DE2051745A1

DE2051745A1 - Von Nucleinsäuren stammende Arznei mittel und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2051745A1
Application number: DE19702051745
Authority: DE
Inventors: Jean Pierre Prof Straßburg Colobert Louis Eugene Mane Prof Coüonges au Mont dOr Louisot Pierre Prof Lyon Ebel, (Frankreich) P
Original assignee: Fa Ugine Kuhlmann, Paris
Priority date: 1969-10-21
Filing date: 1970-10-21
Publication date: 1971-04-29
Also published as: GB1294580A; NL7015376A; US3737524A; BE757653A; JPS502008B1; FR2068412A1

Description

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF onR17A^r

PATENTANWÄLTE L U ν) Ι / 4 ν)

8 MÜNCHEN 2. HI LBLESTR ASSE 2O

Dr. Berg Dipl.-Ing. Stapf, 8 München 2, Hllblestrofle_20_

^{lhrZeichen U11}-™ """■ 21. Okt. 1971

Anwaltsakte 20 041 J3e/A

Ugine Kuhlmann
Paris (Frankreich)

"Von Nucleinsäuren stammende Arzneimittel und Verfahren zu

ihrer Herstellung"

Die vorliegende Erfindung betrifft Ribonucleinsäuren (RIiD) und Desoxyribonucleinsäuren (DNS), die aus menschlichen (ieweben extrahiert und chemisch modifiziert sind, Verfahren zu ihrur Horn tellur) ■■; und neuo, sie enthaltend« Arzneimittel.

I DOB I B/ 2 1 2')

Es wurden bereits Ribonucleinsäure-Hefeextrakte als Arzneimittel vorgeschlagen, die geeignet sind, gegen Vireninfektionen der Atmungsorgane eine Resistenz zu verleihen. Die Erfindung hat das Ziel, Zubereitungen mit bedeutend größerer Aktivität zu erreichen.

Man hat im Laufe von Vorarbeiten festgestellt, daß die verschiedenen Varietäten von Ribonuclein— oder Desoxyribonucleinsäuren, isoliert oder im Gemisch, die aus Geweben einer gegebenen Tierspezies (beispielsweise Kalbsnieren oder Hühnerembryonen) extrahiert wurden und die man danach so behandelt hatte, daß die Purin- oder Pyrimidinbasen, die an ihrem Aufbeu beteiligt sind, chemischen Modifikationen, wie Alk -ylierung, Halogenierung, Acetylierung, der Einwirkung von Salpetrigsäure, Oxydation unterworfen werden, wobei diese Angaben hinsichtlich der chemischen Modifikationen nicht erschöpfend sind, die Eigenschaft aufweisen, besonders wirksam zu sein bei den verschiedenen Zellenoder Gewebeinfektionen der gleichen Tierspezies, von der diese modifizierten Nucleinsäuren anfangs extrahiert wurden, sofern diese bei den angegebenen Zellen oder Geweben angewendet werden.

Weiterhin verhindern Ribonucleinsäure-Extrakte von Kalbsnieren, die nachfolgend methyliert wurden, sofern man sie in das Kulturmedium einführt, wo sich die Kalbsiiierenaellen in vitro vermehren, den Myxovirus Parainfluenzae I (Virus

U) fl 8 I B / 2 1 2 3

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Sendai), sich in diesen Zellen zu vermehren. Eine solche Vermehrung läuft in dem Kulturmedium ohne modifizierte Nucleinsäuren oder bei den gleichen, chemisch nicht modifizierten Nucleinsäuren ab„ Diese Tatsache wurde in der folgenden V/eise demonstriert: die Ribonucleinsäuren, die vollständig aus Kalbsnierenzellen extrahiert wurden, werden unter der Einwirkung von 4 Mol Methylsulfat pro Nucleotid in dem Reaktionsmedium methyliert, dann mit den in Kultur befindlichen Zellen 1 Stunde lang bei 37°0 vor der Einimpfung des Sendai-Virus in Kontakt gebrachte Die so methylierten Nucleinsäuren inhibieren in bemerkenswerter V/eise die Virenentwicklung«, Wenn die Konzentration der methylierten Nucleinsäure-Lösung 70_o10~ g/ml oder mehr erreicht, ist die Inhibierung der ^irenvermehrung vollständig O

Dieses Phänomen steht damit in Verbindung, daß in den Kalbsnierenzellen Substanzen auftreten, die in der Literatur unter der Bezeichnung "Interferon" bekannt sind, jedoch ist nicht auszuschließen, daß andere Faktoren zu dem Schutzphänomen beitragen·

Analoge Feststellungen hat man in den Fällen beobachtet, bei denen die Ribonucleinsäuren Extrakte von Hühnerembry-

,bei denen
onen sind und der untersuchte Virus der Sindbis-Virus ist, von dem bekannt ist, daß er sich leicht in Hühnerfibroblasten vermehrt; hier ist wiederum, wenn die modifizierten

-4-

1 (lii y- i '■ I ? T ? 3

Ribonucleinsäuren in das Kulturmedium in einer Dosis von 100.10 g/ml eingeführt Werden, die Inhibierungswirkung auf die Virenvermehrung sehr "bedeutend? diese Inhibierungs· wirkung wird vollständig, wenn
g/ml oder mehr verwendet wird·

wirkung wird vollständig, wenn als Konzentration 200.10

In den oben erwähnten Versuchen waren die verwendeten Ribonucleinsäuren "Gesamf-Ribonucleinsäuren, d. h. Gemische verschiedener Arten von in Zellen vorkommenden Ribonuclein-

i
säuren, insbesondere von den so bezeichneten "Ribosomen¹¹- und Iransfer-Nucleinsäuren. Man hat die einen von den anderen dieser beiden Ribonucleinsäure-Varietäten getrennt. ^v.Nach Methylierung hat man festgestellt, daß die einen wie die anderen bei den gleichen Gewichtskonzentrationen genau die gleichen biologischen Eigenschaften aufweisen wie die Gemische.

