten Kohlenwasserstoffe zu. verstehen. Diese festgestellte Steigerung des Ausbeutefaktors ist überraschend und stellt einen wertvollen Beitrag zur Gesamtwirtsehaftlichkeit des Verfahrens dar, da der Auisbeutefaktor ein Maß des Wirkungsgrades ist, mit dem die assimilierbaren Kohlenwasserstoffe in Zellmaterial umgewandelt werden und die Kosten dieser Kohlenwasserstoffe ein wesentlicher Faktor in den Kosten des Gesamtverfahrens ^Sinde 109808/0241

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß die Kultivierung von Hefe nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Kohlenwasserstoffe verbrauchende Hefe in Fermentern vom Behältertyp in Gegenwart eines wässrigen Nährmediums und eines die Hauptquelle von assimilierbarem Kohlenstoff darstellenden Kohlenwasserstoffsubstrats sowie in Gegenwart eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases bei einem erhöhten Fermenterdruck im Bereich von 1,5 bis

4,0, vorzugsweise im Bereich von 2 bis 3 kg/cm absolut kultiviert.

Unter dem Fermenterdruck ist hier der mittlere Fermenterdruck, doh. der Druck im Gasraum über der Gärmaische oder, wenn der Behälter vollständig gefüllt ist, der.Druck am Schaumaustritt plus -1/2 des hydrostatischen Drucks des Flüssigkeitsinhaltes zu verstehen,.

Zwar werden nachweisbare Vorteile erzielt, wenn lediglich unter einem erhöhten Fermenterdruck gearbeitet wird, jedoch wird im allgemeinen bei dem gewählten Druck das System optimal gestaltet, Z₀B₀ in Bezug auf die Belüftungsmengen, die Kohlenwasserstoffkonzentrat'ion· und die Nährsalzkonzentrationen, so daß die ausgewählten Mikroorganismen in der günstigsten Umgebung wachsen.

Eines der überraschenden Merkmale der Erfindung ist die Tatsache, daß nur innerhalb des oben genannten«, verhältnismäßig engen Druckbereichs die Steigerung des Ausbeutefaktors beobachtet wird_ö Hierbei pflegt der Ausbeutefaktor

im Bereich zwischen 2 und 3 kg/cm absolut am höchsten zu sein und anschließend abzufallen·

Es wurde jedoch experimentell festgestellt^ daß über den

gesamten Bereich von 1,5 bis 4 kg/cm absolut öle als Gewicht der Trockenzelle» ausgedrückte Produktivität geateigert werden kann, Zwar wird durch Arbeiten bei dem höheren Druck ein Vorteil in Bezug auf die Produktivität erzielt, jedoch muß dieser gegen den lacht eil des., kleiner

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werdenden Ausbeutefaktors abgewogen werden» Es ist somit kein wirtschaftlicher oder praktischer Vorteil zu erzielen, wenn bei Drücken über 4 kg/cm absolut gearbeitet wird»

Der gewünschte Arbeitsdruck wird zweckmäßig durch Regelung der Zufuhr von komprimiertem sauerstoffhaltigem Gas zum Fermenter und/oder durch Anbringung geeigneter Verengungen an der Gasabnahme aus dem Fermenter eingestellte

Zwar stellt die Energie, die erforderlich ist, die mäßig erhöhten Permenterdrücke gemäß der Erfindung einzustellen und aufrecht zu erhalten, zusätzliche Betriebskosten des Verfahrens dar, jedoch ist es ein weiteres Merkmal der Erfindung, daß diese zusätzlichen Kosten weitgehend herabgesetzt werden können, wenn wenigstens ein Teil der Energie der Austrittsgase aus dem Fermenter ausgenutzt wird, um zur Erzeugung und Aufrechterhaltung des gewünschten Drucks . beizutragen* Dies kann zweckmäßig erreicht werden durch Verwendung der aus dem Fermenter austretenden Gase zur Erzeugung wenigstens eines Teils der Energie für das Kompressorsystem, das verwendet wird, um das sauerstoffhaltige Gas dem ersten oder gegebenenfalls nachgeschalteten Fermenter zuzuführen

