DE19734800A1

DE19734800A1 - Verfahren zum Nachweis von ökotoxikologisch wirksamen Schadstoffen mittels pflanzlicher Zellsysteme

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Publication number: DE19734800A1
Application number: DE19734800A
Authority: DE
Inventors: Heide Prof Dr Schnabl; Peter Dr Helfrich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-08-12
Filing date: 1997-08-12
Publication date: 1999-02-18

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum sehr sensitiven Nachweis von ökotoxiko logisch wirksamen Schadstoffen in Böden, Komposten und Substraten, wie bei spielsweise Lebensmitteln, Kosmetika etc., mittels pflanzlicher Zellsysteme. Der Nachweis beruht auf der Sensitivität dieser Zellsysteme in Bezug auf den Eingriff der Schadstoffe in die Physiologie dieser Zellsysteme, wobei die verursachten Än derungen einiger physiologischer Parameter im Vergleich zu standardisierten schad stofffreien Kontrollen gemessen werden und so als biologische Indikatoren für be sagte Schadstoffe dienen.

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens können Kontaminationen mit sehr unter schiedlichen Schadstoffen, insbesondere Herbiziden, Pestiziden, Fungiziden und Schwermetallen aber auch organischen Säuren, etc. in sehr niedrigen Konzentratio nen festgestellt werden, ohne daß besondere zusätzliche Anreicherungsverfahren notwendig sind.

Die Kontamination und Anreicherung von Böden mit ökotoxikologisch wirksamen Schadstoffen stellen ein immer größeres Problem dar. Solche Schadstoffe werden insbesondere durch Land- und Forstwirtschaft und Industrie als Ergebnis von Pro duktionsprozessen sowie damit in Verbindung stehender, unzureichend gesicherter Abfall- und Mülldeponien unkontrolliert in die Böden eingebracht. Oftmals ist man sich über die Quantität und Qualität derartiger Kontaminationen nicht im Klaren. Besonders problematisch ist die Situation bei Komposten anzusehen, die quasi als ein Konzentrat von umgesetzten ehemaligen schadstoffbelasteten Pflanzenteilen an gesehen werden können.

Durch die Nahrungskette können solche Schadstoffe auch in Lebensmittel in ge sundheitlich bedenklichen Konzentrationen gelangen. Pflanzliche und tierische Sub stanzen sind aber auch Grundlage von Kosmetika und sogar Arzneimitteln. Die rechtzeitige Feststellung von Schadstoffen und ihrer toxischen Metabolite in mög lichst geringen Konzentrationen in Böden, Komposten und Substraten stellen also eine große Herausforderung an die zur Verwendung kommenden Nachweismetho den dar.

Der Nachweis der Schadstoffe mittels chemisch-analytischer Methoden erweist sich angesichts der großen Anzahl der verschiedenartigen nachzuweisenden Wirkstoffe und ihrer meist unbekannten Metabolite oft als zu wenig sensitiv, methodisch sehr aufwendig und teuer und damit wirtschaftlich wenig rentabel.

Biologische Testsysteme, die in Zusammenhang mit solchen Nachweismethoden in der Umweltanalytik in den letzten Jahren entwickelt wurden, gewinnen hingegen immer mehr an Bedeutung. Diese Systeme beruhen auf der Detektierung in der Re gel sensitiver Wirkung von Schadstoffen auf lebende Organismen oder deren biolo gischen Einheiten, wie Zellen oder subzelluläre Strukturen.

So können beispielsweise Änderungen in den Sauerstoffbilanzen, sowie der Vor gänge, die unmittelbar mit dem Elektronentransport in Zusammenhang stehen Auf schluß über die Art und die Menge der Schadstoffbelastung geben. Die Änderungen werden beispielsweise über Messung von Photosyntheserate bzw. photosyntheti schen oder anderweitigen Elektronentransport, Atmung und Enzymaktivitäten mit tels bekannter Meßmethoden (z. B. Sauerstoffelektrode, Fluoreszensmessung, etc.) ermittelt.

Bei Verwendung ganzer Organismen lassen sich die bekannten Methoden nicht oder nur schlecht standardisieren.

Pflanzliche Zellen, insbesondere pflanzliche Zellorganellen und deren Substrukturen haben sich oftmals als effizienter erwiesen. So können wasserlösliche Herbizide mittels ganzer Protoplasten über deren Sauerstoffverbrauch in Wasserproben nach gewiesen werden, allerdings nur mit einer noch unbefriedigenden unteren Nach weisgrenze von etwa 0.5 µg/l.