Man hat den Einfluß der verschiedenen chemischen Modifikationen bei den Ribonucleinsäuren, den Ribosomen einerseits, den Transfer andererseits, die auf Hühnerbasis hergestellt waren, auf die Vermehrung des Sindbis-Virus untersucht. Eine Inhibierungswirkung wurde in allen Fällen festgestellt, sei es, daß die chemische Umwandlung die Methylierung, Allylierung, Acetylierung,Desamin3ervng mittels Salpetrigsäure, Oxydation durch Monoperphthalsäure, Bromierung, Chlorierung, Jodierung gewesen ist. Bei einer gegebenen Art einer modifizierten Ribonucleinsäure ist die festgestellte

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Inhibierungswirkung umso bemerkenswerter, als die Menge der in das Zellkulturmedium eingeführten, modifizierten ETucleinsäuremenge höher ist, bis zu einer Konzentrationsgröße, bei der eine' maximale Inhibierungswirkung erreicht wird. Die optimale Konzentration variiert in den verschiedenen Fällen zwischen 20„10" g/ml und 100.10 g/ml.

Die gegenüber der Virenvermehrung ausgewiesene Resistenz, wie sie oben beschrieben wurde, ist nicht ausschließlich den modifizierten Ribonucleinsäuren zuzuschreiben» Die Desoxyribonucleinsäuren weisen diese Resistenzeigenschaften in gleicher Weise auf, sofern sie analogen chemischen Behandlungen, insbesondere einer Methylierung, unterworfen wurden. Es wurde auf diese Weise festgestellt, daß die Entwicklung des Sindbis-Virus in Hühnerfibroblasten inhibiert wird, sofern diese angegebenen Fibroblasten 2 Stunden lang bei 37°C in Kontakt gebracht werden mit einer Lösung von 9 g Natriumchlorid pro Liter, die Konzentrationen zwischen 10.10" g/ml und 50.10"" g/ml Desoxyribonueleinsäure-Hühnerextrakt, der dann methyliert wurde, enthalten. Gleichfalls liefert Desoxyribonucleinsaure, methyliert durch die Einwirkung von Methylsulfat im Verhältnis von 4 Mol pro Nucleotid in dem Reaktionsmedium,die gleiche Aktivität wie Desoxyribonucleinsaure, die durch Einwirkung von 6 Mol Methylsulfat pro Nucleotid methyliert wurde, während "natürlich vorkommende" Desoxyribonucleinsaure, die nicht der Einwirkung von Methyleulfat unterworfen wurde, wirkungslos

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ist· Man hat schließlich festgestellt, daß die Desoxyribonucleinsäure bei einer gleichen Gewichtskonzentration eine Resistenz-Induktionswirkung gegenüber der viralen Entwicklung liefert, die der der Ribonucleinsäuren identisch .ist, die mittels der Einwirkung von 4 Mol Methylsulfat pro Nucleotid methyliert wurden. Eine Konzentration von 50.10 g/ml genügt, um 80 #ig die Virenvermehrung zu inhibieren·

Während die Eigenschaften der modifizierten Ribonucleinsäuren und der modifizierten Desoxyribonucleinsäuren analog sind, hat man festgestellt, daß dies auch¹ für das Gemisch dieser beiden Substanzvarietäten zutrifft. Man hat weiterhin festgestellt, daß kein Unterschied der Inhibierungswirkung im Hinblick auf die Entwicklung des Sindbis-Virus in Hühnerfibroblasten bei"gleichen Gewichtskonzentrationen zwischen der modifizierten Ribonucleinsäure, der modifizierten Desoxyribonucleinsäure, dem modifizierten Gemisch von (30 $») Desoxyribonucleinsäure- und (70 ?£) Ribonucleinsäure-. Hühnerextrakten auftritt, wobei die Modifizierung durch die Einwirkung von 4 Mol Methylsulfat, pro Nuoleotid erhalten wurde·

Aus diesen Erkenntnissen geht hervor, daß die natürlichen, von Geweben einer gegebenen Tierspezies extrahierten Substanzen, die als "Nucleinsäure" anzusprechen sind, geeignet sind, in den Zellen der gleichen Tierepezies einenItesiatenzzuBtand gegenüber verschiedenen Vireninfektionen zu

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liefern, sofern diese Substanzen verschiedenen chemischen Modifikationen unterworfen wurden, die geeignet sind, die in ihren Aufbau eingetretenen Purin- oder Pyrimidinbasen zu ändern. Man hat gleichzeitig festgestellt und es ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung, daß dies auch für den Mensehen zutrifft und daß die Nucleinsäuren menschlichen Ursprungs, isoliert oder im Gemisch, wie man sie beispielsweise aus den Leukozyten des Bluts oder Placentageweben herstellen kann und nachdem sie chemisch modifiziert wurden, geeignet sind, wenn man sie beim Menschen zu therapeutischen Zwecken verwendet, die Resistenz gegenüber Vireninfektionen sehr verschiedener Arten, besonders solchen, die dafür bekannt sind, daß sie gegenüber Substanzen des "Interferon"-Typs empfindlich sind, erhöhen. Man kann demgemäß entweder eine Infektion durch eine geeignete Behandlung während der Inkubationszeit oder während deren Verlauf in günstiger Weise modifizieren. Die Erfindung umfaßt also auch die Verabfolgung von Ribonuclein- und Desoxyribonucleinsäuren menschlichen Ursprungs und chemisch modifiziert in der Humanmedizin zur Behandlung von Tireninfektionen.

Die vorliegende Erfindung umfaßt in gleicher Weise ein Herstellungsverfahren für die neuen Arzneimittel, das darin besteht, isoliert oder im Gemisch Ribonuclein- und Desoxyribonucleinsäure-Extrakte aus menschlichen Geweben chemischen Reaktionen, wie der Alkylierung, insbesondere Methylierung, Rthylierung, Allylierung, Acylierung, insbesondere Acetylierung. Desaminierungj Oxydation, Halogenierung, zu unterwerfen. Die wesentliche Eigenschaft der Erfindung beruht nicht in den bei den Nucleinsäuren jeweils verwendeten,

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besonderen chemischen Reaktionen, sondern allgemein in allen chemischen Reaktionen, die bei Ribonuelein- und Desoxyribonucleinsäure-Extrakten bei menschlichen Geweben unter Bedingungen vorgenommen werden, die nicht tiefwirkend die allgemeine Struktur dieser Säuren modifizieren, aber jedoch Modifikationen in den diese Säuren bildenden Purin- oder Pyrimidinbasen hervorrufen.

