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DE2041647A1 - Zellreihe aus der Leber menschlicher Embryonen,Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung - Google Patents

Zellreihe aus der Leber menschlicher Embryonen,Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

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DE2041647A1
DE2041647A1 DE19702041647 DE2041647A DE2041647A1 DE 2041647 A1 DE2041647 A1 DE 2041647A1 DE 19702041647 DE19702041647 DE 19702041647 DE 2041647 A DE2041647 A DE 2041647A DE 2041647 A1 DE2041647 A1 DE 2041647A1
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DE
Germany
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cells
virus
viruses
medium
cell
Prior art date
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Pending
Application number
DE19702041647
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English (en)
Inventor
Zuckerman Arie Jeremy
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NAT RES DEV
Original Assignee
NAT RES DEV
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/32364—Methods of inactivation or attenuation by serial passage

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Description

•Die Erfindung betrifft die Herstellung von Zellreihen bzw. permanenten Zellkulturen (cell lines), die Züchtung von Viren auf diesen Zellreihen und Impfstoffe, die diese Viren enthalten. .
Im Hinblick auf die Schwierigkeiten, die-mit der Verwendung von primären Kulturen zur Züchtung von Viren verbunden sind, sov/ie auf die hohen Kosten derartiger Kulturen und ihrer begrenzten Eignung ist die Entwicklung neuer Zellreihen, die für die medizinische Forschung und zur herstellung von Impfstoffen verwendet v/erden können, Gegenstand umfangreicher Forscuungsarbeiten. Es v/urden viele Zellreihen
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gefunden, aber verhältnismäßig wenige sind aufgrund ihrer Instabilität und der Entwicklung unerwünschter Eigenschaften für andere als Forschungszwecke geeignet.
Es hat sich jetzt durch ein sorgfältiges Verfahren als möglich erwiesen, eine neue Zellreihe aus der Leber menschlicher Embryonen herzustellen, die serienmäßig gezüchtet werden kann und den Vorteil besitzt, diploid zu sein.
Erfindungsgemäß wird eine Zellreihe aus der Leber menschlicher Embryonen dadurch hergestellt, daß man die Leber aufschließt (disaggregating), die Zellen in einem Wachstumsmedium suspendiert, dieses, wenn es sauer wird, durch frisches Medium ersetzt, und sich eine zusammenfließende Schicht von spindelförmigen Zellen der Zellreihe bilden läßt.
Die zu züchtenden ^eberzellen werden zuerst voneinander getrennt, Eine geeignete Methode dafür ist die Behandlung mit Trypsin, wobei vorzugsweise 2 oder 3mal bei ungefähr 2O0C mit einer Lösung von Trypsin behandelt wird. Das Trypsin kann dann, z.B. durch Zusatz von in der Wärme inaktiviertem fötalem Kälberserum, inaktiviert werden und die Zellsuspension wird 2mal in dem V/achstumsmedium gewaschen, wobei bei verminderten Temperaturen leicht zentrifugiert wird.
Die Zellen werden dann in einem Wachstumsmedium gezüchtet, wobei ein ein Minimum der notwendigen Substanzen enthaltendes LIedium nach Eagle (Eagle's minimum essential mediuu) eine geeignete Grundlage fur dieses liachstumsmedium darstellt, das giinstigerweise zusammen mit 10 bis 1fj> in der hitze inaktivier tea fötalem Kalberserum und verschiedenen Zusätzen verwenaut wird. Jas bevorzugte Verfahren zur Züchtung der Zellen in Suspension bei miscn-lOpulatiGn in dem Wachstumsmed ium \n:v, tor, L ü'U'in, daß mm gleiche Anteile der
• _ 1Z _
fj η :· η -.·) j : f) 3 η BAD ORIGINAL
Suspension in Leighton-Rohrchen mit Deckplättchen gibt und bei ungefähr 55°C inkubiert. Das Waehstumsiuediuiii wird vorzugsweise gewechselt, wenn der pH-Wert des Mediums in den sauren Bereich kommt, was normalerweise alle 3 bis 4 Tage der Fall ist. Im allgemeinen reicht eine Zeitdauer von 5 bis 7 Tagen, um eine zusammenfließende Schicht der neuen Zellreihen zu bilden, wobei andere ursprünglich vorhandene Zellen nicht mehr am Leben bleiben.
