DE19903493A1 - Überexpression einer DNA-Sequenz codierend für eine Transketolase in Pflanzen - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, Ligninen und/oder aromatischen Aminosäuren durch Überexpression eines Transketolase Gens.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von DNA-Sequen­ zen codierend für eine Transketolase zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, aromatischen Aminosäuren und/oder Lignin, speziell die Verwendung von DNA-Sequenzen SEQ-ID No. 1 oder mit dieser hybridisierenden DNA-Sequenzen, einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, aroma­ tischen Aminosäuren und/oder Lignin, sowie die derart herge­ stellte Pflanze selbst.

Ein wichtiges Ziel pflanzenmolekulargenetischer Arbeiten ist bis­ her die Erzeugung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Zuckern, Enzymen und Aminosäuren. Wirtschaftlich interessant ist jedoch auch die Entwicklung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Vitami­ nen, wie z. B. der Erhöhung des Tocopherol-Gehaltes.

Die in der Natur vorkommenden acht Verbindungen mit Vitamin E-Ak­ tivität sind Derivate des 6-Chromanols (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesellschaft, Chapter 4., 478-488, Vitamin E). Die erste Gruppe (1a-d) stammt von Tocopherol ab, die zweite Gruppe besteht aus Derivaten des Tocotrienols (2a-d):

1a, α-Tocopherol: R¹ = R² = R³ = CH₃
1b, β-Tocopherol [148-03-8]: R¹ = R³ = CH₃, R² = H
1c, γ-Tocopherol [54-28-4]: R¹ = H, R² = R³ = CH₃
1d, δ-Tocopherol [119-13-1]: R¹ = R² = H, R³ = CH₃

2a, α-Tocotrienol [1721-51-3]: R¹ = R² = R³ = CH₃
2b, β-Tocotrienol [490-23-3]: R¹ = R³ = CH₃, R² = H
2c, γ-Tocotrienol [14101-61-2]: R¹ = H, R² = R³ = CH₃
2d, δ-Tocotrienol [25612-59-3]: R¹ = R² = H, R³ = CH₃

Wirtschaftlich große Bedeutung besitzt α-Tocopherol.

Der Entwicklung von Kulturpflanzen mit erhöhtem Gehalt an Toco­ pherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, aromatischen Aminosäuren und/­ oder Lignin durch Gewebekultur oder Samenmutagenese und natürli­ che Auswahl sind Grenzen gesetzt. So muß einerseits beispiels­ weise der Tocopherol-Gehalt bzw. der Gehalt des gewünschten Stoffwechselendproduktes bereits in Gewebekultur erfaßbar sein und andererseits können nur diejenigen Pflanzen über Gewebekul­ turtechniken manipuliert werden, deren Regeneration zu ganzen Pflanzen aus Zellkulturen gelingt. Außerdem können Kulturpflanzen nach Mutagenese und Selektion unerwünschte Eigenschaften zeigen, die durch teilweise mehrmalige Rückkreuzungen wieder beseitigt werden müssen. Auch wäre beispielsweise die Erhöhung des Tocophe­ rol-Gehaltes durch Kreuzung auf Pflanzen der selben Art be­ schränkt.

Aus diesen Gründen ist das gentechnische Vorgehen, beispielsweise die für die Tocopherol Syntheseleistung kodierenden, essentiellen Biosynthesegene zu isolieren und in Kulturpflanzen gezielt zu übertragen, dem klassischen Züchtungsverfahren überlegen. Dieses Verfahren setzt voraus, daß die Biosynthese und deren Regulation bekannt ist und daß Gene, die die Biosyntheseleistung beeinflus­ sen, identifiziert werden.

Isoprenoide oder Terpenoide bestehen aus verschiedenen Klassen lipidlöslicher Moleküle und werden teilweise oder vollständig aus C₅-Isopren-Einheiten gebildet. Reine Prenyllipide (z. B. Caroti­ noide) bestehen aus C-Gerüsten, die ausschließlich auf Isopren- Einheiten zurückgehen, während gemischte Prenyllipide (z. B. Chlo­ rophylle, Tocopherole und Vitamin K) eine Isoprenoid-Seitenkette besitzen, die mit einem aromatischen Kern verbunden ist.

Bei den Ringstrukturen der gemischten Prenyllipide, die zur Bil­ dung der Vitamine E und K führen, handelt es sich um Quinone, deren Ausgangsmetabolite aus dem Shikimat-Weg stammen. Die aroma­ tischen Aminosäuren Phenylalanin bzw. Tyrosin werden in Hydroxy­ phenyl-Pyruvat umgewandelt, welches durch Dioxygenierung in Homo­ gentisinsäure überführt wird. Das Chorismat wird einerseits über Erythrose-4-Phosphat, 3'-Dehydrochinat, 3'-Dehydroshikimat, Shi­ kimat, Shikimat-3-Phosphat und 5'-Enolpyruvylshikimat-3-Phosphat gebildet (Abb. 1). Die Bereitstellung von Erythrose-4-Phosphat erfolgt durch die enzymatische Aktivität der plastidären Transke­ tolase. Dabei werden Fruktose-6-Phosphat und Glycerinalde­ hyd-3-Phosphat zu Xylulose-5-Phosphat und Erythrose-4-Phosphat umgesetzt. Die oben beschriebene Homogentisinsäure wird anschlie­ ßend an PPP gebunden, um den Vorläufer von α-Tocopherol und α-To­ coquinon, das 2-Methyl-6-phytylquinol, zu bilden. Durch Methylie­ rungsschritte mit S-Adenosylmethionin als Methyl-Gruppen-Donor entsteht zunächst 2,3-Dimethyl-6-phytylquinol, dann durch Zykli­ sierung γ-Tocopherol und durch nochmalige Methylierung α-Tocophe­ rol (Richter, Biochemie der Pflanzen, Georg Thieme Verlag Stutt­ gart, 1996).

