DE202004002064U1

DE202004002064U1 - Mikroarray-Träger und Biochips mit Fluoreszenzstandards aus Farbglas

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Publication number: DE202004002064U1
Application number: DE200420002064
Authority: DE
Original assignee: Schott Spezialglass GmbH
Current assignee: Schott AG
Priority date: 2004-02-11
Filing date: 2004-02-11
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2014-02-12

Abstract

Mikroarray-Träger (1), umfassend ein vorzugsweise im wesentlichen nicht-fluoreszierendes Substrat (2) und mindestens einen Standard für Fluoreszenzmessungen (4a/b), der ein Farbglas enthält.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Mikroarray-Träger, der ein Substrat und einen oder mehrere Standards für Fluoreszenzmessungen umfasst, wobei der Standard oder die Standards ein Farbglas enthält/enthalten. Des Weiteren betrifft die Erfindung einen Biochip, der einen erfindungsgemäßen Mikroarray-Träger umfasst.
Die Fluoreszenzspektroskopie hat in den letzten Jahren besonders im diagnostischen Bereich und der Qualitätskontrolle stark an Bedeutung zugenommen. Ein Einsatzgebiet von besonders großer Bedeutung ist bspw. die Biochip-Technologie, bei der Bindungstests unter Verwendung von Mikroarrays (z.B. DNA- oder Protein-Mikroarrays) mittels Fluoreszenzmessungen ausgelesen werden.
Die Fluoreszenz wird dabei im Allgemeinen in willkürlichen und relativen Einheiten gemessen. Solche Messungen erlauben zwar Fluoreszenzintensitäten miteinander zu vergleichen, die mit ein und demselben Gerät gemessen wurden. Ein Vergleich von Messwerten, die mit unterschiedlichen Geräten aufgenommen wurden, ist jedoch nur schwer oder unmöglich. Dies ist insbesondere deshalb von großem Nachteil, da Vergleiche von Messwerten, die in verschiedenen Laboren erhalten werden, kaum möglich ist. Zur Lösung dieses Problems sind daher definierte Standards erforderlich, die als Referenz zur individuellen Messung dienen können.
Im Stand der Technik beschriebene Fluoreszenzstandards bestehen meist aus einem organischen Material. Diese Materialien besitzen u.a. folgende, in der Regel gemeinsam auftretende Nachteile: Photoinduzierte Degradation, geringe chemische Beständigkeit und Fluoreszenzschwankungen von Standard zu Standard.
Dies gilt auch für einen Fluoreszenzkalibrierungsstandard für die Mikoskopie, der in WO 01/059503 beschrieben ist. Dabei wird eine dünne fluoreszierende Schicht auf einer Trägerplatte verwendet. Als Breitbandfluorophor in der Schicht dient ein Polyimid. Auch in WO 02/077620 wird ein Fluoreszenzstandard beschrieben, der eine oder mehrere Polymerschichten auf einem im wesentlichen nichtfluoreszierenden festen Träger umfasst.
Weiterhin sind in US 4,662,745 Fluoreszenzstandards zur Gerätekalibrierung beschrieben worden, welche aus einer Platte mit einer fluoreszierenden Oberfläche bzw. Beschichtung bestehen. Die Fluoreszenz basiert auf Atomen von Selten Erdelementen, insbesondere Lanthanoiden, und deren Verbindungen (z.B. Oxiden, Sulfaten etc.), welche in einer spröden Schicht (glasartig, keramisch oder porzellanartig) vorliegen.
In WO 01/06227 werden fluoreszierende Partikel beschrieben, welche entweder als interne Standards zur Referenzierung von Fluoreszenzsignalen oder als Marker zur Markierung und Detektion von Biomolekülen verwendet werden. Die Fluoreszenzpartikel sind Metall-Liganden-Komplexe, vorzugsweise Verbindungen von Übergangsmetallen als Zentralatom, die in inerter Form in feste Materialien, wie anorganische Materialien oder organische Polymere, eingebaut werden.
Fluoreszenzstandards auf Basis von mit Selten Erdelementen dotierten Gläsern oder Metall-Liganden-Komplexen weisen oftmals den Nachteil auf, dass sie vergleichsweise schmale Fluoreszenzspektren aufweisen. Daher sind derartige Standards in Anwendungsbereichen, bei denen die Detektion über einen spektral breiten Bereich erfolgt, wie etwa bei der DNA-Chip-Technologie, nicht zufriedenstellend einsetzbar.
Schließlich wird in US 4,302,678 ein Standard zur Gerätekalibrierung offenbart, der ein fluoreszierendes Glas umfasst, das Uranoxid als Fluorophor enthält. Der Standard ist ausschließlich im UV-Bereich einsetzbar.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein neues System zur Kalibrierung von Array-Fluoreszenzgeräten und zur Standardisierung von Fluoreszenzmessungen bei Mikroarray-Experimenten bereitzustellen, das die Nachteile von im Stand der Technik bekannter Systeme umgeht und insbesondere eine Vergleichbarkeit der mittels Fluoreszenzmessung erhobenen Daten von Mikroarray-Experimenten ermöglicht.
Diese Aufgabe wird durch die in den Schutzansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.
Erfindungsgemäß wurde überraschender Weise festgestellt, dass sich Farbgläser in besonderer Weise als Standard für Fluoreszenzmessungen, die bei Mikroarray-Experimenten durchgeführt werden, eignen.
Somit wird gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Mikroarray-Träger, umfassend ein vorzugsweise im wesentlichen nichtfluoreszierendes Substrat, und mindestes einen Standard für Fluoreszenzmessungen, der ein Farbglas enthält, bereitgestellt.
Der Begriff „Standard für Fluoreszenzmessungen" umfasst insbesondere die Verwendung als Intensitätsstandard (Referenz) zur Normierung von Fluoreszenzintensitäten, die beim Auslesen von Mikroarray-Bindungstests gemessen werden, und die Verwendung als Kalibrierungsstandard zur Prüfung von Fluoreszenzmessgeräten, die im Rahmen von Mikroarray-Experimenten (meist sog. Array-Scanner) eingesetzt werden. Des Weiteren ist an den Einsatz als spektraler Standard bei Mikroarray-Geräten zu denken – etwa die Eigenschaft, dass die Fluoreszenz bei einer Wellenlänge stärker oder schwächer ist als bei einer anderen Wellenlänge.
Der Begriff „im wesentlichen nicht-fluoreszierendes Substrat" bedeutet erfindungsgemäß, dass das Substrat nicht bei den oder in der Nähe der Absorptions- und Emissionswellenlängen des oder der Fluoreszenzstandards fluoresziert, so dass die Fluoreszenz des oder der Standards durch das Substrat nicht in messbarer Weise beeinflusst wird.
Dabei handelt es sich bei dem im oder auf dem Mikroarray-Träger vorliegenden Farbglas vorzugsweise um ein Anlaufglas, mehr bevorzugt um ein Farbglas, das Nanokristalle einer oder mehrerer Halbleiterverbindung(en) enthält. Derartige Farbgläser sind aufgrund ihres selektiv abfallenden Absorptionsverhaltens im Stand der Technik als Absorptionssteilkantenfilter eingesetzt worden (siehe bspw. DE-A-20 26 485, US 3,773,530 , DE-A-26 21 741 und DE-A-101 41 101).
Die farbigen bzw. fluoreszierenden Nanokristalle (auch als Nanokristallite bezeichnet) in den bevorzugt zur Ausstattung des erfindungsgemäßen Mikroarray-Trägers verwendeten Farbgläsern, sind kolloidal in der Glasmatrix verteilt und entstehen durch das spezifische Herstellungsverfahren, bei dem zunächst die Ausgangskomponenten vermischt und eingeschmolzen werden. Danach wird das entstandene Glas in die gewünschte Form gegossen und abgekühlt. Das zunächst hergestellte Glas ist im wesentlichen amorph und wird durch einen definierten Temperaturprozess des erneuten Erhitzens und Abkühlens (Tempern) zum Anlaufen gebracht. Während dieses Prozesses wachsen die fluoreszierenden Nanokristalle im allgemeinen bis zu einer Größe (Durchmesser) von etwa 1 bis etwa 10 nm.
Weitere Farbgläser, die zur Ausstattung des erfindungsgemäßen Mikroarray-Trägers mit einem oder mehreren Fluoreszenzstandard(s) dienen können, sind Metallkolloidgläser wie bspw. Cu- oder Au-dotierte Gläser. Derartige Metallkolloid-Farbgläser sind z.B. von der Anmelderin erhältlich und umfassen diejenigen der SSG-Reihe, wie bspw. SSG 460, SSG 480, SSG 510, SSG 530, SSG 550, SSG 565, SSG 580, SSG 600 und SSG 625. Auch die spektralen Eigenschaften der Metallkolloid-Farbgläser lassen sich in einem Fachmann bekannter Weise einstellen.
Farbgläser zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise solche, die Nanokristalle aus Cd-Halbleiterverbindungen (eine oder mehrere bzw. Mischverbindungen), insbesondere CdS, CdSe oder CdTe, enthalten. Eine besonders bevorzugte Cd-Halbleiterverbindung ist CdSeS. Derartige Farbgläser sind im Stand der Technik, bspw. in DE-A-20 26 485, US 3,773,530 , US 4,106,946 , DE-A-26 21 741 und DE-A-101 41 105 (vgl. auch EP-A-1 285 890, US-A-2003/0153451 und JP-A-2003146695) beschrieben, wobei der Offenbarungsgehalt dieser Druckschriften ausdrücklich in die vorliegende Beschreibung eingeschlossen ist.
Weitere gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendbare Farbgläser sind solche, die Nanokristalle von Verbindungshalbleitern der Klasse I–III–VI enthalten. Solche Gläser sind z.B. in DE-A-101 41 101 (vgl. auch EP-A-1 288 171) und DE-A-101 41 104 (vgl. auch EP-A-1 285 889, US-A-2003/0158029 und JP-A-2003119049) beschrieben. Auf den Offenbarungsgehalt dieser Druckschriften wird in der vorliegenden Erfindung daher ausdrücklich Bezug genommen. Als fluoreszierende Zentren, d.h. als Dotiermittel zur Verleihung der fluoreszierenden Eigenschaften, enthalten diese Gläser Halbleiterverbindungen der Form M^IM^IIIY^II ₂ (mit M^I = Cu⁺ und/oder Ag⁺, M^III = In³⁺ und/oder Ga³⁺ und/oder Al³⁺ und Y^II = S^2– und/oder Se^2–).
Selbstverständlich können die Farbgläser Nanokristalle verschiedener Arten von Halbleiterverbindungen, bspw. Cd-Halbleiterverbindungen (eine oder mehrer oder Gemische} und Halbleiterverbindungen der Klasse I–III–VI (ebenfalls eine oder mehrere bzw. Mischzusammensetzungen), enthalten.
Die Summe der Verbindungshalbleiter im Glas beträgt vorzugsweise mindestens 0,1 Gew.-%, was der Mindestkonzentration entspricht, die zur Lichtabsorption der kolloidal im Glas verteilten Nanokristalle erforderlich ist. Gemäß bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beträgt die Summe der Verbindungshalbleiter im Glas mehr als 0,3 Gew.-%, besonders bevorzugt mehr als 0,5 Gew.-%.
Bevorzugte Gläser zur erfindungsgemäßen Anwendung im Mikroarray-Träger sind Silikatgläser mit höheren Gehalten an ZnO und Alkalioxid(en), insbesondere K₂O. Derartige Gläser werden im allgemeinen als Zinksilikat- oder Alkalizinksilikatgläser bezeichnet.
Wie vorstehend bereits erwähnt, liegt ZnO ebenfalls in größeren Mengen vor. ZnO erhöht die Temperaturwechselbeständigkeit des Glases. Diese Eigenschaft ist für die Verwendung als Fluoreszenzstandard von erheblicher Bedeutung, da die Bestrahlung des Standards mit den in Photoluminometern üblichen Strahlungsquellen im allgemeinen mit einer erheblichen Temperaturabstrahlung verbunden ist. Des Weiteren unterstützt ZnO die homogene Nanokristallbildung des Dotiermaterials (also die Entstehung der fluoreszierenden Zentren) im Glas und ermöglicht dadurch ein homogenes Kristallitwachstum der Halbleiterdotierung bei der Temperung des Glases. ZnO ist somit für die Größenverteilung der Nanokristalle und damit für die spektrale Verteilung der emittierten Fluoreszenz von erheblicher Bedeutung, weshalb das Fluoreszenzspektrum eines gewünschten Standards auch mit Hilfe der Modulation des ZnO-Gehaltes einstellbar ist.
Erfindungsgemäß bevorzugt verwendete Gläser mit Nanokristallen von einer oder mehreren Halbleiterverbindungen des Typs I–III–VI weisen folgende Zusammensetzung (in Gew.-%) auf:
Derartige Gläser und bevorzugte Ausführungsformen davon sowie deren Herstellung sind in DE-A-101 41 104 (vgl. auch EP-A-1 285 889, US-A-2003/0158029 und JP-A-2003119049) beschrieben, deren diesbezüglicher Offenbarungsgehalt in der vorliegenden Erfindung ausdrücklich aufgenommen ist.
Weitere erfindungsgemäß bevorzugt verwendbare Farbgläser weisen die folgende Zusammensetzung auf:

