DE102007054065A1

DE102007054065A1 - An Flavonoiden reiches Gewebe aus Neomarica gracilis und Verfahren zum Kultivieren desselben

Info

Publication number: DE102007054065A1
Application number: DE102007054065A
Authority: DE
Inventors: Chin-Wen Ho; Tin-Hui Chu
Original assignee: Tatung Co Ltd; Tatung University
Current assignee: Tatung Co Ltd; Tatung University
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2007-11-13
Publication date: 2008-07-03
Also published as: GB2445213A; GB0715201D0

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt ein an Flavonoiden reiches In-vitro-Rhizomgewebe von Neomarica gracilis bereit, welches aus einer Gewebekultur-Präparation eines N. gracilis-Gewebes erhalten wird, das zur Proliferation befähigt ist, wie eine Wurzel oder ein Stiel, ein Blatt, ein Basalabschnitt eines Blattes und/oder ein Rhizom. Das an Flavonoiden reiche Rhizomgewebe von N. gracilis enthält Tectorigenin, was deutlich verschieden von dem natürlich gewachsenen Rhizom von N. gracilis ist, welches kein Tectorigenin enthält. Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Kultivieren des an Flavonoiden reichen In-vitro-Rhizomgewebes, ein Verfahren zum Extrahieren des Tectorigenins aus dem an Flavonoid reichen Rhizomgewebe und quantitative Verfahren zum Bestimmen der Menge von Tectorigenin in dem an Flavonoiden reichen In-vitro-Rhizomgewebe bereit.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein an Flavonoid reiches in vitro-Rhizomgewebe von Neomarica gracilis, welches durch eine Gewebekultur-Präparation unter Verwendung eines N. gracilis-Gewebes bereitgestellt wird, das in der Lage ist, zu proliferieren, wie eine Wurzel oder ein Stiel, ein Blatt, ein Basalabschnitt eines Blattes und/oder ein Rhizom. Das an Flavonoid reiche Rhizomgewebe von N. gracilis enthält Tectorigenin, was deutlich verschieden vom Wildtyp-Rhizom von N. gracilis ist, das kein Tectorigenin enthält. Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum in vitro-Kultivieren des an Flavonoiden reichen Rhizomgewebes, ein Verfahren zum Extrahieren des Tectorigenins aus dem an Flavonoid reichen Rhizomgewebe und quantitative Verfahren zum Bestimmen der Tectorigeninmenge im an Flavonoid reichen Rhizomgewebe bereit.
Phytochemikalien sind Substanzen, die Pflanzen naturgemäß produzieren, um sich gegen Bakterien, Viren und Pilze zu schützen. In letzter Zeit war das Interesse an Phytochemikalien groß, weil viele von diesen Wirkungen auf das Verlangsamen des Alterungsprozesses und das Reduzieren des Risikos bezüglich Krebs, Herzkrankheit und anderen chronischen Krankheitszuständen zeigten.
Mehr als 900 verschiedene Phytochemikalien wurden in Lebensmittelpflanzen gefunden, wobei immer noch andere zu entdecken sind. Früchte, Gemüse, ganze Getreide, Soja und Nüsse sind alles Quellen dieser krankheitsbekämpfenden Substanzen. Phytochemikalien sind normalerweise mit Pflanzenpigmenten verwandt, weshalb Früchte und Gemüse mit hellen Farben (gelb, orange, rot, blau, violett, grün) die meisten enthalten.
Flavonoide sind eine Gruppe von Phytochemikalien, die lange dafür bekannt waren, entzündungshemmende, antioxidierende, antiallergene, leberschützende, antithrombotische, antivirale und antikarzinogene Wirkungen zu besitzen. Flavonoide sind typischerweise phenolische Verbindungen und fungieren daher als starke Metallchelatoren und Fänger freier Radikale. Sie sind starke kettenbrechende Antioxidantien. Die Flavonoide zeigen eine bemerkenswert große Anzahl an biochemischen und pharmakologischen Wirkungen, einige von diesen legen nahe, dass bestimmte Mitglieder dieser Gruppe von Verbindungen die Funktion verschiedener Säuger-Zellysteme signifikant beeinflussen können. Neueste Berichte zeigen, dass Pflanzenflavonoide die Aktivierung von in die Kontrolle der Stickstoffbindung eingebundenen bakteriellen (Rhizobium) Regulierungsgenen auslösen, was auf wichtige Beziehungen zwischen bestimmten Flavonoiden und der Aktivierung und Expression von Sängergenen hinweist (s. z. B. Midddledton et al., Pharmacological Reviews, 2000, 52: 673–751).