Eine andere Möglichkeit, den Energiebedarf eines aus mehreren Fermentern bestehenden Systems weitgehend zu verringern, besteht gemäß der Erfindung darin, daß die Gase, die aus einem oder mehreren beim gewünschten erhöhten Druck arbeitenden Fermentern austreten, wenigstens teilweise verwendet werden, um den Bedarf an sauerstoffhaltigem Gas eines weiteren Fermenters, der mit dem ersten Fermenter in der Kaskadenreihe geschaltet ist, wenigstens teilweise au decken. Diese Ausführungsform findet insbe- * sondere bei einem System Anwendung, bei dem cSie gesamten Gase» die aus einem oder mehreren, bei verhältnismäßig hohen Drücken innerhalb des gewünschten Bereichs arbeitenden Fermentern austreten, einem weiteren Ferraenter zugeführt werden, der bei einem relativ niedrigeren Druck

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arbeitet β Zwar kann der verhältnismäßig niedrige Sauerstoffgehalt der unter hohem Druck stehenden Austrittsgase zu schlechter Produktivität in dem weiteren Fermenter führen,dem sie zugeführt werden, jedoch wird dies durch eine Einsparung im Energiebedarf und eine Einsparung in der Zahl von Permentern, die zur Erzielung einer bestimmten Gesaratproduktivität erforderlich sind, wieder aufgewogen.

Das Verfahren gemäß der Erfindung eignet sich besonders zur Kultivierung von Hefe auf einem Kohlenwasserstoffsubstrat, das im wesentlichen aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen besteht, und die anschließende Gewinnung der Hefezellen beispielsweise durch Zentrifugierung der aus dem Fermenter austretenden Kulturflüssigkeit mit anschliessender Trocknung zur Gewinnung eines trockenen Produkts, das sich zur Ergänzung von Viehfutter eignet. ₍

Die geradkettigen Kohlenwasserstoffe sind in den Einsatzmaterialien gemäß der Erfindung gewöhnlich als Paraffine vorhanden, können jedoch auch als Olefine vorliegen., Gemische, die geradkettige Paraffine und Olefine enthalten, sind ebenfalls geeignete

Als Ausgangsmaterialien für das Verfahren gemäß der Erfindung eignen sich beispielsweise lormaIparaffinfraktionen, die wenigstens 90 Gew«,-^ η-Paraffine enthalten und durch Behandlung einer Destillatfraktion von Erdöl_fi z_oB« Leuchtpetroleum oder &asölen₉ mit Molekularsieben erhalten worden SiHd₀ Vorzugsweise wird eine Erdölfraktion verwendet, die ein mittleres Molekulargewicht iiat_s das wenigstens 10 Ö-Atomen im

Unter den laier gebrauch tea Ausdruck ^S0H<sis^m fallen auch He fegeiai solle« Bi® bi®r geaanntea H®£®a -siad Syatem klassifiziert _a das in "Sh® I©aeta =· a gfwidy⁸⁹ γόο Lodd©r unü ICrag@r=¥an HiJ (1952)„ von North Holland Publisliiag Gorapaaf (Ai!St®riam)_s, sohrieben lst_e

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Vorzugsweise gehört die verwendete Hefe zur Familie Cryptococcaceae, insbesondere zur Unterfarailie Cryptoeoccaceae. Gegebenenfalls können jedoGh auch beispielsweise ascosporogene Hefen der Unterfamilie Saccharomycoideae verwendet werden« Bevorzugte Gattungen der Unterfamilie Cryptococcoideae sind Torulopsis (auch als Torula bekannt), Candida und Mycoderma. Bevorzugte Hefespezies sind nachstehend genannt«

Besonders bevorzugt wird die Verwendung der speziellen Stämme, deren Hinterlegungsnummern genannt sind. Die Abkürzungen vor den Zahlen bezeichnen jeweils die Hinterlegungsstelle, und zwar kennzeichnet CBS die beim Centraal Bureau voor Schimmeleultures, Baarn, Holland, hinter!- ?Λβη Stämme, CMI die beim Commonwealth Mycological Institut, Kew, England, hinterlegten Stämme und HCYC die bei der National Collection of Yeast Cultures, Nutfield, England, hinterlegten Stämme*

Spezies	brumptii	Bevorzugter Stamm	Ir.	2078; 3Jr. 599 93743 .376; Ir.153
Candida	blankii
Il	cacoii
Il	catenulata			83350. IiCYC Nr
Il	Qiferrii
It	clausenii
Il	humicola
Il	intermedia
Il	krusei
η	lipolytica
Il	melibiosi	CBS Hr. GMI Ir. HCYÖ Mr
Il	melibiosica
Il	parapsilosis
Il	pulcherrima	CHI
Il	rugosa
H	stellatoidea
Il	109808/024
		1

Candida tropicalis ' NCYC Nr.4 " utilis CMI Nr.2331

Debaryomyces kloeckeri

Hansenula anomala

Pichia guilliermondii CBS Nr.2084; Nr.2031

Bhodotorula glutinis

Torulopsis famata ■ '

¹¹ . magnoliae

Von den vorstehend genannten Stämmen werden Candida lipolytica und Candida tropicalis besonders bevorzugt. .