SiO₂ 50 bis 62

ZnO 13,5 bis 37

K₂O 10 bis 25

Na₂O 0 bis 14

Al₂O₃ 0 bis 2

B₂O₃ 3 bis 5

F 0 bis 1

TiO₂ 0 bis 7

In₂O₃ 0 bis 2

SO₃ 0 bis 1

SeO₂ 0 bis 1

C 0 bis 1

M^IM^IIIY^II ₂ 0,1 bis 3

wobei:

M^I Cu⁺ und/oder Ag⁺

M^III In³⁺ und/oder Ga³⁺ und/oder Al³⁺ und

Y^II S^2– und/oder Se^2–

bedeutet, und wobei wenigstens 0,1 Gew.-% des Oxides (M₂O₃) des oder der M^III, das/die in M^IM^IIIY^II ₂ vorliegt/vorliegen und wenigstens 0,2 Gew.-% des Oxides des oder der Y^II ₂, das/die in M^IM^IIIY^II ₂ vorliegt/vorliegen, vorhanden sind.
Solche Farbgläser mit einer oder mehreren Halbleiterverbindungen des Typs I–III–VI sind in DE-A-101 41 101 (vgl. auch EP-A-1 288 171) beschrieben, auf deren Offenbarungsgehalt, insbesondere hinsichtlich bevorzugter Ausführungsformen und Herstellungsverfahren, in der vorliegenden Beschreibung ausdrücklich Bezug genommen wird.
Im Fall der ternären Halbleitersysteme der obigen Form M^IM^IIIY^II ₂ sind alle Randkomponenten, also bspw. CulnS₂, CulnSe₂, CuGaS₂, CuGaSe₂, AglnS₂, AglnS₂, AgGaS₂ und AgGaSe₂ sowie alle Mischverbindungen aus Zwei- oder Mehrkomponentensystemen verwendbar. Ebenfalls können zwei oder mehrere Randkomponenten gleichzeitig eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt sind Farbgläser mit Dotiermitteln von einer oder mehreren Komponenten aus dem System Culn(Se_1–xS_x)₂ mit x = 0 bis 1, also von den Randkomponenten CulnS₂ und CulnSe₂ sowie von deren Mischverbindungen, wobei diese Komponenten vorzugsweise mit einem Gehalt von 0,1 bis 0,5 Gew.-% vorliegen. Weitere bevorzugte Farbgläser mit Nanokristallen von Halbleitern der Klasse I–III–VI enthalten farbgebende (fluoreszierende) Komponenten der Form CuAl(Se_1–xS_x)₂ mit x = 0 bis 1, d.h. von den Randkomponenten CuAlS₂ und CuAlSe₂ sowie von deren Mischverbindungen. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegen diese Komponenten mit einem Gehalt von 0,1 bis 0,5 Gew.% vor.
Erfindungsgemäß verwendete Farbgläser mit Cd-Nanokristallen weisen bspw. folgende Zusammensetzung (in Gew.-% auf Oxidbasis) auf:

SiO₂ 40 bis 60

B₂O₃ 5 bis 20

P₂O₅ 0 bis 8

Al₂O₃ 1,5 bis 6,0

Na₂O 4 bis 8

K₂O 6 bis 14

ZnO 4 bis 12

BaO 0 bis 6

CdO 0,2 bis 2,0

S 0,2 bis 1,0
Solche Gläser sind in US 3,773,530 beschrieben, auf deren Offenbarungsgehalt in der vorliegenden Erfindung ausdrücklich Bezug genommen wird.
Weitere Farbgläser mit Cd-Halbleiterverbindungen, die erfindungsgemäß verwendbar sind, sind in US 4,106,946 beschrieben, deren Offenbarungsgehalt in der vorliegenden Erfindung vollständig eingeschlossen ist. Diese Farbgläser weisen als Fluoreszenzstandard folgende Zusammensetzung (in Gew.-%) auf:

SiO₂ 40 bis 63

Alkalimetalloxid(e) 8 bis 30

B₂O₃ 0 bis 9

P₂O₅ 0 bis 2,5

Al₂O₃ 0 bis 1,5

ZnO 14 bis 30

TiO₂ 0,9 bis 9

F 0 bis 2

CdO 0 bis 2,0

CdTe 0 bis 2,5

ZnS 0 bis 1,65

CdS 0 bis 2,0

S 0 bis 0,9

Se 0 bis 0,9

wobei der Gehalt an CdO, CdTe, ZnS, CdS, S und Se oder irgendeiner Kombination dieser mindestens 0,5 Gew.-% beträgt.

