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DE20116589U1 - Vorrichtung zur Extraktion elektrisch geladener Moleküle - Google Patents

Vorrichtung zur Extraktion elektrisch geladener Moleküle

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DE20116589U1
DE20116589U1 DE20116589U DE20116589U DE20116589U1 DE 20116589 U1 DE20116589 U1 DE 20116589U1 DE 20116589 U DE20116589 U DE 20116589U DE 20116589 U DE20116589 U DE 20116589U DE 20116589 U1 DE20116589 U1 DE 20116589U1
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matrices
container
agarose
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samples
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    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/405—Concentrating samples by adsorption or absorption
    • G—PHYSICS
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Description

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Vorrichtung zur Extraktion elektrisch geladener Moleküle
Beschreibung:
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Extraktion elektrisch geladener Moleküle.
Es besteht in vielen Bereichen der Analytik ein Bedürfnis nach neuen Vorrichtungen und Verfahren, die eine schnelle Analyse kleiner Probenvolumina ermöglichen. Beispielhaft zu nennen sind hier die medizinische Diagnostik, insbesondere die Identifizierung von Krankheitserregern in der Intensivmedizin, die Analyse von Bodenproben auf Kontaminationen, die Lebensmittelüberwachung und die Identifizierung von Keimen in Wasser, insbesondere bei der Überprüfung von Trinkwasser und Reinstwässern in der pharmazeutischen Industrie.
Die herkömmliche Analytik mittels beispielsweise chromatographischer Verfahren erfordert große Probenvolumina und häufig eine aufwendige Vorreinigung des Untersuchungsgutes. Daher läßt sich eine chemische oder biologische Kontamination meist nicht vor Ort nachweisen, z. B. auf der Mülldeponie, in einem möglicherweise von Schimmelpilzen befallenen Haus, direkt am Krankenbett eines Patienten oder in einem Flüchtlingslager, in dem sich eine Seuche auszubreiten droht. Die Proben müssen in ein Labor gebracht, dort untersucht und ausgewertet werden. Es verstreicht wertvolle Zeit, während derer eine Umweltverschmutzung fortschreiten, oder ein Patient im schlimmsten Fall versterben kann, bevor die notwendigen Hilfsmaßnahmen eingeleitet werden können.
Moderne Analysechips ermöglichen allerdings, auch sehr kleine Mengen eines Analyten präzise zu bestimmen, vorausgesetzt, der Analyt wird mit hinreichender Reinheit auf den Chip aufgebracht. Um diese Reinheit zu gewährleisten, muß auf umständliche Reinigungstechniken zurückgegriffen werden, wie Filtra-
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tion oder chromatographische Auftrennung. Handelt es sich bei dem Analyten um Proteine oder Nukleinsäuren aus Organismen, müssen diese oftmals in Vorkultur genommen werden, um nach einigen Vermehrungszyklen die nötige Menge des Analyten zu gewinnen.
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Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine neue Vorrichtung bereitzustellen, die es ermöglicht, Analyten schnell aus Proben zu extrahieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zur Extraktion elektrisch geladener Moleküle, umfassend
a) Einen ersten Behälter (2), der durch eine Trennstruktur (2.2), die für die zu extrahierenden Moleküle permeabel ist, in zwei Kompartimente unterteilt wird, nämlich in
i einen Probenfüllraum (2.1) und
ii eine Matrix (2.3),
b) eine in den Probenfüllraum (2.1) hineinragende erste Elektrode (1.1),
c) einen weiteren Behälter (4) zur Aufnahme der extrahierten Moleküle sowie
d) eine weitere Elektrode (4.1), die in elektrischem Kontakt mit dem Inhalt des Behälters (4) steht,
Die erfindungsgemäße Vorrichtung nutzt den Umstand, daß viele bedeutsame Analyten elektrisch geladene Moleküle sind, die durch Anlegen eines elektrisehen Feldes mobilisiert werden und durch eine Filter- oder Trennmatrix geleitet werden können.
