DE1926072A1

DE1926072A1 - Verfahren zur Herstellung von cyclischem Adenosin-3',5'-monophosphat auf mikrobiologischem Wege

Info

Publication number: DE1926072A1
Application number: DE19691926072
Authority: DE
Inventors: Jiro Ishiyama; Nobuo Saito; Tamotsu Yokotsuka
Original assignee: Kikkoman Shoyu KK
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1968-08-09
Filing date: 1969-05-22
Publication date: 1970-02-26
Also published as: US3630842A; FR2015396A1

Description

DR. ELISABETH JUNG, UR. VOLKER VOSSlUS, DIPL.-ING. GERHARD COLDEWEY

Patentanwälte 1 Q O Cs Π 7

MÖNCHEN 23 · CLEMENSSTRASSE 30 · TELEFON 34 50 67 - TELEG R AMM-ADRESS E: · INVENT/MUNCHEN · TELEX 5 29686

2 2. MA11969

u.Z.! E 362 (Mü/Vo/we) POS - 17 641

KIKKOMAN SHOYU CO., LTD. Noda, Japan

ⁿ Verfahren zur Herstellung von cyclischen Adenosin-3¹,5' monophosphat auf mikrobiologischem Wege "

Priorität: 9. August 1968, Japan, Nr. 56 138/68 8. Oktober 1968, Japan, Nr. 72 863/68

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von cyclischem Adenosin-3',5'-monophosphat, nachstehend kürzer mit 3'»5'-cyclischer Adenylsäure oder A-3»5-MP bezeichnet, auf mikrobiologischem Wege durch Züchtung von Mikroorganismen, die zu den Gattungen Corynebacterium, Arthrobacter und Microbacterium gehören und die genannte Säure aus Adenosin, Adenin, Inosin, Hypoxanthin, 5-*Amino-4-lmidazolcarboxamid» 5**Ainino-4-imidazolcarboxamid-ribosid, Sucoinyladenosin oder Suooinyladenin in einem Nährmedium erzeugen können, das mindestens eine der genannten Verbindungen sowie übliche Nährstoffquellen enthält.

009809/0999 A-3,5-KP ist bekannt für seine Teilnahme an verschiedenen chemi-

P08TtCHECKK0NT0: MOWGHEN SOIJS ■ BANKKONTO: DEUTSCHE BANK A. G. MÖNCHEN. LEOPOLDSTR. 71. KTO. NR. 60/36794

sehen Reaktionen in lebenden Zellen und für seine aktive Rolle bei der Bildung verschiedener Hormone. Deshalb wird es als biochemisches Reagenz hoch geschätzt. Die Herstellung dieser Säure auf chemischem Wege verläuft über viele komplizierte Synthesestufen und konnte bisher nicht durch ein einfacheres Verfahren abgelöst werden. Überraschenderweise wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß Stämme der Mikroorganismen Corynebacterium murisepticum, Nr. 7, eine neue Art von Arthrobacter, Hr. 11, und eine neue Art von Microbacterium, Nr. 205» bei ihrer Züchtung A-3,5-MP erzeugen können.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein neues Verfahren zur Herstellung von cyclischen! Adenosin-3¹ , 5'-nionopho8phat, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen KikrοOrganismus, der fähig ist, cyclisches Adenosin-3',S'-monophoaphat aus Adenosin, Adenin, Inosin, Hypoxanthin, S-Anino^-iaidazolcarboxamid-ribosid, S-Amino^-inidazolcarboxaraid, Succinyladenosin oder Succinyladeriin in einem Kohlenstoff- und Stiokstoffquellen, anorganische Nährsalze und Adenosin, Adenin, Inosin, Hypoxanthin, 5-Amino-4-imidazolcarboxamid-rlbosid, 5-Amino-4-iraidazolcarboxamid, Succinyladenosin oder Succinyladenin enthaltenden llährmedium bei einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 9 und bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C unter aeroben Bedingungen züchtet, bis cyclisches Adeno8in-3^f,5'-monophosphat im Nährnedium angereichert ist, und dieses aus dem Nährnedium gewinnt.

Aus den folgenden gehen die raykologischen Eigenschaften der obengenannten Stämme hervor:

0098Ü9/Q999 ~—

COPY

I. Morphologische Eigenschaften: (Züchtung in Nähragar und NährbrUhe bei 37° bzw. 3O⁰C)

Microbacterium Kr. 205 (A.T.C.C. 21376)

Form und Anordnung: keulenförraige oder geschwungene Zellen wurden im Gesichtafeid des Mikroskops beobachtet; gelegentlich wurden eckige und palisadenähnliche Anordnungen beobachtet, die durch Zerreißteilung entstanden.

