DE19803077C1 - Verfahren zur Herstellung von Testkörpern zum spezifischen Nachweis einzelner Reaktanden von Rezeptorsubstanz-Ligandensubstanz Komplexen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Testkörpern zum spezifischen Nachweis einzelner Reaktanden von Rezeptorsubstanz-Ligandensubstanz KomplexenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Testkörpern
(Stacked-Layer-Chips (SL-Chips)) zum spezifischen Nachweis einzelner Reaktanden von
Rezeptorsubstanz-Ligandensubstanz Komplexen gemäß Oberbegriff des
Patentanspruchs 1.
Die Erfindung findet Anwendung im Bereich der medizinischen Diagnostik, der
Lebensmittelüberwachung, der Umweltanalytik, der molekularbiologischen
Analytik, sowie bei der Entwicklung pharmazeutischer Präparate.
Bisher werden bei der parallelen Untersuchung von Substanzgemischen oft
filterbasierte Testsysteme angewendet. Im Falle von Gemischen aus
verschiedenen DNA-Fragmenten, setzt man zur Analyse häufig membranbasierte
Verfahren wie Southern-Blots [1], Northern-Blots [2], Western-Blots [3, 4],
Dot-Blots [5, 6] bzw. Slot-Blots oder andere flächenhaft ausgeführte Testkörper [10]
ein, die teilweise als DNA-Mikrochips bezeichnet werden. Letztere verfügen über
eine Vielzahl geordnet immobilisierter Reaktanden auf kleinsten Flächen, die den
sequenzspezifischen Nachweis von Nukleinsäuren erlauben. Die entsprechenden
Testkörper werden flächenhaft auf geeigneten Unterlagen aufgebaut. Dazu
werden Oligonukleotide durch geeignete Verfahren in situ an festgelegten
Positionen auf flächenhaften Unterlagen synthetisiert [7] oder mit physikalischen
Methoden wie z. B. modifizierten Tintenstrahldruckern [8] aufgebracht. Auch
Methoden zur Synthese verschiedener immobilisierter Peptide auf einer Fläche
und einem nachfolgenden Analyseprozeß auf dieser Fläche sind bekannt [9].
In den folgenden Literaturstellen ist der zitierte Stand der Technik beschrieben:
- 1. Southern, E.M.
Detection of specific sequences among DNA-fragments separated by gel electrophoresis.
J. Mol. Biol. (1975); 98: 503, - 2. Thomas P.S.
Hybridization of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980); 77(9): 5201-5205, - 3. Burnette N.W.
Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecylsulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem. (1981); 112: 195-203, - 4. Beisiegel U, Schneider W.J., Brown M.S, Goldstein J.L
Immunoblot analysis of low density lipoprotein receptors in fibroblasts from subjects with familial hypercholesterolemia. J. Biol. Chem. (1982); 257(21): 13150-13156, - 5. Kafatos F.C., Jones C.W., Efstratiadis A.
Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure Nucleic Acids Res. (1979); 7: 1541-1552, - 6. Dyson N.J.
Immobilization of nucleic acids and hybridization analysis. In: Essential molecular biology: A practical approach.
Vol. 2 (T.A. Brown, ed.), 111-156, IRL Press, Oxford, - 7. Hubbell E.A., Lipshutz R.J., Morris M., Winkler J.L.
Computer-aided engineering system for design of sequence arrays and lithographic masks
Patent Nummer: 5593839
Offenlegungstag: 02.06.1995
Land: US, - 8. Wallace R.W.
DNA on a chip: serving up the genome for diagnostics and research Molecular Medicine Today (1997), 3(9): 384-389, - 9. Hudson D., Johnson C.R., Giebel L.
Method and apparatus for peptide synthesis and screening Patent Nummer: 5591646
Offenlegungstag: 07.01.1997
Land: US, - 10. Wölfl S.
Optischer Nachweis von Hybridisierungssignalen
Patent Nummer: 196 12 356 A1
Offenlegungstag: 02.10.1997
Land: Deutschland.
Die geordnete Immobilisierung einer großen Zahl von Nukleinsäuren, Proteinen
oder anderen bindungsfähigen Substanzen ist derzeit nur unter hohen Kosten
und erheblichem apparativen Aufwand möglich.
Hier will die Erfindung Abhilfe schaffen.
Der in den Patentansprüchen angegebenen Erfindung liegt das Problem
zugrunde, ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur geordneten
Immobilisierung verschiedener bindungsfähiger Substanzen auf engstem Raum
zu schaffen.
Erfindungsgemäß wird das Problem durch die in den Patentansprüchen
dargelegten Merkmale gelöst.
Erfindungswesentlich ist die Verwendung einer makroskopischen Anordnung zur
Herstellung dreidimensionaler mikroskopischer Strukturen. Dazu werden die
immobilisierbaren Reaktanden jeweils an geeignetes Matrixmaterial gebunden
und jeweils schichtweise aufeinander angeordnet. Der geringste Abstand
zwischen zwei immobilisierten Reaktanden wird nur durch die technisch
erreichbare minimale Schichtdicke bestimmt. Im Gegensatz zu den bisher
bekannten Verfahren ist die flächenhafte Ausdehnung des substanzbindenden
Bereiches nicht limitierend, so daß die beschriebenen Vorrichtungen in großer
Formenvielfalt und mit variablen äußeren Abmessungen hergestellt werden
können.