Der Extraktion mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind grundsätzlich alle Moleküle zugänglich, die elektrisch geladen sind und eine Filter- oder Trennmatrix passieren können. Entsprechend zugängliche Moleküle sind beispielsweise elektrisch geladene Makromoleküle, insbesondere Biopolymere wie DNA, RNA, PNA, (als Einzelstränge, Duplexe, Triplex-Strukturen oder Kombi-
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nationen hiervon), oder Proteine (z. B. Antikörper, Antigene, Rezeptoren); aber auch Saccharide, Nukleotide, Peptide, und Derivate der kombinatorischen Chemie (z. B. geladene organische Moleküle). Auch Kunststoffe mit polaren Gruppen, wie beispielsweise Polyamine sind der Extraktion mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung zugänglich. Gleiches gilt für niedermolekulare Verbindungen, wie verschiedene Vitamine, oder chemische Kampfstoffe, z. B. Senfgas, Sarin, Soman, Tabun, oder VX, und auch für Metalle sowie metallorganische Verbindungen wie z.B. Zinn-organische Verbindungen mit z.T. erheblicher Toxizität (CD Römpp Chemie Lexikon - Version 1.0 Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag 1995)
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist vorzugsweise so ausgeführt, daß die zu extrahierenden Moleküle in einem zwischen den Elektroden (1.1) und (4.1) angelegten elektrischen Feld aus dem Probenfüllraum (2.1) in den Behälter (4) wandern. Hierzu wird gegebenenfalls, beispielsweise bei einer trockenen Probe, eine geeignete Pufferlösung in den Probenfüllraum gegeben und mit der Probe vermischt. Als Pufferlösung sind übliche Elektrophoresepuffer einsetzbar, die dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise &Egr;-Puffer (4OmM Tris-HCUOmM NaO-Acetat. 1mM EDTA, pH 8.3 in Wasser), oder TBE-Puffer (13OmM Tris-HCI, 45mM Borsäure, 2,5 mM Di-Natrium-EDTA, pH 8,8 in Wasser).
Diese elektroforcierte Extraktion bewirkt eine rasche Anreicherung des Analyten in dem Behälter (4).
Die Elektroden (1.1) und (4.1) können aus demgleichen oder aus unterschiedlichen Materialien bestehen. Geeignete Elektroden-Materialien sind dem Fachmann bekannt und können je nach Art der zu extrahierenden Moleküle variiert werden. Bei der Auswahl der Elektroden-Materialien muß beachtet werden, daß der Analyt, oder der Puffer nicht mit den Elektroden-Materialien reagieren dürfen. Bevorzugte Materialien sind Edelmetalle, wie Gold oder Platin, aber auch
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unedle Metalle wie Kupfer, Silber, oder Chrom bzw. metallische Legierungen wie Stahl, oder auch Silizium und Siliziumverbindungen
Die Trennstruktur (2.2) dient dem Zweck, grobe Verunreinigungen aus der Probe zurückzuhalten. Der Fachmann kann hierzu jede geeignete Sieb- oder Grobfilterstruktur einsetzen, beispielsweise ein Sieb, einen Filter oder eine Fritte. Besonders geeignete Trennstrukturen sind beispielsweise Stahl- oder Edelmetallsiebe, wie auch Fritten aus Keramik oder gesintertem Glasgranulat.
Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, daß die weitere Elektrode (4.1) durch eine feinporöse Schutzschicht (4.2) von den extrahierten Molekülen in dem Behälter (4) getrennt ist. Diese Schutzschicht verhindert, daß die Moleküle des Analyten in direkten Kontakt mit der Elektrode (4.1) kommen und dadurch möglicherweise elektrochemisch verändert werden. Die Art der eingesetzten feinporösen Schutzschicht kann durch den Fachmann variiert werden. Geeignete Schutzschichten (4.2) sind beispielsweise Zellulosemembranen. In Abhängigkeit von den zu extrahierenden Analyten kann eine Membran mit geeigneter Porengröße gewählt werden.
