DE2001734A1 - Chemische Verfahren und Produkte - Google Patents

Description

Patentanwälte Dr. Ing. Walter Abitz Dr. Dieter R Morf Dr. Hans-A. Brauns 8MOOGiMn 86, Pi«nzensuerstr.28

15. Januar I97O 12530

MERCK & CO. INC. Rahway, New Jersey 07065 / USA

Cheoieohe Verfahren und Produkte

Die vorliegende Erfindung betrifft die Induzierung der Bildung von Sub·tanzen, die Virenwaobetun inhibieren, beispielsweise von Interferone^ in vivo und in vitro durch Verwendung von komplexen Polymerisaten sowie die Induzierung von Beständigkeit gegenüber Vireninfektion in vivo und

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in vitro durch Verabreiohung dieser komplexen Polymerisate.

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Induzierung der Interferonerzeugung und die Induzierung von Beständigkeit gegen Vireninfektion durch Verabreichung von komplexen Polymerisaten, die durch eine Mischung gebildet werden, welche sich aus zwei Homopolynucleotiden oder einem Homopolynuoleotid und einem Homooligonuoleotid zusammensetzt.

Bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird der Ausdruck Interferone auf das gleiche aktive Material angewendet» das in der Literatur mit verschiedenen Ausdrücken, wie "Viren-inhibierender Faktor" und "Vireninhibierungssubstanz" identifiziert wird. Der Ausdruck Homopolynucleotid wird bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung in dem Sinn verwendet, daß er nicht nur die Homopolynuoleotide, sondern auch die Homooligonucleotide" umfaßt, deren Unterschied lediglich in der L&nge des Polymerisats besteht. Das heißt, dieser Ausdruck umfaßt bekannte Polymerisate, die zwei bis tausende von Nuoleotidbasenrest-Binheiten aufweisen. Diese bekannten Polymerisate werden durch eneynatisohe Behandlung von Nucleotidd!phosphat in vitro aur Bildung des gewünnohten Polynucleotide mit variierender Anzahl an Nuoleotideinheiten hergestelltι deren Zahl nioht mit Genauigkeit angegeben werden kann·

In der chemotherapeutischen Virusforsohung besteht die Hoffnung, ein ohemlsohes Mittel gegen Viren mit breitem Spektrum zu finden« Bis heute sind die einzigen bekannten Mittel mit breiten Spektrum die Interferpne, dl· in Blut und in den Oeweben von Tieren und Mensohen in Verlauf von Vireninfektionen und anderen Infektionen auftraten und einen ■Öglionen Mtohanltnut fUr die Hemmung voa Virtnkrankheiten

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zu liefern scheinen, der von den speziellen immunologischen Mechanismen getrennt ist und sich von diesen unterscheidet· Es ist jedoch keine Produktion von Interferon in praktischen Mengen für die Verwendung in der Chemotherapie erreicht worden. Ein weiterer Versuch in Hinblick auf Virus-Chemotherapie war die Suche nach einer chemisch definierten, nicht-toxischen, keine Antigene bildenden, nichtreplikativen (non-replicating) und leicht verfügbaren Substanz, die tierische Zellen zur Erzeugung von Interferon stimmuliert, das dann Schutz gegen Virusinfektion verleiht«

Ee sind zahlreiche Interferon-Induzierungsmittel beschrieben worden, wozu lebensfähige und inaktivierte Viren, Endotoxin, Phytohämagglutinin, Trachoma und Inclusion Conjunctivitis-Mittel (TRIC-Mittel), Brucella abortus und andere gehören· Jedoch haben bei jedem davon βehr schwerwiegende Nachteile, wie Toxizität, Bildung von Antigenen und/oder Replikabilität, ihre praktische Eignung für die Behandlung von Virenkrankheiten' beschränkt.

Es wurde nun gefunden, daß hohe Konzentrationen von Interferonen in einem Wirtstier durch Verabreichung von komplexen Polymerisaten induziert werden können, die chemisch definierte, nicht-toxische., keine Antigene erzeugende, nicht-replikative synthetische Mittel sind, die aus leicht verfügbaren Homopolynucleotlden hergestellt werden können, Die Verabreichungsart der komplexen Polymerisate kann entweder parenteral, wie subkutan, intradermal, intraperitoneal, intravenös, intramuskulär, oral oder topisch sein, vorzugsweise auf eine Schleimhaut, wie intranasal und in die Atmungswege. Diese komplexen Polymerisate werden als Mischung von zwei verschiedenen Homopolynucleotiden hergestellt, die selbst synthetisch und im Handel erhältlich sind und durch feststehende Arbeitsweisen hergestellt werden können·

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Diese synthetischen Polynucleotide sind doppelsträngig
(double-stranded) und stellen die folgenden dar:
(a) Komplexprodukt, gebildet zwischen zwei Homopolyribonucleotiden (rI:rC, rA:rU, tI:tSÜ) , selbst-komplexierende oder alternierende Polyribonucleotid-Mischpolymerisate
(rIC, TiBG₉ rAU) oder Komplexprodukt zwischen einem- PoIydeeoxyribonucleotid und einem Polyribonucleotid (Fl DNA-RHA)· Für diese Symbole gelten folgende Erklärungen:

rltrC rAzrU rl+CpO

rIO

rlS?T rAU

- Komplex aus Polyriboinosinsäure und PoIyribocytidylsäure

- Komplex aus Polyriboadenylsäure und PoIyribouridylsäure

- Mischung von Polyriboinosinsäure und
Cytidylylcytidin

- Komplex aus Polyriboinosinsäure und PoIyribobromcytidylsäure

- alternierendes Mischpolymerisat von Riboinosin- und Ribocytidylsäure

- alternierendes Mischpolymerisat von Riboinosin- und Bromribooytidylsäure

- alternierendes Mischpolymerisat von Riboadenyl- und Ribouridylsäure

Yl DHA-RNA - Komplex zwischen Fl-Bakteriophag DKA und RXA

von komplimentärer Nucleotidsequene«

Der Strich über BO zeigt Bronierung an und ändert ähnlioh

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halogenierte Komponenten sowie alkylierte Komponenten werden von der vorliegenden Erfindung umfaßt. Halogenierung oder kurzkettige Alkylierung einer Komponente der alternierenden Ribomiechpolymerisate oder der komplexen Ribohomopolymerisate vermindert nicht die Fähigkeit, Interferon und Wirtsbeetändigkeit zu induzieren· "

Die bei der Herstellung der komplexen Polymerisate verwendeten synthetischen Homopolynucleotide haben ein Pentosephosphatgerüst, worin die Pentose vorzugsweise Ribose oder Desoxyribose ist^und enthalten eine spezifische identifizierbare Pyrimidin- oder Purinbase, wie Adenin, Inοsin, Cytosin, Uraeil, Guanin und dergleichen· Es ist bereits bekannt, daß das Mischen von bestimmten Homopolynucleotiden in wäßriger Lösung zur Bildung eines komplexen Polymerisats führt, das mittels verschiedener physikalischer Teste identifizierbar und von jedem der beiden Homopolynucleotide verschieden ist, aus dem das komplexe Polymerisat gebildet wird. Das Verhältnis, in dem die beiden Homopolynucelotide gemischt werden, ist normalerweise nicht bestimmend für das Verhältnis der beiden in den Komplex eingebauten Homopolynucleotide· Eine Mischung in einem Molverhältnis 1:1 kann zu einem komplexen Polymerisat führen, das die beiden stickstoffhaltigen Basen in einem Verhältnis von 1:1, 1:2 und/oder 2:1 oder in einem anderen Verhältnis mit kleinen ganzen Zahlen enthält, d.h, das sich ergebende Verhältnis ist keine Funktion des Verhältnisses, in dem die Komponenten gemischt werden, sondern wird durch eine gewisse natürliche Neigung bestimmt, eich eo zu vereinigen, wie es den speziellen verwendeten Homopolynuoleotiden eigentümlich ist.