Tectorigenin ist ein Flavonoid. In den letzten Jahren gab es eine Entwicklung beim Untersuchen des potentiellen Nutzens von Tectorigenin gemacht, die antibakterielle, entzündungshemmende und krebsvorbeugende Wirkungen gezeigt hat. Darüber hinaus ist gezeigt worden, dass Tectorigenin die Produktion von Prostaglandin anregt, die Proliferation von Makrophagen induziert, die Aktivität von Östrogenrezeptoren selektiv moduliert und die Kontraktion glatter Muskulatur steuert.
Tectorigenin wird im allgemeinen aus Rhizomen von Iridaceae-Pflanzen extrahiert, wir Iris germanica L., Iris pallida Lam, Iris nigricans, Iris ensata, Iris sanguinea, Iris setosa und Belamacanda chinensis (B. chinensis). Die Tectorigeningehalte in den Rhizomen werden durch Wachstumsbedingungen wie Temperatur und Feuchtigkeit beeinflusst. Im Fall der B. chinensis dauert es im allgemeinen 2–3 Wachstumsjahre, bevor die Rhizome zur Tectorigeninextraktion geerntet werden können. Daher gibt es immer noch einen Bedarf an Verfahren, mit denen Pflanzen mit hohem Tectorigeningehalt effektiv gezüchtet werden können.
Neomarica gracilis (N. gracilis) ist eine sehr gebräuchliche Gartenbaupflanze, die zur Iridaceae-Familie gehört. Sie kann bei geringen Kosten in großer Menge kultiviert werden. Allerdings enthalten die Rhizome von natürlich gezüchteten N. gracilis kein Tectorigenin.
In der in den späteren Abschnitten aufzuzeigenden Erfindung wird ein in vitro-Rhizom von N. gracilis aus einer Gewebekultur-Präparation erhalten, welche nach etwa 1 oder 2 Monaten geerntet werden kann. Das in vitro-Rhizom von N. gracilis ist reich an Flavonoiden und enthält einen hohen Gehalt an Tectorigenin, welcher als Quelle für Tectorigenin verwendet werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt ein an Flavonoiden-reiches in vitro-Gewebe von Neomarica gracilis bereit, das in einer Gewebekulturumgebung hergestellt wurde, die den Flavonoidgehalt der Wildtyp-N. gracilis ändert. Insbesondere enthält das an Flavonoid reiche Gewebe der vorliegenden Erfindung eine wesentliche Menge an Tectorigenin.
Das an Flavonoiden reiche in vitro-Gewebe von N. gracilis ist bevorzugt ein Rhizomgewebe, welches aus einem N. gracilis-Gewebe kultiviert wird, das in der Lage ist, zu proliferieren. Beispiele von N. gracilis-Gewebe, das in der Lage ist, zu proliferieren, schließen die Wurzel oder den Stiel, das Rhizom, das Blatt und einen Basalabschnitt des Blatts von N. gracilis ein.
In der Gewebekultur zum Herstellen des an Flavonoiden reichen Gewebes von N. gracilis wird ein Kulturmedium verwendet. Dieses Kulturmedium enthält (1) einen Pflanzenwachstums-Regulator, (2) ein Salzmedium und (3) ein Kohlenhydrat. Der Pflanzenwachstums-Regulator (PWR) schließt Cytokinine oder Auxine ein. Beispiele für PWR schließen Indol-3-essigsäure, 2-4-Dichlorphenoxyessig-säure, α-Naphthalinessigsäure, 6-Benzyl-aminopurin, Kinetin und/oder eine Mischung davon ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Die Konzentration des Pflanzenwachstums-Regulators beträgt bevorzugt etwa 0,01 bis 2,0 mg/l. Das bevorzugte Salzmedium ist ein Basissalzmedium nach Murashige und Skoog (d. h. ein MS-Medium), welches folgende Salze einschließt, aber nicht darauf eingeschränkt ist: Natrium, Kalium, Nitrat, Ammonium, Magnesium, Sulfat, Calcium, Eisen, Chlorid, Phosphat, Mangan, Jod, Borat, Zink, Kupfer, Molybdän, Kobalt oder eine Mischung davon. Beispiele der Kohlenhydrate schließen Myo-Inositol, Saccharose oder eine Mischung davon ein. Wahlweise kann das Kulturmedium ein Vitamin wie Thiamin·HCl, Pyridoxin·HCl und Nikotinsäure und ein Ancymidol enthalten. Das Kulturmedium weist einen pH von etwa 5 bis 7 auf.
Die Gewebekultur-Präparation schließt eine Kolbenkultur, bevorzugt unter einer Schüttel-Bedingung, ein temporäres Eintauchsystem (TIS) oder eine Kombination davon ein.