Zellengröße (Alter: 16 Std., 30⁰C):

0,4 - 0,7 x 1,5 - 3 Mikron

- Gram-Pärbung: +

Sporenfärbung: (Sporenbildung)

Geißeln: .
Beweglichkeit: -

Corynebacterium murisepticum Kr. 7 (A.T.C.C. 21374)

Form und Anordnung: Ruten, zuerst längliche Zellen, verzweigte

Zellen und V-förmige Zellen wurden beobachtet; nach 2 oder 3 Tagen zeigten die Kulturen kokkoide Formen.

Zellengröße (Alter: 16 Std.):

0,5 - 0,8 χ 1,5 - 4 Mikron

Gram-Färbung: + Sporenfärbung: (Sporenbildung)

Geißeln: Beweglichkeit: Säurefeetigkeit: -

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copyI

Arthrobacta.r, Wr. 11 (A.T₉C.C. 21^75)

Form und Ar-ordmragi Rur;«n_; stieret 1. anglicise Zsllesi, v@

Ztilen_f Y-förmlge Zellen "«uriaii beobachtet, Nach 3 'Jöer 4 Tagen zeigten die Kulturen kökkolaB Formen.

Zellengröße (Alten 16 Std.)s

0,5 - 0,8 χ 2 - 5 Mikron

(iram-F'ärbung; verschieden Sporfciifärbung ι {Sporenbildung)

Geißeln ι
Beweglichkeit:
Säurefestigkeit: -

II, Züchtungseigenschaftenj

1. schräggestelltes Agar-Kährmediums (echräggestelltes Bouillon-Agar, 30⁰C, 4B Std.)

Ur. 205 Nr. 7 Nr. 11 Wachstum: mäßig mäßig mäßig Form: stachelig fadenförmig fadenförmig

Glanz: glänzend und glänzend und glänzend und feucht feucht feucht

Farbe: gelb milchweiß milchweiß Konsistenz: butterartig butterartig butterartig

2. Agar Kolonien: (Bouillon-Agar, 30⁰G, 48 Std.)

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	- 5 -	Kr. 7	1926072
	Nr. 205	rund	Hr. 11
Form:	rund	glatt	rund
Oberfläche t	glatt	ganz	glatt
Hand:	ganz	kissen- förmig	ganz
Oberflächenprofil:	konvex	undurch sichtig	kissen- förmig
optische Eigen schaften:	undurch sichtig	undurch sichtig

3. Nährbrilhes (Bouillon-Brühe» 3O⁰C, 7 Sage)

Hr.

Hr. 11

Oberflächen*»	ringförmig	ringförmig	ringförmig
Trübungs	raäBig trüb	leicht trüb	leicht trüb
Wachstums- menge s	mäßig	mäßig	mäßig
Sediment s	spärlich» klebrig	klebrig	klebrig

4« Schräggestelltsr Kartoffel-Agar: (3O⁰C, 3 Tage)

Hr. 205 Hr. 7 Hr. 11

Wa©hs tiäffii Farbe:

mäSig
gelb

mäßig
milchweiß

kein Wachs« turn

5· Optimale Wachstuestemparaturi

37⁰C

Hr.
37⁰C

Hr. 11 37⁰C

6. Thermische Widerstandsfähigkeit bei Erwärmen In 10 ?i-iger

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Magermilch, 15 Min. bei 72⁰C und 30 Min. bei 7O⁰C:

Nr. Nr. 7

Hr. 11

III. Physiologische Eigenschaften:

Nr. Nr. 7

Nr. 11

1. Katalase-Reaktlon: (30 C, schrägge-

stellte Bouillon)

2. Reduktion von Nitrat: (Züchtung bei 30⁰C)

3. Indol-Bildung: (O, 5 Tage)

4. Schwefelwasserstoff« Bildung:

(300C, 5 Tage)

5. Verwertung von Citrat:

6. Voges-Proskau9r~Re~ aktion:

5 Tage)

7. Methylrot-Test:

8. Verflüssigung von Gelatine:

(30°C, 5 Tage) +

9. Zersetzung von Cellulose: -

10. Urease-Reaktion:

11. Reduktion von Methylenblau : +

12. Wirkung auf Lackmus-Milch: wird reduziert, sauer und peptonisiert wird redu- wird reduziert, al- ziert, alkalisch und kaiisch peptoniaiert und peptonisiert

13. Pigment-Bildung: gelbes Pigment

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. PatUogetiität s

15o Verflüssigung Stärke:

16o Verwertung von Zuckernϊ

Nr.