Die Extraktion der Ribonucleic und Desoxyribonucleinsäuren ™ aus Geweben menschlichen Ursprungs kann nach allen bekannten Verfahren erfolgen, im besonderen mittels Phenol, mit Wasser gesättigtem Phenol und mit Pufferlösungen gesättigtem Phenol. Nach Extraktion der Gewebe kann man für die vorgesehene spätere chemische Reaktion Gesamt- Ribonuclein- oder Desoxyribonucleinsäuren oder die vorausgehenden, isolierten* besonderen Säuren, wie die "Ribpsom"- und die "Transfer"-Nucleinsäuren verwenden«,

_Ä Die verwendeten Gewebe menschlichen Ursprungs können sehr verschiedener Art sein, jedoch ist es angezeigt, Gewebe zu verwenden, über die man laufend verfügen kann, wie Placentas oder Blutleukozyten.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne sie einzuschränken.

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Herstellungsverfahren Beispiel 1

^a) Zerkleinerung der Placenta

Nach Entnahme wird die Placenta in physiologischem Serum gewaschen, dann sofort auf -20⁰C eingefrorene Das Zerkleinern wird in einem Glasbecher eines "lurmix"-Mischers vorgenommen und man führt darin nacheinander die verschiedenen Zuschläge in den folgenden Anteilen zu:

- 100 g gefrorenes Gewebe, vorausgehend in kleine Stücke zerkleinert;

- 200 ml Irishydroxymethylaminomethan (weiterhin Iris bezeichnet) - 10"²M HCl, pH 7,3, 10~²M MgCl₂-PUfferlösungj

- 0,25 $ Cemulsol NPT6 (ein auf dem Markt bekanntes Produkt als oberflächenaktives Mittel)$

- 300 ml gesättigtes Phenol (durch Iris, MgClg-Pufferlösung wie vorher), die unmittelbar bei Verwendung unter Zugabe von 1 #igem 8-Hydroxychinolin hergestellt wurde«, Dieses letztere Gemisch wird weiterhin als "76 9&iges Phenol" bezeichnet»

Das Gewebe wird in drei 1 Minuten langen Behandlungen mit einminütiger Unterbrechung zerrieben· Dieses Arbeitsverfahren wird 10 mal wiederholt, um 1 kg Placenta zu zerreiben. Der erhaltenen homogenen Masse werden 0,3 # Natriumdodeoylsulfat zugegeben, und sie wird der Extraktion zur Gewinnung von HH^-S unterworfen·

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b) Herstellung von RNS

Die vorausgehende Emulsion wird 3 aufeinanderfolgenden Extraktionen bei 4°C unterworfen.

1. Extraktion; einstündiges Rühren, 15 Minuten Zentrifugieren bei 2000 U/Min., Entnahme der wäßrigen und intermediären Phase, der Niederschlag der Zentrifugierung wird zur Seite gestellt·

2ο Extraktion: Zugabe eines gleichen Volumens 76 #igen Phenole zu den vorausgehenden wäßrigen und intermediären Phasen, 45 Minuten langes Rühren der Suspension, Zentrifugieren, Entnahme allein der wäßrigen Phase«,

% Extraktion» Zugabe eines halben Volumens von 76 Phenol zu der vorausgehenden wäßrigen Phase, 30 Minuten langes Rühren der Suspension, Zentrifugieren, Entnahme der wäßrigen Phase.

Die Nucleinsäuren werden aus der wäßrigen Endphase durch Zugabe von 2 Volumen Äthanol in Gegenwart von 0,1 M Na Cl ausgefällt. Nach vollständiger Ausfällung (4 bis 16 Std· bei -20⁰O) wird der Niederschlag zentrifugiert, in 10~*M NaGl gelöst und dann erneut in 2 Volumen Äthanol ausgefällt. Er wird bei -2O⁰C konserviert·

Die so erhaltenen Nucleinsäuren enthalten 75 bis 80^ RNS und 20 bis 25 <£ DNS. Die letztere wird mittels Desoxyribo-

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nuclease unter den nachfolgenden Bedingungen entfernt: die durch die Nucleinsäuren gebildete Ausfällung wird in einem Minimum an Pufferlösung Tris-10~²M HCl, 10"²M MgOl₂ beim pH 7,3 gelöst. Man läßt die Desoxyribonuclease im Verhältnis von 0,1 >ug/ml bei 4⁰C in 20 bis 30 Minuten ablaufen· Nach Abkühlen der Lösung in schmelzendem Eis führt man eine Extraktion mit V2 Volumen 76 tigern Phenol aus, mit dem Ziel, die enzymatischen Proteine zu entfernen« Schließlich wird die RNS aus der wäßrigen Phase durch Zugabe von 2 Volumen Äthanol in Gegenwart von 0,1 M NaGl ausgefällt« Die Ausfällung von ENS wird von Phenolspuren durch 2 oder 3 aufeinanderfolgende Waschungen mit einem Äthanol-Wasser-Gemisch (70 : 30 Vol/Vol) befreit.

^c) Methvlierung

Zu einer lösung der so erhaltenen Nucleinsäuren in 10 ^M NaCl gibt man vorsichtig und unter Rühren 0,05 Volumen 8 M Kaliumacetat, um eine Lösung von 0,4 M in Ealiumacetat zu erhaltene Das erneut destillierte Methylsulfat wurde im Verhältnis von 4 Mol pro Nucleotid zugegeben. Die Reaktion erfolgte nicht sofort, und man laßt sie 22 Stdo lang bei 4 C ablaufen«, Nach beendeter Reaktion werden die methylier— ten Nucleinsäuren durch 2 Volumen Äthanol in Gegenwart von 2 i* Ealiumacetat ausgefällt« Die Ausfällung wird zentrifugiert und zwei mal mit dem Äthano1-0,1 M NaCl (2 t 1 Vol/ VoI)-Gemisch gewaschen, dann erneut in 10"^M NaGl gelöst. Die erhaltene Lösung, die 1 bis 2 mg/ml methylierte RNS

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enthält, wird gegen Wasser bei 4⁰C 16 bis 24 Stunden lang dialysiert, dann lyophilisiert.

