DE1227614B

DE1227614B - Verfahren zur Herstellung von BCG-Vaccinen

Info

Publication number: DE1227614B
Application number: DEC35927A
Authority: DE
Inventors: Dr Hubert Bloch; Dr Jakob Nueesch
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1964-05-26
Filing date: 1965-05-24
Publication date: 1966-10-27
Also published as: GB1108956A; BE664429A; NL6506628A; SE323171B; DK109876C; FR4701M; OA01734A; ES313319A1; BR6569942D0

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. α.:

A61k

Deutsche Kl.: 30h-6

Nummer: 1227 614

Aktenzeichen: C 35927IV a/30 h

Anmeldetag: 24. Mai 1965

Auslegetag: 27. Oktober 1966

Gegenstand der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von BCG-Vaccinen.

BCG (Bac. Calmette-Guorin) wird als Lebendvaccine zur Immunisierung gegen Tuberkulose verwendet. Die Vaccine wird aus BCG-Lebendkulturen, vorzugsweise durch Lyophilisierung, hergestellt.

Eine gute Vaccine soll einen möglichst hohen Gehalt an lebenden Zellen im Verhältnis zur Gesamtzahl der Keime aufweisen. Auch ist erforderlich, daß die Keime längere Zeit lebensfähig bleiben (Lagerungsfähigkeit der Vaccine) und sich gut resuspendieren lassen. Die Erfüllung dieser Anforderungen, bereitet große Schwierigkeiten, da BCG wenig temperaturbeständig insbesondere auch empfindlieh gegenüber den Bedingungen, wie sie bei ler Gefriertrocknung und Lagerung der Vaccine auftreten, ist.

Um die Stabilität der lyophilisierten Vaccine zu erhöhen, werden der BCG-Suspension vor der Lyophilisierung verschiedene Schutzsubstanzen zugesetzt, deren Wirkungsweise aber noch nicht restlos abgeklärt ist. Nach Greaves (Ann. N. Y. Acad. Sei., 85 [1960], S. 723 bis 728) suspendiert man das BCG-Sediment in einem »Trocknungsmedium«, das ein Trägermaterial, z. B, Dextran, zur Erzielung eines schwammigen Kuchens, eine »Puffersubstanz« zur Regulierung des Wassergehaltes der getrockneten Keime, z. B. Saccharose oder Natriumglutamat, und ein »Neutralisierungsmittel« für Carbonylgruppen, z. B. Natriumglutamat, enthält.

Auch die Einfriertemperatur, die Geschwindigkeit der Einfrierung und die Trocknungstemperatur haben einen Einfluß auf die Lebensfähigkeit der lyophilisierten Zellen.

Es ist auch bekannt (vgl. deutsche Patentschrift 1148 038), zwecks Erhöhung der Stabilität der lyophilisierten Vaccine BCG in einem Nährmedium zu züchten, das keine carbonylgruppenhaltigen oder durch BCG in carbonylgruppenhaltigen Verbindungen überführbare Substanzen enthält, insbesondere in einem Medium, das frei ist von Glycerin, Monosaccharide^ Zuckeralkoholen und Polysacchariden. Das Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß BCG in den anzuwendenden Nährmedien weniger gut wächst und daß die Züchtung nicht in technischem Maßstab in den bei der technischen Kultivierung von Mikroorganismen sonst üblichen Fermentern durchgeführt werden kann.