Für die elektroforcierte Extraktion von Proteinen oder Nukleinsäuren, insbesondere von DNA, RNA, oder PNA, vorzugsweise von DNA, eignen sich besonders Dialyseschläuche (bzw. Stücke davon) aus Zellulose oder benzoylierter Zellulose, die Moleküle oberhalb eines MWCO (Molecular Weight Cut Off) von 1.200 bis 12.000 zurückhalten können. Solche Schläuche sind beispielsweise von der Firma Sigma-Aldrich (Deisenhofen) unter der Bezeichnung „Dialysis sacks" Katalog „Biochemikalien + Reagenzien 2000/2001", Katalognummer: 250-7U bzw. 250-9U, erhältlich. Gleichfalls geeignet sind Filter auf Zellulosebasis, die Moleküle oberhalb eines MWCO (Molecular Weight Cut Off) von 5.000 bis 100.000 zurückhalten können. Solche Filter sind beispielsweise von der Firma Carl Roth GmbH (Karlsruhe) unter der Bezeichnung ZelluTrans (regenerierte Zellulose, Filterbereiche MWCO 4000 bis 6000, 8000 bis 10000, 12000 bis 14000, 25000), Spectra/Por (Zelluloseester, Filterbereich von
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MWCO 100 bis zu MWCO 300.000); oder Nadir (Zellulosehydrat, MWCO 10.000 bis 20.000, mittlere Porengröße 25-30 Angstrom) erhältlich. Besonders bevorzugt für die elektroforcierte Extraktion von Proteinen oder Nukleinsäuren, insbesondere von DNA, RNA, oder PNA, vorzugsweise von DNA sind die ZeI-luTrans-Filter der Firma Carl Roth GmbH (Karlsruhe) mit einem MWCO von 8.000 bis 10.000 oder 12.000 bis 14.000 sowie die Dialyseschläuche, die von der Firma Sigma-Aldrich (Deisenhofen) unter der Bezeichnung „Dialysis sacks" Katalog „Biochemikalien + Reagenzien 2000/2001", Katalognummer: 250-7U bzw. 250-9U1 erhältlich sind.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann zusätzlich eine auf den Behälter (2) aufsteckbare oder aufschraubbare Kappe (1) aufweisen, an oder in der die erste Elektrode (1.1) befestigt ist. Die Kappe kann ihrerseits ein Septum (1.2) aufweisen, dass oft aus Silikon oder Gummi hergestellt wird und sowohl als Überdruckventil, als auch zum sterilen Befüllen des Probenfüllraumes (2.1) Verwendung finden kann.
Vorzugsweise ist der Behälter (4) reversibel an dem Behälter (2) befestigt, insbesondere aufgesteckt oder aufgeschraubt, besonders bevorzugt mittels eines Adapters (3), ganz besonders bevorzugt mittels eines LuerLock-Adapters.
Die Kappe (1), der Behälter (2), der Adapter (3) und der Behälter (4) können aus demgleichen Material oder aus unterschiedlichen Materialien bestehen. Geeignete Materialien sind dem Fachmann bekannt und können je nach Art der zu extrahierenden Moleküle variiert werden. Bei der Auswahl der Materialien muß beachtet werden, daß der Analyt, oder der Puffer nicht mit den Materialien reagieren dürfen. Außerdem dürfen die eingesetzten Materialien nicht leitfähig sein. Bevorzugte Materialien sind Kunststoffe, Glas, Keramik, Porzellan und auch entsprechend beschichtete Metalle oder metallische Werkstoffe, z. B.
Stahl mit Kunstoff-Innenbeschichtung.
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Die Matrix (2.3) ist vorzugsweise homogen, d. h. sie besteht durchgehend aus einem Material. Sie kann aber auch heterogen aufgebaut sein, beispielsweise in Schichten aus verschiedenen Materialien. Geeignete Matrix-Materialien sind alle üblichen in der Chromatographie oder Elektrophorese eingesetzten Trennmaterialien, die durch den Fachmann in Abhängigkeit von den zu extrahierenden Analyten ausgewählt werden. Bevorzugte Matrix-Materialien für die elektroforcierte Extraktion von Proteinen oder Nukleinsäuren, insbesondere von DNA, RNA, oder PNA, vorzugsweise von DNA sind ausgewählt unter:
a) Gelfiltrations-Matrices, insbesondere unter Agarose-Gelen, Dextran-Gelen, oder gemischten Agarose-Dextran-Gelen, vorzugsweise unter den als Sephadex-, Sephacryl-, PDX-, Sepharose-, Sepharose CL-, Superdex-, Superose- oder Toyopearl HW-GeI bekannten Matrices.
b) lonenaustausch-Matrices, insbesondere unter solchen auf der Basis von Dextran, Agarose, Cellulose oder Polystyrene, vorzugsweise unter solchen mit
i Anionenaustauschem, die ausgewählt sind unter folgenden Gruppen: Diethylaminoethyl-, „Q" = Trimethylaminoethyl- und „QAE" = Hydroxypropyldiethylaminoethyl-
ii Kationenaustauschern, die ausgewählt sind unter folgenden
Gruppen: Carboxymethyl-, Sulfomethyl- und Sulfopropyl-
c) Polyacrylamid-Elektrophorese-Gelen
d) Agarose- Elektrophorese-Gelen
Besonders bevorzugte Matrix-Materialien für die elektroforcierte Extraktion von Proteinen oder Nukleinsäuren, insbesondere von DNA, RNA, oder PNA, vorzugsweise von DNA sind ausgewählt unter:
e) Gelfiltrations-Matrices mit einem Trennbereich von 0,7 bis 400 &khgr; 105 MW, insbesondere unter den als Sepharose 2B oder Sepharose 2B Cross-linked bekannten Matrices, mit einem wet bead diameter von 60
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bis 200 &mgr;&eegr;&igr; (erhältlich von Sigma, Deisenhofen, „Biochemikalien + Reagenzien 2000/2001", Cat-No: 2B-300 bzw. CL-2B-300).