Beispiele 2 bis 4

Man verfährt wie in Beispiel 1, verwendet aber anstelle von 4 Mol Methylsulfat pro verwendetem Nucleotiden nach dem letzten Absatz 2 bzw_e 6 und 8 Mol pro Nucleotid.

Beispiel 5

Der nach der ersten Extraktion von RNS mit Phenol in Beispiel 1 erhaltene Zentrifugierungsniederschlag, der zur Seite gestellt wurde, wird in einem Puffertris- 10""²M HCl, pH 7,3, 10 M MgCIp in einer Menge von 500 ml, bezogen auf den aus 100 g Gewebe erhaltenen Niederschlag, in Suspension gebracht. Man gibt 2,5 $> Natriumdodecylsulfat zu und rührt kräftig 5 bis 10 Minuten. Die viskose Suspension wird zwei Phenol-Extraktionen bei Zimmertemperatur unterworfen.

1o Extraktion: Zugabe von 1 Volumen 76 tigern Phenol, einstündiges Rühren, Zentrifugieren, Entnahme der wäßrigen Phase.

2ο Extraktion: Zugabe von V2 Volumen 76 #igem Phenol, 30 Minuten langes Rühren, Zentrifugieren, Entnahme der wäßrigen Phase.

Die DNS wird durch Zugabe von 2 VoI Xthanol zur wäßrigen Endphase ausgefällt· Die Fasern werden gesammelt, nachein-

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- 13 ander in Methanol von 75» 85 und 95° gewaschen und in

10 M NaGl gelöst. Die erhaltene Lösung weist eine Trübung auf, die dem Vorhandensein von Glycogen zuzuschreiben ist» Dieses wird durch zweistündiges Zentrifugieren mit 105 000 g entfernt»

Die so hergestellte Lösung von DNS ist mit 5 "bis 7 <fi Proteinen verunreinigte Diese werden auf wenigstens 0,5 "/> durch zwei aufeinanderfolgende Behandlungen mit einem Chloroformisoamylalkohol-G-emisch (24 si Vol/Vol) reduziert» Die Ionenkonzentration der Lösung, die 0,5 bis 1 ing DNS pro ml aufweist, wird auf 0,1 M in NaGl erhöht % danach rührt man 15 Minuten lang mit V2 Volumen Chloroform-Isoamylalkohol-Gremisch· Nach 5 Minuten Zentrifugieren mit 2000 UpM wird die obenstehende wäßrige Phase entnommen und einer zweiten Behandlung unterworfen, die unter denselben Bedingungen durchgeführt wirde Zuletzt werden die DNS-Fasern unter Zugabe von 2 Volumen Äthanol zur wäßrigen Endphase erneut ausgefällt. Die so erhaltene DNS wird, wie die RNS in Beispiel 1, methyliert, jedoch werden die Fasern gesammelt und nacheinander in Äthanol von 75» 85 und 95° gewaschen, bevor sie erneut in 10 M NaGl gelöst und dann gegen 10 M NaGl dialysiert werden. Nach einer neuen Ausfällung mit 2 Volumen Äthanol werden die Fasern gesammelt und 24 Stunden lang in einen Exsiccator gebracht.

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Beispiel 6

Sie Ribonucleinsäuren werden wie in Beispiel 1 hergestellt. Sie werden dann in die Trimethylhexadecylammoniumsalze unter den nachfolgenden Bedingungen überführt« zu einem Volumen einer Lösung der Nucleinsäuren in 10 ^M NaCl gibt man 1 Volumen·der Lösung von Trimethylhexadeoylammoniumbromid, wobei man auf diese Weise eine leicht über der stöchiometriechen Menge liegende Menge zugibt. Nach 5 Min. schonendem Rühren wird die erhaltene Ausfällung zentrifugiert, dann drei mal unter Zentrifugieren mit 2 Volumen Wasser gewaschen, um das im Überschuß vorhandene Ammoniumealz zu entfernen. Die nicht getrockneten Ausfällungen der quarternären Ammoniumnucleate werden danach in 2 VoI Dimethylformamid unter kräftigem, mechanischem Rühren gelöst, (wodurch ec möglich ist, eine Lösung zu erhalten, die 0,5 bis 1 mg Nucleinsäuren pro ml enthält)· Man gibt danach 10 Mol Allylbromid pro Nucleotid zu. Nach Rühren läßt man 22 Stunden bei 4-⁰C ruhen.

Die allylierten Nucleinsäuren werden danach mit 2 Volumen Äthanol in Gegenwart von 2 i» Kaliumacetat ausgefällt· Die Ausfällung wird zentrifugiert und zwei mal mit dem Gemisch Äthanol-O,1 M NaCl (2 ι 1 Vol/Vol) gewaschen, dann erneut in 10"% NaCl gelöst· Die erhaltene Lösung, die 1 bie 2 mg/ml RNS enthält, wird gegen Wasser bei 4⁰G 16 bis 24 Std· dialysiert und dann lyophilieiert·

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Beispiele 7 und 8

Man verfährt wie in Beispiel 6, verwendet aber anstelle von 10 Mol Allyrbromid pro verwendetem Nucleotiden des letzten Absatzes 50 bzw. 60 Mol pro Nucleotide

Beispiel 9

Man stellt wie in Beispiel 5 DNS her« Diese werden wie in Beispiel 6 allyliert, aber die Fasern werden gesammelt und nacheinander in Äthanol von 751 85 und 95° gewaschen, bevor sie erneut in 10 ^M NaGl gelöst, dann gegen 10 -lä NaCl dialysiert werden. Nach einer erneuten Ausfällung mit