Di· komplexen Polymerisate werden durch Mischen eines.Homomit einem anderen Homopolymerisat gebildet, wo-

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bei das gewählte Paar komplementär 1st, beispielsweise ein Homopolymerisat von Adenylsäure gemischt mit einem Homopolymerisat von Uridylsäure oder einem substituierten, beispielsweise bromierten, Derivat davon. Bas gemischte Paar kann auch aus Inosinsäure und Polycytidylsäure oder ihren bromierten oder anders substituierten Derivaten bestehen· Es ist klar, daß für die Guanylsäure substituierte Inosinsäure vorliegen kann, da diese ein Derivat ist. Die Bindung dieser Paare erfolgt durch Wasserstoffbindung, wie aus der Hypochromizität im ultravioletten Bereich hervorgeht. Aueserdem muß eine der Komponenten des Komplexes ein Purinpolymerisat sein und die andere Komponente muß ein Pyrimidinpolymerisat sein, um einen aktiven Komplex zu erzeugen.

Die bei der vorliegenden Erfindung als Interferon-Induzierungsmittel verwendeten komplexen Polymerisate werden durch Syntheseverfahren hergestellt, wie sie unter anderen in Thaoh, R.E., und P.Doty, 1965, Soienoe 147t 1310, Krakow, J.S. und Myra Karstadt, PNAS £8, 2094 (1967)» Nilman G., Mangridge, R., H.J. ChamberHn₁ PNAS £2, 1804-1810 (1967), "The Structure of a DNA-RHA Hybrid" be-. schrieben sind. Die komplexen Polymerisate werden bei,-epieleweise hergestellt, indem zwei ungleiche Homopolynuoleotide in einem Molverhältnis 1i1 bezüglich ihrer Basen für einige Minuten bei Umgebungstemperatur in einen, wäßrigen Puffersystem mit einem breiten pH-Berβloh, beispielsweise Ewioohen etwa 5,0 und 10,0, und einer Ionenetärke zwischen etwa 0,001 und 1,0 gemischt werden· Andere Verhältnisse ale 1ι1 können, wie oben bereite erwähnt, verwendet werden· Puffereysteoe, die ale brauchbar befunden worden sind, sind 0,006 Mol Natriunphosphat in 0,85 J^igtr , latriumohloridlöaung und 0,01 KoI Olyoylolyoin in Oi59 Jtig·» Natriuaohlorid. Xe kann jeder nioht-toxieoh·

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Puffer verwendet werden. Tatsächlich braucht kein Puffer verwendet zu werden, da gefunden worden ist, daß das Pufferungsvermögen des physiologischen Systems des Tieree, dem die Mischung von Homopolynucleotiden verabreicht werden soll, ausreichend ist, um nach der Verabreichung die gewünschte Komplexbildung zu fördern und die gleiche 'induzierung der Interferonerzeugung und des Schutzes vor Vireninfektion zu liefern, wie wenn die beiden Homopolynucleotide vorher komplexiert werden. Die vorliegende Erfindung umfaßt demzufolge auch die Verabreichung der Nucleotide an das Wirtstier einschließlich des Menschen, die im jeweiligen Körper die komplexen Polymerisate bilden, die als Interferon-Induzierungsmittel dienen.

Eine andere Herstellungsweise für die komplexen Polymerisate, die verwendet werden kann, besteht in der Behandlung einer Mischung von zwei Nucleotiddiphosphaten oder Desoxynucleotidtriphosphaten,in einem Phosphatpuffer mit etwa, pH 7 mit der entsprechenden Ribonucleinsäurepolymerase oder Desoxyribonucleinsäurepolymerase. Eine derartige Behandlung führt zur Polymerisation der beiden Monomeren zu zwei Homopolynucleotiden unter gleichzeitiger Bildung des komplexen Polymerisats.

Die in vitro gebildeten komplexen Polymerisate können durch hypochrome Verschiebung im ultravioletten Absorptionsspektrum, durch Saccharose-Dichtegradient-Praktionierung, Chromatographie und die Fähigkeit charakterisiert werden, die Erzeugung von Interferon zu induzieren, eine Aktivität, die jedem der Homopolynucleotide abgeht, aus denen der Komplex gebildet wird. Sie Erzeugung von Interferon ist die bedeutendste Möglichkeit für die Charakterisierung der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten komplexen Polymerisate, da physikalische Methoden oftmals

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keine ausreichende Empfindlichkeit haben·

Die Erzeugung von Interferon durch Verabreichung der komplexen Polymerisate zeigt sich durch den Schutz von Wirtstieren sowie von Zellkulturen vor Virusangriff. Das so erzeugte Interferon kann auch durch Isolierung des induzierten Interferons durch bekannte Arbeitsweisen und anschliessende Bestimmung in vitro seiner Viren-inhibierenden Eigenschaften und Charakterisierung durch Wirt-Spezifizität, Trypsin-Empfindlichkeit, isoelektrischen Punkt und Molekulargewicht ebestimmung charakterisiert werden.

Die erfindungsgemäße Induzierung der Interferonbildung in vivo und/oder die Induzierung von Beständigkeit gegen Vireninfektion wird durch Verabreichung eines in der oben beschriebenen Weise hergestellten komplexen Polymerisate an ein Wirtstier, beispielsweise ein Kaninchen, eine Maus oder ein anderes Tier, erreicht. Die Verabreichung kann , parenteral oder topisch erfolgen, insbesondere auf eine Schleimhaut, wie intranasal, oder in die Atemwege. Die wirksame Dosis hängt ab von der Wirtspecies und in gewissem Ausmaß von dem Virus, gegen den Schutz angestrebt wird· Bei Mäusen ist die Schwellendosis etwa 0,5 mg/kg, während sie bei Kaninchen etwa 0,05 /ug/kg beträgt· Bei diesen Dosen liegen keine sichtbaren Zeichen von Toxizität vor, weder lokal an der Injektionsstelle noch allgemein im Wohlbefinden des gesamten Tieres.

Die Wirksamkeit der komplexen Polymerisate in Hinblick auf die Induzierung von Interferonbilflung in dem Wirtstier kann unter anderem durch parenterale Verabreichung des komplexen Polymerisats an ein Tier und Entnahme von Blutproben nach etwa 1 bis 5 Stunden bestimmt werden· Von geronnenen Proben des Blutes wird das Serum abgetrennt, eteri-

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lisiert und bei mehreren Verdünnungen in Kulturröhrchen titriert, die Zellen von der gleichen Tierspecies enthalten, wie sie als Wirt verwendet worden ist. Nach Inkubierung bei 35⁰C für etwa 18 bis 24 Stunden werden die Zellkulturen dem Angriff durch irgendeinen der bekannten cytopathogenen Viren ausgesetzt und wiederum etwa 3*Tage' lang bei 35⁰C inkubiert. Die Kulturen werden dann auf cytopathogene Effekte untersucht und der Interferontiter wird als der reziproke Wert der Verdünnung bestimmt, bei der 50 i» der Röhrchen keine derartigen cytopathogenen Effekte zeigen.