Säure-Bild

Glucose Glycerin Xylose Seccharose Stärke Fructose Galactose Mannose Arabinose Maltose Trehalose Raffinose Mannit Dextrin Inulin Lactose

Gas-Bild Säure- Gas-Bild Bild

ür. 11

Säure-Bild

Gas-Bild

17c Verwertung von Hitraten:

18. Verwertung von Ammoniumsalzen:

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Hr. 205 Kr. 7 Hr. 11

-β- 1826072

Fach Bsrgfij's ;feri.<:a*· of "bte^isei^.:-, SicrSesiiäQgf<, ? aiiid di·: chenbeaührlebenen Outest

poßltiVe aersb und nie);·: fc^srxiteMcsacl i£s.ä 4gs*i2öff@ffi iQs Kiaeae ^ubacstsrialea* Tfe? Deiters3? fct©rs&3ki.mg dte ©iao® nen St&mae äteilte- r>ich iwraus, laß 3ta? Stosua ίί^_Ρ 2©5 in HO f igftr Magermilon bi8 ku ein%? fespe^atwr iföa 72^0 fSi? 15 und bei 7O°ö für 30 MJ

von allen Gattungen !»ieterisj i-.^ysipslstSiffiSj, C Arthrobecter und Coryn
^ aceae, unterscheidet; er ge&ort at^r- zur Gattimg H

dieser Familie _β Will τπαη ibn :iedöö!i «äli j

det man, daß dieser Stamm au keiner krt dieses G-attm-ig im Manual (Handbuch) und zu keiner anderen bisher bekennten Art gehört* Deshalb wird dieser Stamm als neue Art betrachtet,'_

, Der Stamm Kr. 11 sollte zur Gattung Artlrrobaeter gehören, da seine Gram-Reaktion unterschiedlich ist_s Zn dieser Gattung gehörende Organismen werden gemäß ihrer Fähigkeit, Kitrate, amrnoniakalischen Stickstoff und Citrate zu verwerten, im wesentlichen in zwei Gruppen eingeteilt; dieser Stamm jedoch verwertet Nitrate und amnpniakalischen Stickstoff, aber keine Citrate und gehört deshalb keiner der beiden vorgenannten Gruppen an· Infolgedessen wird der Stamm als neue Art der Gattung Arthrobacter betrachtet.

Stamm Kr. 7 ist katalasepositiv, nicht beweglich, unfähig Oellulose zu verwerten, gram-ipositiv und weist in 10 $-iger Magermilch keine Hitzebeständigkeit auf; also gehört er sur Gattung Coryne-

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bacterium« Außerdem ist der Stamm nicht beweglich, bildet Nitrit aus Nitrat und erzeugt Säure aus G-lu,oose_t. L&Qtose» Saccharose und Mannit· Deshalb wird ®r als Cosinebaoteritua isuriseptieum eingeordnet.

Andere Stämme von Mikroorganismen als die ob@sibesohriebenen₍ die A~3,5~MP aus Adenosin, Adenin, Inosin, Hypoxanthin, 5-Amino-4-

piboslä _ϋ 5-Amir_a©™4-irdde3©l©arb0xamid, Suoci- oder Sueslnyladenin erzeugen könsien« kSnnsa für das der Irfinäimg W2?w@Rd®t wer-desi.

vesi A«3j5«=»MP weMen Adenosln,

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len» Sfeielsateffgiiellsm isii ©Ji©ggaaigela@s Phsssphat und gegebenenQlie Sals© imä B@stemdt©il© ©atMlt. Der Iu &®m läfcxmediEia b©i einem pH-Wert zwi- «ad 9 bei 20 bia 40*^J0 so lang® ge stelltet» bis man die g Ausbaut© ©a Α-3·5-ΚΡ erhält, s»B» 10 bis 80 Stunden laag;₀ toösrnfalls ^±sü eins. ®^fimäimg©g®iBä8 Y@jr«®sideter Stamm von Kikroü^ganisnion suerst &&m Medium eingeimpft waä in diesem Medium bei einem pE-Me^t iia Bsreieh iron 5 bis 9 bei 20 bis 40⁰C für eine geeignete Zeitdauer» ss.B. 10 bis 40 3ttmden₍ gezüchtet. Nach der Züchtung werden Adenosin* Adenin. Imesin$ Hypoxanthin,

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5-Amino-4-imidazolcarboxamid»riboaid_t 5-Amlno-4-imlda2soloarhoxamid, Sucoinyladenosin oder Succinyladenin oder ein Gemisch dieser Verbindungen der Gärmaische in einem Betrag von 0,1 bis 3s?0 Gew.-$ (Gew./Vol.), bezogen auf das Gesamtvolumen des Kediraae, augesetzt. Die Züchtung wird weiter durchgeführt, bis die Meng© der im Nährmedium gebildeten Substanz ein Maximum, ss.B_e nach 10 bis 80 Stunden, erreicht.