2 VoI Äthanol werden die Pasern gesammelt und 24 Stunden in einen Exsiccator gebracht·

Beispiel 10

Zu einer Lösung von RNS in Dimethylformamid, hergestellt wie in Beispiel 6, gibt man gleiche, berechnete Volummengen Tributylamin, Dioxan und Essigsäureanhydrid so zu, daß man 30 Mol von diesem zuletzt angegebenen Reagens pro Nucleotid zur Verfügung hat. Nach Rühren läßt man 20 Std_e bei Zimmertemperatur (20 C) ruhen. Nach abgelaufener Reaktionsdauer werden die Natriumsalze der acetylierten Nucleinsäuren aus den organischen Lösungen durch Zugabe einer

3 M NaCl-Lösung (tyiO des Gesamtvolumens) ausgefällt· Nach Zentrifugieren wird der Niederschlag zwei mal mit dem Äthanol-0,1 M NaCl-Gemisch (2 : 1 Vol/Vol) gewaschen, dann erneut in 10 M NaCl gelöst. Die erhaltene Lösung wird

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bei 4°C gegen Wasser dialyeiert, dann lyophilisiert.

Beispiele 11 und 12

Man verfährt wie in Beispiel 10, verwendet aber anstelle von 30 Mol Essigsäureanhydrid 10 bzw» 15 Mol dieses Reagens mit gleichen Volumen Tributylamin und Dioxan»

Beispiel 13

Zu einer Lösung von RNS, erhalten wie in Beispiel 1, in 10 M NaCl gibt man vorsichtig und unter Rühren 0,1 Volumen 2,5 M Natriumacetat, pH 4»3 zu, (so daß man eine 0,25 M-Lösung erhält)β Die RNS wird danach mit 0,1 VoI einer Lösung behandelt, die gleichzeitig aus 3 M Natriumnitrit hergestellt wurde ο Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt« Die modifizierten Nucleinsäuren werden durch 2 VoI Äthanol in Gegenwart von 2 $ Kaliumacetat ausgefällte Die Ausfällung wird zentrifugiert und zwei mal mit einem Gemisch von Ä'thanol-0,1 M NaCl (2 ι 1 Vol/

—3 VoI) gewaschen und dann erneut in 10 M NaCl gelöst. Die erhaltene Lösung, die 1 bis 2 mg/ml RNS enthält, wird gegen Wasser bei 4⁰C 16 bis 24 Stunden dialysiert, dann lyophilisiert.

Beispiel 14

Man verfährt wie in Beispiel 13» ersetzt aber die verwendeten 0,1 VoI 3M Natriumnitrit-Lösung durch 0,2 VoI dieser gleichen Lösunge

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Beispiel 15

Man verfährt wie in Beispiel 13» ersetzt aber die verwendete RNS-Lösung durch eine Lösung von DNS, die wie im ersten Teil von Beispiel 5 erhalten wurde in 10 M NaOl. Die Fasern werden gesammelt und nacheinander in Äthanol von 75» 85 und 95° gewaschen, bevor sie erneut in 10~% NaGl gelöst, dann gegen 10 ^M NaGl dialysiert werden. Nach einer erneuten Ausfällung durch 2 VoI Äthanol werden die Pasern erneut gesammelt und 24 Stunden lang in einen Exsiccator gebracht.

Beispiel 16

Eine Lösung von RNS, die nach dem Verfahren von Beispiel 1

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erhalten wurde, in 10 ^M NaCl wird im Verhältnis von 10 M an Pufferphosphat pH 7 und 10 M Mg⁺⁺ gebracht» Man gibb eine wäßrige Lösung von Monoperphthalsaure zu, die auf pH 7 eingestellt ist und 2,5 Mol Monoperphthalsaure pro Mol Nucleofcid enthält und läßt die Oxydationsreaktion 5 Std. lang bei 22⁰G ablaufen. Nach beendeter Reaktion werden die modifizierten Nucleinsäuren durch 2 VoI Äthanol in Gegenwart von 2 $ Kaliumacetat ausgefällt. Die Ausfällung wird zentrifugiert und zwei mal mit dem Äthanol-0,1 M NaCl-G-emisch (2:1 Vol/VoI) gewaschen, dann erneut in 10" M NaCl gelöste Die erhaltene Lösung, die 1 bis 2 mg/ml modifizierte RNS enthält, wird gegen Wasser bei 4°G 16 bis 24 Stunden dialysiert, dann lyophilisiert,

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Beispiele 17 und 18

Man verfährt wie in Beispiel 16, verwendet aber 7 bzw, 11,5 Mol Monoperphthalsäure anstelle von 2,5 Mol»

Beispiel 19

Man oxydiert mit Monoperphthalsäure,wie in Beispiel 16 eine DNS, die nach dem Verfahren erhalten wurde, wie es im ersten Teil von Beispiel 5 beschrieben ist und beendet wie in Beispiel 15·

Beispiel 20

Eine Lösung von Trimethylhexadecylammonium-Ribonucleat in Dimethylformamid, die erhalten wurde nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren, wird durch eine Passage über Natriumsiliciumaluminat dehydratisiert» Man gibt eine Brom-Menge, die vorausgehend in Dimethylformamid gelöst wurde, entsprechend 1 Mol Brom pro Nucleotid zu«, Nach einer Reaktionszeit von 30 Sekunden bis zu 1 Minute wird die Regeneration des modifizierten Natriumribonucleat mit einer NaBr-Lösung in Dimethylformamid (Y4 des Gesamtvolumens) bewirkt, um die Einführung von Wasser in das Reaktionsmedium zu vermeiden«. Nach Zentrifugieren wird der Niederschlag zwei mal mit einem Äthanol- 0,1 M NaCl-Gemisch (2:1 Vol/Vol) gewaschen, dann in 10 M NaOl erneut gelöst· Die erhaltene Lösung wird gegen Wasser dialysiert, dann lyophilisiert.