Weitere erfindungsgemäß verwendbare Farbgläser, die Nanokristalle von einer oder mehrerer Cd-Halbleiterverbindungen) enthalten, weisen die folgende Zusammensetzung auf:

SiO₂	40 bis 63
Alkalimetalloxid(e)	8 bis 30
B₂O₃	0 bis 9
P₂O₅	0 bis 2,5
Al₂O₃	0 bis 1,5
ZnO	14 bis 30
TiO₂	0,9 bis 9
F	0 bis 2
CdO	0 bis 2,0
CdTe	0 bis 2,5
ZnS	0 bis 1,65
CdS	0 bis 1,0
S	0 bis 0,9
Se	0 bis 0,9
As₂S₃ und/oder As₂S₄	0 bis 1,5
Sb₂S₃ und/oder Sb₂S₄	0 bis 1,5

wobei der Gehalt an CdO, CdTe, ZnS, CdS, S und Se oder irgendeiner Kombination davon mindestens 0,5 Gew.-% beträgt.

Hinsichtlich dieser Gläser und bevorzugter Ausführungsformen sowie Herstellungsverfahren wird ausdrücklich auf die DE-A-26 21 741 verwiesen, deren diesbezüglicher Offenbarungsgehalt vollständig in die vorliegende Erfindung aufgenommen ist.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Farbgläser als Fluoreszenzstandard verwendet, die folgende Zusammensetzung (in Gew.-% auf Oxidbasis) aufweisen:

SiO₂ 30 bis 75

K₂O 5 bis 35

B₂O₃ >4 bis 17

ZnO 5 bis 30

F 0,1 bis 1

CdO 0,1 bis 1

S + Se + Te 0,1 bis 1,5
Die vorstehenden Farbgläser sind in DE-A-101 41 105 (vgl. auch EP-A-1 285 890, US-A-2003/0153451 und JP-A-2003146695) beschrieben, deren Offenbarungsgehalt, insbesondere hinsichtlich bevorzugter Ausführungsformen und Herstellungsverfahren der dort beschriebenen Farbgläser, vollständig in die vorliegende Beschreibung aufgenommen ist.
Spezifische Zusammensetzungen, insbesondere von im roten, orangen und gelben Bereich des sichtbaren Spektrums fluoreszierenden Anlaufgläsern können den vorstehend genannten Druckschriften entnommen werden.
Zur Verbesserung der Glasqualität können den Farbgläsergemengen, die zur Herstellung erfindungsgemäßer Fluoreszenzstandards verwendet werden, zur Läuterung des Glases ein oder mehrere übliche Läutermittel, bspw. Na₂SO₄, KNO₃ u.ä., in üblichen Mengen zugesetzt werden. Die Läuterung fördert die innere Glasqualität bezüglich Blasen- und Schlierenfreiheit.
Die Spektren der vom Standard absorbierten und emittierten Strahlung, d.h. die spektralen Eigenschaften des Standards, hängen insbesondere vom Bandabstand der die Nanokristalle aufbauenden Halbleiterverbindungen) ab: Je kleiner die Bandlücke, desto langwelliger ist die emittierte Strahlung. Ein übliches Kriterium für die optischen Eigenschaften der Farbgläser, die sich durch eine niedrige Transmission im kurzwelligen Bereich und eine hohe Transmission im höheren Wellenlängenbereich auszeichnen, ist die sog. Kantenwellenlänge (auch als Kantenlage oder Steilkantenlage bezeichnet). Sie entspricht der Wellenlänge, bei welcher der spektrale Reintransmissionsgrad die Hälfte der Maximaltransmission erreicht. Für die Cadmiumchalkogenide können bspw. folgende Werte der spektralen Eigenschaften angegeben werden (Wellenlänge der für den Standard charakteristischen Absorptionssteilkante = Bandlücke/Plancksches Wirkungsquantum):
Die in der obigen Tab. 1 angegebenen Werte für die Bandlücke der Halbleiter werden in der Realität durch aufgrund der geringen Größe der Kristallite auftretende Quanteneffekte zu größeren Werten hin verschoben.
Somit bestimmt die Art der Halbleiterverbindung und die relativen Konzentrationen der die Halbleiterverbindung aufbauenden Komponenten die Größe der Bandlücke innerhalb der Nanokristalle und daher grundlegend die spektralen Eigenschaften des im erfindungsgemäßen Mikroarray-Träger vorliegenden Standards.
Des Weiteren bestimmt die Größe der Nanokristalle den Bandabstand der Halbleiter. Je größer die Kristallite werden, desto kleiner wird der Bandabstand und desto langwelliger („roter") wird die emittierte Strahlung. Die Bildung der kollidal in der Glasmatrix verteilten Nanokristallite wird während des als „Anlaufprozess" genannten Vorgangs der Farbbildung von der Glaszähigkeit, der Übersättigung, dem Löslichkeitsprodukt und der Wachstumsgeschwindigkeit der Fluoreszenzzentren beeinflusst. Während der Abkühlung der Gläser können sich bereits erste Kristallite ausbilden. Meist ist das zunächst hergestellte Glas jedoch im Wesentlichen amorph. Der eigentliche Anlaufprozess findet durch eine weitere Temperaturbehandlung (Tempern) im Temperaturbereich Glasübergangstemperatur (T_g) + ≤ 150 K statt. Die Anlauftemperatur und die -zeit (also die Höhe und Dauer der Temperaturbehandlung) beeinflussen dabei die Kristallitgröße. Kürzeres Tempern führt zu kleineren Kristalliten und zu kürzeren Fluoreszenzwellenlängen. Durch diese Parameter kann ein Fachmann somit die spektralen Eigenschaften des im erfindungsgemäßen Mikroarray-Träger vorliegenden Fluoreszenzstandards bei gegebener Nanokristallzusammensetzung fein steuern. Erfindungsgemäß ist eine Kristallgröße (Durchmesser) von ≤ etwa 10 nm, insbesondere etwa 3 bis etwa 10 nm, bevorzugt, da oberhalb von etwa 10 nm unerwünschte Streueffekte auftreten. Erfindungsgemäß verwendete Farbgläser können somit im Wellenlängenbereich zwischen etwa 320 nm und etwa 1200 nm, vorzugsweise zwischen etwa 480 nm und etwa 750 nm, angeregt werden. Entsprechend liegen die Absorptionsmaxima der erfindungsgemäßen Farbgläser in diesen Bereichen. Die emittierte Fluoreszenz kann zwischen UV-Werten und dem nahen IR-Bereich liegen. Das Fluoreszenzmaximum des Farbglases liegt daher vorzugsweise zwischen etwa 380 nm und etwa 850 nm, mehr bevorzugt zwischen etwa 500 nm und etwa 770 nm.
Erfindungsgemäß zu verwendende Farbgläser, die Cd-Halbleiterverbindungen enthalten, sind besonders geeignet, um Fluoreszenzemissionen im Wellenlängenbereich von 400 bis 850 nm bereitzustellen. Durch Variation der obigen Parameter kann dabei der Spektralbereich im jeweils erwünschten Bereich eingestellt werden.
Erfindungsgemäße Cd-haltige Farbgläser, die eine kürzerwellige Fluoreszenz (etwa 400 bis etwa 500 nm) emittieren, werden auch als Gelbgläser bezeichnet und sind bspw. unter den Bezeichnungen GG 400, GG 420, GG 435, GG 455, GG 475 und GG 495 von der Anmelderin erhältlich. Fluoreszenzen im Bereich von z.B. etwa 500 bis etwa 600 nm können bspw. mit den sog. Orangegläsern OG 515, OG 530, OG 550, OG 570 und OG 590 der Anmelderin realisiert werden. Im längerwelligen Bereich (etwa 600 bis etwa 850 nm) stehen z.B. die als Rotgläser bezeichneten Gläser RG 9, RG 610, RG 630, RG 645, RG 665, RG 695, RG 715, RG 780, RG 830 und RG 850 zur Verfügung, die von der Anmelderin erhältlich sind. Als ein erfindungsgemäß besonders bevorzugtes Beispiel ist das Orangeglas OG 550 mit der in Tab. 3.2 angegebenen Zusammensetzung zu nennen.
Die Herstellung der erfindungsgemäß zum Einsatz kommenden Farbgläser kann bspw. im wesentlichen gemäß einem Fachmann bekannter Verfahren (siehe bspw. DE-A-20 26 485, US 3,773,530 , US 4,106,946 , DE-A-26 21 741, DE-A-101 41 105, DE-A-101 41 101 und DE-A-101 41 104) erfolgen. Derartige Herstellungsverfahren beginnen mit dem Schmelzen der Glaszusammensetzung (wobei hier die Schritte Einschmelzen des Gemenges, Läutern, Homogenisieren und Konditionieren erfasst sind). Das Einschmelzen erfolgt in keramischen Tiegeln (Häfen) bei Temperaturen von etwa 1100 bis etwa 1550°C, vorzugsweise im Bereich von etwa 1200 bis 1360°C. Das Blankschmelzen (Läutern) erfolgt vorzugsweise bei etwas geringerer Temperatur, bspw. bei etwa 1300 bis etwa 1340°C für etwa 1 bis etwa 2 h. Nach der Abstehphase (üblicherweise etwa 3 bis etwa 4 h) wird die Temperatur üblicherweise auf etwa 1230°C abgesenkt, wobei die Schmelze homogenisiert wird. Der Guss erfolgt typischerweise bei etwa 950 bis 1000°C in eine gewünschte Form. Anschließend wird das Glas abgekühlt, wobei sich bereits die erfindungsgemäßen Nanokristallite vollständig oder teilweise bilden können. Ggf. kann das Glas auch gewalzt werden. Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt die Bildung der Farb- bzw. Fluoreszenzzentren in der Glasmatrix im wesentlichen durch das nachfolgende Tempern des Glases, also erneutes Erhitzen und Abkühlen, z.B. bei Temperaturen von etwa 500 bis etwa 720°C, vorzugsweise bei etwa 560 bis etwa 720°C, für etwa 1 Stunde bis etwa 2 Wochen, und langsames Abkühlen bis auf Raumtemperatur (z.B. Abkühlung um etwa 1 bis etwa 10 K pro Stunde in elektrischen oder gasbeheizten Öfen). Wie bereits vorstehend erläutert, kann bei gegebener Zusammensetzung der Glasschmelze und damit der entstehenden Kristallite deren Größe besonders durch Dauer und Höhe der Temperaturbehandlung gesteuert werden, was es ermöglicht, die gewünschten spektralen Eigenschaften des Farbglases relativ fein einzustellen, wobei vorzugsweise die Anregungs- und Emissionswellenlänge des entstandenen Standards um nicht mehr als etwa 6 nm, mehr bevorzugt nicht mehr als etwa 3 bis etwa 5 nm, von den gewünschten Werten abweicht.
Mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren werden die Standards für den erfindungsgemäßen Mikroarray-Träger üblicherweise als Massivgläser hergestellt. Ein als Massivglas vorliegender Standard für den Mikroarray-Träger der vorliegenden Erfindung kann an einem Substrat, bspw. aus Glas, befestigt werden. Vorzugsweise handelt es sich dabei um ein oder mehrere im wesentlichen nicht-fluoreszierende Gläser. Als geeignete Verbindungsmethoden können an sich bekannte Verfahren wie „Low-Temperature-Bonding", „Verschmelzung im Glasslot", Verkleben und „Ansprengung" genannt werden. So können die im Bereich der Biochip- oder Mikroarray-Technologie als Träger verwendeten (üblicherweise nichtfluoreszierenden) Substrate, vorzugsweise solche aus Glas, mit einem erfindungsgemäßen Fluoreszenzstandard ausgestattet werden. Dies kann vorteilhafter Weise dadurch geschehen, dass ein Teil des verwendeten (Glas)-Substrats bspw. durch Absägen entfernt und durch einen gleich großen Fluoreszenzstandard mit den jeweils gewünschten spektralen Eigenschaften ersetzt wird. Hierdurch ist es möglich, die vorgegebenen Standardmaße (üblicherweise Mikroarray-Träger oder Biochips mit Dimensionen von etwa 75 × 25 × 1 mm), die in der Mikroarray-Technologie verwendet werden, einzuhalten. Selbstverständlich kann das entfernte Substrat- oder allgemein Probenstück durch mehrere verschieden zusammengesetzte Standards ersetzt werden, so dass das fertige Produkt Standards mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften enthält. Vorzugsweise werden so ein oder mehrere Standards in einem oder beiden Endbereichen (also insbesondere an der oder den Schmalseite(n) eines Objekts mit rechteckiger Oberfläche, wie es bei üblichen Mikroarray-Trägern bzw. Biochips der Fall ist) des ansonsten nicht-fluoreszierenden Substrats vorliegen. Im Fall von üblichen Mikroarray-Trägern oder Biochips bleiben somit die Dimensionen des Produkts aus Substrat, vorzugsweise nicht-fluoreszierendem Glas, plus Massivfarbglas (und ggf. aufgetragenen Beschichtungen und Sondenmolekülen), insbesondere von etwa 75 mm × 25 mm × 1 mm, erhalten.
Das erfindungsgemäß verwendete Farbglas kann auch als dünner Film mit einer Dicke von einigen Nanometern bis einigen Mikrometern, vorzugsweise etwa 3 nm bis etwa 20 μm, vorliegen, der auf einem Substrat, z.B. einem im wesentlichen nichtfluoreszierenden Glassubstrat, aufgebracht ist. In dieser Ausführungsform kann der Glasfilm durch an sich bekannte Depositionsverfahren, wie Sol-Gel-Verfahren, Siebdruckverfahren (mit organischen oder anorganischen Bindemitteln) oder Sputtern, gegebenenfalls mit nachfolgenden Temperschritten, hergestellt werden. Ein derartiger Fluoreszenzstandard in Form eines Glasfilms kann außerdem in mehrere flächige Einzelsegmente strukturiert auf dem Substrat vorliegen. Die Strukturierung des Dünnfilmstandards kann z.B. unmittelbar im Siebdruckverfahren oder durch Maskierung des Substrats erfolgen. Des Weiteren ist eine Strukturierung des Glasfilms durch Ätztechniken möglich. Mit derartigen strukturierten Standards können weitere Testmöglichkeiten für Mikroarray-Fluoreszenzmessgeräte, bspw. das flächenhafte Auflösungsvermögen, bereitgestellt werden.
Weiterhin ist es möglich, erfindungsgemäße Fluoreszenzstandards als Dünnglas herzustellen und als dünne Glasplättchen mit einer Dicke von bspw. etwa 50 bis etwa 200 μm, typischerweise etwa 100 μm, auf ein geeignetes Substrat, vorzugsweise nicht-fluoreszierendes Glas, aufzubringen. Diese Ausführungsform kann bspw. durch Aufkleben des Dünnglases realisiert werden.
Prinzipiell kann der Fluoreszenzstandard im Mikroarray-Träger zweierlei Funktionen dienen. Der Standard kann erstens zur Prüfung des jeweiligen Mikroarray-Fluoreszenzgeräts verwendet werden. Hierbei kann mit Hilfe der Farbgläser insbesondere die Uniformität, die Linearität und das flächenhafte Auflösungsvermögen des Messgeräts getestet werden. Weiterhin kann das Gerät hinsichtlich einer zeitlichen Variabilität über bspw. Tage, Wochen, Monate oder Jahre überprüft werden. Der Mikroarray-Träger mit Fluoreszenzstandard dient zweitens der Normierung unkalibrierter Fluoreszenzintensitäten, wodurch eine allgemeine Vergleichbarkeit der mit Mikroarray-Experimenten erhaltenen Messwerte ermöglicht wird. Die Ausstattung des erfindungsgemäßen Mikroarray-Trägers mit einem oder mehreren Farbglasfluoreszenzstandard(s) erlaubt die simultane Standardisierung der in der bzw. den Probe(n) des Biochips gemessenen Fluoreszenzsignale.
Ein unter Verwendung der erfindungsgemäßen Farbgläser hergestellter Standard kann vorteilhafter Weise mit unterschiedlichen Fluoreszenz- bzw. Fluoreszenzintensitäten bereitgestellt werden. Die vom Standard emittierte Intensität hängt im wesentlichen von der Intensität der Anregungsstrahlung und der Menge des angeregten Materials ab. Die Anregungsintensität (bspw. die Intensität eines Lasers) ist ein rein externer Einfluss, wobei Anregungs- und Fluoreszenzintensität in der Regel linear miteinander zusammenhängen. Daher kann durch eine Veränderung der Anregungsintensität die Fluoreszenzintensität moduliert werden und so z.B. die Linearität der Detektion getestet werden.
Erfindungsgemäß können die Farbgläser als Fluoreszenzstandards für Mikroarray-Träger durch geeignete Wahl der Konzentration bzw. absolute Menge der angeregten und damit fluoreszierenden Zentren mit unterschiedlichen Emissionsintensitäten hergestellt werden. Nach Eichung der Standards können diese dazu verwendet werden, den Messbereich oder die Linearität der Detektion eines unbekannten Geräts zu prüfen. Die Konzentration der fluoreszierenden Zentren kann insbesondere durch Veränderung der Glaszusammensetzung und/oder der bei der Glasherstellung gewählten Bedingungen (z.B. Temperatur und Dauer der Temperung) moduliert werden. Wenn das erfindungsgemäße Farbglas als dünne Schicht, insbesondere als Glasfilm vorliegt, kann die Intensität der emittierten Strahlung auch durch Variation der Schicht- bzw. Filmdicke verändert werden. Diese Möglichkeit beruht auf der Tatsache, dass bei einer dünnen Schicht, bspw. einem Glasfilm obiger Dicke, nicht das gesamte anregende Licht sondern nur ein Teil davon absorbiert wird. Der nicht absorbierte Teil wird transmittiert. Bei einem dickeren Film können daher mehr Fluoreszenzzentren angeregt werden, weshalb über die Schichtbzw. Filmdicke die Intensität des vom Standard emittierten Lichts gesteuert werden kann. Somit kann durch Verwendung des erfindungsgemäßen Farbglases die Konzentration der fluoreszierenden Zentren (Nanokristallite aus einer oder mehreren Halbleiterverbindungen) und/oder die Filmdicke derart eingestellt werden, dass die vom Standard emittierte Strahlung (bei gegebener Anregungsintensität) in einem Intensitätsbereich liegt, welcher dem Bereich der Fluoreszenzintensitäten der jeweils zu messenden Proben entspricht.
Erfindungsgemäße Mikroarray-Träger, die mit einem oder mehreren Fluoreszenzstandard aus Farbglas versehen sind, können daher auf zweierlei Weise an die jeweiligen Messungen angepasst werden. Zum einen kann, wie vorstehend beschrieben, der Spektralbereich des Glases, d.h. Absorptions- und Emissionseigenschaften, insbesondere Absorptionsmaxima und Fluoreszenzmaxima, derart eingestellt werden, dass die spektralen Kenngrößen in einem ähnlichen Bereich liegen, wie die entsprechenden Kenngrößen der in einer Mikroarray-Messung eingesetzten fluoreszierenden Materialien, insbesondere organische und/oder biologisch-chemische Fluorophoren. Vorzugsweise weichen die spektralen Eigenschaften, wie Fluoreszenzmaxima und/oder Absorptionsmaxima, um nicht mehr als 20%, mehr bevorzugt nicht mehr als 10%, besonders bevorzugt nicht mehr als 5%, insbesondere nicht mehr als 1 %, von den Fluoreszenzmaxima bzw. Absorptionsmaxima ab, welche Fluoreszenzzentren, meist organische und/oder biologisch-chemische Fluorophore, aufweisen, die bei einer gegebenen Mikroarray-Messung verwendet werden. Zum anderen kann der Standard, wenn er bspw. als dünne Schicht vorliegt, bei gegebener Anregungsintensität eine Fluoreszenzintensität aufweisen, welche im Bereich der mittleren Intensität liegt, die bei einem gegebenen Mikroarray-System gemessen werden. Vorzugsweise weicht die Intensität der vom Farbglas emittierten Strahlung (bei gegebener Anregungsintensität) um nicht mehr als 20%, mehr bevorzugt nicht mehr als 10%, besonders bevorzugt nicht mehr als 5%, insbesondere nicht mehr als 1 %, von der mittleren Fluoreszenzintesität ab, die bei einer typischen Messung im Mikroarraybereich gemessen wird.