In der Literatur finden sich Beispiele die zeigen, daß die Mani­ pulation eines Enzyms den Metabolit-Fluß direktional beeinflußen kann. In Experimenten mit einer veränderten Expression der Phy­ toen Synthase, welche zwei GGPP-Moleküle zu 15-cis-Phytoen mit­ einander verknüpft, konnte ein direkter Einfluß auf die Caroti­ noid-Mengen dieser transgenen Tomatenpflanzen gemessen werden (Fray und Grierson, Plant Mol. Biol. 22(4),589-602(1993); Fray et al., Plant J., 8, 693-701(1995)). Wie zu erwarten, zeigen trans­ gene Tabakpflanzen mit verringerten Mengen an Phenylalanin-Ammo­ nium Lyase reduzierte Phenylpropanoid-Mengen. Das Enzym Phenyla­ lanin-Ammonium Lyase katalysiert den Abbau von Phenylalanin, ent­ zieht es also der Phenylpropanoid-Biosynthese (Bate et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91 (16): 7608-7612 (1994); Howles et al., Plant Physiol. 112. 1617-1624 (1996)).

Über die Erhöhung des Metabolitflusses zur Steigerung des Toco­ pherol-Gehaltes in Pflanzen durch Überexpression einzelner Bio­ synthesegene ist bisher wenig bekannt. Lediglich WO 97/27285 be­ schreibt eine Modifikation des Tocopherol-Gehaltes durch ver­ stärkte Expression bzw. durch Herunterregulation des Enzyms p-Hy­ droxyphenylpyruvatdioxygenase (HPPD).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Entwicklung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, aromatischen Aminosäuren, Chlorophyllen und/oder Lignin.

Die Aufgabe wurden überraschenderweise gelöst durch die Überex­ pression eines Transketolase-Gens in den Pflanzen.

Um beispielsweise den Metabolit-Fluß aus dem Primärstoffwechsel in die Tocopherol-Biosynthese zu verstärken, wurde die Bildung von Chorismat als essentiellem Ausgangssubstrat für alle plasti­ dären Isoprenoide erhöht. Zu diesem Zweck wurde in transgenen Pflanzen die Aktivität der plastidären Transketolase durch Über­ expression des Transketolasegens aus Hefe erhöht. Dies kann prin­ zipiell auch durch Expression homologer oder heterologer Transke­ tolasegene erreicht werden.

Gene, die für Transketolase kodieren, wurden bisher aus Saccharo­ myces cerevisiae (Flechter et al., Biochemistry 31, 1892-1896, 1993; Sundström et al., J. Biol. Chem. 268,24346-24352, 1993; Schaff-Gerstenschläger et al., Eur. J. Biochem. 217, 487-492, 1993), aus Hansenula polymorpha (Janowicz et al., Nucl. Acids Res. 13, 3043-3062, 1985), menschlichen Erythrozyten (Abedinia et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 183, 1159-1166, 1992; McCool et al., J. Biol. Chem. 268, 1397-1404, 1993), Rhodobacter sphae­ roides (Chen et al., J. Biol. Chem. 266, 20447-20452, 1992), Escherichia coli (Sprenger, Biochem. Biophys. Acta 1216, 307-310, 1992; Tida et al., J. Bacteriol. 175, 5375-5383, 1993), sowie aus Tabak (EP-A 0723017) isoliert und beschrieben.

In einem Ausführungsbeispiel wird das Transketolase-Gen (SEQ-ID No. 1, Accesion Nr. M 63302) aus Hefe (Saccharomyces cerevisiae) in transgenen Pflanzen verstärkt exprimiert. Um eine Plastidenlo­ kalisation zu gewährleisten wird dem Strukturgen der Hefe Trans­ ketolase eine Transitsignalsequenz vorangestellt. Auch geeignet als Expressionskassette ist eine DNA-Sequenz, die für ein Trans­ ketolase-Gen codiert, das mit SEQ-ID No. 1 hybridisiert und das aus anderen Organismen bzw. aus anderen Pflanzen stammt.

Das durch die zusätzliche Expression des Transketolasegens nun vermehrt zur Verfügung stehende Erythrose-4-Phosphat wird weiter über Chorismat und Prephenat in Richtung Tocopherole, Vitamin K, Lignine, Chlorophylle und aromatische Aminosäuren umgesetzt.

Die Herstellung der transgenen Pflanzen erfolgt durch Transforma­ tion der Pflanzen mit einem das Transketolase-Gen enthaltenden Konstrukt. Als Modellpflanzen für die Produktion von Tocophero­ len, Vitamin K, Ligninen, Chlorophyllen und aromatischen Amino­ säuren wurden Tabak und Raps eingesetzt.

Antisensekonstrukte sowie homologe bzw. heterologe pflanzliche Transketolasegene wurden unabhängig voneinander in Pflanzen transformiert. Messungen an Transketolase-Antisensepflanzen erga­ ben bezüglich des Gehaltes an aromatischen Aminosäuren, des Chlo­ rophyll-, des Lignin- und des Tocopherolgehaltes eine drastische Abnahme, siehe Abb. 2 bis 7. Dies belegt den direkten Ein­ fluß der plastidären pflanzlichen Transketolase auf die Synthese von aromatischen Aminosäuren, Chlorophyllen, Ligninen und Toco­ pherolen.

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 aus Hefe, die für eine Transketolase oder deren funktionelle Äquivalente kodieren, zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, Ligninen und/oder aromatischen Aminosäuren. Die Nukleinsäurese­ quenz kann dabei z. B. eine DNA- oder cDNA-Sequenz sein. Zur In­ sertion in eine Expressionskassette geeignete kodierende Sequen­ zen sind beispielsweise solche, die für eine Transketolase kodie­ ren und die dem Wirt die Fähigkeit zur Überproduktion von Toco­ pherolen, Vitamin K, Chlorophyllen und/oder aromatischen Amino­ säuren verleihen.

Die Expressionskassetten beinhalten außerdem regulative Nuklein­ säuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine Expressionskassette stromaufwärts, d. h. am 5'-Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d. h. am 3'-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden ko­ dierenden Sequenz für das Transketolase-Gen operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequen­ zielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der re­ gulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodie­ renden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten aber nicht darauf beschränkten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lo­ kalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden, im Mito­ chondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten und Translationsverstär­ ker wie die 5'-Führungssequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).

Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in den Ta­ bak-Transformationsvektor pBinAR-Hyg eingebaut werden. Abb. 8 zeigt die Tabaktransformationsvektoren pBinAR-Hyg mit 35S-Promo­ tor (A) bzw. pBinAR-Hyg mit samenspezifischem Promotor Phaseolin 796 (B):

• - HPT: Hygromycin-Phosphotransferase
• - OCS: Octopin-Synthase-Terminator
• - PNOS: Nopalin-Synthase-Promotor
• - außerdem sind solche Restriktionsschnittstellen eingezeich­ net, die nur einmal den Vektor schneiden.

Als Promotoren der Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Pflanzen steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvi­ rus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294). Dieser Promotor enthält bekanntlich unterschiedliche Erkennungssequenzen für transkriptionale Effektoren, die in ihrer Gesamtheit zu einer permanenten und konstitutiven Expression des eingeführten Gens führen (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989), 2195-2202).

Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen Trans­ ketolase-Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt ge­ steuert werden kann. Derartige Promotoren wie z. B. der PRP1-Pro­ motor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzenesulfonamid-induzierbarer (EP-A 388186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP-A 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor können u. a. verwendet werden.

Weiterhin sind insbesonders solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen beispielsweise die Biosynthese von Tocopherol bzw. dessen Vorstu­ fen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-245).

Mit Hilfe eines samenspezifischen Promotors konnte ein Fremdpro­ tein stabil bis zu einem Anteil von 0,67% des gesamten löslichen Samenproteins in den Samen transgener Tabakpflanzen exprimiert werden (Fiedler und Conrad, Bio/Technology 10 (1995), 1090-1094). Die Expressionskassette kann daher beispielsweise einen samenspe­ zifischen Promotor (bevorzugt den Phaseolin-Promotor (US 5504200), den USP- (Baumlein, H. et al., Mol. Gen. Genet. (1991) 225 (3), 459-467) oder LEB4-Promotor (Fiedler und Con­ rad, 1995)), das LEB4-Signalpeptid, das zu exprimierende Gen und ein ER-Retentionssignal enthalten.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten Transketolase-DNA Sequenz und vorzugsweise einer zwischen Promotor und Transketo­ lase-DNA-Sequenz inserierten DNA, die für ein chloroplastenspezi­ fisches Transitpeptid kodiert, sowie einem Polyadenylierungssi­ gnal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo­ ratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrie­ ben sind.

Insbesondere bevorzugt sind Sequenzen, die ein Targeting in den Apoplasten, in Plastiden, in die Vakuole, in das Mitochondrium, in das Endoplasmatische Retikulum (ER) oder durch ein Fehlen ent­ sprechender operativer Sequenzen einen Verbleib im Kompartiment des Entstehens, dem Zytosol, gewährleisten (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423). Für die Menge der Proteinakku­ mulation in transgenen Pflanzen besonders förderlich erwiesen hat sich eine Lokalisation im ER (Schouten et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792).

Es können auch Expressionskassetten verwendet werden, deren DNA- Sequenz für ein Transketolase-Fusionsprotein kodiert, wobei ein Teil des Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translo­ kation des Polypeptides steuert. Bevorzugt sind für die Chloro­ plasten spezifische Transitpeptide, welche nach Translokation des Transketolase-Gens in die Chloroplasten vom Transketolase-Teil enzymatisch abgespalten werden. Insbesondere bevorzugt ist das Transitpeptid, das von der plastidären Transketolase oder einem funktionellen Äquivalent dieses Transitpeptids (z. B. dem Transit­ peptid der kleinen Untereinheit der Rubisco oder der Ferredoxin NADP Oxidoreduktase) abgeleitet ist.

Besonders bevorzugt sind DNA-Sequenzen von drei Kassetten des Plastiden-Transitpeptids der plastidären Transketolase aus Kar­ toffel in drei Leserastern als KpnI/BamHI Fragmente mit einem ATG-Codon in der NcoI Schnittstelle:

Die inserierte Nukleotid-Sequenz kodierend für eine Transketolase kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Transketolase-Ge­ nabschnitten verschiedener Organismen bestehen. Im allgemeinen werden synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons erzeugt, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Ro­ dons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit be­ stimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nu­ kleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrek­ ten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausge­ stattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.

Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator-Regio­ nen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion die­ ser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktions­ stellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatori­ schen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet in der 5'-3'-Transkrip­ tionsrichtung den Promotor, eine DNA-Sequenz die für ein Transke­ tolase-Gen codiert und eine Region für die transkriptionale Ter­ mination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.

Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnitt­ stellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restrikti­ onsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Trans­ versionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerre­ pair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen, wie z. B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffül­ len von Überhängen für "bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.

Von Bedeutung für den erfindungsgemäßen Erfolg kann u. a. das An­ hängen des spezifischen ER-Retentionssignals SEKDEL sein (Schou­ ten, A. et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792), die durchschnittliche Expressionshöhe wird damit verdreifacht bis vervierfacht. Es können auch andere Retentionssignale, die natür­ licherweise bei im ER lokalisierten pflanzlichen und tierischen Proteinen vorkommen, für den Aufbau der Kassette eingesetzt wer­ den.

Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadeny­ lierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA- Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbeson­ dere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder funktionelle Äquivalente.

Eine Expressionskassette kann beispielsweise einen konstitutiven Promotor (bevorzugt den CaMV 35 S-Promotor), das LeB4-Signalpep­ tid, das zu exprimierende Gen und das ER-Retentionssignal enthal­ ten. Als ER-Retentionssignal wird bevorzugt die Aminosäuresequenz KDEL (Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Leucin) verwendet.

Vorzugsweise wird die fusionierte Expressionskassette, die für ein Transketolase-Gen kodiert, in einen Vektor, beispielsweise pBin19, kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren. Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobak­ terien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z. B. von Tabak­ pflanzen, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blät­ ter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und an­ schließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transfor­ mation von Pflanzen durch Agrobakterien ist unter anderem bekannt aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausge­ geben von S. D. Rung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38. Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regene­ riert werden, die ein in die Expressionskassette integriertes Gen für die Expression eines Transketolase-Gens enthalten.

Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einer für eine Transke­ tolase kodierenden DNA wird eine Expressionskassette als Inser­ tion in einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzliche funktionelle Regulationssignale, beispielsweise Se­ quenzen für Replikation oder Integration enthält. Geeignete Vek­ toren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 (1993) be­ schrieben.

Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und Klonie­ rungstechniken können die Expressionskassetten in geeignete Vek­ toren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvektoren sind u.a. pBR332, pUC-Serien, M13mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobak­ terien replizieren können.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung ei­ ner Expressionskassette enthaltend DNA-Sequenzen SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA-Sequenzen zur Transformation von Pflanzen, -zellen, -geweben oder Pflanzenteilen. Vorzugsweise ist Ziel der Verwendung die Erhöhung des Gehaltes an Tocophero­ len, Vitamin K, Ligninen, Chlorophyllen und/oder der aromatischen Aminosäuren der Pflanze.

Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression spezifisch in den Blättern, in den Samen oder anderen Teilen der Pflanze er­ folgen. Solche transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut, sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile sind ein weiterer Ge­ genstand der vorliegenden Erfindung.

Die Expressionskassette kann darüberhinaus auch zur Transforma­ tion von Bakterien, Cyanobakterien, Hefen, filamentösen Pilzen und Algen mit dem Ziel einer Erhöhung des Gehaltes an Tocophero­ len, Vitamin K, Lignin, Chlorophyll und/oder aromatischen Amino­ säuren eingesetzt werden.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten­ transformativn durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genann­ ten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus, Annu. Rev. Plant Phy­ siol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225) beschrieben. Vor­ zugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu trans­ formieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).

Mit einer Expressionskassette transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Hafer, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und den verschie­ denen Baum-, Nuß- und Weinspezies, verwendet werden, z. B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.

Funktionell äquivalente Sequenzen, die für ein Transketolase-Gen kodieren, sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nu­ kleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktio­ nelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon-Gebrauch einer Pflanze angepaßte, künstliche Nukleotid-Sequenzen.

Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten für eine Transketolase kodierende Sequenz, welche wei­ terhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Sub­ stitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Inser­ tionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden bei­ spielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation der Transke­ tolase-Nukleotidsequenz erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodieren­ den Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsen­ zym-Schnittstellen sein.

Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funk­ tion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abge­ schwächt oder verstärkt ist.

Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschte Eigenschaft beispielsweise der Erhöhung des Tocopherol-Gehaltes in der Pflanze durch Überex­ pression des Transketolase-Gens in Kulturpflanzen vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung mittels Molecular Modelling konstruierter Pro­ teine, die Transketolase-Aktivität aufweisen oder durch in vitro- Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen Kodon-Nutzung erhal­ ten wurden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit pflanzen­ genetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertun­ gen anderer, bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln.

Als weitere geeignete äquivalente Nukleinsäure-Sequenzen sind zu nennen Sequenzen, welche für Fusionsproteine kodieren, wobei Be­ standteil des Fusionsproteins ein Transketolase-Polypeptid oder ein funktionell äquivalenter Teil davon ist. Der zweite Teil des Fusionsproteins kann z. B. ein weiteres Polypeptid mit enzymati­ scher Aktivität sein oder eine antigene Polypeptidsequenz mit deren Hilfe ein Nachweis auf Transketolase-Expression möglich ist (z. B. myc-tag oder his-tag). Bevorzugt handelt es sich dabei je­ doch um eine regulative Proteinsequenz, wie z. B. ein Signal- oder Transitpeptid, das das Transketolase-Protein an den gewünschten Wirkort leitet.

Erhöhung des Gehaltes an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, Ligninen und/oder aromatischen Aminosäuren bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Biosyntheseleistung dieser Verbindungen durch funktio­ nelle Überexpression des Transketolase-Gens in der Pflanze gegen­ über der nicht gentechnisch modifizierten Pflanze für die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration.

Der Biosyntheseort von Tocopherolen beispielsweise ist im allge­ meinen das Blattgewebe, so daß eine blattspezifische Expression des Transketolase-Gens sinnvoll ist. Es ist jedoch naheliegend, daß die Tocopherol-Biosynthese nicht auf das Blattgewebe be­ schränkt sein muß, sondern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze - beispielsweise in fetthaltigen Samen - gewebespezifisch erfolgen kann.

Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen Transketolase-Gens von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare Expression wünschenswert erscheinen.

Die Wirksamkeit der Expression des transgen exprimierten Transke­ tolase-Gens kann beispielsweise in vitro durch Sproßmeristemver­ mehrung ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe verän­ derte Expression des Transketolase-Gens und deren Auswirkung auf die Tocopherol-Biosyntheseleistung an Testpflanzen in Gewächs­ hausversuchen getestet werden.

Gegenstand der Erfindung sind außerdem transgene Pflanzen, trans­ formiert mit einer Expressionskassette enthaltend die Sequenz SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA-Sequenzen, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Vermehrungsgut solcher Pflan­ zen. Besonders bevorzugt sind dabei transgene Kulturpflanzen, wie z. B. Gerste, Weizen, Roggen, Mais, Hafer, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und die verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies.

Pflanzen im Sinne der Erfindung sind mono- und dikotyle Pflanzen oder Algen.

Durch Überexpression der für eine Transketolase kodierenden Gen­ sequenz SEQ-ID NO. 1 in einer Pflanze kann prinzipiell eine er­ höhte Resistenz gegenüber Inhibitoren der Transketolase erreicht werden. Die derart hergestellten transgenen Pflanzen sind eben­ falls Gegenstand der Erfindung.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind:

• - Verfahren zur Transformation einer Pflanze dadurch gekenn­ zeichnet, daß man Expressionskassetten enthaltend eine DNA- Sequenz SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA-Se­ quenzen in eine Pflanzenzelle, in Kallusgewebe, eine ganze Pflanze oder Protoplasten von Pflanzen einbringt.
• - Verwendung der Expressionskassette enthaltend eine DNA-Se­ quenz SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA-Se­ quenzen zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegenüber Inhibitoren der Transketolase durch verstärkte Ex­ pression der DNA-Sequenzen SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hy­ bridisierende DNA Sequenzen.

Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:

Allgemeine Klonierungsverfahren Gentechnische Verfahren, die den Beispielen zugrundeliegen 1. Allgemeine Klonierungsverfahren

Klonierungsverfahren wie z. B. Restriktionsspaltungen, Aga­ rose-Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Trans­ fer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Se­ quenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durchgeführt. Die Transformation von Agrobacterium tumefaciens wurde entsprechend der Methode von Höfgen und Willmitzer (Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877) ausgeführt. Die Anzucht der Agrobakterien erfogte in YEB Me­ dium (Vervliet et al., J. Gen. Virol. (1975) 26, 33).

Die im folgenden verwendeten Bakterienstämme (E. coli, XL-I Blue) wurden von Stratagene bezogen. Der zur Pflanzentrans­ formation verwendete Agrobakterienstamm (Agrobacterium tume­ faciens, C58C1 mit dem Plasmid pGV2260 oder pGV3850kan) wurde von Deblaere et al. in Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777 be­ schrieben. Alternativ können auch der Agrobakterienstamm LBA4404 (Clontech) oder andere geeignete Stämme eingesetzt werden. Zur Klonierung können die Vektoren pUC19 (Yanish-Per­ ron, Gene 33 (1985), 103-119) pBluescript SK- (Stratagene), pGEM-T (Promega), pZerO (Invitrogen), pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-8720) und pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990), 221-230) benutzt werden.

2. Erzeugung von cDNA-Bibliotheken

Zur Herstellung von Blatt-spezifischen cDNA Bibliotheken wurde Gesamt-RNA aus Tabakblättern nach einer von Logemann et al. (Anal. Biochem. (1987) 163,21) beschriebenen Methode iso­ liert. Anschließend wurde die poly(A)-RNA über Oligo(dT)-Cel­ lulose Type 7 (Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstel­ lers gereinigt. Nach photometrischer Konzentrationsbestimmung wurden 5 µg der so erhaltenen RNA für die cDNA Synthese ein­ gesetzt. Alle für die Herstellung der cDNA notwendigen Chemi­ kalien und Enzyme wurden durch die Firma Stratagene (La Jolla CA 92037, USA) bezogen. Die angewandten Methoden wurden nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Synthese des ersten und zweiten Stranges der cDNA wurde mit dem ZAP-cDNA Synthese Kit durchgeführt. Die erhaltenen doppelsträngigen cDNAs wur­ den anschließend mit EcoRI-NotI Adaptoren versehen und in ei­ nen EcoRI gespaltenen Lambda ZAPII Vektor kloniert. Nach in vitro Verpackung (Gigapack II Verpackungsextrakt) der rekom­ binanten Lambda DNA wurden XL-1 E. coli Zellen (Stratagene) transformiert. Durch Auszählen der gebildeten Plaques wurde der Titer der cDNA-Bibliotheken bestimmt.

3. Durchmusterung einer cDNA-Bibliothek mittels heterologer DNA- Sonden

2 × 10⁵ rekombinante Lambda Phagen (Lambda ZapII) einer blattspezifische cDNA-Bibliothek aus Tabak (Varietät Samsun NN) wurden auf Agarplatten ausplattiert. Die Phagen-DNA wurde mittels Standardverfahren (Sambrook et al. (1989); Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) auf Ny­ lon-Membranen (Hybond N, Amersham Buchler) transferiert und durch Inkubation für 2 Stunden bei 80°C auf den Filtern fi­ xiert. Als Hybridisierungssonden dienten DNA-Fragmente, die mit Hilfe eines "Multiprime DNA labelling systems" (Amersham Buchler) in Anwesenheit von a-³²P-dCTP (spezifische Aktivität 3000 Ci/mmol) nach Herstellerangaben radioaktiv markiert wur­ den. Hybridisierung der Membran erfolgte nach Prähybridisie­ rung bei 42°C in PEG-Puffer (Amasino (1986) Anal. Biochem. 152, 304-307) für 12-16 Stunden. Anschließend wurden die Fil­ ter 3 × 20 Minuten in 2 × SSC, 0,1% SDS bei 42°C gewaschen. Positiv hybridisierende Phagen wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht und durch Standardtechniken gereinigt.

4. Analyse von Gesamt RNA aus pflanzlichen Geweben

Gesamt-RNA aus pflanzlichen Geweben wurde wie bei Logemann et al. (Anal. Biochem. (1987) 163,21) beschrieben isoliert. Für die Analyse wurden jeweils 20-40 µg RNA in einem Formaldehyd- haltigen 1,5%igen Agarosegel aufgetrennt. Nach elektrophore­ tischer Auftrennung der RNA Moleküle wurde die RNA mittels Kapillartransfer auf eine Nylon Membran übertragen. Der Nach­ weis spezifischer Transkripte wurde wie bei Amasino (Anal. Biochem. (1986) 152, 304) beschrieben durchgeführt. Die als Sonde eingesetzten cDNA-Fragmente wurden mit einem Random Primed DNA Labeling Rit (Boehringer, Mannheim) radioaktiv markiert.

5. Sequenzanalyse rekombinanter DNA

Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit ei­ nem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Licor (Ver­ trieb durch MWG Biotech, Ebersbach) nach der Methode von San­ ger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).

Beispiel 1 Klonierung der plastidären Transketolase

Aus einer blattspezifischen cDNA-Bibliothek aus Tabak (Varietät Samsun NN) wurde ein Klon, der für Transketolase kodiert, ausge­ wählt. Die DNA Sequenz ist in SEQ-ID No. 3 dargestellt (Accession NR. A 52295).

Der 2629 Basenpaar lange cDNA-Klon 21 enthält einen offenen Lese­ raster von 2229 Basen und kodiert für ein Protein mit 743 Amino­ säuren. Analyse des Polypeptides unter Verwendung des Sequenzpro­ gramms PC/Gene (Untermenü TRANSPEP) ergab, daß am N-Terminus des Proteins ein chloroplastidäres Transitpeptid von vermutlich 77 Aminosäuren vorhanden ist, siehe auch EP-A 0 723 017.