Es wurde nun gefunden, daß man auch unabhängig von der Art des Nährmediums die Stabilität von BCG im Hinblick auf Lyophilisierung und Lagerungsfähigkeit der Vaccine wesentlich verbessern kann und daß man daher auch Nährmedien verwenden kann,

Verfahren zur Herstellung von BCG-Vaccinen

Anmelder:

CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)

Vertreter:

Dr.-Ing. Dr. jur. F. Redies, Dr. rer. nat. B. Redies, Dr. rer. nat. D. Türk und Dipl.-Ing. Ch. Gille,
Patentanwälte, Opladen, Rennbaumstr. 27

Als Erfinder benannt;

Dr. Hubert Bloch, Basel;

Dr. Jakob Nüesch, Riehen (Schweiz)

Beanspruchte Priorität:
Schweiz vom 26. Mai 1964 (6839),
vom 25. März 1965 (4203)

die sich für die Herstellung von BCG-Lebendkulturen in Fermentern besonders gut eignen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein BCG-Kultur den Bedingungen der Herstellung und Lagerung der Vaccine unterwirft, die unter diesen Bedingungen am besten beständigen Einzellkulturen selektioniert, durch Züchtung vermehrt und danach zu Vaccine verarbeitet. Bei der Herstellung lyophilisierter BCG-Vaccine geht man beispielsweise so vor, daß man eine BCG-Kultur in bestimmter Weise lyophilisiert, längere Zeit, beispielsweise 1 bis 6 Monate, bei einer eventuellen Lagerungstemperatur der Vaccine, ζ. Β. 30 bis 40°C, oder beispielsweise 8 Tage bei maximal 50° C lagert, dann suspendiert, die Suspension auf einen festen Nährboden in solcher Konzentration aussät,daß die Kolonien getrennt wachsen, einzelne Einzellkolonien in flüssigem Nährmedium vermehrt, die so erhaltenen Einzellkulturen in gleicher Weise wie vorher lyophilisiert (etwa 10 bis 20 Ampullen zu 1 mg/ml pro Ein-

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zellkultur), zur Feststellung der Überlebensrate auf feste Nährböden' aussät, die Einzellkulturen mit 80 bis 100% Überlebensrate auswählt und als Ausgangsmaterial für die Herstellung der Lebendkulturen verwendet.

Es hat sich gezeigt, daß etwa 10 bis 100 Einzellkolonien zur Auslese von thermostabilen Einzellkulturen erforderlich sind. Einen erhaltenen thermostabilen Stamm mit guten immunisierenden Eigenschaften kann man so lange für die Gewinnung von BCG-Kulturen bzw. Vaccinen verwenden, bis sich eine Verschlechterung der Eigenschaften bemerkbar macht.

Das Lyophilisieren der BCG-Kultur wird in einem geeigneten »Trocknungsmedium«, vorzugsweise einer

wäßrigen Lösung von Dextran, Glutamat und einem Zucker, z. B. Saccharose, oder einer natürlichen Hexose, wie Glukose, Laktose oder Fruktose, vorgenommen. Man verwendet etwa 1 kg Bakterientrockengewicht pro Liter »Trocknungsmedium«. Als bestes Trocknungsmedium erwies sich eine Lösung von 5% Dextran, 5% Natriumglutamat und 5°/₀ Saccharose in destilliertem Wasser, fast gleich gut ist eine Lösung von 5% Dextran, 2% Natriumglutamat

ο und 5°/o Glukose in destilliertem Wasser. In der folgenden Tabelle 1 ist die Überlebensrate (Verhältnis der Anzahl lebender Keime pro ml nach Lyophilisierung zur Anzahl lebender Keime pro Milliliter vor der Lyophilisierung) in Prozenten," bezogen auf Medium I = 100%, angegeben.

Tabelle

Trocknungsmedium	% relative Überlebensrate
1	100
2	92
3	58
4	1
5	15
6	0

1 = 5% Dextran, 5 % Natriumglutamat,

2 = 5% Dextran, 2% Natriumglutamat,

3 = 3% Dextran, 2% Natriumglutamat,

4 = 3% Dextran, 3% Natriumglutamat,

5 = 0% Dextran, 2% Natriumglutamat,

6 = 0% Dextran, 0% Natriumglutamat, 5 % Saccharose, aq. dest. ad 1000 ml,
5% Glukose, aq. dest. ad 1000 ml,
3 % Laktose, aq. dest. ad 1000 ml,
2% Glukose,
2% Fruktose,