Das an Flavonoid reiche Gewebe von N. gracilis enthält Tectorigenin in der Menge von etwa 2,5 bis 65 mg pro kg Gewicht des trockenen Gewebes. Die Gesamtmenge an Flavonoiden einer festen Gewebekultur in einem MSO (d. h. ein MS-Medium ohne zugegebenen Pflanzenwachstums-Regulator) beträgt nach 8 Wochen von der Menge her etwa 10,74 mg (basierend auf Messungen unter Verwendung von ψ-Tectorigenin als Standard) pro g Trockengewicht des an Flavonoid reichen Gewebes.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhalt des an Flavonoid reichen in vitro-Gewebes von N. gracilis bereit. Das Verfahren schließt (1) das Impfen eines N. gracilis-Gewebes in ein Kulturmedium der Gewebekultur; und (2) das Züchten des N. gracilis-Gewebes in der Gewebekultur für einen ausreichenden Zeitraum ein, um die Bildung eines Rhizomgewebes zu ermöglichen. Das N. gracilis-Gewebe ist zur Zellreplikation befähigt, wie z. B. eine Wurzel oder ein Stiel, ein Blatt, ein Basalabschnitt eines Blattes oder ein Rhizom.
Das Kulturmedium wird bevorzugt bei etwa 20°C bis 30°C gehalten.
Die Gewebekultur ist eine Kolbenkultur, ein temporäres Eintauchsystem (TIS) oder eine Kombination davon.
Der ausreichende Zeitraum zum Bilden des an Flavonoid reichen Rhizomgewebes von N. gracilis beträgt etwa 4 bis 8 Wochen.
Das TIS ermöglicht dem N. gracilis-Gewebe, etwa alle 2–4 Stunden für etwa 1–3 Minuten in das Kulturmedium eingetaucht zu werden.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Extrahieren des Tectorigenins aus dem an Flavonoid reichen Gewebe von N. gracilis bereit. Das Verfahren umfasst: (1) Trocknen des an Flavonoiden reichen in vitro-Gewebes von N. gracilis, um ein getrocknetes, an Flavonoid reiches Gewebe zu erhalten; (2) Zufügen eines Alkohols zu dem getrockneten, an Flavonoid reichen Gewebe, um eine Suspension zu bilden; (3) Erwärmen der Suspension, um eine erwärmte Suspension zu bilden; und (4) Filtern der erwärmten Suspension, nachdem die erwärmte Suspension abgekühlt hat, um ein Filtrat zu sammeln, welches Tectorigenin enthält. Das bevorzugte Verfahren zum Trocknen des an Flavonoid reichen in vitro-Gewebes ist das durch Gefriertrocknen. Der bevorzugte Weg, die Suspension zu Erwärmen, ist die Verwendung von Ultraschall-Schwingung unter Erwärmen der Suspension für etwa eine Stunde bei etwa 50–70°C. Beispiele des Alkohols, welcher zu dem getrockneten, an Flavonoid reichem in vitro-Gewebe zugegeben werden kann, sind Methanol oder Ethanol. Wahlweise kann das getrocknete, an Flavonoid reiche in vitro-Gewebe zerkleinert werden, bevor der Alkohol zugegeben wird. Vorzugsweise wird das Filtrat durch Passieren der erwärmten Suspension durch einen Whatman^® Nr. 1 Filter gesammelt.
Die Gesamtmenge an aus dem an Flavonoid reichen Gewebe von N. gracilis extrahierten Tectorigenin wird durch eine Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) bestimmt. Die für die HPLC bevorzugte Säule ist eine Cosmosil^® 5 C18-AR-II-Säule. Die bevorzugte Eluenslösung ist eine Lösung, die Methanol und Wasser (mit 0,1% Essigsäure) in einem Volumenverhältnis von 55:45 enthält. Die Tectorigeninmenge wird bei einer Wellenlänge von etwa 265 nm unter Verwendung eines ψ-Tectorigenins (Sigma^® T-9165) als Standard gemessen.
1 ist eine Zeichnung, die das temporäre Eintauchsystem zeigt, welches eines der beiden Gewebekultursysteme ist (das andere Gewebekultursystem ist ein Kolbenkultursystem), die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
2 ist ein Diagramm, das die Wirkung vom Inokkulum-Gewichtsverhältnis auf die Wachstumsrate des an Flavonoiden reichen in vitro-Rhizomgewebes von N. gracilis in einer Kolbenkultur zeigt. Die Daten wurden von dem Rhizomgewebe gesammelt, das für 3 Wochen in einem MS-Medium (Murashige und Skoog Medium) kultiviert wurde, das 0,5 mg/l 6-Benzylaminopurin (BA), 0,1 mg/l 2,4 Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) und 0,84 mg/l α-Naphthalinessigsäure (NAA) enthält. Jeder Datenpunkt stellt ein Mittel von 3 Wiederholungen dar, und die Fehlerbalken stellen die Standardfehler der Mittelwerte dar.