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Beispiele 21 und 22

Man verfährt wie in Beispiel 20, verwendet aber 0,5 "bzw» 4 Mol Brom pro Nucleotide

Beispiele 23» 24 und 25

Man verfährt wie in Beispiel 20, ersetzt aber das Brom

.oder 5 durch N-Ohlorsuccinimid, wobei man V oder 15 Mol N-Chlorsuccinimid pro Nucleotid verwendet» Die Natriumsalze der modifizierten ENS werden indessen durch wäßrige 3 M NaCl-Lösung (V1O des Gesamtvolumens) statt durch eine organische NaBr-Lösung regenerierte

Nach der Regenerierung der Natriumsalze der Nucleinsäuren werden diese zentrifugiert« Die Niederschläge werden zwei mal mit dem Äthanol-0,1 M NaCl-Gemisch (2 i 1 Vol/Vol) gewaschen, dann erneut in 10 M NaOl gelöst« Die erhaltenen Lösungen werden gegen Wasser dialysiert, dann lyophilisiert·

Beispiel 26

Jodchlorid in Lösung in Dimethylformamid wird einer Lösung von RNS, (die wie in Beispiel 6 erhalten wurde), in dem gleichen Lösungsmittel in einer Konzentration von 2 Mol JCl pro Nucleotid in das Reaktionsgemisch zugegeben» Nach 2 Stunden Reaktion bei 4⁰C wird die RNS aus der organischen Lösung durch Zugabe einer 3 M NaCl-Lösung (ViO des Gesamtvolumens) regeneriert. Nach Zentrifugieren wird der Nieder-

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schlag zwei mal mit dem A'thanol-0,1 M NaGl-Gemisch (2 : 1 Vol/Vol) gewaschen, dann in 10~-^M NaCl erneut gelöst. Die erhaltene Lösung wird gegen Wasser bei 4°C dialysiert, dann lyophilisiert.

Beispiele 27 und 28

Man verfährt wie in Beispiel 26, verwendet aber 4 bzw. 6 Mol JGl pro Nucleotide

Physikalisch-chemische und analytische Eigenschaften Die Nucleinsäure-Extrakte aus menschlichen Geweben sind in 10"⁵M NaGl löslich. Die Lösung der RNS ist leicht, die der DNS erfordert sanftes Rühren und eine minimale Lösungszeit von 48 Stunden. Bei den gelösten Nucleinsäuren kann man ohne Nachteil die Ionenkonzentration der Lösungen, (beispielsweise bis auf 0,2 M in NaCl, in Zitrat usw.), erhöhen. Die maximale Löslichkeit:

RNSi 5 mg/ml ο Darüber handelt es sich um Suspensionen. DNS: über einer Konzentration von 500/Ug/ml sind die Lösungen viskos.

Untersuchungen haben gezeigt, daß die molekulare Integrität der modifizierten (heterologen oder homologen) Nucleinsäuren nicht unbedingt notwendig war, um eine Inhibierungswirkung gegen Vireninfektion zu bilden. Andere Arbeiten, besonders die von Kawade und üjihara (Nature 1969, 221,

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569),zeigen, daß RNS, die einer alkalischen Hydrolyse unterworfen wurde oder Gemische von Mononucleotiden inaktiv sind. Diese Tatsachen zeigen, daß eine gewisse polyribonucleotide Struktur notwendig ist, um die gewünschte biologische Aktivität zum Einsatz zu bringen. RNS und DNS aus Placenta wurden verschiedenen Kontrollverfahren unterworfene

^a) Spektrophotometrisoh.es Verfahren RNS- und DNS-Extrakte aus Placenta liefern ein Absorptionsspektrum in ultraviolettem licht, das für Nucleinsäuren charakteristisch ist, d„ h«,, sie zeigen eine minimale Absorption bei 230 mja und ein Maximum bei 260 m Ai₀ Die Verhältnisse der optischen Dichten

in gleicher Weise den allgemeinen Werten der Nucleinsäuren

b) Ultrazentrifugierungen
- Bestimmung der Sedimentationskonstanten Die Sedimentationskonstante ist direkt proportional der molekularen Masse und hängt von den Abmessungen des in Lösung befindlichen Partikels ab_e Die Bestimmungen der Sedimentations-Koeffizienten (S) wurden dadurch bewirkt, daß man das Absorptionsverfahren in UV mit Zellen in KeIP verwendete.

- Zentrifugieren der Nucleinsäuren in einem linearen

Konzentrationsgradienten in Saccharose Die auf der Oberfläche eines SaccharOBe-Gradienten abgela-

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gerten, dann zentrifugieren Nucleinsäurelösungen wandern mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten entsprechend der Masse und Form ihrer Moleküle· Man hat Zentrifugierungen 16 Stde bei 4 C in einer Ultrazentrifuge mit linearen Saccharosekonzentrationsgradienten von 20 bis 5 Po100 erhalten.

Die RNS bilden einen polydispersen Querschnitt entsprechend ihren Molekülen und weisen Sedimentationskonstante zwischen 50 und 4 S auf.

Die DNS zeigen charakteristische, einzigartige Spitzen, die im wesentlichen zwischen 9 und 13 ^igen Saccharosekonzentrationen sedimentierene Die analytischen Ultrazentrifugierungs-Messungen erlaubenden DNS eine Sedimentations-Konstante von ungefähr 15 S zuzuschreiben·

Analyse der modifizierten Nucleinsäuren Die Analyse der chemisch modifizierten RNS und DNS wurde mittels zweidimensionaler Chromatographie auf Whatman t-Papier bewirkt· Das Hydrolysenverfahren und die verwendeten Lösungsmittel sind entsprechend der in Betracht kommenden Modifizierungen variabel· Die chemischen Modifikationsarten und -werte, die als Funktion der Molzahl der in das Reaktionsmedium eingeführten Reagentien erhalten wurden, sind in der Tabelle angegeben· Entsprechend der Art und dem Wert der chemischen Modifikation beobachtet man eine mehr oder weniger bedeutende Destabilisierung der

109818/212!

durch Änderung der Schmelzkurven sichtbaren sekundären Struktur· Durch die sehr erhöhten Modifizierungswerte stellt man Spaltungen des Nueleinsäuremoleküls fest» Die Lösungseigenschaften der modifizierten Nucleinsäuren sind denen der nicht modifizierten RNS und DNS identisch.