Die Wirksamkeit der komplexen Polymerisate in Hinblick auf die Induzierung von Interferonerzeugung und Wirtsbeständigkeit bei einer großen Vielfalt von lebenden Zellsystemen sowohl in vivo als auch in vitro geht aus der beträchtlichen Anzahl von Gewebezellkulturen und Wirten hervor, in denen Interferon hervorgebracht werden kann. Repräsentativ dafür sind ^JHühnch'enembryo, Hühnchen-Chorioallantois-Haut (chiok chorioallantoio membrane), die im Ei sowie in vitro vorliegen kann, Affennierenzeilkultur, Kaninohenhaut und Kaninchenhoden in vito, Kalbsnierenzellkultur, Kaninchennierenzellkultur, menschliche Annionzellkultur, Intraallantois im Ei, MCN-Zellkultur (MCN cell aulture), Mäuse-Fibroblasten-Zellkultur, i

menschliche Vorhaut, Hühnchenembryozellkultur, KB-ZeIlkultur, Mäueelunge in vivo, erwachsenes Mäusegehirn in vivo, Hühnchen-Pibroblasten-Ztllkultur, Schilddrüse vom erwachsenen Menschen oder Embryolunge oder Embryonierenzellkultur, menechliobe Leukooyten, Mäuee-Embryo-Zell- linien (3B, KB 29) in Zellenkultur und primäre Mäuse-Embryo-Ztllkultur« Et kann daher erwartet werden, daß je de ltbtndt Ztilt, entweder in dem Wirt oder in einem KuI-turatdiue, dit In dtr Lagt iit, Interftron htrvorzurufen,

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unter dem Einfluß der erfindungsgemäßen komplexen Polymerisate zur Interferonerzeugung induziert wird.

DaQ die gemäß der obigen Methode erzeugten Interferone zu einer speziellen Species gehören, wird unter Verwendung eines Interferon-Fleckenverminderungstests gezeigt, der Inkubation eines aliquoten Teiles des Interferon enthaltenden Serums mit einzelnen Zellkulturen verschiedener Species, anschließenden Angriff duroh einen Virus, wie . vesiculärem Stomatitisvirus oder einen anderen bekannten m. cytopathogenen Virus, und Inkubation umfaßt, um die Virusfleckenbildung zu erlauben· Die Fleckenanzahl auf Interferon-behandelten Kulturen wird mit der auf unbehandelten Virus-infizierten Vergleichskulturen verglichen. Bei der artigen Tests wird beobachtet, daß Interferonaktivität nur in solchen Fällen auftritt, bei denen die Zellkulturen von der gleiohen Tierspeoies stauen, aus der das Inter feron enthaltende Serum isoliert worden let. ' ,

Daß die unter Verwendung von komplexen Polymerisaten duroh da· erflndungsgemäße Verfahren induzierten Interferone Trypsin-empfindlloh sind, kann unter Verwendung eines Interferon-Fleokenvenninderungstests gezeigt werden, d.h., " dl« Interferonaktivität wird duroh Trypeinbehandlung seretort.

Das in der vorstehend beschriebenen Weis· induzierte Interferon wird ausserdea, wie in den Beispielen beschrieben ist» duroh bekannte Methoden in Hinbliok auf den ieoelektrisohtn Punkt und das Molekulargewicht charakterisiert.

Nachfolgend wird die Herstellung der la erfindungsgemttßen Verfahren verwendeten koaplexen Polyaerisate veransohaulioht.

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JJ

Herstellung von komplexen Polymerisaten

SUBSTANZ It Herstellung eines Komplexes aus Polyinosin- säure und Polycytidylsäure, "Poly (I f C)"

Es wird eine Lösung von Polyinosinsäure (I) hergestellt, die 550/ug/ml in einem Puffer enthält, der 0,01 molar an Glycylglycin und 0,1 molar an Natriumchlorid ist. Es wird eine Lösung von Polycytidylsäure (C) hergestellt, die 500/Ug/ml in dem gleichen Puffer enthält. Die Lösung der Polyinosinsäure und die Lösung der Polycytidylsäure werden dann gemischt, so daß sich ein Holverhältnis von 1x1 bezüglich der Basen ergibt· Die sich ergebende Lösung wird direkt als die Quelle der komplexen Polymerisate, Poly (I + C), auch bekannt als rlxrC, verwendet. Sie hat einen Schmelzübergangsmittelpunkt (melting transition midpoint) (Tm) von 60,5⁰O, die .Ionenstärke beträgt 0,1.

SUBSTANZ II: Herstellung eines Komplexes aus Polyadenyl-Bäure und Polyurldylsäure, "Poly (A + U)"

Gemäß der oben für die Herstellung für Substanz I beschriebenen Arbeitsweise, wobei jedoch äquimolare Mengen (bezüglich der Baeen) Polyadenylsäure (A) und Polyuridylsäure (U) anstelle der dort verwendeten Polyinosinsäure und Polycytidylsäure verwendet werden, wird das komplexe Polymerisat Poly (A + U), das auch ale rAtrU bezeichnet wird, hergestellt. Es hat einen Tm von 56⁰C, die Ionen- fltärke beträgt 0,1.

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SUBSTANZ III: Herstellung eines Komplexes aus Polyinosin-

säure und Cytidylylcytidin "Poly (I + CpC)"

Verwendet man die oben in Hinblick auf die Herstellung von Subetanz I beschriebene Arbeitsweise, wobei jedoch die dort verwendete Polycytidylsäure durch eine äquimolare Menge an Cytidylylcytidin, einem Oligonucleotid, ersetzt und ein Puffersystem, das sich aus 0,006 Mol Natriumphosphat in 0,85 #iger Salzlösung zusammensetzt, mit pH 7,0 verwendet wird, so wird das komplexe Polymerisat, Poly (I + CpC), das auch als rI:rCpC, bezeichnet wird, gebildet.

Verwendet man die für die Herstellung von Substanz I verwendete Arbeitsweise, wobei jedoch die Polyinosinsäure und die Polycytidylsäure durch äquivalente Mengen von anderen bekannten HomopolynucleotJLden ersetzt werden, so werden beispielsweise die folgenden Komplexe Poly (A + I), Poly (G + C), Poly (A + DHU), Poly (A + 8U), Poly (U + 8A) gebildet, wobei A, I, C und U die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, (J Polyguanylsäure, DHU Polydihydrouridylsäure und 8A bzw# 8U Polyadenyl- bzw. Polyuridylsäure bedeuten, die jeweils acht Nucleotideinheiten pro Molekül enthalten. Diese gleichen Komplexe können auch als rA:rI, ^ rG:rC usw. identifiziert werden.

SUBSTANZ IV: Herstellung von Desoxyribohomopolymerisaten

Das Verfahren zur Herstellung von Desoxyribohomopolymerisaten ist von R.B. Inman und R.L. Baldwin, in J. Mol. Biol. (1964) 8, 452, beschrieben worden.