3 ist ein Diagramm, das die Wirkung von Indol-3-essigsäure (IAA) und Kinetin auf den Biomasseanstieg bei dem an Flavonoid reichen in vitro-Rhizomgewebe von Neomarica gracilis zeigt, wo das Rhizomgewebe von einer Kolbenkultur erhalten wird. Jeder Datenpunkt stellt einen Mittel von 3 Wiederholungen dar, und die Fehlerbalken stellen die Standardfehler von den Mittelwerten dar. Biomassenanstieg = Endfrischgewicht – das Frischgewicht 2 Tage vorher.
4 ist ein Diagramm, das die Wachstumskurve von N. gracilis zeigt, die für 8 Wochen in einem MS-Medium gezüchtet wurde, das 0,1 mg/l (♦) von α-Naphthalinessigsäure (NAA) enthält. Jeder Datenpunkt stellt ein Mittel von 3 Wiederholungen dar und die Fehlerbalken stellen die Standardfehler von den Mittelwerten dar.
5 ist ein Diagramm, das den Tectorigeningehalt des an Flavonoid reichen Rhizoms zeigt, das für 8 Wochen in 0,1 mg/l (O) MS + NAA, oder 1 mg/l NAA und 0,1 mg/l 2,4-D (∎) kultiviert wurde. Jeder Datenpunkt stellt ein Mittel von 3 Wiederholungen dar und Fehlerbalken stellen die Standardfehler von den Mittelwerten dar.
6 ist eine Zusammenstellung von Bildern, die die Trieb-Bildung von N. gracilis-Rhizomgewebe unter Anwesenheit von Ancymidol zeigen. Die Photographien wurden nach drei Wochen Kultur gemacht. Balken = 1 cm. Feld (a): 0,5 mg/l Ancymidol, zugegeben am Tag 7; Feld (b): 2,0 mg/l Ancymidol, zugegeben am Tag 7; Feld (c): 2,0 mg/l Ancymidol, zugegeben am Tag 14, und Feld (d): Kontrollkultur ohne jegliches Ancymidol.
7 ist ein Diagramm, das die Wirkung des Inokkulumgewichts und des Pflanzenwachstums-Regulators (PWR) auf die Wachstumsrate von N. gracilis-Rhizomgewebe zeigt. Jeder Datenpunkt stellt das Mittel von 3 Wiederholungen dar und die Fehlerbalken stellen die Standardfehler der Mittelwerte dar. Wachstumsrate = (End-F.G. – anfängliches F.G.)/anfängliches F.G.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein an Flavonoiden-reiches Gewebe von N. gracilis, welches aus einer Gewebekultur eines N. gracilis-Gewebes erhalten wird, das zur Proliferation und Zellreplikation fähig ist, wie Wurzel oder Stiel, Blatt, der Basalabschnitt eines Blattes und Rhizom. Das an Flavonoid reiche Gewebe ist ein in vitro-Rhizomgewebe, welches deutlich verschieden von einem Wildtyp-Rhizom von N. gracilis ist, indem es Tectorigenin enthält. Die neueste Forschung hat gezeigt, daß Tectorigenin beim Eliminieren freier Radikale, beim Anhalten der Tumorprogression und beim Inhibieren pathologischer Bakterien und Pilze, wie H. pylori und Schimmel, etc., medizinische Wirkungen zeigt.
Tectorigenin weist die unten gezeigte Struktur auf:
Tectorigenin wird von Natur aus in Rhizomen, Wurzeln oder Stielen vieler Schwertlilien und Hülsenfruchtpflanzen wie Iris spuria, Iris carthaliniae und Iris germanica und Pueraria thunbergiana gefunden. Allerdings sind die Tectorigeninmengen in diesen Pflanzen zu gering, um als Tectorigeninquellen verwendet zu werden.
Die Hauptquelle von Tectorigenin stammt aus den Rhizomen der natürlich gewachsenen Belamacanda chinensis. Allerdings weist die B. chinensis eine langsame Wachstumsgeschwindigkeit (d. h. vom Säen bis zum Ernten) von etwa zwei bis drei Jahren auf, was die Gewinnung von Tectorigenin schwer durchführbar macht.