Das genannte Medium enthält Kohlenhydrate, wie Glucose, Stärkehydrolysate oder Glycerin als Kohlenstoff quellen, AisiaoniTOSiilf at _D Amrconiumchlorid, Harnstoff_s Aminosäuren, Protein- odar Peptid= hydrolysate und Zellextrakte» S₆B, M&isquellwasser und Befeex» trakt, als Stickstoff quellen, KsliuisSrLhydrogenpiiosphat oä®£> Ia= triumdihydrogenphosphat, Dikaliiisihydr^ganphospiiat oder Bii umhydragenphosphat oder ABinmii^phosplisya als ajaasrgaaiSQlie phatquellen, sowie gegebenenfalls aMe^e asorgseilseö,® Sals®₈ Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Eise2i(IH)-SmIfat oder" Ei (Il)-sulfat, Eisen(III)-ohloria oäar Elsöa(II)-s!il@ifM, Zinks«! fat oder Sinkchlorid, Kobaltsulfat oder tung wird nach irgendeiner geeignete» Methode, s.B, wa.tez teln, unter Rühren, aerob durchgeführt»

Wenn die Bildung von A-3,5-MP im Nährmedium ihr Plaximüm erreicht, wird die Züchtung beendet und die Säurs aus der Q'äxmm,±B&h.e isoliert und gereinigt. Bei der Isolierung und Heinigimg der Säure können Aktivkohle, ein AnionenharzauBtauscher und ein A-5₉5*-M? nicht lösendes Lösungsmittel verwendet werden. Z.B. wird die Gärmaische nach Entfernung der Zellen mit Aktivkohle zur Adsorp-

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tion des in der Brülle enthaltenen Α~3eIH^P läshaffidsit-s worauf Aktivkohle mit AuLmoKiak/ltliasiol--Ijl5siisBg eä©s?- ltim@n±®k/A®&tQn~ sung but Eliation der genannten. Säm^;i gsMaseSiSii wiri« Bas erhaltene Eluat i^/ird unter vermindertem 3?iaek elngeöarapft, vm überschüssiges Ammoniak wia Xthanol mn entf@Es,@n_s umä mit cJnera Anionenau3tauGcherh&z?2_e wie Doimii 1 (Ghioridfona) ©cliiff Bowsx I (Fo2?!iiiatforin) weiter behandelt und mit einem geeigaeten Löaungsmitt@l_e s_eB_e mit ^erätinater Salfssäur-e od©r ©alei'öMehler-icllmltiger verdünnter Salzsäure für Doues: I (öhlordifox-a) bsö_s mit verdünnter Ameisensäure oder Natriumf@rmi@t enthaltender verdtlraiter Ameisensäure für Dowex I (FormiatforBi)₈ sisr Eint ion öee A gewaeehen» Das Eluat wird wieder an Aktivkohle adsorbiert_t Amra&aiak/Äthanol-Iiösung oder Ammoniak/Aeeton~Lös\ing -gewasoben, unter vermindertem Druck eingedampft, mn überschüssiges Ammoniak und Äthanol zu entfernen» an einem Kationenaustausoherharz, z.B. Hövieiz 50, in der H^-Porm adsorbiert und schließlich mit verdünnter Salzsäure eluiert. Das so erhaltene Eluat wird unter vermindertem Druck eingedampft, in der Kälte stehengelassen oder mit einem Lösungsmittel, wie Äthanol oder Aceton, welche A-3*5-MP nicht lösen, versetzt, wodurch man die Säure in kristalliner Pokern erhalte

Gemäß einer anderen Verfahrensweise wird das in der Gärmaische gebildete A-3»5-KP nach Entfernung der Zellen aus der Brühe an Aktivkohle adsorbiert und mit Ammoniak/i?thanol-Lösung oder Amnoniak/Aceton~Lösung eluiert. Das Eluat wird naoh Entfernung von überschüssigem Ammoniak und ithanol^ s_oB_e durch Eindampfen unter vermindertem Druck, mit Salzsäure angesäuert und mit einem orga-

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nieohen Lösungsmittel, wie Alkohol oder Aoetösa» vsrs©tst_f durch man rohes A-3,5-föF erhält. Das so erhaltene roh© A-3₉5-MP kann mittels eines Anionenaustauoclierliarsee oder eines Kationeaaustauseherharzes, wie erwähnt, gereinigt werden. Das erhaltene rohe A-3.5-MP wird in Wasser gelöst, mit Salzsäure oder Phosphorsäure angesäuert, mit einera Austauacherhars, z.B. Duolite S-30_ff entfärbt und nit Äthanol, Aceton oder anderen das A-3,5-KP nicht lösenden Lösungsmitteln vereetst, wodurch man A~3,5-MP in kristalliner Form erhält.