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Jfe

SUBSTANZ V: Herstellung eines Komplexes, in dem eine der

Komponenten chemisch verändert 1st, beispielsveise rl;r!5ci

Die komplexen Polymerisate rI:rSO* werden gemäß einer von D.R. Davies und A.J. Rieh, in J. Amer. Chem. Soc^eo, 1003 (1958), für die Herstellung von rl:rC beschriebenen Arbeitsweise hergestellt, mit der Ausnahme, daß bei der Synthese von rB"(T 5-Bromcytosin-5'-triphosphat verwendet wird. Der Komplex hat einen Tm von 89,5⁰C in einem Puffer mit einer Ionenstärke von 0,1. Diese gleiche Arbeitsweise kann verwendet werden, um andere Komplexe aus anderen bromierten oder halogenierten Polynucleotiden zu erhalten, beispielsweise rA:r5TT, rltrüTc* und dergl. In ähnlicher Weise können die Basen durch Alkylierung in bekannter Weise chemisch verändert worden sein·

SUBSTANZ VI: Herstellung eines Komplexes aus alternierendem Polyribonucleotidmischpolymerisat, rIC:rI0

Dieees alternierende Mischpolymerisat wird gemäß der von J.S. Krakow et al. in dem oben erwähnten Zeitschriften- ■ artikel beschriebenen Arbeitsweise hergestellt. Der Komplex hat in einem Puffer mit einer Ionenetärke von 0,1 einen Tm von 64 bis 65⁰C.

Diese alternierenden Komplexe werden, wie in dem genannten Artikel angegeben, unter Verwendung eines Enzyms synthetisiert, das aus Mikroorganismen hergestellt und als RNA-Polynerase bezeichnet wird. Die Polymerisate liegen in einen Verhältnis 111 vor und sind duroh Wasserstoffbindung der alternierenden konplimentären Basen um eich selbst doppeletrangig. Diese Materialien können unter Verwendung

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dieses Enzyms in Gegenwart einer Schablone hergestellt werden, die dAT oder wärmedenaturierte DNA sein kann, wobei natürlich vorzugsweise dAT verwendet wird. Diese alternierenden Mischpolymerisate sind nicht auf regelmäßig abwechselnde Mischpolymerisate beschränkt, sondern umfassen auch unregelmäßig abwechselnde Mischpolymerisate, solang die Komponenten in einem bestimmten Verhältnis vorliegen. Andere alternierende Mischpolymerisate werden ähnlich hergestellt, beispielsweise rAUxrAU und dergl.

SUBSTANZ VII: Herstellung eines Komplexes aus alternierendem Ribonucleotid-Mischpolymerisat unter Verwendung eines halogenierten Ribonucleotids

Ein Beispiel hierfür ist rl5?:rlBl?, hergestellt gemäß der Arbeitsweise in dem Artikel von J.S. Krakow et al. Er hat in einem Puffer mit einer Ionenstärke von 0,1 einen Tm von 91⁰O. Andere Beispiele sind rABl?:rAW, rlClCsrluIB' und dergl.

SUBSTANZ VIII: Herstellung eines Komplexes zwischen einem

Polydesoxyribonucleotid und einem Polyribonucleotid

W Ein Beispiel dieses doppelsträngigen Komplexes ist Pl DttA-RNA, welcher einen Komplex zwischen Fl Bakteriophag DNA und einer RNA mit komplementären Nuoleotidsequenzen darstellt. Die Pl Bakteriophag DNA wird hier als eine Schablone für die enzymatieche RNA-Synthese verwendet. Das Verfahren zur Herstellung dieser und ähnlicher doppelsträngiger Hybride ist in dem oben erwähnten Zeitschriftenartikel von O.Milman •t al· beschrieben. Der Komplex Pl DNA-RNA hat in einem Puffer mit einer Ionenetärke von 0,1 einen Tm von 82°·

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Die nachfolgenden Beispiele sollen die Induzierung von Interferon durch Verabreichung von bestimmten der oben beschriebenen Homopolynucleotidkomplexe sowohl in lebenden Wirtstieren als auch in isolierten Zellkultüren zeigen, wobei jedoch auch andere erfindungsgemäße komplexe ,,Poly- . merisate verwendet werden können, um die Interferonerzeugung in ähnlicher Weise zu stimmulieren·

Beispiel Induzierung von Interferon in Kaninchen

Die oben beschriebenen komplexen Polymerisate werden getrennt als aliquote Teile mit 0,5 ml durch intravenöse Injektion an Kaninchen mit 2,04·bis 2,27 kg (4,5 bis 5,0 ' pounds) verabreicht. Kach etwa 2 Stunden werden von jedem Kaninchen durch Herzpunktion Blutproben entnommen. Von jeder der geronnenen Blutproben wird Serum abgetrennt und getrennt durch Einwirkung von ultravioletter Strahlung sterilisiert. Aliquote Seile dieser sterilisierten Proben werden in den folgenden Tests verwendet.

Bestimmung von Interferontitern

DaB sterilisierte Kaninchenserum von jedem Kaninchen wird getrennt durch Reihen-Zweifachverdünnungen von 1:5 bis 1:640 unter Verwendung von Zellkultur-Wachstumsmedium als Verdünnungsmittel titriert. Eine 1 ml Probe von jeder Verdünnung wird zu jeder von vier Röhrchenkulturen von Kaninchen nierenzellen gegeben, die von verbrauchtem Wachetumsmedium

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abfließen gelassen worden sind. Nach Inkubation über Nacht bei 35⁰C werden die Röhrchenkulturen wiederum abfließen ge lassen und mit 10 bis 100 TCID^q (Gewebekultur-infizierende Dosis γλ) vesikulärem Stomatitisvirus infiziert, der in 1 ml Wachstumsmedium enthalten ist. Jede Röhrchenkultur wird für weitere 3 Tage bei 35⁰C inkubiert und dann in Hinblick auf das Auftreten von cytopathogenen Vireneffekten untersucht und mit (+) bei positivem Auftreten derartiger Effekte oder mit (0) bei Fehlen des Auftretens von cytopathogenen Effekten gewertet. Der Interferontiter für jede Serumprobe wird als der reeiproke Wert der Serumverdünnung bestimmt, bei der 50 # der Röhrchen keine cytopathogenen Effekte zeigen. Serum von unbehandelten Tieren (d.h., von normalen Vergleichstieren)wird in jedem Versuch titriert, um normale Serumfaktoren zu bestimmen· Die auf diese Weise bestimmten Titer sind in Tabelle I gezeigt.