Der Nachweis bindender Substanzen erfolgt unter Verwendung geeigneter
Nachweissysteme nach einer Bindungsreaktion gegen immobilisierte Reaktanden
auf den Schnittflächen des dreidimensionalen Objektes. Die Schnitte sind dabei
so zu führen, daß die nachweisrelevanten Schichten der dreidimensionalen
Anordnung freigelegt und für das Substanzgemisch zugänglich werden. Zur
Freilegung der Schichten können physikalische oder chemische Verfahren zur
Anwendung kommen. Im Gegensatz zu den bekannten flächenhaft ausgeführten
Anordnungen können zu analysierende Substanzen nicht nur an die
Schnittfläche selbst, sondern auch an die Flächen binden, die in die Tiefe des
dreidimensionalen Objektes weisen.
Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist die Möglichkeit zur Immobilisierung von
Reaktanden mit unterschiedlicher chemischer Grundstruktur durch die Variation
der Testkörpermatrix unter Beibehaltung der Testkörpergeometrie.
Die Erfindung wird an einem Beispiel in den nachfolgenden Schritten näher
erläutert. Die beigefügte Zeichnung zeigt ein Strukturbild des SL-Chips aus dem
Beispiel.
- 1. Nylonmembranen wurden entweder mit alkalisch denaturierter DNA des Phagen Lambda oder mit ebenfalls alkalisch denaturierter genomischer DNA aus Hühnererythrozyten beschickt und durch UV-Licht fixiert. Die einzelnen Membranen hatten jeweils eine Flächengröße von 1 cm × 2 cm.
Die Verwendung von Nylonmembranen stellt nur eine Möglichkeit zur
Matriximmobilisierung von DNA dar. Generell sind alle
Immobilisierungsmethoden verwendbar, die zur Konstruktion von Objekten
nach Patentanspruch 1-2 geeignet sind und die an ihren Schnittflächen die
Bindung und Detektion von Substanzen durch geeignete Nachweissysteme
erlauben.
- 2. Die Membranen wurden mit Kontaktkleber nach Angaben des Herstellers aufeinander verklebt, so daß sich ein Membranobjekt mit den Maßen 2 cm × 1 cm und einer Dicke von insgesamt 2 mm ergab.
Die Verwendung des Kontaktklebstoffes ist erfindungsgemäß nicht zwingend
notwendig. Neben der Verwendung anderer Klebstoffe kann auch eine
physikalische Fixierung der Membranschichten erfolgen. Auch kann die
Unterscheidung zwischen Matrix und Klebstoff entfallen. Generell sind alle
Methoden verwendbar, die zur Konstruktion von Objekten nach
Patentanspruch 1-2 geeignet sind und die an ihren Schnittflächen die Bindung
und Detektion von Substanzen durch geeignete Nachweissysteme erlauben.
- 3. Vom Membranobjekt wurden 1 cm lange und 2 mm breite Stücke abgeschnitten. Diese Objektstücke enthielten jeweils Schnittflächen aller verklebten Membranen.
Die angegebenen geometrischen Formen und Maße sind nicht bindend. Die
Parameter können je nach Anwendungszweck und dem zur Verfügung
stehenden Auswertegerät angepaßt werden.
- 4. Ein Objektstück wurde über Nacht mit einer Lambda-spezifischen DNA-Sonde hybridisiert, die zuvor mit Fluorescein-12-dGTP markiert worden war. Nach dem Waschen fluoreszierte nur die mit Lambda-DNA beschickte Membranschicht des Objektstückes. Zur Beobachtung diente ein Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung geeigneter Objektive und eines geeigneten Filtersatzes.
Die Nachweis- und Detektionsmethoden beschränken sich nicht auf die hier
beschriebene. Je nach gebundener Substanz müssen geeignete und
spezifische Methoden ausgewählt werden.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von Testkörpern (Stacked-Layer-Chips (SL-Chips))
zum spezifischen Nachweis einzelner Reaktanden von Rezeptorsubstanz-Li
gandensubstanz Komplexen, dadurch gekennzeichnet,
- a) daß immobilisierte Reaktanden jeweils an geeignetes Matrixmaterial gebunden und dreidimensional, schichtweise aufeinander angeordnet sind,
- b) daß der geringste Abstand zwischen zwei immobilisierten Reaktanden durch die technisch erreichbare minimale Schichtdicke bestimmt ist,
- c) daß geeignete Schnittflächen durch die dreidimensionale Anordnung der Reaktandenschichten zum Nachweis von Bindungspartnern dienen und
- d) daß weitere Schichten verwendet werden, deren Schnittflächen nicht der Bindung von Bindungspartnern dienen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
- a) daß Nukleinsäuren oder Proteine,
- b) daß Desoxyribonukleinsäuren, Ribonukleinsäuren sowie ihre natürlich vorkommenden oder synthetischen Derivate oder Analoga jeweils in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form,
- c) daß natürlich vorkommende oder synthetische Derivate oder Analoga von Proteinen und Peptiden verwendet werden,
- d) daß Reaktanden immobilisiert werden, deren chemische Grundstruktur sich von Proteinen oder Nukleinsäuren unterscheidet.
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