Zelluläre Substrukturen sind in der Regel besser geeignet. So werden in der DE 34 12 023 A1 und der DE 44 20 093 Verfahren zum Nachweis von Schadstof fen in (Trink-)Wasser- bzw. Gewässerproben beschrieben, welche aus Chloropla sten höherer Pflanzen isolierte Thylakoidmembranen einsetzen. Allerdings besteht hier zumeist das Problem, daß bei der Präparation die für die zu messende physio logische Wirkung notwendigen Faktoren und Substanzen ausgewaschen werden, was zunächst wiederum eine unbefriedigende Sensitivität des Tests zur Folge hat. Durch die Zugabe entsprechend geeigneter Mediatoren kann dieser Nachteil, wie in den oben angegebenen Patentanmeldungen beschrieben, wieder ausgeglichen wer den.

Die für diese Zwecke geeigneten Methoden des Standes der Technik weisen also entweder eine zu hohe Nachweisgrenze auf und/oder beschränken sich auf den Nachweis spezieller Schadstoffgruppen oder auf den Nachweis von Schadstoffen ausschließlich in einfacher zu handhabenden Wasser bzw. Gewässerproben.

Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen sehr sensitiven Nachweis von Schadstoffen eines breiten Wirkungs- und Substanzspektrums, welche aus kontaminierten Böden, Komposten und anderweitigen festen Substraten stammen, ohne Einsatz zusätzlicher Anreicherungsverfahren zur Verfügung zu stellen. Insbe sondere ist es auch Aufgabe der Erfindung, ein effektives Extraktions- und Aufrei nigungsverfahren dieser Schadstoffe aus den festen Substraten, bzw. Böden bereit zustellen, welches erst Voraussetzung für einen solchen Nachweis ist. Dieses Ver fahren ist im Hinblick auf die Empfindlichkeit der zu verwendenden biologischen Einheiten, die möglichst während des Tests physiologisch intakt bleiben sollten, sehr sorgfältig auszuwählen. Andrerseits sollte das Isolierungs- und Aufreinigungs verfahren möglichst vollständig alle in wäßrige Lösungen extrahierbare Schadstoffe liefern können.

Gegenstand der Erfindung ist so ein Verfahren zum Nachweis von Schadstoffen in umweltbelasteten Böden, Komposten und Substraten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man (i) aus einer Boden-, Kompost- oder Substratprobe einen wäßrigen Extrakt herstellt, (ii) besagten Extrakt aufreinigt, (iii) eine Probe dieses Extraktes einer biologischen Einheit, bestehend im wesentlichen aus Zellorganellen oder deren Bestandteilen gibt, und (iv) mittels einer biosensorischen Meßapparatur die physiologischen Parameter im Vergleich zu einer standardisierten, schadstofffreien Kontrolle mißt.

Gegenstand sind insbesondere Verfahren, bei denen die biologische Einheit aus Thylakoidmembranen, Protoplasten oder Mitochondrien besteht.

Dabei kann die biologische Einheit aus nur einer der drei genannten subzellulären Strukturen bestehen. Die Auswahl richtet sich dabei nach der Art des in der Probe erwartenden Schadstoffes oder Schadstoffgemisches.

Für Schadstoffe, die vor allem eine Hemmwirkung auf den photosynthetischen Elektronentransport der Photosystemapparate I und II ausüben sind vor allem Thy lakoidmembranen geeignet.

Schadstoffe, die vorwiegend die Atmungskette und Fettsäuresynthese beeinflussen können mit Hilfe von Mitochondrien nachgewiesen werden.

Schadstoffe, die vorwiegend Aminosäure- bzw. Enzymsynthesen betreffen, lassen sich mit Protoplasten detektieren. Eine biologische Einheit kann aber auch erfin dungsgemäß aus einem Gemisch von zwei oder allen genannten subzellulären Strukturen aufgebaut sein.

Letztlich können auch, insbesondere dann, wenn mit verschiedenartigen Schadstof fen in den Proben zu rechnen ist, mehrere biologische Einheiten, die jeweils aus ei ner subzellulären Struktur bestehen, einzeln oder hintereinander geschaltet, zum Einsatz kommen.