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TABELLE I Interferontiter, bestimmt in Kaninchennierenζellenkultüren

chemisches Mittel

Dosia/Tier

I + C	(rI:rC)	2	/Ug
Il		0,5	/Ug
Il		0,25	/Ug
Poly I		25	/Ug
Poly C		25	/Ug
normale	Vergleichsproben	keine

Interferontiter

>640 20-40

<5

<5

<5

<5

A + π (rA:rTJ)

Polyadenylsäure
Polyuridylsäure
normale Vergleicheprobe

200	/Ug
100	/Ug
50	/Ug
• 25.	/Ug
12,5	/Ug
6,25	/Ug
200	/Ug
200	/Ug

keine

10-20 10-20 40-80 20-40 5-10 5-10 <5 5 <5

Poly 1+CpC (rlirCpO)
η

normale Vergleichsprobe

100 /Ug 10 /Ug

1 /ug

50 /Ug

keine >640 <5 <5

< 5

< 5

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In einem Testversuch auf der Basis von Beispiel 1 wird gefunden, daß die folgenden Mengen der Komplexe, wenn sie pro Kaninchen intravenös injiziert werden, die Erzeugung von feststellbaren Konzentrationen an Seruminterferon in zwei Stunden induzieren:

• O|5/Ug rI:rC, 25/Ug rA:rU, 100/Ug rI:rCpC, 10,5/Ug rI:rSc\ 10 /Ug rIC:rIC, 12/ug rlEc":rIB"c" und 5/Ug Pl DNA-RNA. Bei manchen diesen Substanzen sind die für die Induzierung angegebenen Mengen nicht die minimalen Mengen·

Beispiel 2

Induzierung von Interferon bei Mäusen

Eine Lösung von Poly (I + C) (Substanz I) sowie Lösungen von Folyinosinsäure und Polycytidylsäure werden getrennt ale aliquote Teile mit 0,2 ml durch intravenöse Injektion an Mäuse mit 16 bis 18 g verabreicht· Jede Lösung wird auf diese Weise an 25 Mäuse verabreicht. Nach etwa 2 Stunden werden von jeder Maus Blutproben entnommen. Von jeder der | geronnenen Blutproben wird Serum abgetrennt. Sera von denjenigen Tieren, denen ein aliquoter Teil des gleichen Polynucleotide oder der gleichen komplexen Polymerisatlösung injiziert worden ist, werden vereinigt und durch Einwirkung von ultravioletter Bestrahlung sterilisiert und durch, die Fleckenverminderungsmethode an Mäuseembryo- zellen gegen einen Angriff durch veeikulärem StomatitisviruB titriert. Vereinigt· Stra aus unbthandtlttn Tiertn werdtn tbeneo titriert.

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!EABELlE II

Stimmulierung der Interferonerzeugung in Musen, ermittelt durch die Pleckenverminderungsmethode

Chemisches Mittel Dosis/Tier Interferontiter

Poly I 55,0 /ug <8

Poly C 50,0 /ug < 8

Poly I + C (rI:rC) 52,5 /Ug 256

normales gepuffertes
Vergleichsverdünnungsmittel - <8

Beispiel

Induzierte Beständigkeit gegen Columbia SK Virus-Infektion von Mäusen

Die Infektion durch Columbia SK hat bei Mäusen die Symptome eines zerzausten Felles, von Lethargie und von schwacher Paralyse zur Folge, wobei die Mehrzahl der Tiere 3 bis Tage nach der Injektion stirbt· Zur Bestimmung der Wirksamkeit der komplexen Polymerisate in Hinblick auf die Induzierung einer schützenden Menge an Interferon wird die folgende experimentelle Arbeltsweise verwendet:

0,5 ml der Testlösung des in Tabelle III identifizierten komplexen Polymerisate des Homopolynucleotide werden intra-

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peritoneal 18 Stunden vor der Infektion an jeweils 15 Hause verabreicht, die jeweils zwischen 14 und 16 g wiegen. Dann wird eine Menge an Columbia SK Virus, die ausreicht, um 90 i» der Mäuse 5 Tage nach der Infektion zu töten, in einen 0,5 τώΙ aufmachenden aliquoten Teil subkutan injiziert und jede Ha-us wird dann mit 0,5 al der Testlösung behandelt_? ά: e i.r, tracer;, toncal 3 Stunden nach der Infektion injirie:-' ■■■■:..■ ■■ _: Zv, "· o: /:"!e.\ciien Y/r;ire rait komplexem Polymer! υ α ;, ',ο 3 "■' ::■ Ο; ■■ λ. ■ ■. Vox^ d b-h

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- 20 -

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TABELLE ^TTT

XXi.

Induzierte Beständigkeit bzw« Widerstandsfähigkeit gegenüber Columbia SK Virus-Infektion bei Mäusen

Chemisches Mittel

Gesamtdosis °J> über- pro Tag durchpro Tier lebende schnittlich Tiere überlebende Tiere

Pho sphatpuffer	«te	mg	3,3	437
Polyinosinsäure	0,91	Sg	0,0	4,5
Polycytidylsäure	1,00	mg	0,0	4,2
Poly I + C (rI:rC)	1,05	rag	40,0	8,5
Poly I +C (rI:rC)	0,53	ag	20,0	7,1
Poly I + C (rI:rC)	0,26	6,7	6,0

Wenn die gleiche Arbeitsweise vervfenäi':■ wiiv* ^iν der Ausnahme, daß die Nachinfektionsuosis we^elaaBer;. wird, werden Ergebnisse erhalten, die mit den in 'Tabelle III wi?=·^ergegebenen Ergebnissen vergleichbar sins.

Bei anderen Tests wird gefunden, oe3 Kliuac *a: &er t-.'lgenden Kombination gegen den Columbia SK Virus gc-achutr.-i; werden?

rlirC, intranasal verabreichv und intranasaler Virusangriff,

rI:rC, intraperitoneal verabreicht und Yirysaiicrifi intraperitoneal,

rltrOf intraperitoneÄl verabreicht νινί Yi.iUB&K^r-iff ir.-fcra-

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Bei einem ähnlichen Test wird gefunden, daß eine intraperitoneal verabreichte Dosis von 16 mg rI:rC pro Maus diese gegen den Sendai Virus schützt.

Beispiel 4

Induzierte Beständigkeit gegen Pneumonia Virus-(PVM)· Infektion bei Mäusen

Die Infizierung von Mäusen durch intranasale Inokulation von Mäuse-Pneumonia-Viren (PVM) hat eine Virueinfektion der Atemwege zur Folge, die ihren Höhepunkt in einer Pneumonia hat, wobei bei der Mehrzahl der Tiere 6 bis 7 Tage nach der Infektion der Tod eintritt.

Lösungen der komplexen Polymerisate und von Hömopolynucleotiden werden hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, prophylaktischen Schutz gegen PVM-Infektion zu geben, indem 20 Mäuse mit 8 bis 10 g intranasal mit 0,03 ml der Lösung vorbehandelt werden, die das in Tabelle IV angegebene Testmaterial enthält, bevor mit dem Virus Intranasal inokuliert wird. Es wird genügend Virus verwendet, um 75 i» der Mäusepopulstiön 6 bis 7 Tags nach der Inokulation abzutöten. Bei Beendigung des Versuches (nach H Tagen) sind 59 der 60 infizierten, jedoch unbehandelten Mäuse an der Virusinfektion gestorben.

Die Anzahl der lebenden und die Anzahl der toten Tiere wird täglich ermittelt. Die Tiere werfen H Tage lang beobftchtet*

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TABEILE

Induzierte Beständigkeit vsn i!är~*n g eg entity tion slit Ma

Chemische β Mitte!

Poly I f C (rj.:r·.

Es wird auch gefunden, -"a2 K-urr- ßdrovi ein-Angriff durch Vaccinia Vir^o ge;.-:-jüist cLnc einer prophylaktischen Behandlung entweder oder subkutan rlsrC verabreicht wird.