Beispiel 2 Herstellung von Transketolase-Antisense-Transformanten

Ein 1300 Basenpaar-Fragment (1329-2611) dieses Klons wurde in An­ tisense-Orientierung in einen binären Vektor pBin19AR unter der Kontrolle des 35S-Promotors kloniert. Dieses Konstrukt wurde durch Agrobakterium-vermittelte Transformation in Tabak übertra­ gen. Regenerierte Pflanzen wurden auf plastidäre Transketolase mRNA-Mengen hin untersucht. Pflanzen mit reduzierter Transketola­ seaktivität wurden einer Selbstung unterzogen und der erhaltene Samen geerntet. Zur weiteren Analyse der Pflanzen wurde Samen aus der F1-Generation folgender Linien verwendet: TR 7 und TK 8. Die nachfolgend beschriebenen Daten sind durch Analysen dieser Linien gewonnen worden.

Alle untersuchten Antisense-Pflanzen zeigten hinsichtlich der Pflanzengröße deutliche Unterschiede auf. Es wurden Pflanzen ge­ funden, die die gleiche Größe hatten wie der Wildtyp, bis hin zu ganz kleinen Pflanzen. Die nachfolgenden Generationen waren also nicht einheitlich. Dies gilt auch für die Reduktion in der Trans­ ketolase-Aktivität, die innerhalb einer Linie nicht einheitlich war, d. h. man kann eine Linie nicht durch eine spezifische Reduk­ tion in der Transketolase-Aktivität definieren, sondern die Li­ nien spalten auf (Sedoheptulose-1,7-Bisphosphatase-antisense-Ta­ bak-Pflanzen weisen ein vergleichbares Phänomen auf; vgl. Harri­ son et al. 1998, Planta 204: 27-36).

Die Biomassen-Analyse ergab eine Korrelation zwischen Reduktion der Transketolase-Aktivität und Reduktion in der Biomasse.

Sämtliche Pflanzen wurden vor der Durchführung der eigentlichen Experimente auf ihre plastidäre Transketolase-Aktivität hin un­ tersucht. Pflanzen mit vergleichbarer Reduktion in der Transketo­ lase-Aktivität wurden gepoolt und über ihre relative Reduktion der TK-Aktivität gegenüber dem Wildtyp definiert (z. B. Gruppe von transgenen Pflanzen mit einer Reduktion der TK-Aktivität um 50% im Vergleich zum Wildtyp).

In Abb. 7 sind plastidäre Transketolase-Aktivitäten von in­ dividuellen Pflanzen der Linien TK 7 und TK 8 angegeben. Die Be­ stimmungen erfolgen auf Basis von RNA- und Proteinmessungen. Die Aktivitäten sind bezogen auf % WT (WT-Aktivität ist 100% ge­ setzt).

Beispiel 3 Bestimmung der Transketolase-Aktivität

Die Transketolase-Aktivität wurde in einem gekoppelten enzymati­ schen in vitro-Test aus pflanzlichen Rohextrakten ermittelt. Die detaillierte experimentelle Verfahrensweise ist von Haake veröf­ fentlicht worden (Haake et al, 1998, The Plant Journal 14: 147-157).

Schockgefrorenes Blattmaterial wird in einem eisgekühlten Extrak­ tionspuffer homogenisiert und die löslichen Proteine extrahiert. Der erhaltene Extrakt wird nach Abzentrifugieren der unlöslichen Zellrückstände unmittelbar im Transketolase-Aktivitätstest einge­ setzt. Hierbei setzt die im Extrakt vorhandene Transketolase die zugesetzten Substrate Xylulose-5-P und Erythrose-4-P um, wobei Sedoheptulose-7-P und Glycerinaldehyd-3-P entstehen. Letzteres kann mit Hilfe zugesetzter Hilfsenzyme (Triose-P-Isomerase und Glycerin-3-P-Dehydrogenase) nach Isomeri­ sierung zum Keton (Dihydroxyacetonphosphat) reduziert werden zum Alkohol (Glyce­ rol-3-P). Dabei wird NADH als Elektronendonator der Redoxreaktion oxidiert, was spektrophotometrisch nachgewiesen werden kann (Wel­ lenlänge: 340 nm).

Enzymextraktionspuffer: 100 mM Hepes pH 7,7, 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mM Aminocapronat, 0,5 mM PMSF, 10% Glycerin, 0,01% Triton X-100, 5 mM DTT, Extraktion: 1 : 20 (w/v).

Nach Abzentrifugieren der Zellreste wird ein Aliquot des Über­ standes in einem gekoppelten Enzymassay eingesetzt.
100 mM Hepes pH 7,7, 0,2 mM Cocarboxylase, 10 mM MgCl₂, 0,15 mM NADH, 0,8 mM Xylulose-5-P (X5P), 1 U TPI/GDH-Mix (Hoehringer Mannheim)
Start: 0,8 mM Erythrose-4-P (E4P)

Reaktionsschema

X5P + E4P -(TR)→ SH7P + GA3P
GA3P -(TPI)→ DHAP
DHAP -(GDH)→ G3P (bei dieser Reaktion wird NADH verbraucht; photometrischer Nachweis bei 340 nm)
SH7P = Sedoheptulose-7-P, GA3P = Glycerinaldehyd-3-P, DHAP = Di­ hydroxyaceton-P, G3P = Glycerin-3-P, TPI = Triose-P-Isomerase, GDH = Glycerinaldehyd-3-P-Dehydrogenase

Beispiel 4

Klonierung einer Transketolase-Isoform aus Saccharomyces cerevi­ siae in den pflanzlichen Expressionsvektor TK-Tp-BinAR-9 zur Überexpression der Hefe-Transketolase in Nicotiana tabacum SNN.

Aufgrund vorhandener Sequenzinformationen aus der Datenbank (Hefe Transketolase TKT1; Accession number: M63302) wurden Primer her­ gestellt, mit deren Hilfe mittels PCR aus Hefe-DNA ein ca. 2,1 Kb großes Fragment ("YTK") isoliert werden konnte. Dieses konnte durch Sequenzieren als Transketolase-Isoform TKT1 identifiziert werden, siehe SEQ-ID NO. 1.