0%

8 % Saccharose, aq. dest. ad 1000 ml,
5 % Albumin,
Frakt. V,
3% Glyzerin,

aq. dest. ad 1000 ml,

5% Albumin,
Frakt. V,

Die zu lyophiüsierende Bakteriensuspension wird bei etwa —50° C möglichst schnell (Temperaturabfall 1 bis 3⁰C pro Minute) tiefgefroren. Die Trocknungstemperatur beträgt vorzugsweise —15 bis —20°C (bei 0,02 mm Hg). In diesem Temperaturbereich ist die Überlebensrate etwa lOOmal größer als bei —30°C.

Das Lyophilisat wird bei 0,02 mm Hg über Silikagel nachgetrocknet. Der Endwassergehalt der getrockneten BCG beträgt Ibis 2%·

Das getrocknete Bakteriengut wird unter den schärfsten Bedingungen, die für die Lagerung der Vaccine in Betracht kommen, beispielsweise bei einer Temperatur von 30 bis 40° C, längere Zeit, beispielsweise 6 Monate, oder kürzere Zeit bei maximal 50° C gelagert.

Um aus dem so erhaltenen Bakteriengut die lyophilisierungs- und lagerungsbeständigsten Mutanten auszulesen, resuspendiert man es, beispielsweise in einer 0,25 %iE^eQ Lösung von »Bovin Albumin Fraction V« (Hersteller Pentex Inc., Kankakee, Illinois), und sät es auf feste Nährböden, beispielsweise Löwenstein-Jensen-Agar aus. Die Konzentration der zur Aussaat verwendeten Suspension wird so gewählt, daß die Kolonien getrennt wachsen. Die Platten werden wie üblich bei 37⁰C inkubiert. Von den gewachsenen Einzellkolonien überträgt man eine Anzahl (beispielsweise 10 bis 20) getrennt in ein flüssiges Nährmedium in Schüttelkolben und inkubiert bei 37° C, bis die Kulturen gut gewachsen sind (optische Dichte bei 655 ηιμ, gemessen in einem photoelektrischen Kolorimeter, 0,5 bis 0,8, entsprechend einem Zelltrockengewicht von 0,25 bis 0,4 g pro Liter Kulturlösung). Zur Gewinnung einer homogenen Kultur überimpft man dann in neue Schüttelkolben mit der gleichen Nährlösung (5 Volumprozent Kultur pro neue Schüttelkultur) und läßt bis zu einem Zelltrockengewicht von 0,5 bis 0,75 g pro Liter Kulturlösung (optische Dichte 1,0 bis 1,5) wachsen. Dann zentrifugiert man ab, wäscht das Sediment, beispielsweise miteinerO,O5%igen Lösung von Albumin Fraktion V, suspendiert die verschiedenen Einzellkultursedimente in dem vorher verwendeten Trocknungsmedium und sät je einen Teil der Suspension auf ein festes Nährmedium (Löwenstein-Jensen-Agar) aus, während man einen anderen Teil unter den gleichen Bedingungen wie vorher lyophilisiert, resuspendiert und eine vergleichbare Menge der Suspension auf das feste Nährmedium aussät. Beim Inkubieren zeigt sich, daß die

Uberlebensrate der verschiedenen Einzellkulturen sehr verschieden ist (vgl. Tabelle 2).

Tabelle 2

Einzell- Kultur Nr.	Anzahl Kolonien pro Milliliter vor Lyophilisierung	Anzahl Kolonien pro Milliliter nach Lyophilisierung	Über lebensrate in%
1 2 3 4 5 6 7 8 9	1,03 · 10⁸ 9,0 -10' 7,8 -10' 8,6 -10' 4,8 -10' 1,47 · 10⁸ 1,07 · 10⁸ 1,03 · 10⁸ 1,16 · ΙΟ⁸	1,04 · 10⁸ 3,24 · 10' 7,0 ·10^β 5,44 · 10' 0 1,46 · 10⁸ 1,06 · 10⁸ 0 1,50 · 10'	1000 40 8 52 0 100 99 0 1