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12530

Beispiel

Aktivität in vitro von komplexen Polymerisaten als Viren inhibierende Substanzen

Jede der in Tabelle V identifizierten Zellkulturen wird über flacht mit einem der komplexen Polymerisate, verdünnt in dem Wa:;hstumsmedium, von dem man weiß, daß es für die verv^fi=:-aete Zellkultur erforderlich ist, inkubiert. Nach der Entfernung der komplexes Polymerisat enthaltenden Lösungen v/iru jede Kultur mit vesikulären Stomatitisvirus-S'Jspsnsionen infiziert, inkubiert und hinsichtlich der ?leckeribilduT5£ beobachtet, die für den Test beschrieben vordor. ist, der Art Spezifitat zeigt·

TABELLE V

/ug-Dosis des komplexen Polymerisate/ml, die erforderlich let, um Beständigkeit gegenüber VSV-Fleckenbildung zu induzieren

Zellkultur

primäre Kaninchenniere primäres menschliches Amnion primäre menschliche Embryoniere primäres Hühnchenembryo primäre Rinderniere primäre Hundeniere primäreβ Mäuseembryo

Poly I + C	Poly A + U	>100	-
(rI:rC)	(rA:rU)
<0,00125	0,0015
0,04	26,25
1,25	-
0,33
5,00
1,25

>100

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12530 5

Die relative Wirksamkeit der Komplexe im Vergleich mit ihren unkomplexierten Nucleotiden ist in Tabelle Va ge zeigt, wobei dieser gleiche Test verwendet wird.

TABELLE Va

Konzentration an komplexem Polymerisat, die erforderlich ist, um bei primären Kaninchennierenzellkulturen Beständigkeit gegen VSV-Fleckenbildung zu induzieren

Polymerisat /ug/rol

Poly I >11

Poly C >10

Poly I + 0 (rI:rC) 0,091?5

Poly A ':

Poly U ' :-10

Poly A + U (rAsrU) 0,0015

rI:rB"C* 0,08

(nicht die Mindest· menge)

rIC:rIC 0,003

rTSffjrTBc· 0,04

rAUirAU 0,04

Pl DHA-RNA 0,6-1,25

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12530

Verwendet man die in Beispiel 1 bis 5 -beschriebenen Arbeitsweisen, wobei jedoch Substanz IV oder die nach der Beschreibung von Substanz III beschriebenen komplexen Polymerisate für die hier verwendeten Substanzen I, II und III eingesetzt werden, so werden ähnliche Ergebniese erhalten·

Beispiel

Nachweis der möglichen therapeutischen Wirkung des intranasal verabreichten Interferon-Induzierungsmittels rI:rC gegen einen intranasalen Angriff durch Mäuse-Pneumonia-Virus

Mäuse werden auf intranasalem Weg mit Pneumonia-Virus injiziert und anschließend werden 24, 48, 72 und 96 Stunden nach dem Angriff 33Mg (rI:rC) intranasal verabreicht·¹ Für jeden Tag des Angriffes werden Vergleichstiere bereitgehalten. Sie Ergebnisse sind in Tabelle VI gezeigt, woraus zu entnehmen ist, daß das Interferon-Induzierungsmittel rI:rO bedeutende Wirkung als ein therapeutisches Mittel für etwa 72 Stunden naoh dem Angriff durch Pneumonia· * Virus besitzt.

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12530 3Λ

TABELLE YI

Therapeutische Wirksamkeit de¹:: rlirO-Iiid/L... 1 .--i*·.;:..■ .■ on Virtsbeetändigkeit bei Mäusen geg-.u. PYM-Arigr '■. fi!

:g Kit rlsrO* nach. 5a I¹I er j

24 Sturer.
46 Stunden

72 Stunden
95 St"ut:d yn

*rIirO

A.E/rrir

Beiepiel

Demonstration in Tierversuchen der Dauer dea Schnee von Mäusen gegen den Angriff durch Pneumonia-Virns r- ich einer einzigen intranasalen Dosis des Interf eron-IncLusierung ?- mittels

Alle Tiere erhalten intranasal eine Dosis von 32 /ag rI:rC. Pur jede Periode des Angriffes werden getrennt Yergleichstiere gehalten. Die Tiere werden mit Mäuse-Pneumonia-Virus 3 Stunden, 4 Tage, 5 Tage, 6 Tage, 7 Tage und 8 Tage nach der InduzierungsmitteldoBis dem Angriff ausgesetzt« Die Ergebnisse sind in Tabelle VIX gezeigt. Es ist ersichtlich, daß eine einzige Dosis von 32/ug pro Haus für eine

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009830/1328

spanne von 6 Tagen einen ausgeprägt guten Schutz gegen Virenangriff liefert.

TABELLE YII

Dauer der Schutzwirkung der Induzierung von Wirtsbeständig keit bei Mäusen gegen intranasalen Angriff durch PVM-Virus	io Überlebende gegenüber Vergleichstieren
Angriffszeit nach rI:rC*	100
3 Stunden	71
4 Tage	100
5 Tage	88
6 Tage	24
7 Tage j	24
8 Tage

* 32/ug rlsrC ι Alle Tiere erhalten 3 Stunden vor dem ' ersten Angriff intranasal 1 Doeis.

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B e i s ρ i e 1 8

Ein Test für die Heftigkeit der VirusangriffÜberwindung, wenn bei Mäusen durch rI:rC, intranasal verabreicht, Virtsbeständigkeit bzw. -Widerstandsfähigkeit induziert ist

Allen in diesem Experiment behandelten Tieren werden 16/Ug rI:rC 3 Stunden vor dem Angriff mit abgemessenen Dosen Pneumonia-Virus verabreicht. Der Angriff umfaßt 31 bis 10 000 LDcQ· Der Angriff erfolgt ebenfalls intranasal. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII angegeben und es ist ersichtlich, daß eine 3 Stunden vor dem Angriff intranasal verabreichte Dosis von 16/ug rI:rC ausgezeichnete Beständigkeit gegen einen Angriff von mindestens 10 000 LDc₀ induziert·

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12530 «J Q

Tabelle VIII

Feststellung des Wirksamkeitsgrades von Wirtsbeständigkeit gegen PVM, induziert in Mäusen durch rI:rC

Überlebende

Angriff	in I»Dcq
10	000
3	150
1	000
	315
	100
	31,5

93 73 87

100 93

100

* Mäuse-Pneumonia-Virus, alle Tiere erhalten 16 /Ug rI:rC 3 Stunden vor dem Angriff.

Identifizierung von Interferonen

Die Interferone werden als Proteinmoleküle mit relativ niedrigem Molekulargewicht identifiziert, die die Fähigkeit besitzen, Virenreplikation nur in Zellen der gleichen Spezies zu stören, woraus die Interferone erzeugt werden. Zur Charakterisierung der Interferone verwendet man den Nachweis der Artspezifität, r der Antivirusaktivität, der Trypsinempfindlichkeit (ein Test für Proteine), des isoelektrischen Punktes sowie Molekulargewichtsbestimmungen.

Die nachfolgenden Tests dienen zur Identifizierung der aktiven Vireninhibierenden Substanzen als Interferone.