Mit RNS- und DNS-Extrakten von menschlichen Placentas erhaltene chemische Modifikationsarten und -werte als Funktion der Molzahl der in das Reaktionsmedium eingeführten

Reagentien
In wäßrigem Milieu

Modifikation

Mol des Reagens pro Nucleotid

Art und Prozentsatz der in Frage kommenden Basen

Adenin

Guanin

Cytosin

(D

(2)

(3)

(4)

(5)

1-Methyl- 7-Methyl- 3-Methyladenin guanin cytosin

Methylie- rung durch Methyl sulfat	2 4 6	Spuren 5-12 10 - 15	10 15 - 20 -	25 30	2 4	Spuren Spuren
	8	45 - 55		17	8-12
		Hypoxan- thin	Xanthin	Uracil
Deaminie- rung durch Salpetrigsäure	50 100	1 - 2 3-4	1 - 3 -	2 4-5

-24-

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Fortsetzung Tabelle

(D	(2)	(3)	(4)	(5)
		1-Hydroxy-	Abbau v»	1-Hydroxy-
		adenin (A)	Gruanin	cytosin (C)
		Abbau von		Abbau von
		Adenin (B)		Cytosin (D)
		A B		G D
Oxydation	2,5	16 14	13	5 9
durch
Monoper-	7	27 22	29	12 17
phthal-
säure	11,5	34 23	34	16 18

Mit RIfS- und DNS-Extrakten von menschlichen Placentas erhaltene chemische Modifikationsarten und -werte als Funktion der Molzahl der in daa Reaktionsmedium eingeführten

Reagent!en

	In Dimethylformamid-Medium	Art und Prozentsatz der in Frage kommenden Basen	Cytosin	Uracil (im Falle von RNS)
Modifikation	Mol des Reagens pro Nu- cleotid	Guanin	(3) (4), 8-Bromgua- 5-Brom nin cytosin 30-35 5-10 70-80 20 - 35	(5) 5-Brom- uracil 13 80
	(2) 1 4
(D Bromierung durch Brom

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gortsetzung Tabelle

(D

(2)

(3) (4)

(5)

Jodierung
durch Jodchlorid

Allylierung durch.
Allylbromid

Acetylierung
durch. Essigsäureanhydrid

1 2

10 50 60

10 15 30

Abbau

Chlorierung	1	2-4
durch. N-
Chlorsuc-	5	25
cinimid
	15	35

7-Allylguanin

4-6 6 8 5-Ohloruracil

2-3 20

5-Jod-6-hydroxy-5|6-dihydrouraeil

40

55

6-Acetylcytosin

Die Ergebnisse sind ausgedrückt durch das Verhältnis:

-26-

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Thymin "bleibt im Falle von DNS in den durchgeführten Reaktionen unbeeinflußt.

Pharmakologische Eigenschaften

Die Toxizität der modifizierten EJJS und DNS wurde mit methylierter ENS von menschlicher Placenta, methylierter
DNS von menschlicher Placenta und einem Gemisch von 75 ^6
methylierter KNS von menschlicher Placenta und 25 $> methylierter DNS von menschlicher Placenta untersucht·

Oral wurden die drei Produkte in Suspension in einem
10 $igen G-ummi arabicum-Schleim verabfolgt. Die aus Placenta-Material stammende, modifizierte DNS ist nach grobem Pulverisieren in einer Konzentration von 0,06 i* in Wasser unlösliche Demgegenüber wurden die beiden anderen Produkte im Verlaufe von 48 Stunden in eine wäßrige Lösung von einer Konzentration von 0,2-5 $> gebracht, und die Lösungen wurden isotonisch gemacht durch Zugabe von ClNa unmittelbar vor
den Injektionen. Bei Mäusen sind die methylierten Nucleinsäuren die methylierte RNS, und das Gemisch von methylierter ¹¹RNS plus DNS^M nicht toxisch bei einer Dosis von 3000
mg/kg p.Oe und 125 mg/kg i.V.. Die methylierte DNS aus
Placenta war toxisch bei 1500 mg/kg Ρ·ο·. Schließlich wird, welche Verabfolgung man auch wählt, keine Symptomatologie bei Mäusen durch diese modifizierten Nucleinsäuren gesetzt.

Es folgen nunmehr einige Beispiele, um die Wirkung von

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einigen modifizierten Nucleinsäuren aus menschlicher Placenta auf verschiedene Virusarten und die Bildung von starken Interferon-Konzentraten in menschlichen Leukozyt-Kulturen aufzuzeigen.

1) Nucleinsäure-Extrakte von menschlicher Placenta, später methyliert mit 4 Mol Methylsulfat pro Nucleotid in dem Reaktionsmilieu, inhibieren die Entwicklung des Virus der Vesikulär-Mundentzündung (VeS₀Ve) in diploiden Mens chen-Kultürζ eilen _e

Die Versuche wurden in der folgenden Weise durchgeführt: Man führt in das Kulturmedium von Zellen aus einer ersten Entnahme,die von menschlichen Embryonen-Nieren herrühren und in einzelliger Stammform kultiviert wurden, wachsende Dosen von methylierten Ribonucleinsäuren aus menschlicher Placenta ein· Zwölf Stunden später entfernt man das Milieu und impft jede Flasche mit einer solchen V.S.V.-Virusmenge, daß man in den Kontrollflaschen, in die keine Nucleinsäuren eingeführt wurden oder in denen nicht modifizierte Nucleinsäuren natürlichen Ursprungs eingeführt wurden, 50 Necrose-Plaquetten nach 24 Stunden Kulturzeit bei 37°C zählt. Man stellt auf diese Weise fest, daß die Konzentration von 200·10 g/ml methylierte Nucleinsäuren 95 #Lg die Virenentwicklung inhibieren· Schwächere Konzentrationen von 10 χ 1O~ g/ml weisen noch Inhibierungsaktivität auf, die aber weniger ausgeprägt ist.

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Ähnliche Ergebnisse werden mit einem Gemisch von methylierten Ribonuclein- und Desoxyribonucleinsäuren erhalten, in dem sich diese Verbindungen in entsprechenden Verhältnissen von 70 und 30 $ befinden.