Die Veränderungen in der jeweiligen biologischen Einheit aufgrund der physiologi schen Wirkung der Schadstoffe werden mit geeigneten, an sich bekannten biosenso rischen Meßapparaturen gemessen. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um Meß apparaturen, die den Sauerstoffverbrauch oder Fluoreszenseigenschaften betreffen. Die Fluoreszensmessung ist dabei ausschließlich für die Vorgänge in den Thyla koidmembranen einsetzbar.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein entsprechendes Verfahren, das mittels einer biosensorischen Meßapparatur den Sauerstoffverbrauch bzw. die Sauerstoffpro duktion sowie den photosynthetischen Elektronentransport durch Fluoreszensmes sung bestimmt.

Erfindungsgemäß besteht eine biologische Einheit aus den entsprechenden subzel lulären Strukturen in Form einer wäßrigen Suspension. Unter subzellulären Struktu ren sind prinzipiell alle für diese Zwecke geeigneten Bestandteile von Zellen und de ren Unterstrukturen gemeint, insbesondere also Chloroplasten, Protoplasten, Mito chondrien, Thylakoide.

Die subzellulären Strukturen können aber auch in Form von Immobilisaten, die nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden können, vorliegen. Dabei sind die entsprechenden subzellulären Strukturen in bzw. an Trägermaterialien fixiert. Als Trägermaterialien sind alle für diese Zwecke bekannten Materialien geeignet, die die Messungen der Fluoreszenz und des Sauerstoffverbrauchs mittels einer Sau erstoffelektrode zulassen, beispielsweise Agar oder entsprechende Polymerisations gele.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein entsprechendes Verfahren, bei dem die biologische Einheit in Form einer im wesentlichen wäßrigen Suspension oder in immobilisierter Form eingesetzt wird.

Als besonders vorteilhaft hat sich gezeigt, daß die ausgewählte biologische Einheit in lyophilisierter Form sowohl bei der Messung in Suspension als auch im Immobili sat eingesetzt wird. Lyophilisate subzellulärer Strukturen haben den Vorteil, daß sie länger physiologisch wirksam bleiben und daher gut aufbewahrt werden können. Es erübrigt sich so, daß für jede neue Schadstoffbestimmung frische Zellen gewonnen und aufbereitet werden müssen. Überdies konnte überraschend gezeigt werden, daß die Sensitivität der so gewonnenen biologischen Einheit gegenüber der angewand ten Meßmethodik erfindungsgemäß oft höher ist als bei frisch aufbereiteten oder tiefgefrorenem Material. Die erfindungsgemäßen Lyophilisate können nach im Stand der Technik bekannten Methoden gewonnen werden.

Alternativ kann die biologische Einheit nach ihrer Isolierung bei ca. -20°C einge froren und über einen Zeitraum von ca. vier Wochen aufbewahrt werden, ohne daß ein größerer Aktivitätsverlust gegenüber dem frisch verwendetem Material festzu stellen ist.

Ein wesentlicher Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, die Schadstoffe in der richtigen und geeigneten Weise aus den festen Proben aufzube reiten und für die Reaktion mit der biologischen Einheit bereitzustellen.

Dabei hat sich überraschenderweise das qualitative und quantitative Herauslösen bzw. Extrahieren aus den genannten festen Proben als Problem erwiesen, das erfin dungsgemäß gelöst werden mußte.

Es wurde nun gefunden, daß die in Struktur und Wirkung unterschiedlichsten Wirk- bzw. Schadstoffe, mit denen Böden und insbesondere Komposte kontaminiert sein können, mit bestimmten, im wesentlichen wäßrigen komplexbildenden Puffersyste men herausgelöst werden können.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein entsprechendes Verfahren, das sich dadurch auszeichnet, daß man die Boden-, Kompost- oder Substratprobe in einem wäßrigen komplexbildenden Puffersystem, welches bei einem pH-Wert zwischen 4 und 7 puffert, aufnimmt, extrahiert, ultrazentrifugiert und den erhaltenen klaren Überstand direkt zu der biologischen Einheit gibt, in welcher die durch die Schadstoffe verur sachten Veränderungen gemessen werden.

Gegenstand der Erfindung ist schließlich die Verwendung von Thylakoidmembra nen, Protoplasten und Mitochondrien in dem oben und unten spezifizierten erfin dungsgemäßen Verfahren, bzw. die entsprechende Verwendung zum Nachweis von Herbiziden, Pestiziden, Fungiziden, Schwermetallen und anderen Umweltschad stoffen.