YJenn man das Verfahren sorgfältig ausführt, ist es möglich, die neue Zellreihe in reproduzierbarer Weise zu erhalten, die bei Medical Research Council's of Immunological Products Control, Hampstead, London und bei A.T.C.C. unter | Nr. CL99 hinterlegt worden ist. Die Zellreihe besitzt.die folgenden Cbarakteristika:
1. Sie bildet einfache Schichten von spindelförmigen Zellen, die weiter gezüchtet werden und eine Reihe von Passagen durchlaufen können. Ein Kollagen-Substrat ist dabei nicht erforderlich.
2. Es sind weder Leberzellen (Hepatocytes) noch mit der Blutbildung zusammenhängende Zellen (heamapoietic series) vorhanden.
3. Durch Elektronen-Mikroskopie kann gezeigt werden, daß die Zellen keine Pibroblasten sind.
4. Die Untersuchung der Zellkerne (karylogy) zeigt, daß sie diploid sind.
5. Die Zellsuspension kann unter flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden.
Die Erfindung umfaßt auch ein Zellkultur-System, das Zellen der Zellreihe menschlicher Embryonen in einem Nähr-
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medium enthält, das geeignet ist, um Säugetier-Zellen in Gewebekultur zu züchten oder zu erhalten.·
Es ist möglich, die neue Zellreihe zur Züchtung einer großen Vielzahl von Viren einschließlich Adeno-Viren, z.B. der Typen 2, 3, 4, 5, 7 und 17, San-Carlos-Viren, z.B. der Typen 3,6,8 und 49, ECHO-Viren, z.B. Typ 11, Anthropodborne Group A Viren, z.B. Sindbis-Virus, Pocken-Viren, z.B. Kuhpocken-Virus, Myxo-Viren und Paramyxo-Viren, z.B. Influenza-Viren wie den Influenza A2 Virus (Stamm A2/Singapore/i/57), Picorna-Viren, z.B. Poliomyelitis-Viren wie Sabin Polio-Virus Typ 1 und den AR-17 Haemo-Virus (isoliert von Parke Davis and Co.) zu verwenden. Außerdem wird die Verwendung der Zellreihe zur Vermehrung (replication) von Arbo-Viren und einigen anderen RNS-Viren sowie einigen Herpes-Viren 'und anderen DNS-Viren in Betracht gezogen. So wurde menschliches Serum, von dem man wußte, daß es Viren der infektiösen MS1 Hepatitis enthielt, auf ein Kultur-System aufgeimpft, das Zellen der Zellreihe enthielt, und die Ergebnisse zeigten das Auftreten eines cytopathogenen Effektes, entsprechend dem cytopathogenen Effekt,der durch AR-17 erzeugt wird,die auf diesem Medium gezüchtet werden können. Die Verwendung der neuen Zellreihe zur Züchtung dieser und anderer Stämme von Hepatitis-Viren ist daher erfindungsgemäß vorgesehen und stellt einen besonderen Vorteil dar im Hinblick auf die bisher ergebnislose Suche nach geeigneten Zellen, in denen diese Viren gezüchtet werden können.
Die Erfindung betrifft daher ferner ein Verfahren zur Züchtung dieser Viren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine lebensfähige Zellkultur aus einer ^ellreihe aus der Leber menschlicher Embryonen in einem Nährmedium hält, diese Kultur mit einem Virus impft, gegen den die Zellen empfindlich sind und den Virus in dieser Kultur züchtet. Die Zellen können auf jede geeignete Weise gezüchtet werden und das für das Wachstum vieler Viren verwendete Nährmedium kann günstigerweise das gleiche sein, wie es oben für das Wachstum der
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Zellreihe beschrieben woraen ist. Andere Viren können jedoch ein anderes Nährmedium erfordern, "um ein zufriedenstellendes Wachstum zu erreichen.
Die Erfindung betrifft ferner die Herstellung von Impfstoffen. Um die entsprechenden Impfstoffe aus Viren, die erfindungsgemäß gezüchtet worden sind, herzustellen, ist es notwendig, die Viren durch an sich bekannte Verfahren weiter aufzuarbeiten. So kann ein Virus gezüchtet werden, der ein .antigenes Endprodukt bildet, das in einer I'orm und Dosierung, in der es verabreicht werden kann, zu einer Vaccine verarbeitet wird, die . verwendet werden kann, um Antikörper zur passiven Immunisierung zu erzeugen. Die auf der neuen Zellreihe gewachsenen Viren können zur Herstellung von lebenden, abgetöteten oder verdünnten Impfstoffen verwendet werden, je nach der Art der Viren selbst. Die Impfstoffe können mit verschiedenen Medien zubereitet werden, wobei im allgemeinen eine isotonische Salzlösung verwendet wird, gegebenenfalls zusammen mit verschiedenen Zusätzen, wie z.B. Puffern. Die Impfstoffe können auf verschiedene paranterale Weisen verabreicht werden, z.B. intravenös, intramuskulär und subkutan.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:
Beispiel 1
Produktion der Zellreihe:
Die Jjeber 10 bis 22 Wochen älter menschlicher Embryonen, die durch Kaiserschnitt geboren worden sind, wird 20 Minuten bei 2O0C mit einer 0,2<frigen Trypsin-Lösung behandelt. Diese Trypsin-Behandlung wird 2 bis 3mal durchgeführt. Das Trypsin wird durch Zusatz von in der Hitze inaktiviertem fötalem Kälberserum inaktiviert, wobei eine Konzentration von 20/* entsteht. Die Zellsuspension v/ird 2mal in dem Wachstuiiismedium gewaschen, wobei 5 Minuten bei 40C mit 500 bis 600 U»p.M. leicht zentrifugiert wird. c
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Die Zellen (Mischpopulation) werden in einem WachstuiiiS-medium, das ungefähr 85'* Eagle's Medium mit einem Minimalgehalt an lebensv»ichtigen Stoffen, 155*» iß der Wärme inaktiviertes fötales Kälberserum, 0,15$> Natriumbicarbonat, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 //g/ml Streptomycin und 25 üinbeiten/ml Nystatin enthält, suspendiert. Von dieser Suspension werden jeweils Anteile von 2 ml, die ungefähr 8 χ 10 Zellen/ml enthalten in Leigtiton-Röhrchen mit einer Deckplatte gegeben und bei 350C inkubiert. Das Wachstumsraedium wird nach 3 bis 4 Tagen, wenn der pH-Wert des Mediums ins Sauere geht, ausgewechselt. Nach 5 bis 7 Tagen erhält man eine zusammenfließende Schicht von spindelförmigen Zellen, in der keine Leberzellen oder blutbildenden Zellen mehr vorhanden sind.
Die Elektronen-Mikroskopie zeigt, daß diese spindelförmigen Zellen keine typischen Fibroblastensind. Die Untersuchung der Zellkerne zeigt, daß sie diploid sind (mit Auftreten von Rissen - (break) - subdiploiden und polyploiden Formen, die als diploide Zellen angesehen werden können, obwohl die subdiploiden Resultate manchmal etwas hoch sind).
Die Zellsuspensionen können in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden, wobei entweder Dimethylsulfoxid, vorzugsweise in einer Konzentration von 20# (Yol./Vol.), was zu einer Endkonzentration von loft SuIfoxid führt, oder 5 bis 10^ί Glycerin verwendet werden.
Beispiel 2
Subkultur der ^ellreihe:
Die Zellen werden aus dem ursprünglichen Kulturgefäß, indem sie fest an dem Glas haften, durch Ablösen (disaggregation), z.B. durch Verwendung von Trypsin und anschließendes Abkratzen entfernt. So wird 1 ml einer 0,2?iigen Trypsin-
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Lösung in jedes Röhrchen gegeben und bei Raumtemperatur ungefähr 6 Minuten stehen gelassen. Das überschüssige Trypsin wird abgegossen und verworfen und es werden jeweils 2 ml eines Wachs tuinsmediuiüs zugegeben, das aus ungefähr · 85$ Eagle's Medium, 15$ in der Hitze inaktivierten fötalen Kälberserum, 0,15$ Natriumbicarbonat, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 yWg/ml Streptomycin, 25 Einheiten/ml Nystatin besteht. Die Röhrchen werden bei Raumtemperatur etwa 6 Minuten stehen gelassen, damit sich die Zellschicht ablöst. Etwaige, noch an dem Glas hängende Zellen werden dann von der Deckplatte mit einem gebogenen dünnen Glasstab entfernt und die erhaltene Zellsusperision mit einer Pasteur-Pipette angesaugt. Anteile von 1 ml der Zellsuspension werden in 2 neue Röhrchen gegeben und das Volumen mit Wachstumsmedium auf 2 ml in jedem Röhrchen erhöht. In ungefähr 2 bis 3 Tagen erhält man eine zusammenfließende einfache Schicht. ■·■■■■
Bei einer Reihenkultur in der oben beschriebenen Weise zeigen die Zellen typischerweise ein vollständig normales Wachstums-Schema bis zu 32. Duplikatur. Von der 33. Subkultur an wird jedoch eine Phase des Alterns beobachtet, die durch eine Verminderung der Wachstums-Geschwindigkeit und Erhöhung der körnigen Beschaffenheit gekennzeichnet ist. Typische Kern-Befunde der Zellreibe, die sich aus der Untersuchung der Metaphase-Platten ergeben, die bei verschiedenen Passagen erhalten wurden, sind in der unten stehenden Tabelle 1 angegeben und zeigen den Erhalt der diploiden Kern-Cbarakteristika der Zellen über eine Reihe von Tochter-Kulturen.