Die Primer waren so gewählt, daß sie Schnittstellen enthielten, die eine gerichtete sense-Klonierung des Fragmentes in den Über­ expressionsvektor TK-Tp-BinAR-9 ermöglichten. Er ist vom binären Expressionsvektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990, Plant Sciences 66, S. 221-230) abgeleitet und erlaubt die Translations­ fusion eines beliebigen Proteins mit dem Transitpeptid der pla­ stidären Transketolase (TK-Tp) aus Tabak zur Dirigierung hetero­ loger Proteine in den Chloroplasten unter der Kontrolle des 35S-CaMV-Promotors (35S). Als Terminator dient das Polyadenylie­ rungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH 5 (OCS), (Gielen et al., 1984, EMBO J. 3, 835-846).

Dieses Überexpressionskonstrukt, siehe Abb. 10, wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens vermittelten Gentransfers in Nicotiana tabacum Varietät Samsun NN transformiert (Rosahl et 1 al., 1987, EMBO J. 6, S. 23-29).

Die Selektion von Pflanzen mit einer Überexpression der Transke­ tolase erfolgte zunächst durch Ermittlung der Transketolase-Akti­ vität, gefolgt von einer Untersuchung auf erhöhte Transketolase mRNA- und Proteinmenge.

Beispiel 5 Extraktion und Detektion von Tocopherol Extraktionsverfahren

• - 100 mg Feuchtgewicht Blattmaterial
• - Extraktionspuffer: 80% Ethanol, 10 mM Hepes pH 7,0, 1 mM Ascorbat
• - Extraktion: 1 : 5 (w/v)
• - Inkubation bei 50°C, 30 Minuten
• - Reine Zentrifugation
• - Zugabe von ½ Volumen n-Hexan zu dem Extrakt
• - Vortex und Zentrifugation (5 Minuten, Raumtemperatur)
• - Gewinnung der oberen sehr grün gefärbten Phase
• - Wiederholung der n-Hexan Extraktion mit der unteren Phase
• - Vereinigung der n-Hexan Phasen
• - Vakuum Trocknung (2-3 Stunden für 1 ml n-Hexan bei Raumtempe­ ratur)
• - Wiederauflösung des Rückstandes in ca. 1/5 des ursprünglichen n-Hexan Volumens
• - Injektion von 30-50 µl auf die HPLC
  HPLC-Detektion für Tocopherol
• - Detektion der Fluoreszenz: Anregung bei 295 nm, Emission bei 330 nm
• - Säule: RP-18 (Nucleosil 100, C18, 3 µm, Fa. Knauer)
• - Isokratisches System: n-Hexan plus 0,2% 2-Propanol
• - Fluß: 0,8 ml/min (Druck: 110 bar)
• - Standards von Sigma oder Merck
• - Laufzeit: 15 Minuten

Beispiel 6 Extraktion phenolischer Substanzen aus Blättern und HPLC-Analytik

Die Extraktion phenolischer Substanzen aus Blättern wurde wie bei Yao et al., The Plant Cell, 7 (1995), 1787 - beschrieben durchge­ führt.

Beispiel 7 Quantitative Bestimmung des Ligningehaltes

Die Extraktion des Lignins aus Stammgewebe erfolgte wie in Lange et al. beschrieben (1995).

Beispiel 8

Extraktion der aromatischen Aminosäuren und Nachweis mit Hilfe der HPLC.

Eine detaillierte Darstellung der Methoden zur Extraktion und zum Nachweis von Aminosäuren ist in Scheible et al. veröffentlicht (Scheible et al., 1997, The Plant Cell 9: 783-798).

Beispiel 9 Herstellung von transgenen Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN)

Für die Herstellung transgener Tabakpflanzen, die einen veränder­ ten Prenyllipidgehalt aufweisen, wurden Tabakblattscheiben mit Sequenzen der Transketolase (SEQ-ID No. 1, SEQ-ID No. 3) trans­ formiert. Zur Transformation von Tabakpflanzen wurden 10 ml einer unter Selektion gewachsenen Übernachtkultur von Agrobacterium tu­ mefaciens abzentrifugiert, der Überstand verworfen und die Bakte­ rien in gleichem Volumen Antibiotika-freien Mediums resuspen­ diert. In einer sterilen Petrischale wurden Blattscheiben steri­ ler Pflanzen (Durchmesser ca. 1 cm) in dieser Bakteriensuspension gebadet. Anschließend wurden die Blattscheiben in Petrischalen auf MS-Medium (Murashige und Skoog, Physiol. Plant (1962) 15, 473) mit 2% Saccharose und 0.8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach 2-tä­ giger Inkubation im Dunkeln bei 25°C wurden sie auf MS-Medium mit 100 mg/l Kanamycin, 500 mg/l Claforan, 1 mg/l Benzylaminopurin (BAP), 0.2 mg/l Naphtylessigsäure (NAA), 1.6% Glukose und 0.8% Bacto-Agar übertragen und die Kultivierung (16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit) fortgesetzt. Wachsende Sprosse wurden auf hormonfreies MS-Medium mit 2% Saccharose, 250 mg/l Claforan und 0.8% Bacto-Agar überführt.

Beispiel 10 Herstellung von transgenen Rapspflanzen (Brassica napus)

Die Herstellung der transgenen Rapspflanzen, die einen veränder­ ten Prenyllipidgehalt aufweisen, orientierte sich an einem Proto­ koll von Bade, J. B. und Damm, B. (in Gene Transfer to Plants, Po­ trykus, I. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Sprin­ ger Verlag, 1995, 30-38), in welchem auch die Zusammensetzungen der verwendeten Medien und Puffer angegeben sind.