Im Gegensatz zu B. chinensis ist N. gracilis eine gängige Halb-Freilandpflanze, die leicht zu züchten und fortzupflanzen ist. Allerdings enthält die N. gracilis kein Tectorigenin. N. gracilis gehört zur Iridaceae-Familie und zur Neomarica-Gattung, welche 16 Arten beinhaltet: N. caerulea, N. capitellata, N. caulosa, N. fluminensis, N. gracilis, N. imbricata, N. longifolia, N. nitida, N. northiana, N. paradoxa, N. portosecurensis, N. rotundata, N. rupestris, N. sabini, N. silvestris und N. variegata. N. gracilis ist in den tropischen Gebieten West-Afrikas und Zentral- und Südamerikas heimisch, mit der höchsten Dichte in Brasilien. N. gracilis ist eine krautartige, mehrjährige Pflanze, die sich durch ein dickes Rhizom und neue Pflänzchen, die sich aus dem Stiel, wo einst Blüten hervorgingen, fortpflanzt.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Züchten eines in vitro-Rhizomgewebes von N. gracilis mit hohen Tectorigeningehalten durch Gewebekulturtechniken für einen relativ kurzen Zeitraum, im allgemeinen zwischen 4 bis 8 Wochen, und stellt somit eine neue Tectorigeninquelle bereit. Das Verfahren umfasst die Schritte vom Impfen eines N. gracilis-Gewebes in ein Kulturmedium, und Züchten des N. gracilis-Gewebes für einen ausreichenden Zeitraum, bis das Rhizomgewebe entwickelt ist.
Das N. gracilis-Gewebe kann irgendein Gewebe sein, das aus einer natürlich gewachsenen N. gracilis oder einer kultivierten N. gracilis erhalten wurde, das zur Proliferation befähigt ist. Bevorzugt ist das N. gracilis-Gewebe ein Gewebe, das aus der Wurzel oder dem Stiel, dem Rhizom, dem Blatt oder dem Basalabschnitt des Blattes von N. gracilis entnommen wird.
Das Kulturmedium umfasst mindestens einen Pflanzenwachstums-Regulator (PWR), ein Salz und ein Kohlenhydrat. PWR verursachen oder fördern die Differenzierung oder Dedifferenzierung des explantierten Gewebes, das in der Kulturkammer fortgepflanzt wird. Beispiele von PWR schließen Auxine und Cytokinine ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
Auxin ist der Wirkstoff in den meisten wurzelfördernden Mischungen. Auxin hilft der vegetativen Fortpflanzung von Pflanzen. Auf einer zellulären Ebene beeinflussen Auxine die Zellausdehnung, Zellteilung und die Bildung von hinzukommenden Wurzeln oder Stielen. Einige Auxine sind bei extrem geringen Konzentrationen effektiv. Auxine können in einem Konzentrationsbereich von 0,0001–20 mg/l, bevorzugt 0,01–10 mg/l und weiter bevorzugt 0,01–2,0 mg/l verwendet werden. Beispiele von Auxinen schließen 4-Biphenylessigsäure, 3-Chlor-4-hydroxyphenylessigsäure, 4-hydroxyphenylessigsäure, Indol-3-essigsäure (IAA), Indol-3-propionsäure, Indol-3-buttersäure, Indol-3-acetyl-L-alanin, Indol-3-acetyl-DL-aspartamsäure, Indol-3-acetyl-DL-tryptophan, Indol-3-acetyl-L-valin, 2,4-dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) und alpha-Naphthalinessigsäure (NAA) ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
Cytokinine begünstigen die Zellteilung, stimulieren die Trieb-Proliferation, aktivieren die Genexpression und die metabolische Aktivität im Allgemeinen. Zugleich inhibieren Cytokinine die Wurzelbildung. Dies macht Cytokinine beim Kultivieren von Pflanzenzellgewebe verwendbar, wo starkes Wachstum ohne Wurzelbildung erwünscht ist. Zusätzlich verlangsamen Cytokinine den Alterungsprozess in Pflanzen. Cytokinin kann in einem Konzentrationsbereich von 0,0001–20 mg/l, bevorzugt 0,01–10 mg/l und weiter bevorzugt 0,01–2,0 mg/l verwendet werden. Beispiele von Cytokininen schließen N-(3-Methyl-2-en-butyl)-1H-Purin-6-amin, 6-Benzyl-aminopurin (BA), Kinetin und Zeatin ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
Beispiele der Salze schließen Salze von anorganischen Säuren wie Salpetersäure, Salzsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Borsäure, Jodsäure; organische Säuren wie Essigsäure, Malonsäure, Mandelsäure, Oxalsäure, Milchsäure, Lactobionsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Weinsäure, Zitronensäure und Ascorbinsäure ein. Das Salz kann ein Natrium-, Kalium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen-, Magnesium-, Mangan-, Zink-, Kupfer- oder Kobaltsalz sein. Das Kulturmedium kann eine Salzmischung enthalten.