Beispiel 1

Candida lipolytica wurde kontinuierlich in einem mit Rührwerk versehenen Gärbehälter kultiviert, der ein Arbeitsvolumen von 20 1 hatte, wobei ein Gemisch von n-Paraffinen mit 11 bis 14 C-Atomen im Molekül als Kohlenwasserstoffsubstrat verwendet wurde. Nach einer Anlaufzeit, während der die Kultur die gewünschte Konzentration an Hefezellen für kontinuierlichen Betrieb erreichte, wird mit der kontinuierlichen Zuführung von wässrigem mineralischem Medium und Kohlenwasserstoffsubstrat begonnen, um eine Verdünnungsrate der Gärmaische von 0,1 aufrecht zu erhalten. Die Temperatur wird bei 30⁰C und der p_H~Wert der Gärmaische durch kontinuierlichen Zusatz von Ammoniak bei 5,5 gehalten. Das verwendete wässrige Mineralmedium hatte folgende Zusammensetzung:

(NH₄J₂HPO₄ 2 g

KCl 1,15 g

MgSO₄.7H₂O 0,65 g

ZnSO₄ 0,17 g

MnSO₄.4H₂O 0,045 g ■*

PeSO₄.7H₂O 0,068 g

Leitungswasser 200 ml

Hefeextrakt 0,025 g

Destilliertes Wasser zur Auffüllung auf 1000 ml

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Die Gärmaische wurde kräftig gerührt, während Luft in einer Menge und unter einem Druck, die zur Aufrechterhaltung des Fermenterdrucks bei dem gewünschten Wert erforderlich .waren, eingeführt wurde.

Drei Versuche wurden bei drei verschiedenen Permenterdrücken durchgeführt. Beim ersten Versuch lag der Permenterdruck sehr dicht bei Normaldruck, d.h. dieser Versuch wurde nicht gemäß der Erfindung durchgeführt.

Versuch' 1 2 3

Zugeführte Kohlenwasserstoffmenge, g/l Zuführungsmenge des Mediums, i/Std. Temperatur, ⁰C Verdünnungsrate Pg-Wert
. Zugeführte Luftmenge, V/V/Min.

Eintrittsdruck der Luft, kg/cm²

■ 2 * Fermenterdruck, kg/cm (mittlerer Permenterdruck in kg/cm² absolut) Gewicht der trockenen Zellen, g/l Ausbeutefaktor Ausnutzung von Kohlenwasserstoffen Gelöster Sauerstoff in der

Gärmaische, $> der Sättigung . etwa

Das vorstehende Beispiel zeigt, daß ein wesentlicher Anstieg der Produktivität, ausgedrückt als Gewicht der Trockenzellen, und ein Anstieg des Ausbeutefaktors erreicht wird, auch wenn die anderen Verfahrensbedingungen im wesentlichen konstant gehalten werden und lediglich der Ferpenterdruck variiert wird, .'■--..

Beispiel 2

35,4	34,9	34,8
1,9	1,9	1,9
30	30	30
0,1	0,1	0,1
5,5	5,5	5,5
0,5	0,5	0,5
1,3	1,7	2,1
1,1	1,5	2,0
10,2	12,6	13,2
0,57	0,62	0,72
0,49	0,60	0,53

Bei diesem Versuch wurde gleichzeitig mit der Erhöhung des Arbeitsdrucks a) die zugeführte Kohlenwassers-boffisenge so eingestellt, daß die Fermentation nicht icohlenwasser-

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- ίο - .

s toff-'begrenzt wurde, b) die Zusammensetzung. deg.-NÄhr-r ,,..·. mediums so eingestellt, daß d:ie_; Vermeidung etoer.legren·^ _:t! zung durch Nährstoffe-sichergestellt-war, undo) falls·.;? _(:, erforderlich, die zugeführte Luftmenge- so eingeAiiellt, ₍;. .,, daß die Vermeidung einer*Begrenzung durch.Sauerstoff, sichergestellt war. Der Druck wurde stufenweise um je . 0,5 kg/cm über den Bereich von 1,5 bis 3 kg/cm absolut gesteigert. . .r _r. . _;