Bei den Einzellkulturen mit großer Überlebensrate handelt es sich um Kulturen, die aus einer genotypisch thermostabilen Mutante des BCG-Stammes hervorgegangen sind. Solche Kulturen eigeben bei der Züchtung in hohem Maße lyophilisierungs- und lagerungsbeständige Lebendkulturen, die zur Herstellung von lyophilisierten Vaccinen besonders geeignet sind. Die selektionierten Kulturen zeigen im Tierversuch die volle immunisierende Wirkung im Vergleich zu nicht lyophilisierten, frischen Lebendkulturen.

Die selektionierten Kulturen können zur Züchtung von BCG nach den bekannten Methoden verwendet werden. Ein besonderer Vorteil ist, daß man sie auch bei der technischen Züchtung von BCG in Fermentern als Ausgangsmaterial einsetzen kann. Dabei kann man eine Nährlösung verwenden, die Glyzerin als Kohlenstoff- und Energiequelle sowie Netzmittel vom Tween-Typ, z. B. Tween 80, enthält. Glyzerin wird in Konzentrationen von 20 bis 100 g/l Nährlösung, das Netzmittel in solchen von 1 bis 20 g/l gebraucht. Die übrigen Nährlösungsbestandteile, Stickstoffquellen, Salze, Spurenelemente, entsprechen den in der Literatur für die Züchtung von BCG angegebenen Medien. Das Verfahren zeichnet sich durch hohe Ausbeuten bei der Durchführung im technischen Maßstab (50- oder 500-1-Fermenter) aus.

Im folgenden Beispiel wird die Erfindung beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Beispiel

Eine BCG-Kultur wird zentrifugiert, das erhaltene Sediment mit einer sterilen 0,05⁰/oig^en Lösung von »Bovin Albumin Fraction V« gewaschen und in einem »Trocknungsmedium« (1 g BCG-Trockengewicht pro Liter) suspendiert. Das Trocknungsmedium stellt man her, indem man 50 g Dextran, 50 g Natriumglutamat und 50 g Saccharose mit destilliertem Wasser auf 11 auffüllt, auf 90° erhitzt bis zur vollständigen Lösung und nach dem Abkühlen auf etwa 30° seitzfiltriert. Die Suspension wird in Ampullen abgefüllt (Inhalt der Ampullen z.B. lmg BCG-Trockengewicht), in einer Kühltruhe mit Umlufteinrichtung mit einer Geschwindigkeit von 1 bis 3°/Min. auf —50° abgekühlt, dann in den Gefriertrockner gebracht und bei 0,02 mm Hg und —15 bis —20° getrocknet. In einem mit einer Diffusionspumpe evakuierten Exsikkator mit Silikagel wird das Lyophilisat bei 0,02 mm Hg nachgetrocknet und mit chemisch reinem, wasserfreiem Stickstoff begast. Schließlich schmilzt man die Ampullen zu. Nachdem man sie 6 Monate bei 37° gelagert hat, suspendiert man den Inhalt der Ampullen in einer 0,25%igen Lösung von Albumin Fraktion V und gießt die Suspension auf Löwenstein-Jensen-Platten in Petrischalen aus, so daß pro Petrischale nicht mehr als 100 Kolonien wachsen. Die Platten werden wie üblich 4 bis 6 Wochen bei 37° inkubiert. Neun der gebildeten Einzellkolonien impft man in 500-ml-Erlenmeyerkolben mit je 100 ml Nährlösung ab. Die Nährlösung hat folgende Zusammensetzung:

Glyzerin 50,0 g

Tween 80 15,0 g

Natriumacetat 1,0 g

ao L-Asparagin 2,0 g

Bacto Casiton 1,0 g

Hefeextrakt Difco 3,0 g

Kaliumphosphat, prim 1,0 g

Natriumphosphat, sek., 12H₂O 2,5 g

Ferriammoniumcitrat 10 mg

Magnesiumsulfat, 7H₂O 10 mg

Calciumchlorid, 6H₂O 0,5 mg

Zinksulfat, 7H₂O 0,1 mg

Kupfersulfat, 5H₂O 0,1 mg

deionisiertes Wasser ad 1000 ml

Die Lösung wird 20 Minuten bei 120° und 1,2 atü autoklaviert.
Die neun Erlenmeyerkolben werden auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 120 Umdrehungen pro Minute bei 37° inkubiert, bis die optische Dichte bei 655 πιμ 0,5 bis 0,8 beträgt. Dann überträgt man je 5 Volumprozent der Kulturen in neun neue Schüttelkolben mit der gleichen Nährlösung, läßt bis zum Erreichen einer optischen Dichte von 1,0 bis 1,5 wachsen, zentrifugiert ab und wäscht das Sediment jeweils mit 0,05%iger Albumin-Fraktion V-Lösung. Dann suspendiert man die Sedimente in dem obengenannten »Trocknungsmedium«. Je 0,5 ml der Suspension gießt man auf Löwenstein-Jensen-Platten aus, der Rest wird ampulliert, tiefgefroren und lyophilisiert, wie oben beschrieben. Danach resuspendiert man das Lyophilisat in adäquaten Mengen sterilem destilliertem Wasser und gießt je 0,5 ml auf Löwenstein-Jensen-Platten aus. Die Platten werden bei 37° inkubiert. Nach 4 bis 6 Wochen zählt man die Kolonien der Vergleichsplatten mit nicht lyophilisierten und mit lyophilisierten Kulturen. Das Verhältnis der letzten zu der ersten gibt die Überlebensrate (vgl.

Tabelle 2).

Die Isolationen Nr. 1, 6 und 7 zeigen eine praktisch 100%ig^e Überlebensrate. Sie werden als Ausgangsmaterial für die Züchtung von BCG in Fermenter- bzw. Schüttelkolben verwendet.

Die Züchtung wird wie folgt durchgeführt: Der Inhalt der Ampulle Nr. 1 wird auf Löwenstein-Jensen-Platten ausgesät, bei 37° inkubiert und die so erhaltene Kultur mit einer 0,25%igen Lösung von Albumin Fraktion V aufgeschwemmt. Die Suspension wird zur Beimpfung von 500-ml-Erlenmeyerkolben mit je 100 ml der obigen Nährlösung verwendet. Die Impfmenge beträgt 1 Volumprozent. Auf diese Weise stellt man auf einer rotierenden Schüttelmaschine

1,51 einer 9 Tage alten Kultur her, die eine optische Dichte von 0,4 bis 0,6 (bei 655 ηιμ) aufweist. Mit diesen 1,51 beimpft man einen 50-1-Fermenter (der in der Antibiotikaproduktion üblichen Bauweise) mit Luftverteiler, Rührer und Temperaturregulator, der 301 der obigen Nährlösung enthält. Die Züchtung erfolgt bei 37^s, bei einem Luftumsatz von 0,25 Volumen pro Volumen Nährlösung pro Minute und unter Rühren mit einem sechsblättrigen Turbinenrührer mit 50 Umdrehungen pro Minute. Nach 10 Tagen weist die Kulturlösung eine optische Dichte von 4,40 (bei 655 πιμ), d. h. ein Zelltrockengewicht von etwa 2,2 g pro Liter Kulturlösung, auf.

Die Kulturlösung wird zentrifugiert, gewaschen und, wie oben beschrieben, zu Vaccinen verarbeitet. Der Inhalt der Ampullen Nr. 6 und 7 wird zur Züchtung in 500-ml-Erlenmeyerkolben, wie oben beschrieben, verwendet. Die beiden so erhaltenen Lebendkulturen werden ebenfalls zu Vaccinen verarbeitet.