Gemäß einem weiteren Trenn- und Reinigungsverfahren wird die Gärmaische nach Entfernung der Zellen direkt mit einen Anionen~ oder Kationenaustauscherharz zur Adsorption des A-3»5-KP behandelt. Nach der Behandlung des erhaltenen Eluats mit Aktivkohle oder einem entfärbenden Harz erhält man A-3_f5-MP in kristalliner Form durch Zugabe eines nicht lösend wirkenden Lösungsmittels < >

Das nach dem Verfahren der Erfindung hergestellte Produkt ergab in Bezug auf Elementaranalyse, Ribose- oder Phosphorgehalt und W UV-Spektrum und IR-Spektrum die gleichen Ergebnisse wie eine authentische Probe von A-3,5-MP.

Das Verfahren der Erfindung ist ein Einstufenverfahren. Bisher konnte Α-3,5-ΓιΡ nur in einem komplizierten Mehrstufenverfahren auf chemischem Wege hergestellt werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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Beispiel 1

Stamm Wr. 205 (A.T.C.G, 21376) der Gattung Kiorobaoteriuia vurde einem sohräggestellten Nährmedium» das 0,5 $ Amaoniumsulfat, 0,5 °/ Kaiiumdihydrogenphoaphat, 0,05 f° Magnesiumsulfat, 1,0 # Peptone aua Casein (casaiaino acid), 0,3 "ρ Hefeextrakt, 1,0 # Glucose und 2,0 i> Agar-Agar enthielt und dessen pH~Wert mit 3 η Kalilauge auf 7$ eingestellt wurde, ©isigeisnpft und darauf gezüchtet ₀

Getrennt davon wmlen je 40 ml ©ines liäiiraeäaUias, das 0,01 tf> Einksulfat, 5»O '/o Slueose, 0^5 '/<> Harnstoffs 0_s5 / Ammoniumsulfat, 1gö ^c/j Kaliuaiadihydrogexiphosphats 1,0 fi Bikalimafejdrog^nphosphat, 1₀0 φ Poljptptoiiij Opt ml pro Liter föaisquell^assej*, 0,3 ?³ Inosia mad 1₉0 ?C NagnesiPjisMlfat enthielt und d@ss©a pH-Wert mit 5 a Kalilauge auf S₉Q eingestellt ~wurde» in 500 ssl-Scküttelkulabgefullt» Haeii 12-minütigem Autolclaviessn bei 115°C

die ©tesasrhaltene iänzuehtkultur diiseg· ßäsmaisohe singeisapft vmü 32 Stußdsa unt©r S©Mtt@Iii *©@i 30^@G gesticfetet· Es bil-3»1 mg pr© sal A-3,5~MP im

Dl© ©rfealtsa® GrSjsmaisoh© ^^rda sut T^ittQmmmg &.®s lallen ssentrifugiert, Mad der tfe®rgt^i<t i^iirda mit ksas-eats'isrtes' Salzsäure auf den pH«=l'l®rt 2_a0 slngag-feeilt und flaim ©it Aktivkohle »ur Adsorption des A-»3,5-MP behandelt» Di® aa der Aktivkohle adsorbierte Säure wurde mit einer 1,4 ?^lg©n · Aimöniak/A"thanol-tösung eluiert und das Bluat wurde zur !Entfernung des Ammoniaks und des Äthanols unter vermindertem Druck eingedampfte Bann wurde das

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dabei erhaltene Nährmediumfiltrat bei einem pH-Wert von 8,0 an Dowex I (X4), Pormiatform (Korngröße 0,14-0,074 mm) chromato» graphiert, Bei der dilution mit einem Genlsch aus 0,1 η Ameisensäure und 0,1 η Natriumforraiat wurde eine Fraktion mit A~3»5-MP erhalten.