Das in seinen optischen Eigenschaften im Vergleich zu anderen Standards in einem weiten Bereich gezielt veränderbare Farbglas zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung kann daher in vielseitiger Weise als Fluoreszenzstandard bei Mikroarray-Experimenten eingesetzt werden. Zu dieser Vielseitigkeit trägt auch bei, dass das Farbglas in vielen unterschiedlichen Formen, bspw. als Massivglas, Glasfilm oder Dünnglas, herstellbar ist.
Zunächst eignen sich sämtliche Ausführungsformen sehr gut als Referenz zum Vergleich der Intensität eines bei einer Probe gemessenen Signals. Ebenso können Prüfungen der Langzeitstabilität von Mikroarray-Fluoreszenzmessgeräten, insbesondere Arrayscannern, vorgenommen werden. Hierbei ist besonders die zeitlich und chemisch praktisch unveränderliche Stabilität der optischen Eigenschaften der als Standard verwendeten Farbgläser von zentraler Bedeutung.
Wie bereits vorstehend angedeutet, kann mit einem strukturierten Farbglasstandard, der vorzugsweise als Glasfilm oder Dünnglas auf einem nicht-fluoreszierenden Substrat vorliegt, das flächenhafte Auflösungsvermögen des Array-Messgeräts getestet werden. Bspw. wird hierzu der Standard in Einzelsegmente mit Dimensionen von etwa 9 μm² bis etwa 12 mm² strukturiert, wobei die Flächen z.B. quadratische Formen von bspw. etwa 3 μm × 3 μm annehmen oder rund mit Durchmessern von bspw. etwa 3 μm bis etwa 2 mm vorliegen können. Weiterhin können als großflächige Standards, hier also vorzugsweise als Massivglas, Glasfilm oder Dünnglas, vorliegende Farbgläser zur Prüfung der Uniformität von Fluoreszenzmessungen auf zweidimensionalen Array-Messoberflächen verwendet werden.
Weiterhin dienen erfindungsgemäße Mikroarray-Träger mit Farbgläsern als Standards zur Prüfung der Linearität von mit Fluoreszenzspektrometern ausgestatteten Mikroarray-Geräten. Durch geeignete Wahl der Zusammensetzung des Fluoreszenzstandards wird erreicht, dass die Intensität der emittierten Strahlung (bei gegebener Anregungsintensität) in weiten Bereichen variiert werden kann, wodurch es ermöglicht wird, den linearen Bereich des zu prüfenden Array-Messgeräts zu bestimmen.
Ein weiterer Anwendungsbereich liegt in der Feststellung von sog. „Cross Talk" in einem Array-Messgerät durch erfindungsgemäß verwendete Farbgläser. Hierbei wird es aufgrund des bekannten, zeitlich im wesentlichen keinerlei Schwankungen unterlegenen Fluoreszenzspektrums ermöglicht, die Genauigkeit der Abgrenzung unterschiedlicher Fluoreszenzdetektionskanäle untereinander zu prüfen.
Ein besonders vorteilhafter Gesichtspunkt bei der Anwendung der erfindungsgemäßen, mit Farbglasfluoreszenzstandards ausgestatteten Mikroarray-Träger bzw. Biochips bildet die Möglichkeit des Vergleichs von Fluoreszenzmessungen in unterschiedlichen Laboren. Da die Intensitäten aufgrund eines erhöhten Aufwands in der Regel nicht in absoluten Einheiten gemessen werden, stellt ein gemeinsamer Farbglasstandard, vorzugsweise enthaltend Nanokristalle einer oder mehrerer Halbleiterverbindung(en), eine Referenz dar, mit der Messergebnisse verschiedener Labore (die mit unterschiedlichen Geräten erhoben wurden) verglichen werden können.
Schließlich kann bei bekannter quantitativer Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Standards eine Umrechnung des Fluoreszenzsignals in Effizienzen (bspw. Fluoreszenz pro Molekül und Fläche) erfolgen.
Wie bereits vorstehend erläutert, können erfindungsgemäß in einem Mikroarray-Träger verwendete Farbgläser mit gezielt in einem weiten Bereich veränderbaren spektralen Eigenschaften hergestellt werden. Daher kann das zu untersuchende Material in einem geeigneten spektralen Bereich angeregt, die Fluoreszenz gemessen und mit dem Standard verglichen werden.
Erfindungsgemäße Mikroarray-Träger mit Farbglasstandards können vorteilhafter Weise in der Qualitätskontrolle eingesetzt werde. Hier wird das zu prüfende Material üblicherweise im UV-Bereich bei Wellenlängen unterhalb von 400 nm, bspw. bei etwa 320 ± 15 nm oder auch darunter, angeregt und bei Wellenlängen um die 400 nm, bspw. 380 ± 15 nm nm, ggf. aber auch darunter oder darüber, die emittierte (Fluoreszenz-)Strahlung detektiert. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der im Mikroarray-Träger einzusetzende Farbglasstandard entsprechend den in diesem Anwendungsbereich erforderlichen spektralen Eigenschaften durch geeignete Wahl der Glaszusammensetzung und Temperarturbehandlung (Tempern) eingestellt. Ein Fachmann kann ohne weiteres ausgehend von bekannten Nanokristallit- oder Metallkolloid-Farbgläsern mit Hilfe von Routineversuchen und seines allgemeinen Fachwissens das jeweilige Farbglas mit den gewünschten optischen Eigenschaften bereitstellen. Dies gilt für alle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Ein besonders bevorzugter Anwendungsbereich der vorliegend beschriebenen Farbgläser liegt in der Standardisierung von Fluoreszenzsignalen, die bei Mikroarray-Messungen detektiert werden sowie in der Kalibrierung von in diesem Anwendungsbereich eingesetzten Messgeräten, insbesondere Arrayscannern. Demnach wird ein erfindungsgemäßer Mikroarray-Träger mit mindestens einem Fluoreszenzstandard, umfassend ein oder mehrere vorstehend beschriebenes) Farbglas/Farbgläser, bevorzugt mit Mikroarray-Systemen verbunden, die im biologisch-chemischen Bereich angewandt werden. Zu nennen sind hier insbesondere Laser-gestützte Systeme, die vorzugsweise für Hochdurchsatzverfahren ausgelegt sind. Solche Systeme werden üblicherweise in der Materialprüfung, Wirkstofforschung („high throughput screening", HTS) und bei Bindungstests (z.B. DNA- oder Protein-Mikroarrays) eingesetzt.
Bei Mikroarray-Anwendungen werden üblicherweise im sichtbaren Bereich des Lichts bis zum nahen IR emittierende Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt, in dem geeignete Derivate davon an die zu untersuchenden Moleküle gekoppelt werden. Im allgemeinen werden hierzu im Stand der Technik bekannte Fluoreszenzmarker verwendet. Derartige Fluoreszenzmarker sind im Handel, bspw. bei Amersham Bioscience (Piscataway, NJ, USA; http://www.amershambioscience.com), Molecular Probes (Eugene, OR, USA; http://www.probes.com), Sigma-Aldrich (München, Deutschland; http://www.sigmaaldrich.com), Atto-Tec (Siegen, Deutschland; http://www.atto-tec.de) u.v.a., erhältlich. Unter den entsprechenden Internet-Seten der einem Fachmann bekannten Firmen können die spektralen und chemischen Eigenschaften der jeweiligen Fluorophore abgerufen werden.
Im Mikroarray-Anwendungsbereich (Markierung von Biomolekülen, aber auch, wo erwünscht, von kleineren organischen Molekülen, bspw. pharmakologisch zu testenden Verbindungen) werden z.B. oft Texas Rot, Fluorescein, insbesondere Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Rhodamin und entsprechende Derivate, sowie Fluoreszenzmarker der CyDye^®-Serie (Amersham Bioscience) verwendet. Die wesentlichen spektralen Eigenschaften dieser bevorzugt verwendeten Fluorophore sind in der Tab. 2 beispielhaft angegeben.
Besonders bevorzugte Anregungswellenlängen, die bei Mikroarray-Anwendungen gewählt werden, liegen um 530 nm, bspw. 532 nm, sowie um 630 nm, bspw. 635 nm (jeweils üblicherweise ± 15 nm). Die Detektion der Fluoreszenz erfolgt bevorzugt bei Wellenlängen um etwa 580 nm und/oder 680 nm, typischerweise bei 580 nm ± 15 nm und 680 nm ± 15 nm.