In einer Ausführungsform schließt das Kulturmedium Nährstoffe ein, die das Wachstum eines explantierten Pflanzengewebes fördern, wie zum Beispiel die Makro- und Mikronährstoffe, die in Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473–497 (1962) dargelegt sind, welche nachstehend als das "MS Basismedium" bezeichnet werden. Die im MS Basismedium enthaltenen Salze werden als "MS-Salze" bezeichnet. Die im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendeten MS-Salze schließen geeignete Konzentrationen an Ammoniumnitrat, Borsäure, Calciumchlorid, Kobaltchlorid, Kupfersulfat, Na₂-EDTA, Eisensulfat, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Molybdänsäure, Kaliumjodid, Kaliumnitrat, einbasiges Kaliumphosphat, Natriumnitrat, einbasiges Natriumphosphat und Zinksulfat ein.
Der Kohlenwasserstoff kann irgendein Kohlenwasserstoff sein, der einen Nährwert für eine Pflanzenkultur aufweist. Bevorzugt ist der Kohlenwasserstoff ein Saccharid. Weiter bevorzugt ist der Kohlenwasserstoff Myo-Inositol, Saccharose oder eine Mischung davon.
Das Kulturmedium kann zusätzlich andere Komponenten, wie Aminosäuren, Vitamine oder Mischungen davon enthalten. Bevorzugte Vitamine schließen Vitamin B1 (Thiamin·HCl), Vitamin B6 (Pyridoxin·HCl) und Vitamin B3 (Nikotinsäure) ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
Das Kulturmedium wird auf einen pH-Bereich eingestellt, der für das Züchten von N. gracilis geeignet ist. Der pH-Bereich liegt bevorzugt zwischen 4 und 8 und weiter bevorzugt zwischen 5 und 7. In einer Ausführungsform schließt das Kulturmedium geeignete Puffermittel ein, um den pH auf dem gewünschten Niveau zu halten. Diese Mittel werden typischerweise einen pka zwischen etwa 4,5 und etwa 5,5 aufweisen und schließen Zitronensäure, N-Morpholin-Ethansulfonsäure, Kaliumhydrogenphthalat und Benzoesäure ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
Die Temperatur der Kultur wird normalerweise bei oder unter etwa 30°C gehalten, bevorzugt in einem Bereich von etwa 20–30°C.
Die gewünschte Züchtungsdauer beträgt 2 bis 16 Wochen, bevorzugt 4–8 Wochen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Kulturmedium MS-Salz, Saccharose (30 g/l), Myo-Inositol (100 mg/l), 6-Benzyl-aminopurin (BA) (0,5 mg/l), 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) (0,1 mg/l) und α-Naphthalinessigsäure (NAA) (0,84 mg/l).
In einer anderen Ausführungsform wird das N. gracilis-Gewebe bei konstanter Agitation kultiviert. In einer anderen Ausführungsform wird das N. gracilis-Gewebe in einem temporären Eintauchsystem (TIS) kultiviert. Wie in 1 gezeigt, ernährt und oxygeniert ein TIS Pflanzenkulturen durch unterbrochenes Eintauchen des Pflanzengewebes in das Kulturmedium. Kurz gesagt wurde eine Kammer 10 fasst Kulturen 12 auf einem Sieb 14 oder in einem Korb. Unterdruck-Luft wird in die Kammer 10 gepumpt, was das flüssige Medium 16 nach oben zwingt und die Kulturen 12 badet. Der Luftstrom oxygeniert und agitiert das Medium 16 auch. Wenn der Strom ausgeschaltet wird, endet der Druck, und das Medium 16 kehrt auf den Boden der Kammer 10 zurück. Normalerweise sind alle Komponenten des TIS autoklavierbar und wiederverwendbar. Das System kann für Pflanzengewebekulturen im Großmaßstab leicht automatisiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das N. gracilis-Gewebe durch das Kulturmedium alle 2–4 Stunden für 1–3 Minuten eingetaucht.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung stellt kultivierte N. gracilis-Gewebe mit hohen Niveaus an Tectorigenin bereit. In einer Ausführungsform weisen die kultivierten N. gracilis-Rhizomgewebe einen Tectorigeningehalt von 2,5–65 mg/kg Gewicht des trockenen Rhizoms auf. Die kultivierten N. gracilis-Rhizomgewebe weisen einen Gesamtgehalt an Flavonoid von 10,741 ± 0,311 (Mittelwerte ± Standardabweichung) mg/g Gewicht des trockenen Rhizomgewebes in fester, ein MS-Medium ohne zugefügten PWR (MS0) enthaltender Kultur auf, welcher unter Verwendung von ψ-Tectorigenin als Standard gemessen wird.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Extrahieren von Flavonoiden aus N. gracilis-Geweben. Das Verfahren schließt die Schritte des Trocknens des Gewebes, des Zerkleinerns des getrockneten Gewebes, des Suspendierens des zerkleinerten Gewebes in einem Alkohol, des Erwärmens der Suspension und des Filterns der Suspension ein, um Extrakte von Flavonoiden zu erhalten.