Die erhaltene Fraktion wurde wieder an Aktivkohle adsorbiert; die Aktivkohle wurde mit i'asser gewaschen und mit einer 1,4 i->-igen Ammoniak/Äthanol-Lösung nach der oben beschriebenen Methode eluierb. Das ^luat wurde unter vermindertem Druck eingeengt * Die erhaltene Lösung wurde mit verdünnter Salseäure auf eimn -pH-Wert von 2,0 eingestellt und an Dowss-SO (X^)H"¹" (Korngröße O,14'»O,O74 mm) ohroiaatographiert. Bai des llution mit 0,1 m Salzsäure erhielt man eine Fraktion mit A-3,5-KP. BIe Fraktion wurde unter vermindertem Druck e-iagearigt uziü üqt Rileästaad In einem Kühlraum bsi 2° odsr 3⁰C stehengelassene Man erhielt aus 500 ml Gärraaische 920 mg kristallines A-3,5-MP_o

Beispiel 2

Corynsbacterium murieepticuni Nr₃ 7 (A₀TeC₈C 21374) wird® ©iaom schräggestellten Nährmedium, aas 0,5 ^CU ÄmiaoiiiuEsulfat» O₉ 5 /' Kaliumdiiijdroge.nphosphatg 0,005 $ Magnesiumsulfat_B 1 f "casaraiao acid", 0,3 f Hefeextrakt, 1,0 jfi CJlucose und 2,0 f Agar-Agar enthielt und mit 3 η Kalilauge auf den pH-Wert von 7,0 eingestellt . wurde, eingeimpft und darauf gezüchtet.

Getrennt davon wurden je 30 ml eines Nährmediume, das 5_ff0 f-Glucose, 0,5 $> Ammoniumchlorid, 1,0 ^ Bikaliumhydrogenphosphat,

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1,0 ^e/> Kaliumdiliydrogesiphosphat, 1,0 $ Polypepton, 0,5 i> Hefe» extrakt imd 0_f 0027 ί> Sinksulfat enthielt und dessen pK-Wert mit 3 η Kalilauge auf 8,0 eingestellt wurde, in 500 läl-SehUttelkulturflaschen abgefüllt. Nach 1O-ninütigen Autoklavieren dieses Nährmediums bei 115°C und nach Zusatz von 3 # getrennt sterilisiertem Calciunicarbonat wurde die Anzuchtkultur dieser Gärmaische eingeimpft und 10 Stunden unter Schütteln bei 30°C gezüchtet. Dann wurden 60 Mg Inosin zugesetzt, und die Züchtung wurde bei derselben Temperatur unter Schütteln 70 Stünden fortgesetzt, wobei A-3»5-MP in einer Menge von 21 mg/ml gebildet wurde.

Die erhaltene Gärmaische wurde zur Entfernung der Zellen zentrifugiert, der Überstand wurde mit 3 η Salzsäure auf den pH-Wert 4,0 eingestellt und zur Adsorption des darin enthaltenen A~3,5-MP mit Aktivkohle behandelt» Die an der Aktivkohle adsorbierte Säure wurde mit einer 1,4 $~igen Ammoniak/A"thanol«Lösung eluiert« Das Eluat wurde zur Entfernung überschüssigen Ammoniaks an Amberlite IRC-fjO (H⁴') chromatographiert und dann unter vermindertem Druck eingedampft. Kach Zusatz von Alkohol zum Rückstand erhielt man 830 mg kristallines A-3.5-MP aus 500 ml Gärmaische.

Beispiel 3

Stamm Nr. 205 (A.T.C.C. 21376) der Gattung Microbacterium wurde einem schräggeotellten Hährmedium, das 0,5 /'· Ammoniurasulfat, 0,5 i° Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 *! Kagnesiunsulfat, 1,0 i> "Casamino acid", 0_P3 5' Hefeextrakt, 1,0 $ Glucose und 2,0 # Agar-Agar enthielt und dessen pH-Wert mit 3 η Kalilauge auf 7,0

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eingestellt wurde, eingeimpft und darauf gezüchtet«»

Getrennt davon wurden je 40 ml eines Nährmediitms, das 4»0 / Glycerin, 0,5 $ Ammoniumsulfat, O₈ 5 ¹Z* Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 'ß> Harnstoff, 0,5 # Dikaliumhydrogenphosphat, 1,0 # Polypepton, 1,0 # Magnesiumsulfat, 0,5 ?' Hefeextrakt, 0,2 ?6 Hypoxanthin und 0,0027 # Zinksulfat enthielt und dessen pH-Wert mit 3 η Kalilauge auf 7,0 eingestellt wurde, in 500 ml-Schüttelkulturflaschen abgefüllt. Nach 10-minütigem Autoklavieren des Nährmediums bei 115⁰C und Zusats von 3 r getrennt sterilisiertem Calciumcarbonat wurde die oben erhaltene Anzuchtkultur durch Sucpenaion eingeimpft und unter Schütteln 30 Stunden bei 30⁰C gezüchtet, wobei A-3,5-MP in einer Menge von 1,5 mg/ml gebildet wurde·