2) Nucleinsäure-Extrakte von menschlicher Placenta, später methyliert mit Hilfe von 4 Mol Methylsulfat pro Nucelotid in dem Reaktionsmilieu,induzieren in einer Kultur menschlicher Leukozyten die Bildung starker Interferon-Konzentrate»

Man führt in jedes Reagenzglas einer Reihe 2 ml menschliches Gesamtblut, aufgenommen in Heparin, ein. Man gibt dann in jedes Reagenzglas 1 ml einer Lösung der methylierten Ribonucleinsäuren aus menschlicher Placenta, was die Endkonzentration zwischen 750.10 g/ml bis 5,5.10 g/ml variiert.

Die Reagenzgläser werden 18 Stunden bei 37⁰C gehalten,

Man gibt dann in jedes Reagenzglas 7 ml Natriumchloridlösung von 9 g/1000 ml. Der Inhalt jedes Glases wird auseinander zentrifugiert» Der Niederschlag wird entfernt. Die überstehende Schicht wird 24 Std. bei 4°0 gegen Glykokoll-HCl-Puffer, pH 2, dialysiert, dann 24 Stunden gegen destilliertes Wasser.

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Der Tiber'des in dieoen dialysierten lösungen enblialfcenen Inberferons wird mit Hilfe des Sysbems bestimmt, das'durch den vesikulären Stomatitis-Virus und einen polyploiden Zellenabamm aus diploiden Zellen menschlichen Ursprungs W 38 gebildet wird. Der V.S.V. liefert nach 24 Std. bei 37⁰C Necrose-Plaquetten auf diesen Zellen, aber diese Zellen können gegen den V.S,V. durch menschliche Interferon-Bildung geschützt sein.

Man sbellt für jede Lösung zum Titrieren, wobei man das KuI-burmedium für die Zellen als Verdünnungamibbel verwendet, Verdünnungen 1/40, ]/80, 1/160, 1/320 und I/64O her. Man

2
führb in ein Fläschchen von 75 cm , dessen Oberfläche durch Zellen abgedeckt isb, die gegenüber dem 7.S.V.-Virus empfindlich aind, 7 nil der zu- untersuchenden Interferon-Verdünnung ein. Sie wird dann 10 Stunden beL 37°0 gehalten. Die Flüssigkeit wird dann entfernt. Man führt Ln das Fläschchen 0,5 ml einer solchen V.S.V.-VirusVerdünnung ein, daß die Anzahl der Plaquetten, die in den Konbrollfliäsohchen, die kein Interferon erhalben hatten, festgestellt wurde, nach 24 Sbunden bei.37⁰P ungefähr 100 beträgt.

Nach 30 Minuten gibt man 6,5 nil Kulturmedium zu, und das Fläflohohen wird dann 24 Stunden lang bei 37°0 bebrütet. Zu diesem Zeitpunkt zählb man dio Anzahl dor Neeroso-J?locken bzw» «Plaquetten. _:

-30-

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Der Titer der untersuchten Interferonlösung wird durch die Inversion der stärksten Verdünnung, die die Anzahl der Flecken bzw, Plaquetten von 50 <$> gegenüber der Kontrolle reduziert, ausgedrückt.

Unter diesen Bedingungen beobachtet man, daß Konzentrationen von methylierten Menschen-Nucleinsäuren, die in Menschen-Gesamtblut mit Konzentrationen über 11.10 g/ml eingeführt wurden, die Interferon-Bildung induzieren., Konzentrationen von 47.10" g/ml oder darüber liefern eine gleiche Induzierungswirkung, wobei der Titer mit interferierender Wirksamkeit im allgemeinen 1/320 ist„

Konzentrationen zwischen 47.10" g/ml und 11.10 g/ml bilden eine erkennbare, aber immer weniger markierte Induzierung3aktivität.

Die gleichen Beobachtungen wurden mit dem Gemisch (70 $, 30 i>) von methylierten Ribonuclein- und Desoxyribonucleinsäuren aus menschlicher Placenta gemacht.

Beispiel für die therapeutische Anwendung Man 3 teilt eine Salbe mit 1 i» lyophilisiertem Produkt her, das durch Methylieren von einem Gemisch von 75 bis 80 # RNS-und 20 bi3 25 # DHS-Extrakt au3 menschlicher Placenta mit 4 Mol Methylsulfat erhalten wurde. Diese Salbe ist ein ExzLpient der folgenden ZusammensetzungJ

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- Cetylalkohol 5 %

- Stearinalkohol 5 %

- Propylenglykol 10 % -Polyoxyäthylenglykolstearat 10 %

- polyoxyäthylierter Fettalkohol 10 %

- Methylparahydroxybenzoat 0,1 %

- destilliertes Wasser 59,9 %

Man behandelt mit dieser Salbe 5 bis 15 Tage lang mit Virendermatosen befallene Kranke (Herpes, venerische Vegetationen, Gürtelflechte) in 7 von 20 Fällen ist die therapeutische Wirkung zufriedenstellend.

/ΙΟ<*χι2 ΙχηΖΊ " ³² '

Claims

Patentansprüche :

1. Arzneimittel, insbesondere für die Humanmedizin zur Behandlung von Virenerkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie chemisch modifizierte Ribonucleinsäuren und Desoxyribonucleinsäuren menschlichen Ursprungs enthalten.

2. Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln dadurch gekennzeichnet, daß man Ribonucleinsäure- oder Desoxyribonucleinsäure-Extrakte von Geweben menschlichen Ursprungs chemischen Reaktionen unter solchen Bedingungen unterwirft, daß die allgemeine Struktur dieser Säuren nicht tief modifiziert wird, aber die Purin- und Pyrimidinbasen, die Bestandteil dieser Säuren sind, Modifikationen unterworfen werden.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Reaktion eine Alkyliernngsreaktion ist.

¹J. Verfahren gemäß Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Reaktion eine Acylierungsreaktion ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, daß die Chemische Reaktion eine Deaminierungsreaktion ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Reaktion eine Oxydationsreaktion ist.

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7. Verfahren gemäß Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Reaktion eine Halogenierungsreaktion ist.

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