Candida lipolytica wurde in einem mit Rührwerk',;versehenen· Fermenter vom Behältertyp, der ein Arbeitsvolumen von 1800 1 hatte, kontinuierlich kultiviert, wobei als Kohlen-Wasserstoffsubstrat ein Gemisch von η-Paraffinen mit 10 bis 14 C-Atomen im Molekül verwendet wurde. Nach einer Anfahrtzeit, während der die Kultur eine gewünschte Konzentration von Hefezellen für kontinuierlichen Betrieb erreichte,.wurde mit der kontinuierlichen Zuführung des wässrigen Nährmediums und des Kohlenwasserstoffsubstrats begonnen, um eine Verdünnungsrate der Gärmaische von 0,15 aufrecht zu erhalten. Die Temperatur wurde bei 32⁰C und der p^-Wert des Kulturmediums durch kontinuierlichen Zusatz von Ammoniak bei 5_f5 gehalten«

Das wässrige mineralische Medium_$ das während der Betriebs-

zeit !bei 1,5 kg/cm verwendet wurde» hatte die in Beispiel 1 angegebene Zusammensetzung,,

Wie bereits erwähnt,, wurden die Sal^konzentrationen während des Versuchs mit steigendem Druck erhöht, um sicherzustellen, daß das System nicht durch Nährstoffe begrenzt wurde·

Die Gärmaische wurde kräftig gerührt₈ wätorenä Luff in einer Menge zugeführt wm?cle₉ die sicherstellte ₈ daß keine Begrenzung des Systems öureh Sauerstoff vorlag. Die Geschwindigkeit dee Rütetrs wurde wfibrend ies Versuche konstant bei 320 "UpI!

- ti -

Der Versuch wurde über eine längere Zeit fortgesetzt, die etwas über 2000 Stunden lag. Der Fermenterdruck betrug

zu Beginn 1,5 kg/cm absolut und wurde während des Ver-

2 ' 2

suchs in Abständen auf 2 kg/cm', dann auf 2,5 kg/cm und

schließlich auf 3 kg/cm erhöht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Mittlerer Fermenter- .

druck, kg/cm² absolut

Zugeführte Kohlenwasserstoffmenge, g/l ..,. _.,. _.,.. ,_,,

Zuführungsmenge des Nähr- -'™

mediums, 1/Std.

Zugeführte luftmenee, V/V/Minute

Gewicht der trockenen Zellen, g/l

Ausbeutefaktor

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß bei einem mittleren

Permenterdruck von 3 kg/cm absolut der Ausbeutefaktor, der mit steigendem Druck stieg, zu fallen begann, obwohl die Produktivität, ausgedrückt als Gewicht der trockenen Zellen, noch stieg.

1,5 .	2	2,5	3
17,0	20,0	24,1	30,5
270	260	270	270
0,75	0,74	0,85	1,07
13,9	17,7	21,6	26,2
0,87	0,91	0,92	0,89

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Claims (6)

Patentansprüche

1) Kontinuierliches Verfahren zur Kultivierung von Hefe, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kohlenwasserstoffe verbrauchende Hefe kontinuierlich in einem üblichen behälterfö'rmigen Fermenter in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und eines die Hauptquelle assimilierbaren Kohlenstoff bildenden Kohlenwasserstoffsubstrats in Gegenwart eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases und bei erhöhtem Permenterdruck im Bereich von 1,5 bis 4,0, vorzugsweise 2 bis 3 kg/

ρ
cm absolut kultiviert.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Permenterdruck, Belüftungsmenge, Kohlenwasserstoffkonzentra tion und Nährsalzkonzentration so optimal einstellt, daß
die günstigsten Wachstumsbedingungen für die Hefe erreicht werden.

3) Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2_t dadurch gekennzeichnet, daß man die Austrittsgase aus dem Fermenter zur Schaffung
wenigstens eines Teils der Energie für das Kompressorsystem verwendet, das das sauerstoffhaltige Gas dem Fermenter zuführt.

4) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis j5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenwasserstoffsubstrat eine Normalparaffinfraktion mit einem Gehalt von wenigstens 90 Gew.-% an
η-Paraffinen verwendet, die durch Molekularsiebbehandlung
eines aus Erdöl stammenden Kerosins oder Gasöl erhalten
worden sind. ·

5) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Hefe der Familie Cryptococcaceae kultiviert,,

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6) Verfahren nach Anspruch 5* dadurch gekennzeichnet, daß man Hefe der Gattung Candida, vorzugsweise vom Stamm Candida lipolytica, kultiviert. '

-ItMOI/0241