f) Gelfiltrations-Matrices mit einem Trennbereich von 0.5 bis 50 &khgr; 106 MW, insbesondere unter den als Toyopearl HW-75F bekannten Matrices mit einem dry bead diameter von 30 bis 60 pm (erhältlich von Sigma, Deisenhofen, „Biochemikalien + Reagenzien 2000/2001", Cat-No:8-07469).
g) lonenaustausch-Matrices, insbesondere unter solchen auf der Basis von Agarose mit starken Kationenaustauschern, vorzugsweise unter den als SP-Sepharose bekannten Matrices mit einer wet bead size von 45 bis 165 &mgr;&eegr;&tgr;&igr; (erhältlich von Sigma, Deisenhofen, „Biochemikalien + Reagenzien 2000/2001", Cat-No: S. 1799 ff),
h) Polyacrylamid-Elektrophorese-Gelen mit einer Konzentration von 2 bis
30 Gew-% Polyacrylamid, vorzugsweise 2 bis 10 Gew-% Polyacrylamid, i) Agarose- Elektrophorese-Gelen mit einer Konzentration von 0,2 bis 4 Gew-% Agarose, vorzugsweise 0,3 bis 0,8 Gew-% Agarose.
Vorzugsweise erstreckt sich die Matrix (2.3) in den Behälter (4). In diesem Fall sind die Materialien der Matrices (2.3) und (4.3) identisch. Die Matrices können jedoch auch voneinander verschieden sein. Es kann auch eine leitende Verbindung durch den verwendeten Elekrtophosepuffer bestehen, wenn sich die Matrix (2.3) nicht in den Behälter (4) erstreckt. Die Matrix (4.3) kann daher auch vollständig fehlen und beispielsweise durch Pufferlösung ersetzt sein.
Die mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung extrahierten Analyten können aufgrund ihrer Reinheit und hohen Konzentration direkt in oder auf eine geeignete Analysevorrichtung ein- oder aufgebracht werden, beispielsweis auf einen Analysechip, oder in einen tragbaren Gaschromatographen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist insbesondere auf dem Gebiet des Umweltschutzes, der Toxikologie, der Diagnostik bei Menschen, Pflanzen oder Tieren, der Lebensmittel- und Trinkwasseruntersuchung, der Qualitätskontrolle von Rohstoffen, Zwischenprodukten und Endprodukten der pharmazeutischen,
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kosmetischen und der Lebensmittelindustrie sowie der Abwehr terroristischer Angriffe mit biologischen oder chemischen Kampfmitteln verwendbar.
Liste der Bezugszeichen: 5
1. Kappe
1.1. erste Elektrode mit Kontakt
1.2. Septum
2. erster Behälter 2.1. Probenfüllraum
2.2. Trennstruktur
2.3. Matrix
3. Adapter
4. weiterer Behälter
4.1. weitere Elektrode mit Kontaktpunkt
4.2. feinporöse Schutzschicht
4.3. Matrix
Die Figuren (Zeichnungen) verdeutlichen die Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken:
Figur 1 zeigt eine mögliche Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
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Figur 2 zeigt in einer detaillierten Ausschnittsvergrößerung aus Figur 1 den Behälter (4).

Claims (13)

1. Vorrichtung zur Extraktion elektrisch geladener Moleküle, umfassend
a) Einen ersten Behälter (2), der durch eine Trennstruktur (2.2), die für die zu extrahierenden Moleküle permeabel ist, in zwei Kompartimente unterteilt wird, nämlich in
1. i einen Probenfüllraum (2.1) und
2. ii eine Matrix (2.3),
b) eine in den Probenfüllraum (2.1) hineinragende erste Elektrode (1.1),
c) einen weiteren Behälter (4) zur Aufnahme der extrahierten Moleküle sowie
d) eine weitere Elektrode (4.1), die in elektrischem Kontakt mit dem Inhalt des Behälters (4) steht,
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die weitere Elektrode (4.1) durch eine feinporöse Schutzschicht (4.2) von den extrahierten Molekülen in dem Behälter (4) getrennt ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich eine auf den Behälter (2) aufsteckbare oder aufschraubbare Kappe (1) aufweist, an oder in der die erste Elektrode (1.1) befestigt ist.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kappe ein Septum (1.2) aufweist.
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälter (4) reversibel an dem Behälter (2) befestigt ist, vorzugsweise aufgesteckt oder aufgeschraubt, besonders bevorzugt mittels eines Adapters (3), ganz besonders bevorzugt eines LuerLock-Adapters.