Das Pflanzengewebe kann mit irgendeinem Verfahren getrocknet werden, bevorzugt durch Gefriertrocknung unter Verwendung eines gekühlten Vakuumtrockners. Der Alkohol kann irgendein Alkohol sein, bevorzugt Methanol oder Ethanol. Der Alkohol wird bevorzugt auf einen Temperaturbereich von 50°C bis 70°C erwärmt, und weiter bevorzugt wird er unter Schütteln, Vibration oder Ultraschallbehandlung erwärmt. Ein bevorzugtes Vibrationsverfahren ist die Ultraschallwellenschwingung.
Die folgenden experimentellen Ausgestaltungen und Ergebnisse sind veranschaulichend, aber schränken den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht ein. Angemessene Änderungen, wie sie erfahrenen Fachleuten einfallen, können hier gemacht werden. Auch wird beim Beschreiben der Erfindung um der Klarheit willen ein besonderer Fachwortschatz verwendet. Allerdings wird nicht beabsichtigt, die Erfindung durch den so ausgewählten besonderen Fachwortschatz einzuschränken. Es ist verständlich, daß jedes spezifische Merkmal alle technischen Äquivalente einschließt, welche in gleicher Weise arbeiten, um eine ähnliche Aufgabe zu bewerkstelligen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Material und Methoden
An Flavonoid reiches in vitro-Rhizomgewebe von N. gracilis (Neomarica gracilis)
Die an Flavonoid reichen in vitro-Rhizomgewebe von N. gracilis wurden vom Tatung Universitäts-Pflanzengewebekulturlabor kultiviert. Die Rhizomgewebe wurden jeden Monat mit einem mit 30 g/l Saccharose, 100 mg/l Myo-Inositol, 0,5 mg/l BA, 0,1 mg/l 2,4-D und 0,84 mg/l NAA ergänzten MS-Basissalzmedium subkultiviert.
Kulturmedium
Das das MS-Basissalzmedium (Murashige und Skoog, 1962) (Tabelle 1) umfasste das flüssige Kulturmedium, das mit 30 g/l Saccharose, 100 mg/l Myo-Inositol und verschiedenen Pflanzenwachstumsreglern gemäß den verschiedenen Experimenten ergänzt wurde. Das feste Kulturmedium wurde durch Zugeben von 8 g/l Agar zum flüssigen Medium hergestellt. Die feste Kultur wurde in 8 × 1,5 × 1,5 cm Kulturröhren (10 ml Kulturmedium/Röhre) oder Kolben (30 ml Kulturmedium/Kolben) durchgeführt. Die Flüssigkultur wurde in 50 ml, 100 ml oder 250 ml Kolben mit jeweils 10 ml, 50 ml oder 100 ml Kulturmedium durchgeführt. Die Öffnung der Kulturröhre oder des -kolbens wurde mit Aluminiumfolie bedeckt.
Die TIS-Kultur verwendete das Plantima^® System von der A-Tech Bioscientific Co. Ltd. Zu jeder Kulturkammer wurde etwa 200 ml Medium zugegeben. Plastikröhren und sterile Filtermembrane wurden am Gaseinlass und -auslass wie vorgeschrieben platziert.
Die Filtermembran wurde mit Baumwolle und Aluminiumfolie umhüllt, und die Plastikröhren wurden mit Klammern festgemacht, um den Eintritt von Wasserdampf in den Filter zu verhindern.
Die Kulturkammer wurde mit Aluminiumfolie bedeckt.

Alle Kulturmedien wiesen einen pH-Wert von 5,70 ± 0,05 auf und wurden für 15 Minuten bei 121°C bei 1,1–1,2 kg/cm² Druck autoklaviert. Tabelle 1. Die Grundsalz-Zusammensetzung von MS (Murashige und Skoog, 1962)

Chemikalie		mg/l
Makronährstoffe
	KNO₃	1900
	NH₄NO₃	1650
	MgSO₄·7H₂O	370
	CaCl₂·2H₂O	440
	KH₂PO₄	170
Mikronährstoffe
	MnSO₄·4H₂O	22,3
	KI	0,83
	H₃BO₃	0,2
	ZnSO₄·7H₂O	8,6
	CuSO₄·5H₂O	0,025
	Na₂MoO₄·2H₂O	0,25
	CoCl₂·6H₂O	0,025
	FeSO₄·7H₂O	27,8
	Na₂EDTA	37,3

Kolbenkultur

(1) Um die Wirkung des Inokkulumgewichts (ausgedrückt als Prozentsatz von Gramm Frischgewicht des Inokkulums/100 ml Kulturmedium) zu bestimmten, wurde flüssig kultiviertes N. gracilis-Rhizomgewebe einem Subkulturmedium, das ein MS-Grundsalz, 0,5 mg/l BA, 0,1 mg/l 2,4-D und 0,84 mg/l NAA enthält, bei einem Inokkulumgewichtsverhältnis von 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 10 oder 15% (g Frischgewicht (F.G.)/100 ml Medium) inokkuliert. Drei Wochen nach der Impfung wurde das Kulturgewebe gewogen.