Die Transformationen erfolgten mit dem Agrobacterium tumefaciens Stamm LBA4404 (Clontech GmbH, Heidelberg). Als binäre Vektoren wurden das bereits oben beschriebene binäre Konstrukt mit der ge­ samten cDNA der Transketolase aus Saccaromyces cerevisiae (SEQ-ID No. 1) verwendet. In allen hier verwendeten binären Vektoren wurde die NOS-Terminatorsequenz durch das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTIACH5 (Gielen et al., 1984) zur Transkriptionstermination ersetzt. Brassica napus Samen wurden mit 70% (v/v) Ethanol oberflächensteril gemacht, 10 min bei 55°C in H₂O gewaschen, in 1%iger Hypochlorit-Lösung (25% v/v Teepol, 0,1% v/v Tween 20) für 20 min inkubiert und sechsmal mit sterilem H₂O für jeweils 20 min gewaschen. Die Samen wurden drei Tage auf Filterpapier getrocknet und 10-15 Samen in einem Glas­ kolben mit 15 ml Keimungsmedium zur Keimung gebracht. Von mehre­ ren Keimlingen (ca. 10 cm groß) wurden die Wurzeln und Apices entfernt und die verbleibenden Hypokotyle in ca. 6 mm lange Stücke geschnitten. Die so gewonnenen ca. 600 Explante werden 30 min mit 50 ml Basalmedium gewaschen und in einen 300 ml Kolben überführt. Nach Zugabe von 100 ml Kallus-Induktionsmedium wurden die Kulturen für 24 h bei 100 U/min inkubiert.

Vom Agrobacterium-Stamm wurde eine Übernachtkultur bei 29°C in Lu­ ria Broth-Medium mit Kanamycin (20 mg/l) angesetzt, davon 2 ml in 50 ml Luria Broth-Medium ohne Kanamycin für 4 h bei 29°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0,4-0,5 inkubiert. Nach der Pelletierung der Kultur bei 2000 U/min für 25 min wurde das Zellpellet in 25 ml Basalmedium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der Lösung wurde durch Zugabe von weiterem Basalmedium auf eine OD₆₀₀ von 0.3 eingestellt.

Aus den Raps-Explanten wurde das Kallus-Induktionsmedium mit ste­ rilen Pipetten entfernt, 50 ml Agrobacterium-Lösung hinzugefügt, vorsichtig gemischt und für 20 min inkubiert. Die Agrobacterien- Suspension wurde entfernt, die Raps-Explante für 1 min mit 50 ml Kallus-Induktionsmedium gewaschen und anschließend 100 ml Kallus- Induktionsmedium hinzugefügt. Die Co-Kultivierung wurde für 24 h auf einem Rotationsschüttler bei 100 U/min durchgeführt. Die Co- Kultivierung wurde durch Wegnahme des Kallus-Induktionsmediums gestoppt und die Explante zweimal für jeweils 1 min mit 25 ml und zweimal für 60 min mit jeweils 100 ml Waschmedium bei 100 U/min gewaschen. Das Waschmedium mit den Explanten wurde in 15 cm Pe­ trischalen überführt und das Medium mit sterilen Pipetten ent­ fernt.

Zur Regeneration wurden jeweils 20-30 Explante in 90 mm Petri­ schalen überführt, welche 25 ml Sproß-Induktionsmedium mit Kana­ mycin enthielten. Die Petrischalen wurden mit 2 Lagen Leukopor verschlossen und bei 25°C und 2000 lux bei Photoperioden von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit inkubiert. Alle 12 Tage wurden die sich entwickelnden Kalli auf frische Petrischalen mit Sproß- Induktionsmedium überführt. Alle weiteren Schritte zur Regenera­ tion ganzer Pflanzen wurde wie von Bade, J. B. und Damm, B. (in Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38) beschrieben durchgeführt.

Beispiel 11 Steigerung der Tocopherolbiosynthese in Tabak

Die Überexpression der Hefe-Transketolase in Tabak erfolgte wie in Beispiel 4 beschrieben.

Mit den entsprechenden Konstrukten transformierte Takakpflanzen wurden im Gewächshaus angezogen. Anschließend wurde der α-Toco­ pherolgehalt der Gesamtpflanze bzw. der Samen der Pflanze bes­ timmt. In allen Fällen war die α-Tocopherolkonzentration im Verg­ leich zur nicht transfomierten Pflanze erhöht.

Beispiel 12 Steigerung der Tocopherolbiosynthese in Raps

Die cDNA der Transketolase aus Saccharomyces cerevisiae (SEQ-No. 1) wurde mit einem CaMV35S-Promotor versehen und in Raps unter Verwendung des 35S-Promotors überexprimiert. Parallel dazu wurde der samenspezifische Promotor des Phaseolingenes verwendet, um den Tocopherolgehalt spezifisch im Rapssamen zu erhöhen. Mit den entsprechenden Konstrukten transformierte Rapspflanzen wurden im Gewächshaus angezogen. Anschließend wurde der α-Tocopherolge­ halt der Gesamtpflanze bzw. der Samen der Pflanze bestimmt. In allen Fällen war die α-Tocopherolkonzentration im Vergleich zur nicht transfomierten Pflanze erhöht.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (7)

1. Verwendung von DNA-Sequenzen codierend für eine Transketolase zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocophe­ rolen, Vitamin K, Chlorophyllen, Ligninen und/oder aromatis­ chen Aminosäuren.

2. Verwendung einer DNA-Sequenz SEQ ID No. 1 oder einer mit die­ ser hybridisierenden DNA-Sequenz kodierend für eine Transke­ tolase (TK) zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, Ligninen und/oder aromatischen Aminosäuren.

3. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, Ligninen und/oder aromatischen Aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, daß eine DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder eine mit dieser hybridisierende DNA-Sequenz in Pflanzen exprimiert wird.

4. Verfahren zur Transformation einer Pflanze dadurch gekenn­ zeichnet, daß man eine Expressionskassette enthaltend einen Promotor und eine DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder eine mit die­ ser hybridisierende DNA-Sequenz in eine Pflanzenzelle, in Kallusgewebe, eine ganze Pflanze oder Protoplasten von Pflan­ zenzellen einbringt.

5. Verfahren zur Transformation von Pflanzen gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformation mit Hilfe des Stammes Agrobacterium tumefaciens, der Elektroporation oder der particle bombardment Methode erfolgt.

6. Pflanze mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlo­ rophyllen, Ligninen und/oder aromatischen Aminosäuren enthal­ tend eine Expressionskassette gemäß Anspruch 4.

7. Pflanze nach Anspruch 6, ausgewählt aus der Gruppe Soja, Ca­ nola, Gerste, Hafer, Weizen, Raps, Mais oder Sonnenblume.