Unter dem Begriff "Substrat" werden erfindungsgemäß alle festen, halbfesten, fließbaren aber nicht flüssigen Verbindungen oder Gemische, welche nicht Böden oder Komposte sind, verstanden. Beispiele hierfür sind Kosmetika, Arzneimittel, Lebensmittel sowie Hilfs- und Zusatzstoffe für die genannten Bereiche.

Unter komplexbildenden Puffersystemen werden erfindungsgemäß physiologische Pufferlösungen verstanden, welche Komplexe mit anderen Substanzen zu bilden vermögen, zum Beispiel Chelat-Komplexe, EDTA-haltige Puffersysteme, Rin ger'sche Lösung, Citratpuffer oder Clathratbildner wie Huminstoffe. Derartige Puf fersysteme sind nicht nur besonders vorteilhaft in Bezug auf die Fähigkeit, die ent sprechenden Schadstoffe gut herauszulösen, sondern sie besitzen eine besonders schonende Wirkung auf die physiologisch aktiven biologischen Systeme und Ein heiten. Ohne diese Puffersysteme ist zudem die Nachweisgrenze, ermittelt durch die verwendeten biologischen Einheiten, deutlich höher.

Die Nachweisgrenze des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt je nach verwendeter biologischer Einheit und zu messendem Schadstoff zwischen 0.05 und 0.5 µg/l, vorzugsweise zwischen 0.1 und 0.5 µg/l. Bei der Verwendung von Thylakoiden wird erfindungsgemäß ein Elektronenakzeptor (Mediator), wie beispielsweise Fla vin-Mononukleotid (FMN) hinzugesetzt, der den Elektronentransport zwischen PS II und PS I ermöglicht.

Mittels des Biosensors der Erfindung können die verschiedenartigsten Schadstoffe gemessen werden, insbesondere Herbizide und Pestizide, die zum einen wasserlös lich sind und zum anderen eine signifikante meßbare Schädigung der biologischen Einheit des Biosensors bewirken. Im folgenden sind einige Beispiele aufgeführt:

Schadstoffe, welche vorzugsweise mit Thylakoidmembranen als biologische Einheit gemessen werden können:
Herbizide mit Hemmwirkung auf den Elektronentransport am Photosystem II aus der Klasse der Triazine (z. B. Atrazin, Simazin, Terbutylazin), Triazindione (z. B. Metribuzin) oder der Klasse der substituierten Harnstoffderivate (Diuron, Isoprotu ron), der Anilide, Biscarbamate, Uracile oder Heterocyclen (z. B. Tribunil, Bro macil);
Herbizide mit Hemmwirkung auf den Elektronentransport am Photosystem I aus der Klasse der Bipyridine (z. B. Paraquat);
Herbizide mit Entkopplungswirkung des Elektronentransports, z. B. PCP; Herbizide mit Chlorose-Wirkung, wie z. B. Amitrol.

Schadstoffe, welche vorzugsweise mit Protoplasten als biologischer Einheit gemes sen werden können:
Wirkung auf Aminosäuresynthese z. B. durch Methioninsulfoximin;
Wirkung auf die Acetolactat-Synthase (ALS) durch Sulfonylharnstoffe, wie z. B. Amidosulfuron oder Chlorsulfuron;
Hemmwirkung auf die Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-synthase (EPSPS) durch beispielsweise Glyphosat;
Hemmwirkung auf die Histidin-Biosynthese durch z. B. Amitrol.

Schadstoffe, welche vorzugsweise mit Protoplasten und/oder Mitochondrien als biologischer Einheit gemessen werden können:
Wirkung auf Mikrotubuli (z. B. Dinitroaniline, wie Trifuralin);
Wirkung auf die Mitose (Carbamate, Phosphoramide, Pyridine);
Wirkung auf die Cellulose-Synthese;
Wirkung auf die Fettsäuresynthese (z. B. durch Aryloxypropionsäuren, Cyclohexa none, Acetyl-CoA-Carboxylasen);
Auxin-Herbizide, beispielsweise Phenoxycarbonsäuren oder heterocyclische Car bonsäuren, wie Picloram)
Pestizidwirkung durch substituierte Phenole und Anilide.

Weitere Herbizide, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erfaßt werden können, sind der gängigen Fachliteratur zu entnehmen (z. B. Herbizide, B. Hock et al., 1995, Georg Thieme Verlag).

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern:

Beispiel 1

Eine Probe (ca. 10 g) des Bodens, Substrats, Komposts wurde sorgfältig gesiebt (Maschenweite 7-12 mm) und bei ca. 40°C für 10 bis 15 Stunden bis zur Ge wichtskonstanz getrocknet.