Daher wird der im erfindungsgemäßen Mikroarray-Träger vorliegende Standard vorzugsweise mit spektralen Eigenschaften ausgestattet, welche den bei Mikroarray-Experimenten verwendeten Fluorophoren entsprechen. Selbstverständlich können auch Standards aus Massivglas (als solches oder angefügt an geeignete Gegenstände, vorzugsweise aus Glas), Glasfilmen oder Dünngläsern derart ausgestaltet werden, dass das Endprodukt als Standard für verschiedene spektrale Bereiche und/oder Emissionsintesitäten dienen kann. So können zwei oder mehr verschiedene Standards aus Massivglas zusammengefügt (z.B. verklebt) und an Substrate aus Glas oder aus Kunststoff (siehe hierzu auch die obigen Ausführungen), angefügt werden. Es können auch zwei oder mehr verschiedene Standards aus Dünngläsern auf ein geeignetes Substrat aufgebracht werden. Gleiches gilt selbstverständlich für Glasfilme. So können die Signale von zwei oder mehr verschiedenen Fluoreszenzmarkern während eines einzelnen Messvorgangs standardisiert werden, wenn das Array-Messgerät entsprechend ausgelegt ist und emittierte Strahlung in zwei oder mehr verschiedenen Kanälen detektieren kann. Derartige Messungen von Doppel- und Mehrfachmarkierungen werden in der Biochip-Technologie häufig durchgeführt.
Die Bereitstellung von langlebigen und gleich bleibenden Fluoreszenzstandards mit wohl definierten spektralen Eigenschaften ist in der Biochip-Technologie besonders erwünscht. Gerade hier fehlt es den im Stand der Technik bekannten Standards an der Langlebigkeit, Lagerbeständigkeit, chemischen Beständigkeit, Photobeständigkeit und den gleich bleibenden optischen Eigenschaften (sowohl über die Zeit als auch von Standard zu Standard), die für die im erfindungsgemäßen Mikroarray-Träger vorliegenden Farbgläser, deren Eigenschaften ein Fachmann, wie vorstehend erläutert, in weiten Bereichen gezielt steuern kann, kennzeichnend sind.
Weitere spezifische Ausführungsformen des Trägers der vorliegenden Erfindung sind einem Fachmann bekannt. Der Träger wird vorzugsweise geeignete, im Stand der Technik bekannte Beschichtungen, bspw. Silanderivate, Polymerbeschichtungen, einschließlich Hydrogele, aufweisen, um die aufzubringenden Sondenmoleküle auf dem Substrat zu verankern. Der Mikroarray-Träger kann auch zur Aufnahme mehrerer Array-Anordnungen (multiple Arrays) ausgelegt sein.
Vorzugsweise bildet der Fluoreszenzstandard (es können, wie oben beschrieben auch mehrere vorliegen) einen Teil des Substrats, d.h. einen oder mehrere Bereiche der Oberfläche des Mikroarray-Trägers (auf dem bei einem Biochip die Sondenmoleküle aufgebracht werden) aus. Vorzugsweise liegt der/liegen die Standards) in einem oder mehreren Endbereichen) des Substrats vor. Bei einer bevorzugten Form des Mikroarray-Trägers handelt es sich, wie bereits vorstehend ausgeführt, um Objekte, vorzugsweise aus Glas, mit Dimensionen von etwa 75 mm × 25 mm × 1 mm (also einer rechteckige Oberfläche mit 75 mm × 25 mm). Im Fall eines oder mehrerer Standards aus Massivglas kann somit der Träger derart ausgestaltet werden, dass ein entsprechender Endbereich vom Substrat entfernt, bspw. abgeschnitten, und das so entfernte Teilstück durch einen entsprechenden Standard aus Massivglas ersetzt wird (Kleben, Ansprengung etc.). Weitere bevorzugte Ausführungsformen stellen Mikroarray-Träger dar, bei denen der/die Standards) als Glasfilme oder als Dünnglas mindestens bereichsweise auf dem Substrat (das vorzugsweise jedenfalls nicht bei den entsprechenden Wellenlängen des/der Standards) fluoresziert) aufgebracht ist/sind. Vorzugsweise sind dies wiederum ein oder mehrere Rand- oder Endbereiche) des Trägers. Auf der Oberfläche des Substrats, welche zur Aufnahme der Array-Moleküle vorgesehen ist, wird vorteilhafter Weise kein Fluoreszenzstandard vorliegen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Biochip, umfassend einen wie vorstehend definierten Mikroarray-Träger, auf dem ein Mikroarray von Sondenmolekülen aufgebracht ist. Hierzu zählen Protein-Mikroarrays, DNA-Mikroarrays, Saccharid-Mikroarrays usw. Es können auch auf einem Biochip mehrere Mikroarrays aufgebracht sein (multiple Arrays).
Die Figur zeigt:
1 zeigt beispielhafte Ausführungsformen ((A) bis (D)) eines erfindungsgemäßen Mikroarray-Trägers in Aufsicht.
Ein erfindungsgemäßer Mikroarray-Träger (1) umfasst typischerweise ein Substrat (im allgemeinen Glas) (2) auf dem mindestens ein Bereich (3) zur Aufnahme eines Mikroarrays vorgesehen ist. Bei einem erfindungsgemäßen Biochip sind im Mikroarray-Bereich Sondenmoleküle in einer Mikroarrray-Anordnung aufgebracht. In der Auführungsform gemäß 1A ist in einem Endbereich (im vorliegenden Fall eine Schmalseite einer rechteckigen Ausführungsform) des Mikrorarray-Trägers (1) ein Fluoreszenzstandard (4a) aus einem Farbglas aufgebracht (z.B. als Dünnglas oder Glasfilm) oder in Form eines Massivglases an das Substrat (2) angeklebt. Bei einem Substrat mit Dimensionen von etwa 75 × 25 × 1 mm kann ein derartiger Bereich eine Oberfläche von bspw. etwa 2 × 25 mm umfassen. Handelt es sich dabei um einen Massivglasstandard, so wird dieser entsprechende Dimensionen von etwa 2 × 25 × 1 mm aufweisen, wobei dieser nur einen Teil des Mikroarray-Trägers von 75 × 25 × 1 mm ausbilden kann oder an ein Substrat dieser Dimensionierung angefügt (z.B. angeklebt) sein kann. In der Ausführungsform gemäß 1B bildet der Farbglas-Fluoreszenzstandard einen Teil der Schmalseite des Mikroarray-Trägers. Eine derartige Ausführungsform eignet sich vorteilhafter Weise dazu, die Orientierung des Mikroarray-Trägers bzw. des entsprechenden Biochips festzulegen. In einer weiteren Ausführungsform (1C und 1D) sind zwei Fluoreszenzstandards (bspw. Standards verschiedener Absoprtions-/Emissionspektren oder Standards verschiedener Intensität) vorgesehen, wobei die Standards gemäß 1C an einer Schmalseite des Trägers vorliegen (z.B. zwei aneinander geklebte Massivglasstandards oder zwei nebeneinander auf dem nicht-fluoreszierenden Substrat aufgeklebte oder in anderer Weise aufgebrachte Dünngläser oder Glasfilme). Die unterschiedlichen Fluoreszenzstandards können auch auf gegenüberliegenden Seiten des Trägers, wie in 1D gezeigt, vorliegen, wobei es sich in der gezeigten Ausführungsform um die Schmalseiten des Mikroarray-Trägers mit rechteckiger Oberfläche handelt. Selbstverständlich können auch mehr als zwei Fluoreszenzstandards vorgesehen werden, deren Anordnung von den in 1 gezeigten Varianten abweichen kann.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung näher, ohne sie einzuschränken.
Beispiele
Beispiel 1
Herstellung eines Fluoreszenzstandards für einen Mikroarray-Träger als Massivglas Mit den Bestandteilen gemäß nachstehender Tab. 3.2 wird das Orangeglas OG 550 (siehe Beispiel 10) hergestellt, das Nanokristalle der Form CdSeS enthält. Die Bestandteile werden bei etwa 1300°C in einem Tiegel (etwa 1300 mm × 1300 mm × 200 mm) eingeschmolzen (sog. Hafenschmelze) und danach in Formen gegossen sowie ggf. gewalzt. Das Glas wird dann langsam abgekühlt. Bei diesem Abkühlungsprozess bilden sich wenige CdSeS-Aggregate in einer ansonsten amorphen und farblosen Glasmatrix. Während des nachfolgenden Temperns bei etwa 600°C für 1 bis 3 Tage bilden sich CdSeS-Nanokristalle. Im Endprodukt liegen etwa 0,4 Gew.-% Nanokristalle in der Glasmatrix vor. Während des Schmelzvorgangs der Glasbestandteile sublimieren oder zersetzen sich mehr als 80% der Cd-Chalkogenide, weshalb die Cd-, S- und Se-Bestandteile im Überschuss eingesetzt werden.
Beispiele 2 bis 22
Zusammensetzung von Anlaufgläsern als Fluoreszenzstandards für Mikroarray-Träger Die Zusammensetzungen von im roten, orangen und gelben Bereich des sichtbaren Spektrums fluoreszierenden Anlaufgläsern ist nachfolgend in den Tab. 3.1 bis 3.3 angegeben. Mit Ausnahme des Rotglases RG 9 geben die Zahlen im Namen der Gläser jeweils die sog. Kantenwellenlänge (Wellenlänge bei der die Transmission des Glases die Hälfte des Maximalwerts erreicht) an. Gläser mit gleicher Ausgangszusammensetzung jedoch unterschiedlichen spektralen Eigenschaften können durch Variation der Temperbedingungen (Temperatur und Dauer) durch Routineversuche bereitgestellt werden.
Das Farbglas OG 550 (siehe Beispiel 10) eignet sich aufgrund seiner spektralen Eigenschaften besonders zur Anwendung als Fluoreszenzstandard für Mikroarrays.