Die erhaltene Gärmaische wurde zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und auf dieselbe Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, behandelt. Man erhielt 350 mg A-3,5-KP aus 500 ml Gärmaische„

Beiapiel 4

Stamm Nr. 11 (A.T₀C,C. 21375) der Gattung Arthrobaoter wurde auf einem schräggestellten Nährmedium der gleichen Zusammensetzung wie im Beispiel 2 bei 30⁰C 24 Stunden gezüchtet. Die erhaltene Anzuchtkultur wurde in 500 ml-Schüttelkulturflaechen in je 40 ml Nährmedium eingeimpft, das 5,0 $> Glucose, 0,5 $ Ammoniumsulfat, 1,0 # Dikaliumhydrogenphosphat, 0,5 i° Harnstoff, 1,0 '/S Kaliumdihydrogenphosphat, 1,0 ?ί Polypepton, 1,0 5έ Magnesiumsulfat, 0,5 /■' Hefeextrakt, 0,2 $ 5-Amino-4~imidazolcarl}OX-

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said-ribosid und 0,001 f* Kobaltsulfat enthielt, dessen pH-Wert mit 3 η Kalilauge auf 7,0 eingestellt wurde, das 12 Kinuten bei 115⁰C autoklaviert und mit 3 f° getrennt sterilisiertem Calciumcarbonat versetzt worden war. Man züchtete 40 Stunden unter Schütteln und erhielt 1,8 mg/ml A-3,5-MP_#

Die erhaltene Gärmalsohe wurde zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und auf die gleiche Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, behandelt. Man erhielt 415 mg A-3,5-MP aus 500 ml Gärmai- sehe«,

Beispiel %

Stamm Nr. 11 (A.T₈CG. 21375) äer Gattung Arthrobaater wurde in ©ines? actoäggeetailten Nährmediium. dar gleich©^ I tn Beispiel 2 bei 30⁰C 24 Stunden au.g©gS©litat_e Bi@ erhaltene

äa® 5 *& Gl^o©s©» O₁S f Aas©aiM3iaulfat_f BaKaliuioliGrdrogeiipliosphat, 0^5 °fi Harnstoff^ 1 f> laliumdihy-' $ 0,5 %

it 3 21 Kalilauge aisf d®2ä pH-Wert 7,0

si^elSL'S isrnd aw^@klavies?t ward®, imd Ijti 30®S 12 Stunden unt©s S©Mtt@ln g©3?l@M@t. is bildeten ®i@& 1₉4 ng/iol A-3,5-MP la Nätes©&i?!sa₉ Bi® Särmalseh© t^iffd® &m£ die gl®£©h© Weise, wie in Beispiel 1 beeohxieben* behandelt» üan e^hi@lt 332 mg A-3,5- ΨΪΒ aus 500 ml Gärmaisoha«,

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Beispiel 6

Corynebacterlum murlsepticura Hr. 7 (A.T.C.C 21374) wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 5 in einen Anzuchtnährmedium angezüchtet und in ein Nährmedium eingeimpft, das die gleiche Zusammensetzung wie in Beispiel 4 hatte» mit einer Ausnahme, daß anstelle von S-Araino^-lmidazolcarboxanid 0,2 $> Succinyladenosin zugesetzt wurden. Bei 30⁰C wurde 40 Stunden unter Schütteln gazüchtet. Es bildeten sich 1,2 rag/ml A-3,5~MP. Die Gärmaische wurde zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und wie in Beispiel 1 behandelt; man erhielt 180 mg A-3»5~MP aus 500 ml Gärinaische.

Beispiel 7

Stamm Hr, 205 (A.T.C.C, 2ι37β) der Gattung Hicrobactarium wurde nach dem gleichen Anzuchtver-fahren wie in Beispiel 4 anganiiolitst und in ein Nährmedium eingeimpft, das di© gleiche Zusammeasst= zung wie in Beispiel 5 hat ta, mit einer Ausnahme, claS anstells von 5"Aininö-'4"-imidazolcarⁱboxamia 0_s2 i° wurden. Nach 70-stündigem Züchten unter Schütteln bei 30 G wur den 0,7 mg/ml A~3»5-HP erzeugt. Die GäCTiaisclis wurde zur Entfernung" dar Zellen zentrifugiert imd wia in Beispiel 1 deltj man erhielt 121 mg A«3,5-MP aus 500 ml Särmaische*