5 g der so vorbereiteten Probe wurden nun in 50 ml eines komplexierenden Puffers, beispielsweise Citratpuffer (aus Trinatriumcitrat und Citronensäure) aufgenommen. Der Puffer wurde durch Mischen von 40 ml deionisiertes Wasser, 40 ml Citratpuffer (20 mM, pH 4 bzw. pH 6).

Die suspendierte Probe wurde ca. 10-24 Stunden über Kopf geschüttelt und an schließend bei zunächst 1.700 g für 30 Minuten und dann 30 Minuten bei ca. 22.000 g zentrifugiert.

Der so erhaltene Überstand wurde ohne weiteres Anreicherungsverfahren für die Messung eingesetzt.

Als eine von zahlreichen Alternativen wurde ein entsprechender EDTA-haltiger Puffer (10-100 mM EDTA) eingesetzt.

Als weitere Alternative wurde ein entsprechender Puffer, der einen Chlathratbildner (Huminstoffe) enthält verwendet.

Beispiel 2

Thylakoidmembranen wurden aus ca. 3 Wochen alten Bohnenpflanzen isoliert, die unter Kurztagbedingungen (9 Stunden Licht, 15 Stunden Dunkelperiode, 20°C) zuvor angezogen wurden. Die Isolierung erfolgte nach einem Verfahren von Cohen und Baxter (Plant Physiol. 93, 1005 (1990)). Ein osmotischer Aufschluß der Chlo roplasten in destilliertem Wasser wurde zwischen den Reinigungsschritten einge fügt. Da bei der Isolierung der Thylakoide die meisten für den Elektronentransport verantwortlichen löslichen Stoffe (z. B. NADP, Ferredoxin, Oxidoreduktasen) aus gewaschen werden, wurde Flavin-Mononukleotid als Mediator hinzugefügt, der ei nen starken lichtabhängigen Elektronenfluß an den Thylakoidmembranen hervor ruft, welcher wiederum später durch die Schadstoffwirkung gehemmt wird.

Protoplasten wurden nach einem Verfahren von Schnabl (Planta 152, 307 (1981)) isoliert und aufgereinigt.

Mitochondrien wurden nach einem Verfahren von Douce (aus "Mitochondria in Higher Plants", Kap. 2.II.C, 125 (1992) gewonnen.

Beispiel 3

Der photosynthetische Elektronentransport durch Thylakoidmembranen wurde so wohl mit der Fluoreszenzmessung als auch mit der Sauerstoffmessung verfolgt.

Die Fluoreszenzmessung erfolgte nach einer Methodik von Schreiber und Bilger (Progress in Botany 54, 151 (1993), Springer Verlag). Die Einwirkzeit der Licht blitze betrug zwei Minuten, die eigentliche Messung nur eine Minute. Die Fluores zenzmessung erfolgte mit einem handelsüblichen Fluorometer.

Die Sauerstoffbestimmung erfolgte mit einer handelsüblichen Sauerstoffelektrode. Das Meßverfahren beruht auf der Tatsache, daß ein intakter Elektronentransport in der jeweiligen biologischen Einheit unter Lichteinwirkung einen hohen Sauerstoff verbrauch erzeugt, der durch die Wirkung von Schadstoffen gemindert wird. Die zunächst abgedunkelte Probe (10 min) wurde dann einer Lichtphase von 5 min (150 W Halogenlampe) ausgesetzt.

Als Meßmedium diente ein Puffer aus 250 mmol/l K₂HPO₄/KH₂PO₄, 50 mmol/l NaCl, 12.5 mmol/l NH₄Cl, pH 7.8). Im Falle der Verwendung von Thylakoiden enthielt dieses Medium zusätzlich 30 mg/l FMN. Diese Lösung wurde im Verhältnis 1 : 4 mit bidestilliertem Wasser versetzt.

Für jede Messung wurden bei einem Meßvolumen von 0.8 bis 1.0 ml etwa 20-30 µl Thylakoidsuspension an biologischer Einheit (entspricht einem Chlorophyllgehalt 15-25 µg) eingesetzt.

Beispiel 4 (i) Fluoreszenzmessung an Chloroplasten-Thylakoiden

Als eine besonders geeignete Meßgröße erwies sich der Fluoreszenz-Parameter "Yield". Yield = (Fm' - Ft)/Fm' = ΔF/Fm' (Schreiber und Bilger, Progress in Botany 54, 151 (1993), Springer Verlag). Dabei wird bei lichtadaptiertem Chloro phyll die Differenz der maximalen Fluoreszenzausbeute nach sättigendem Lichtblitz (Fm') zur Grundausbeute beim Meßlicht (Ft) bezogen auf Fm' gemessen.