NaohwelB der Artspezifität von induziertem Interferon

Proben von 3 ml von Zweifach-Reihenverdünnungen in dem Kulturmedium der Interferonproben von Beisr'tl 1, die duroh Einwir-

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kung von ultravioletter Strahlung sterilisiert worden sind, werden zu Monoschichten von verschiedenen Zeiltypen gegeben, die getrennt in 30 ml Gewebekulturkolben gewachsen sind. Nach Inkubierung über Nacht werden die Serumproben abgezogen und durch 0,5 ml veeikuläre Stromatitisvirussuspension ersetzt und die Kulturen werden erneut für v/eitere 1^5 Stunden bei 35⁰C inkubiert. Dann wird eine Deckschicht vor. 5 ml Aufrechterhai tungskulturmedium (maintenance culture ^ediuro), das Methylcellulose als ein verfestigendes Mittel eiitMlt, in ;jeden Kolben gegeben und die Inkubierung wird i'u^ ν _: ⁴tere 3 bis 4 Tage bei 35⁰C fortgesetzt, um Yirusfieo^!?. bildung au erlauben. Das Deckschichtmedium wird dann eintrat \mä die Zellen werden mit Carbolfuohsin angefärbt, der mit Interferon behandelten Ηθίΐο.··.αίο^ν^ Fleckenzahlen von un behänd el ten Viruv-IiK.

monoechichteri verglichen« Oie reziproke In die eine mindestens 50 i:..f:3 Verruinderun?, -I ergibt, wird als der Ititerferontiter der ?

'Die so bestimmten Titer zeigen Artspszifität, iier einer bestimmten Spezies induziertes Interferon ist nur in Zellen aktiv, die von einem Tier äer gleichen Spezies stammen. Diese Titer sind in Tabelle IX gezeigt.

	j.. s	:::i<:eri^ahleTi	de ή	einem
f;""-' we		. :' ;ϋ j/	•-Ichs
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ät, d	f

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12530

Tabelle IX

Artspezifität der induzierten Interferone bei Tests mit einem Angriff durch vesikulären Stomatitisvirus

	Serum- quvlle	Interferontiter, bestimmt atff kultur	<16	Kaninchen niere	der Zeil-
chemisches Mittel		Hühnchen- Mäuse embryo embryo	128	>2048	BSC * Affe
	Kaninchen	_	<8	<16	<16
I + C	Maus	<8	<8	512	-
I + C	Kaninchen	<32	<16	>2048 ;	-
A + U	Kaninchen	-	<16	-
I + CpC	Kaninchen	—		<16
unbehan- delt

♦ BSC: Eine festgestellte Zellinie, die von Nierenzellen von afrikanischen Grünaffen stammt.

Nachweis der Trypsinempfindlichkeit des induzierten Interfe ron8

Ein Interferon-enthaltendes Serum aus Tieren, die mit einem komplexen Polymerisat induziert worden sind, wird durch Chromatographie an CM-Sephadex (ein Kationenaustauschermaterial, das durch Einführung von Carboxymethylgruppen in Sephadex erhalten wird) isoliert. Eine Probe des isolierten Interferons wird mit einer kristallinen Trypsinlösung (50 /Ug/ml Endkonzentration) 4 Stunden lang bei 35⁰C behandelt. Eine ähnliche nicht-behandelte Interferon-Probe wird ebenfalle 4 Stunden lang bei 35⁰C Inkubiert. Nach der 4-stündigen Inkubationsperiode wird ein Sojabohnen-Trypsininhibitor jeder Probe einschließlich der Kontrollprobe zugesetzt. Die Proben werden in Hinblick auf ihre Interferon-Aktivität naoh

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der Fleckenverminderungsmethode titriert. Die Trypsinlösung, welcher der Sojabohnen-Trypsininhibitor zugesetzt worden ist, wird ebenfalls in Hinblick auf ihre Antiviren-Aktivität titriert. Die Ergebnisse des Trypsin-Empfindlichkeitstests sind in der Tabelle X zusammengefaßt.

T a b e 1 1 e X *

Trypsinempfindlichkeit des induzierten Interferons

Behandlung Interferon-Titer

Poly(l+C)induziertes Interferon + Trypsin 16 Poly(I+C)induziertes Interferon 256

Trypsin-Vergleichsprobe 16

Poly(I+CpC)induziertes Interferon + Trypsin 8 PoIy(I-J-CpC) induziertes Interferon 1024

Trypsin-Vergleichsprobe ,. . <8 ,

Bestimmung des Molekulargewichts des induzierten Interferons

Die Molekulargewichte des durch die komplexen Polymerisate induzierten Interferons werden nach folgender Methode bestimmt. Säulen mit einer Größe von 2 χ 35 cm werden mit hydratisierten Sephadex-G-200-Kugeln gepackt, worauf langsam 2 bis 3. Tage lang ein 0,006m Natriumphosphat/O,15m NaCl-Puffer (pH 7) zur Erzielung einer Gleichgewichtseinstellung durchsickern gelassen wird (Sephadex ist eine hydrophile unlösliche Substanz, die durch Vernetzen von Polysacchariddextran gebildet wird. Die Bezeichnung "G-200" bezieht sich auf das Ausmaß der Vernetzung und damit der Porosität des hydratisieren Gels). 1 ml-Mengen des Serums, welche induziertes Interferon, das gemäß Beispiel 1 hergestellt worden ist, enthalten, wird auf die Säulen aufgegeben. Die Fließgesohwindigkeit in der Säule

τ 33 -

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wird auf 20 bis 25 ml pro Stunde eingestellt, wobei Fraktionen in 3 ml-Mengen gesammelt werden. Die Fraktionen werden auf ihren Interferon-Gehalt nach der Fleckenverminderungsmethode untersucht, wobei das Molekulargewicht einer jeden Probe nach der Formel M¹^⁵ = 146 [1,480 - V/Vo¹^⁵] berechnet wird, worin "M" für das Molekulargewicht steht, "Vⁿ das Eluierungsvolumen des getesteten Materials ist und "Vo" das E'eervolumen der Säule darstellt. Diese Methode liefert Werte, die innerhalb 10 $> der Molekulargewichte liegen, die beim Testen mit gereinigten Proteinen angegeben werden.

Die Ergebnisse- der Molekulargewichte-Bestimmungen sind wie | folgt:

Kaninchen-Interferon Molekulargewicht Poly(I+C), induziert 49 000 bis 52 000

Bestimmung des isoelektrischen Punktes von Interferon

Die Serum-Proben, welche Interferon enthalten, das nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode hergestellt worden ist, werden über Nacht gegen einen 0,1m Natriumphosphatpuffer (pH 6 oder einfach verdünnt auf 1:3 mit Puffer) dialysiert. 20 ml einer jeden Probe werden auf eine 1,5 x 10 cm CM-Sephafc dex-Säule aufgebracht, die mittels des gleichen Puffers in einen Gleichgewichtszustand überführt worden ist. Das Interferon wird durch naoheinanderfolgende Zugabe von 5 ml-Mengen eines 0,1m Natriumphosphats mit steigender Erhöhung des pH-Wertes um 0,2 Einheiteh eluiert. Der Abfluß wird in 5 ml-Fraktionen gesammelt,, worauf der pH und die Interferon-Aktivität einer jeden Fraktion gemessen wird. Der pH der Fraktion mit einer Spitzenaktivität wird aufgezeichnet, worauf der isoelektrisohe Punkt duroh Zugabe einer 0,4 pH-Einheit bereohnet / wird. Der auf diese Weise bestimmte ieoelektrische Punkt für Interferonef die in einem Kaninohen duroh Verabreichung von

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₁₂₅3o ■

\~?ply (I+C) bestimmt worden, beiträgt 6,8 bis 6,9.