6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix (2.3) aus einem Material besteht, das ausgewählt ist unter:
a) Gelfiltrations-Matrices, insbesondere unter Agarose-Gelen, Dextran- Gelen, oder gemischten Agarose-Dextran-Gelen, vorzugsweise unter den als Sephadex-, Sephacryl-, PDX-, Sepharose-, Sepharose CL-, Superdex-, Superose- oder Toyopearl HW-Gel bekannten Matrices.
b) Ionenaustausch-Matrices, insbesondere unter solchen auf der Basis von Dextran, Agarose, Cellulose oder Polystyrene, vorzugsweise unter solchen mit
1. i Anionenaustauschern, die ausgewählt sind unter folgenden Gruppen: Diethylaminoethyl-, "Q" = Trimethylaminoethyl- oder "QAE" = Hydroxypropyldiethylaminoethyl-
2. ii Kationenaustauschern, die ausgewählt sind unter folgenden Gruppen: Carboxymethyl-, Sulfomethyl- und Sulfopropyl-
c) Polyacrylamid-Elektrophorese-Gelen
d) Agarose-Elektrophorese-Gelen
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix (2.3) aus einem Material besteht, das ausgewählt ist unter:
a) Gelfiltrations-Matrices mit einem Trennbereich von 0,7 bis 400 × 105 MW, insbesondere unter den als Sepharose 2B oder Sepharose 2B Cross-linked bekannten Matrices, mit einem wet bead diameter von 60 bis 200 µm
b) Gelfiltrations-Matrices mit einem Trennbereich von 0.5 bis 50 × 106 MW, insbesondere unter den als Toyopearl HW-75F bekannten Matrices mit einem dry bead diameter von 30 bis 60 µm
c) Ionenaustausch-Matrices, insbesondere unter solchen auf der Basis von Agarose mit starken Kationenaustauschern, vorzugsweise unter den als SP-Sepharose bekannten Matrices mit einer wet bead size von 45 bis 165 µm.
d) Polyacrylamid-Elektrophorese-Gelen mit einer Konzentration von 2 bis 30 Gew-% Polyacrylamid, vorzugsweise 2 bis 10 Gew-% Polyacrylamid.
e) Agarose-Elektrophorese-Gelen mit einer Konzentration von 0,2 bis 4 Gew-% Agarose, vorzugsweise 0,3 bis 0,8 Gew-% Agarose.
8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Materialien der Matrices (2.3) und (4.3) identisch sind.
9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zu extrahierenden elektrisch geladenenen Moleküle ausgewählt sind unter
a) elektrisch geladenen Makromolekülen, insbesondere
1. i Biopolymeren wie DNA, RNA, PNA, (als Einzelstränge, Duplexe, Triplex-Strukturen oder Kombinationen hiervon), oder Proteinen (z. B. Antikörper, Antigene, Rezeptoren);
2. ii Kunststoffen mit polaren Gruppen, wie beispielsweise Polyamine,
b) niedermolekularen Verbindungen, wie Saccharide, Nukleotide, Peptide, und Derivate der kombinatorischen Chemie (z. B. geladene organische Moleküle), Vitamine, oder chemische Kampfstoffe, z. B. Senfgas, Sarm, Soman, Tabun, oder VX,
c) Metallen sowie metallorganischen Verbindungen wie z. B. Zinnorganischen Verbindungen.
10. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion aus Proben erfolgt, insbesondere aus Proben, die ausgewählt sind unter Staub-, Luft-, Boden-, Wasser-, Lebensmittel-, oder medizinischen Proben, vorzugsweise aus Proben, die ausgewählt sind unter Blut-, Serum-, Sputum-, Sperma-, Liquor, Stuhl-, oder Urinproben sowie aus Proben von Trachealsekret, Bronchiallavage, oder Bronchoalveolärelavage.
11. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden (1.1) und (4.1) gleich oder verschieden sind und aus Materialien bestehen, die ausgewählt sind unter Edelmetallen, wie Gold oder Platin, aber auch unedlen Metallen wie Kupfer, Silber, oder Chrom bzw. metallischen Legierungen wie Stahl, oder auch Silizium und Siliziumverbindungen.
12. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennstruktur (2.2) ausgewählt ist unter Sieb- oder Grobfilterstrukturen, insbesondere Sieben, Filtern oder Fritten, vorzugsweise Stahl- oder Edelmetallsieben, oder Fritten aus Keramik oder gesinterten Glasperlen.
13. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die feinporöse Schutzschicht (4.2) eine Zellulosemembran ist.
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