1: Mikroarray-Träger
2: Substrat
3: Mikroarray-Bereich
4a/b: Farbglasfluoreszenzstandard

Claims

Mikroarray-Träger (1), umfassend ein vorzugsweise im wesentlichen nicht-fluoreszierendes Substrat (2) und mindestens einen Standard für Fluoreszenzmessungen (4a/b), der ein Farbglas enthält.
Mikroarray-Träger (1) nach Anspruch 1, wobei das Farbglas ein Anlaufglas ist.
Mikroarray-Träger (1) nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Farbglas Nanokristalle einer oder mehrerer Halbleiterverbindungen) enthält.
Mikroarray-Träger (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Halbleiterverbindungen) aus Cd-Halbleiterverbindungen und Halbleiterverbindungen der Form M^IM^IIIY^II ₂ ausgewählt ist/sind, wobei M^I Cu⁺ und/oder Ag⁺ M^III In³⁺ und/oder Ga³⁺ und/oder Al³⁺ und Y^II S^2– und/oder Se^2– bedeutet, mit der Maßgabe, dass die Summe der Halbleiterverbdindungen im Glas mindestens 0,1 Gew.-% beträgt.
Mikroarray-Träger (1) nach Anpsruch 3 oder 4, wobei das Farbglas ein Cd-Chalkogenid, insbesondere CdS, CdSe oder CdTe, oder eine Mischverbindung dieser umfasst.
Mikroarray-Träger (1) nach Anspruch 5, wobei das Farbglas CdSeS umfasst.
Mikroarray-Träger (1) nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Farbglas folgende Zusammensetzung (in Gew.-%) aufweist: SiO₂ 30 bis 75 K₂O 5 bis 35 TiO₂ 0 bis 5 F 0,01 bis 10 M^IM^IIIY^II ₂ 0,1 bis 3 wobei: M^I Cu⁺ und/oder Ag⁺ M^III In³⁺ und/oder Ga³⁺ und/oder Al³⁺ und Y^II S^2– und/oder Se^2– bedeutet, sowie gegebenenfalls übliche Läutermittel in üblichen Mengen.
Mikroarray-Träger (1) nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Farbglas folgende Zusammensetzung (in Gew.-%) aufweist: SiO₂ 50 bis 62 ZnO 13,5 bis 37 K₂O 10 bis 25 Na₂O 0 bis 14 Al₂O₃ 0 bis 2 B₂O₃ 3 bis 5 F 0 bis 1 TiO₂ 0 bis 7 In₂O₃ 0 bis 2 SO₃ 0 bis 1 SeO₂ 0 bis 1 C 0 bis 1 M^IM^IIIY^II ₂ 0,1 bis 3 wobei: M^I Cu⁺ und/oder Ag⁺ M^III In³⁺ und/oder Ga³⁺ und/oder Al³⁺ und Y^II S^2– und/oder Se^2– bedeutet, und wobei wenigstens 0,1 Gew.-% des Oxides (M₂O₃) des oder der M^III, das/die in M^IM^IIIY^II ₂ vorliegt/vorliegen und wenigstens 0,2 Gew.-% des Oxides des oder der Y^II ₂, das/die in M^IM^IIIY^II ₂ vorliegt/vorliegen, vorhanden sind, sowie gegebenenfalls übliche Läutermittel in üblichen Mengen.
Mikroarray-Träger (1) nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Farbglas Nanokristalle einer Halbleiterverbindung der Form Culn(Se_1–xS_x)₂, mit x = 0 bis 1, enthält.
Mikroarray-Träger (1) nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Farbglas Nanokristalle einer Halbleiterverbindung der Form CuAl(Se_1–xS_x)₂, mit x = 0 bis 1, enthält.
Mikroarray-Träger (1) nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei das Farbglas die folgende Zusammensetzung (in Gew.-% auf Oxidbasis) aufweist: SiO₂ 40 bis 60 B₂O₃ 5 bis 20 P₂O₅ 0 bis 8 Al₂O₃ 1,5 bis 6,0 Na₂O 4 bis 8 K₂O 6 bis 14 ZnO 4 bis 12 BaO 0 bis 6 CdO 0,2 bis 2,0 S 0,2 bis 1,0 sowie gegebenenfalls übliche Läutermittel in üblichen Mengen.
Mikroarray-Träger (1) nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei das Farbglas die folgende Zusammensetzung (in Gew.-%) aufweist: SiO₂ 40 bis 63 Alkalimetalloxid(e) 8 bis 30 B₂O₃ 0 bis 9 P₂O₅ 0 bis 2,5 Al₂O₃ 0 bis 1,5 ZnO 14 bis 30 TiO₂ 0,9 bis 9 F 0 bis 2 Cd0 0 bis 2,0 CdTe 0 bis 2,5 ZnS 0 bis 1,65 CdS 0 bis 2,0 S 0 bis 0,9 Se 0 bis 0,9 wobei der Gehalt an CdO, CdTe, ZnS, CdS, S und Se oder irgendeiner Kombination dieser mindestens 0,5 Gew.-% beträgt, sowie gegebenenfalls übliche Läutermittel in üblichen Mengen.
Mikroarray-Träger (1) nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei das Farbglas die folgende Zusammensetzung (in Gew.-%) aufweist: SiO₂ 40 bis 63 Alkalimetalloxid(e) 8 bis 30 B₂O₃ 0 bis 9 P₂O₅ 0 bis 2,5 Al₂O₃ 0 bis 1,5 ZnO 14 bis 30 TiO₂ 0,9 bis 9 F 0 bis 2 CdO 0 bis 2,0 CdTe 0 bis 2,5 ZnS 0 bis 1,65 CdS 0 bis 1,0 S 0 bis 0,9 Se 0 bis 0,9 As₂S₃ und/oder As₂S₄ 0 bis 1,5 Sb₂S₃ und/oder Sb₂S₄ 0 bis 1,5 wobei der Gehalt an CdO, CdTe, ZnS, CdS, S und Se oder irgendeiner Kombination davon mindestens 0,5 Gew.-% beträgt, sowie gegebenenfalls übliche Läutermittel in üblichen Mengen.
Mikroarray-Träger (1) nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei das Farbglas die folgende Zusammensetzung (in Gew.-% auf Oxidbasis) aufweist: SiO₂ 30 bis 75 K₂O 5 bis 35 B₂O₃ >4 bis 17 ZnO 5 bis 30 F 0,1 bis 1 CdO 0,1 bis 1 S + Se + Te 0,1 bis 1,5 sowie gegebenenfalls übliche Läutermittel in üblichen Mengen.
Mikroarray-Träger (1) nach einem der Ansprüche 3 bis 14, wobei die Nanokristalle einen Durchmesser von nicht mehr als etwa 10 nm, vorzugsweise zwischen etwa 3 und etwa 10 nm, aufweisen.
Mikroarray-Träger (1) nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Farbglas ein Metallkolloidglas ist.
Mikroarray-Träger (1) nach Anspruch 15, wobei das Metallkolloidglas ein Cu- oder Au-dotiertes Farbglas ist.
Mikroarray-Träger (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das Farbglas ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge zwischen etwa 320 nm und etwa 1200 nm, vorzugsweise zwischen etwa 480 und etwa 750 nm aufweist.
Mikroarray-Träger (1) nach Anspruch 18, wobei das Farbglas ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 320 ± 15 nm, 532 ± 15 nm oder 645 ± 15 nm aufweist.
Mikroarray-Träger (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei das Farbglas ein Fluoreszenzemissionsmaximum bei einer Wellenlänge zwischen etwa 380 und etwa 850 nm, vorzugsweise zwischen etwa 500 und etwa 770 nm, aufweist.
Mikroarray-Träger (1) nach Anspruch 20, wobei das Farbglas ein Fluoreszenzemissionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 380 ± 15 nm, 580 ± 15 nm oder 680 ± 15 nm aufweist.
Mikroarray-Träger (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei der Standard (4a/b) flächig als Massivglas, Glasfilm oder Dünnglas vorliegt.
Mikroarray-Träger (1) nach Anspruch 22, wobei der Massivglasstandard (4a/b) einen Teil des Substrats (2) bildet.
Mikroarray-Träger (1) nach Anspruch 23, wobei der Massivglasstandard (4a/b) mindestens einen Endbereich des Trägers (1) ausbildet.
Mikroarray-Träger (1) nach Anspruch 22, wobei der Glasfilm oder das Dünnglas bereichsweise auf dem Substrat (2) aufgebracht ist.
Mikroarray-Träger (1) nach Anspruch 25, wobei der Glasfilm oder das Dünnglas in mindestens einem Endbereich des Substrats (2) aufgebracht ist.
Mikroarray-Träger (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 26, umfassend zwei oder mehr Fluoreszenzstandards (4a, 4b).
Mikroarray-Träger (1) nach Anspruch 27, wobei die Fluoreszenzstandards (4a, 4b) unterschiedliche Fluoreszenzspektren und/oder -intensitäten aufweisen.
Mikroarray-Träger (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 28, wobei der/die Fluoreszenzstandard(s) (4a/b) ein Fluoreszenzmaximum/Fluoreszenzmaxima und/oder eine Fluoreszenzintensität/Fluoreszenzintensitäten aufweist/aufweisen, das/die um weniger als 20%, vorzugsweise weniger als 10%, mehr bevorzugt weniger als 5%, insbesondere weniger als 1 %, von der Fluoreszenzwellenlänge/den Fluoreszenzwellenlängen bzw. der mittleren Fluoreszenzintensität/den mittleren Fluoreszenzintensitäten abweichen, welche bei einem mit dem Mikroarray-Träger (1) durchgeführten Mikroarray-Experiment verwendet/gemessen werden.
Biochip, umfassend einen Mikroarray-Träger (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 29 und ein oder mehrere auf dem Träger aufgebrachte Mikroarrays von Sondenmolekülen.