Die vorstehende Beschreibung der Herstellung der komplexen Polymerisate sowie die Beispiele erläutern bestimmte Merkmale der vorliegenden Erfindung. Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt. Es kann -vielmehr auch mit komplexen Polymerisaten durchgeführt werden, die aus bekannten Homopolynucleotiden, Homooligonucleotiden oder deren Deeoxyanaloga hergestellt worden sind und in der oben beschriebenen Weise parenteral oder topisch verabreicht worden sind.

Beispiel 9 Oral-nasales Präparat

Als ein propylaktisches intranasales Präparat gegen Viren der Atemwege wie die gewöhnliche Erkältung wird eine Dosis von 0,01 bis 10 mg des komplexen Polymerisats rI:rG alle 2 bis 3 Tage auf die naealen und j oralen Hautteile aufgebracht. Diese Verabreichungsperiode beruht auf der verlängerten Dauer des induzierten Interferons.

Die Applikation kann mittels einer wässerigen Suspension in einem Aspirator-Spray erfolgen, so daß ein oder zwei Sprühvorgänge etwa 0,01 bis 10 mg freisetzen. Es kann auch ein Aerosolpräparat unter Verwendung von herkömmlichen Fluorchlorkohlenwas serstoffen als Treibmittel hergestellt und verwendet werden. Außerdem kann das Präparat als eine pharmazeutische Nasentropfenflüssigkeit angewendet werden.

Dieses Präparat wird im Falle von tatsächlicher Infektion der Atemwege etwa alle 2 bis 3 Tage auch therapeutisch angewendet. Es liegt in der Entscheidung des Arztes, ob eine häufigere (beispielsweise tägliche) oder eine weniger häufige Verabreiohung (wie jeden 4. Tag) angezeigt ist.

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Eines der anderen erfindungsgemäßen Induzierungsmittel kann das rlrrC des vorliegenden Beispiels ersetzen, wobei deren oben erörterte relative Aktivität in Betracht zu ziehen ist.

Beispiel 10

Augenpräparat "*

Für prophylaktische und therapeutische Anwendung in den Augen wird ein herkömmliches' Augentropfenpräparat, wie steriles Erdnußöl, derart aufbereitet, daß ein einziger Tropfen 0,01 bis 10 mg des komplexen Polymerisats rlrrC oder eines anderen der obigen Induzierungsmittel enthält. Ein einziger Tropfen wird alle 2 bis 3 Tage auf das Auge angewendet.

^ Tropfen werden aufgrund ihrer therapeutischen Aktivität auf ein Auge angewendet, das mit Herpes, Adenovirus und Vaccinia und auch mit Trachoma infiziert ist. Es wird gleichzeitig als ein prophylaktischer Schutz auf das nicht-infizierte Auge angewendet.

Eine herkömmliche Augensalbe wird derart hergestellt, daß die gewöhnlich angewendete kleine Menge 0,01 bis 10 mg des rI:rC enthält. Diese Salbe kann beispielsweise ein Polyäthylen/flüa- ^ siges Petrolatum-Gel sein. _:

Beispiel 11 Hautpräparat

Zur Anwendung auf die Haut in geschädigten Bereichen kann das Interferon-InduzierungBmittel herkömmlichen Grundlagen für Salben, Cremes, frötions oder flüssigen Präparaten derjärt ' BUgesetzt werden, daß 1 g 0,1 bis 100 mg beispielsweise rlirC enthält. Eb wird alle 2 bis 3 Tage angewendet.

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Beispiel 12 Steriles In.iektionspräparat

Repräsentativ für ein Präparat zur parenteralen Verabreichung ist eine herkömmliche sterile Lösung oder Suspension-auf öl-

oder Wasserbasis, wie physiologische Kochsalzlösung. Ein ■
■5

cnr davon enthält 0,1 bis 100 mg des ausgewählten erfindungs- gemäßen Interferon-Induzierungsmittels und wird in Fällen von Vireninfektion alle 2 bis 3 Tage injiziert.

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Claims (1)

12530 15. Januar 2#8 1 7 3 A

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Induzierung der Bildung von Interferon in lebenden Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man an die Zellen ein komplexes Polymerisat verabreicht, das unter PoIynucleotid-altemierenden Mischpolymerisaten, Komplexen von zwei Homopolynucleotiden, die substituierte Nucleotidkomponenten enthalten, und Hybriden zwischen einem Polydesoxyribonucleotid und einem Polyribonucleotid, die substituierte Nucleotidkomponenten enthalten, ausgewählt ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung der Paare durch Wasserstoffbindung erfolgt, wie die Hypochrom!zitat im ultravioletten Bereich anzeigt.

.3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen in einem lebenden Wirt vorliegen. · ,

4* Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen in einem lebenden Wirt vorliegen und daß das' komplexe Polymerisat systemisch verabreicht wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen in einem lebenden Wirt vorliegen"und das komplexe Polymerisat topisch verabreicht wird.

6. Verfahren naoh Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen aus einem lebenden Wirt abgetrennt worden sind und in einem Kulturmedium vorliegen.

7. Verfahren nach Anspruoh 1, dadurch gekennzeichnet, daß das komplexe Polymerisat aus Komplexen von zwei verschiedenen Homopolynucleotiden besteht, die substituiert· Nuoleotidein-

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OFUGWAL INSPECTED

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heiten enthalten, ausgewählt unter substituierter Adenylsäure, substituierter Uridylsäure, substituierter Inosinsäure und substituierter Oytidylsäure.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nur eines der Polynucleotide chemisch verändert ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das komplexe Polymerisat rI:rBC ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das komplexe Polymerisat rICrrIC ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das komplexe Polymerisat rIBCYrIBC ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das komplexe Polymerisat Pl DNA-RNA ist.

13. Pharmazeutisches Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es bei der Verabreichung an lebende Zellen die Bildung von Interferon in den Zellen induziert und einen pharmazeutischen Träger und ein komplexes Polymerisat umfaßt, das unter PoIynucleotid-alternierenden Mischpolymerisaten, Komplexen von zwei Homopolynucleotiden, die substituierte Nucleotidkomponenten enthaltep, und Hybriden zwischen einem Polydeeoxyribo- " nucleotid und einem Polyribonucleotid, die substituierte Nucleotidkomponenten enthalten, ausgewählt ist. . ■

1.4. Mittel.nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, daß das komplexe Polymerisat aus Komplexen von zwei verschiedenen Homopolynucleotiden besteht, die substituierte ''~~.. Nucleotideinheiten enthalten, ausgewählt unter substituierter Adenyleäure, substituierter Uridylsäure, substituierter Inoeineäure und substituierter Cytidylsäure·

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HO

15. Mittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß, nur eines der Polynucleotide chemisch verändert ist.

16. Mittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das komplexe Polymerisat rI:rBC ist.

17. Mittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, .daß das komplexe Polymerisat rIC:rIC ist.

18. Mittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das komplexe Polymerisat rIBC:rIBC ist.

19· Mittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das komplexe Polymerisat Pl DNA-RNA ist.

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