Tabelle 109809/2036
Tabelle
Passage Polyploidität Subdiploidität Chromosomen-Brüche mögliche
weitere
Brüche		 Sonstige
Abweichungen
15
17
23		 1/287
2/268
6/314		 1/42
6/32
6/27		 2/50
1/100
1/50		 0/100
ί/100
0/50		 0/100
0/100
0/50
Passage Achromatische
Schäden		 Gesamt
brüche
15
17
23		 0/50
2/100
0/50		 2/50
3/100
1/50
Beispiel 3
Allgemeines Verfahren.zur Züchtung von Viren in Zellreihen:
Die Virus-Suspension wird serienmäßig mit Phosphat-ge-
pufferter Lösung verdünnt, wobei man 0,2 ml einer entweder
-2 -3
10 -oder 10 -Verdünnung der Viren-Suspension für Leighton-Röhrchen oder Gewebekultur-Röhrchen und 0,4 ml einer entweder
-2 -3
10 - oder 10 -Verdünnung für Hedizinflaschen mit 28 ml Inhalt verwendet. Der Virus wird 30 Minuten bei 35°C an der Zellschicht absorbiert und dann wird das Vacbstuwsniediuni, das ungefähr 85^ Eagle's Medium, 15fr in der Hitze inaktiviertes fötales Kälberserum, 0,15?» Natriumbicarbonat, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100//g Streptomycin und 25 Einheiten/ml Nystatin enthält, zugesetzt. Die Röhrchen oder
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Flaschen werden täglich untersucht, um den cytopathogenen Effekt zu beobachten und der Virus wird gewonnen, wenn ungefähr 75$ der Zellen angegriffen sind. Der Titer des erhaltene]
liegen.
— 6 —V haltenen Virus kann im Bereich von 10" Ms 10"' pro ml
Beispiel 4 ■
Züchtung von AR-17 Haemo-Viren in der Zellreihe:
Der AR-17 Ausgangs-Virus wird von infizierten Detroit 6Y292 (558)-Zellen gewonnen. 'Dieses Material ist die 11.Gewebekultur dieses Virus', b Tage nach der Impfung zeigen die Kulturen eine deutliche Degeneration. Zu dieser Zeit werden sie gewonnen. Die Zellen und die Flüssigkeit werden gesammelt und dann dreimal schnell eingefroren und ' wieder aufgetaut. Die·Zeiltrümmer werden durch 10 Minuten langes Zentrifugieren mit 1500 U.p.M. entfernt und die erhaltene überstehende Flüssigkeit wird in Anteilen von 1 ml bei -55°ö aufbewahrt. Der Ausgangsvirus, 1:2 in Phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt in 0,2 ml auf die Einfach-Schicht von Zellen der Zellreihe aus der leber menschlicher Embryonen aufgeimpft, ergibt in Flaschen von 28 ecm Inhalt einen cytopathogenen Effekt innerhalb von 7 bis 9 Tagen nach der Impfung. Der von der I.Passage gewonnene Virus besitzt typischerweise einen TCIDcQ-Wert von 10 , aber kann nicht über diese erste Passage hinaus gezüchtet werden
Beispiel 5
Züchtung von San-Carlos-Virus Typ 3 in der Zellreihe:
Der Anfangs-San-Carlos-Virus 3 wird aus einem Virus gewonnen, der 5 Passagen in einer Primär-Kultur von Leberzellen menschlicher Embryonen durchlaufen hat. Die Kulturen werden 4 Tage nach der Impfung gewonnen, wenn ungefähr 75$
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der Zellen angegriffen sind. Die Zellen und die Flüssigkeit werden gesammelt und auf die in Beispiel 4 für den AR-17-Virus beschriebenen Weise behandelt. Die Titration dieses Materials in den Primär-Kulturen von Leberzellen menschlicher Embryonen ergibt typischerweise einen Titer von 10^» TCIDcn pro 0,1 ml.
Beispiel 6
Titration von Stock-Viren in der Zellreihe:
Die Titration einer Anzahl von Stock-Viren in der Leberzellreihe von menschlichen Embryonen ergibt Endpunkte, die denen ähnlich sind, die in dem menschlichen diploiden ZeIletamm aus Lungen, der als WI-38 bezeichnet wird, gewonnen wurden. Typische Ergebnisse hierfür sind in der folgenden Tabelle 2 angegeben:
Tabelle
Virus Titer TCID50 (Iog10/ml) WI-38
Lungen-Zellen
ECHO-Virus Typ 11
Sabin-Polio-Virus Typ 1
Adeno-Virus Typ 7
Sindbis-Virus		 Leber-Zellreibe
menschlicher
Embryonen		 8,3
6,7
6,0
6,8
8,2
7,1
5,2.
6,7
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Patentansprüche
- 11 -