Beispiel 8

Stamm Nr. 205 (A₉T.CO. 21376) der Gattung Mlorobaoterium in demselben Anzuchtmedium wie in Beispiel 5 angezliohtet, in ein Nährmedium eingeimpft, das dieselben Bestandteile wie In

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Beispiel 6 hatüe, mit der Ausnahme, daS anstelle von 5-Amino-4-imidaaolcai-boxamid 0,2 "/■- Adencmin zugeaetat wurden, und unter Schütteln 40 Stunden bei 3O°C gezüchtet. Man erhielt 2,0 mg/ml Λ 5,5 HPo Die Gärmaische wurde zur Entfernung der Zellen sentrijfu.giert und wie in Beispiel 2 behandelt; man erhielt 750 mg A--3, 5-ΙΊΡ au« 500 ml Gärmaische.

Stamm Hr. ?.O5 (A.T.C.0. 21376) der Gattung Kicrobacterium wurde im gleichen Anssuehtnährmedium wie in Beispiel 4 gesüohtet, in ein Nährmediuin eingeimpft, das die gleiche Zusammensetzung vjie in Beispiel 5 hatte, mit der Ausnahme, daß anstelle von 5 Amino 4-imidazolcartioxaniid 0,1 % Adenin zugesetzt wurde, und -fcer Schütteln 70 Stunden bei 30⁰G gezüchtet. Man erhielt

1,2 ing/ml A"3,5-HP. Die Gärmaische wurde zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt. Man erhielt 230 mg A-3,5-MP aus 500 ml Gärmaische,

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Claims

Ansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von cyclischera Adenoein-3'5*-ssono~· phosphat, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus, der fähig iet, cyolisches Adenosin-3¹,5^f-monopho8phat aus Adenosin, Adenin, Inosin, Hypoxanthin, 5-Aminc-4-iraidazolcarboxamid-ribosid, 5-Amino-4~iraidazolcarboxanid, Suecinyladenosin oder Succinyladenin in einem Kohlenetoff- und Stickstoffquellen, anorganische Nährsalze und Adenosin, Adenin* Inosin, Hypoxanthin_f 5-Amino-4-iraidazolcarboxamid~ribosid, S-Amino^-imidazolcarboxaraid, Succinyladenosin oder Succinyladenin enthaltenden Nährmedium bei einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 9 und bei einer Temperatur von 20° bis 40⁰C unter aeroben Bedingungen züchtet, bis cyclisches Adenosin-3%5^fmoBOphosphat im Kährmedium angereichert ist, und dieses aus dem »ährmedium gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nan

. «inen Mikroorganismus der Gattungen Coryne bacterium, Ar throbaoter oder Microbacterium verwendet.

3« terfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet» daß man als Mikroorganismus Coryne bacterium murisepticum Nr. 7, A.f.C.C. 21374, Arthrobacter Nr. 11, A.T,C.C. 21375 oder Miorobacterium Nr. 205» A.T.C.C. 21376 verwendete

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung unter Schütteln, Rühren oder Belüftung durch-

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führt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung 10 bis 80 Stunden durchführt.

6. Verfahren naoh Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dafl nan ein Nährmedium mit 0,1 bis 2,0 # Gewicht pro Volumen Adenosin, Adenin, Inosin, Hypoxanthin, S-Araino^-imidazolcarboxaaidrib~isid, 5-Araino-4-imidazolcarboxaraid, Sucoinyladenosin oder Succinyladenin, berechnet auf das Gesamtvolumen dee Nährmediums, verwendet.

7. Verfahren naoh Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daO man den Mikroorganismus direkt in das Nährmedium einimpft·

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus in einem Nährmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Nährsalze tnthält» bei einem pH-Wert im Bereich von 5-9 und bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C züchtet, Adenosin» Adenin, Inosin» Hypoxanthin, 5-Amino-4-lmldazolcarboxamid-ribosid» 5-Amlno-4-imidazoloarboxamid, Suocinyladenosin oder Suooinyladenin den angezüchteten Nährmedium zusetzt und die Züohtung bei einem pH-Wert im Bereich von 5-9 bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C weiterführt.

9· Verfahren naoh Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet» dafl man das mit cyolischem Adenoain-3¹,S'-monophosphat angereicherte

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Nährmedium mit Aktivkohle, einem Anionenaustauscherharz, einem Kationenaustauscherharz oder entfärbendem Harz behandelt, unter vermindertem Druck eindampft oder mit einem Lösungsmittel behandelt, das das cyclische Adenosin-3',5'-monophosphat nicht

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