Yield-Kontrolle:
0,450 = 100%
Yield-Schadstoffprobe:
0,405 = ca. 10%.

Die Probe zeigt eine Hemmung des photosynthetischen Elektronentransports (PET) 10%.

(ii) Sauerstoffmessung an Chloroplasten-Thylakoiden

Sauerstoffverbrauch (µmol O₂/h/mg Clorophyll) der lyophilisierten Chloropla sten-Thylakoide im Licht. Die Chlorophyll-Bestimmung erfolgte nach Arnon (Plant. Physiol. 24, 1 (1949)).

Kontrolle:
-635 (µmol O₂/h/mg Clorophyll)
Probe:
-375 (µmol O₂/h/mg Clorophyll).

Die Beeinflussung der biologischen Einheit wird als prozentualer Anteil der Kon trolle (100%) erfaßt.

Geringerer Sauerstoffverbrauch im Licht zeigt eine Schädigung der biologischen Einheit an.

(iii) Sauerstoffmessung an Protoplasten in der Dunkelphase

Kontrolle:
-4,1 (µmol O₂/h/mg Clorophyll)
Probe 1:
-5.0 (µmol O₂/h/mg Clorophyll)
Probe 2:
-4,0 (µmol O₂/h/mg Clorophyll).

Höherer Sauerstoffverbrauch im Dunkeln zeigt eine Schädigung der biologischen Einheit an.

Sauerstoffproduktion in der anschließenden Lichtphase:

Kontrolle:
12,0 (µmol O₂/h/mg Clorophyll)
Probe 1:
8,5 (µmol O₂/h/mg Clorophyll)
Probe 2:
9,2 (µmol O₂/h/mg Clorophyll).

Geringerer Sauerstoffverbrauch im Licht zeigt eine Schädigung der biologischen Einheiten.

(iv) Sauerstoffverbrauch an Mitochondrien

Kontrolle:
-15,6 (µmol O₂/h/mg Clorophyll)
Probe:
-10,5 (µmol O₂/h/mg Clorophyll).

Geringerer Sauerstoffverbrauch zeigt eine Schädigung der biologischen Einheit an.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Schadstoffen in umweltbelasteten Böden, Komposten und Substraten, dadurch gekennzeichnet, daß man

(i) aus einer Boden-, Kompost- oder Substratprobe einen wäßrigen Extrakt her stellt,
(ii) besagten Extrakt aufreinigt,
(iii) eine Probe dieses Extraktes zu einer biologischen Einheit, bestehend im we sentlichen aus Zellorganellen oder deren Bestandteilen gibt, und
(iv) mittels einer biosensorischen Meßapparatur die physiologischen Parameter im Vergleich zu einer standardisierten, schadstofffreien Kontrolle mißt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Einheit wesentlichen aus Thylakoidmembranen besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Einheit wesentlichen aus Protoplasten besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Einheit wesentlichen aus Mitochondrien besteht.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß mittels der biosensori schen Meßapparatur der Sauerstoffverbrauch bzw. die Sauerstoffproduktion sowie der photosynthetische Elektronentransport durch Fluoreszensmessung bestimmt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß mittels der bio sensorischen Meßapparatur der Sauerstoffverbrauch bzw. die Sauerstoffproduktion bestimmt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Einheit in Form einer im wesentlichen wäßrigen Suspension oder in immobilisierter Form eingesetzt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Boden-, Kompost- oder Substratprobe in einem wäßrigen komplexbildenden Puf fersystem, welches bei einem pH-Wert zwischen 4 und 7 puffert, aufnimmt, extra hiert, ultrazentrifugiert und den erhaltenen klaren Überstand direkt zu der biologi schen Einheit gibt.

9. Verwendung von Thylakoidmembranen, Protoplasten und Mitochondrien in einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 8.

10. Verwendung nach Anspruch 9 zum Nachweis von Herbiziden, Pestiziden und Schwermetallen.

11. Verwendung nach Anspruch 10 zum Nachweis der besagten Schadstoffe, die ohne jegliche Anreicherungsverfahren ab einer Konzentration von 0.1-0.5 µg/l je nach Schadstoff nachgewiesen werden können.