In der folgenden Tabelle 3 sind die Ergebnisse eines Vergleichs der erfindungsgemäß erhaltenen Vaccinen aus Isolationen Nr. 1 (Fermenter) und 6 und 7 (Schüttelkolben) mit Vaccinen, die ohne Selektion aus dem BCG-Ausgangsstamm erhalten werden, hinsichtlich Thermostabilität angegeben. Es wurden je fünf Ampullen mit 1 mg BCG-Trockengewicht 1 Woche bei 50° gelagert. Vor und nach der Lagerung wird der Gehalt an lebensfähigen, Kolonien bildenden Zelleinheiten (viable units) bestimmt. Die Zahlen sind Mittelwerte aus fünf Ampullen.

Tabelle

BCG-Stamm

Anzahl Kolonien je Milligramm

BCG-Trockengewicht
vor der Lagerung I naph der Lagerung

Überlebensrate

Selektion Nr. 1 (Fermenter) ,
Selektion. Nr. 6 (Schüttelkolben)
Selektion, Nr. 7 (Schüttelkolben)
Grundstamm

In Tabelle 4 ist die immunisierende Wirkung der obigen Vaccinen im Vergleich zu derjenigen einer frischen BCG-Kultur angegeben. Als Versuchstiere dienten weiße Mäuse. Der Inhalt der Ampullen mit 1 mg BCG-Trockengewicht wurde in 3 ml destilliertem Wasser, dem 3%o Tween 80 zugesetzt sind, aufgeschwemmt und die Suspension mit physiologischer Natriumchloridlösung bis zu einer Konzentration Von 10 bzw. Iy BCG/0,1 ml weiterverdünnt. Je 1,30 · 10^e
3,98 · IQ⁷
5,94 · 10⁷
1,84 ·10⁷

1,62 · 10"
6,92 -10»
7,5 -10⁶
2,31 ν 10*

1,25
1,74
1,26
0,13

20 Mäuse pro Versuchseinheit werden mit 1 ml einer Suspension, die 1 bzw. 1Oy BCG-Trockengewicht' enthält, subkutan geimpft. 4 Wochen nach der Impfung werden die Tiere intravenös mit einer letalen Dosis (0,4 ml mit 300000 Zelleinheiten (viable units) des bovinen Tb-Stammes Ravenel geimpft. Es wird die mittlere Überlebenszeit festgestellt. Nicht geimpfte Tiere sterben im Durchschnitt 20 Tage nach der Infektion.

Tabelle

Impfstoff

Selektion Nr. 1 (Fermenter) ,

Selektion Nr. 6 (Schüttelkolben)

Selektion Nr. 7

Frische BCG'Kultur (etwa 20 bis 30 γ BCG-Trockengewicht)

Claims

55 Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von BCG-Vaccinen aus BCG-Lebendkulturen, dadurch g e" kennzeichnet, daß man eine BCG-Kultur 6g den Bedingungen der Herstellung und Lagerung der Vaccine unterwirft, die unter diesen Bedingungen am besten beständigen Einzellkulturen selektioniert, durch Züchtung vermehrt und danach zu Vaccine verarbeitet. Mittlere Überlebenszeit
(je 20 Mäuse)

1Oy

lyBCG/Maus

24 Tage

35 Tage
26 Tage

BCG/Maus

43 Tage

39 Tage
36 Tage

39 Tage

2, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn-, zeichnet, daß man eine BCG-Kultur lyophilisiert, längere Zeit bei 20 bis 50° lagert, suspendiert, die ■ " Suspension auf einen festen Nährboden in solcher Konzentration aussät, daß die Kolonien getrennt wachsen, einzelne Einzellkolonien in flüssigem Nährmedium vermehrt, die so erhaltenen Einzellkulfuren lyophilisiert, zur Feststellung der Überlebensrate auf feste Nährböden aussät und die: Einzellkolonien mit einer Überlebensrate von¹ 80 bis 100% auswählt. .