Claims (12)

  1. Pat entansprüche
    1· Zellreihe aus der Leber menschlicher Embryonen, niedergelegt bei American Type Culture Collection unter der Wr.
    CL99 und bei Medical Research Council*s Division of Immunological Products Control, gegebenenfalls in einem Nährmedium, das zur Züchtung und Erhaltung von Säugetier-Zellen in Gewebe-Kultur geeignet ist.
  2. 2. Zellreihe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß sie mit einem Virus geimpft ist,
    der sich in diesen Zellen vermehren kann, und ein Nährmedium enthält, das das Wachstum der Viruszellen ermöglicht,
  3. 3. Zellreihe nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß das, Nährmedium Eagle's Medium ist,
    das in der Hitze inaktiviertes fötales Kälberserum enthält.
  4. 4. Verfahren zur Herstellung der Zellreihe nach Anspruch i-3j dadurch ge kenn zeichne t,daß man die Zellen voneinander trennt, sie in einem Wachstumsmedium suspendiert,
    dieses, wenn es sauer wird, durch frisches Medium ersetzt, · und sich eine zusammenfließende Schicht von spindelförmigen Zellen der Zellreihe, bilden läßt.
    - 12 -
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  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch .gekennzeichnet, daß man die Zellen durch Behandlung mit Trypsin, vorzugsweise bei ungefähr 2O0C voneinander trennt,
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung mit Trypsin 2- oder 3mal durchführt.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 4 bis 6, dadurch g e k e η η zeichnet , daß man als Grundlage des liährmediums Eagle'β Medium verwendet, das gegebenenfalls in der Hitze inaktiviertes fötales Kälberserum enthält.
  8. β. Verfahren nach Anspruch 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß die Zellen durch eine Reihe von Passagen in frischem Wachstuxasiaedium weitergezüchtet werden.
  9. 9. Verwendung der Zellreihe nach Anspruch 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet« daß man eine lebende Zellkultur in einem liährciediuia hält, mit einem Virus impft, gegen den die Zellen empfindlich sind, und den Virus in der Kultur züchtet.
  10. 10. Verwendung nach Anspruch 9 zur Züchtung von Adenoviren, San Carlos Viren, ECLO-Viren, Antbropodborne Gruppe A Viren, Pocken-Viren, liyxoviren, Paramyxoviren, Picornaviren und des AR-17 Kaeoovirus.
  11. 11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10 zur Züchtung von Adenovirus Typ 2, 3, 4, 5, 7 und 17, San-Carlos-Virus Typen
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    3, 6, 8 und 49» ECHO-Virus Typ 11, Sindbis-Virus, Kuhpocken-Virus, Influenza-A2-Virus und andere Influenza-Viren·, SaMn-Polio-Virus Typ 1 und andere Pöliomyelitis-Viren.
  12. 12. Antigenes Material aus den nach Anspruch 9 Ms 11 gezüchteten Viren.
    13· Vaccine, enthaltend das antigene Material nach Anspruch 12.
    ORIGINAL ü«Si'n£UTED
    109109/2031
DE19702041647 1969-08-22 1970-08-21 Zellreihe aus der Leber menschlicher Embryonen,Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung Pending DE2041647A1 (de)

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GB42062/69A GB1300391A (en) 1969-08-22 1969-08-22 Cell lines and virus culture

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DE2041647A1 true DE2041647A1 (de) 1971-02-25

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ID=10422668

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Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19702041647 Pending DE2041647A1 (de) 1969-08-22 1970-08-21 Zellreihe aus der Leber menschlicher Embryonen,Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

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GB (1) GB1300391A (de)

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