(2) Um die Wirkung des Pflanzenwachstums-Regulators (PWR) zu bestimmen, wurden Triebe von flüssig kultiviertem N. gracilis-Rhizomgewebe mit einem Skalpell entfernt. Das Rhizomgewebe wurde bei 3% Inokkulumgewicht (g F.G./50 ml) in ein Kulturmedium inokkuliert, das, wie in Tabelle 2 gezeigt, mit PWR ergänztes MS Basismedium enthält. Das Kulturmedium wurde alle zwei Wochen gewechselt. Das kultivierte Gewebe wurde bei jedem Mediumwechsel für eine Gesamtzeit von acht Wochen gewogen.
(3) Um die Wachstumskurve von N. gracilis-Rhizomgewebe und den Tectorigeningehalt zu bestimmen, wurden von flüssig kultivierten N. gracilis-Rhizomgeweben Triebe mit einem Skalpell entfernt. Die Rhizomgewebe wurden bei einem Inokkulumgewicht (g F.G./50 ml) in das Kulturmedium inokkuliert, das das MS Basismedium enthält, das mit 0,1 mg/l NAA oder einer Mischung aus 1 mg/l NAA und 1,0 mg/l 2,4-D ergänzt wurde. Die Gewebe wurden für acht aufeinanderfolgende Wochen jede Woche gewogen und bezüglich des Tectorigeningehalts untersucht.
(4) Um die Wirkung des Ancymidols auf die Triebbildung und den Tectorigeningehalt zu bestimmen, wurde flüssig kultiviertes N. gracilis-Rhizomgewebe bei 3% Inokkulumgewicht (g F.G./100 ml) zu einem Subkulturmedium inokkuliert, das MS, 0,5 mg/l BA, 0,1 mg/l 2,4-D und 0,84 mg/l NAA enthält. Am Tag 7 und 14 der Kultur wurde steril gefiltertes (0,2 μm) Ancymidol bis zu einer Endkonzentration von 0,5, 1,0, oder 2,0 mg/l zum Kulturmedium zugegeben. Das Wachstum des Gewebes wurde überwacht, und der Tectorigeningehalt wurde analysiert.

Tabelle 2. Wirkung des Pflanzenwachstums-Regulators auf das N. gracilis Gewebewachstum in Kolben-Kultur
TIS-Kultur
Das TIS-Plantima^® Kultursystem wurde von der A-Tect Bioscientific Co., Ltd. in Taipeh, Taiwan erworben.

(1) Um die Wirkung des Inokkulumgewichts auf das Gewebewachstum zu untersuchen, wurde die TIS-Kulturkammer in vier Bereiche eingeteilt. In jeden Bereich wurde flüssig kultiviertes N. gracilis-Rhizomgewebe von 1,5, 3, 6 und 9 g inokkuliert. Das Kulturmedium war ein mit PWR ergänztes MS-Medium, wie in den Proben TI2, TI7 und TI8 der Tabelle 3 beschrieben. Die Gewebe wurden unter Bedingungen kultiviert, wie sie im Plantima^® Benutzerhandbuch ausführlich beschrieben sind, und alle drei Stunden für zwei Minuten eingetaucht. Alle zehn Tage wurde das Kulturgewebe gewogen und das Medium ersetzt.
(2) Um die Wirkung von PWR auf das Wachstum von N. gracilis und den Tectorigeningehalt-Einfluss zu bestimmen, wurden zehn Stück flüssig kultiviertes N. gracilis-Rhizomgewebe in das Kulturmedium inokkuliert, das MS und PWR wie in den Proben MS0, TI3, TI4, TI5 und TI6 der Tabelle 3 beschrieben, enthält. In Woche 2 wurden die Kulturmedien ersetzt und in Woche 4 wurden die Gewebe geerntet und bezüglich des Tectorigeningehalts analysiert.

Tabelle 3. Wirkung des Pflanzenwachstums-Regulators auf das N. gracilis Gewebewachstum in der TIS-Kultur
Extraktion von Tectorigenin und Gesamtmenge an Flavonoid N. gracilis-Rhizomgewebe wurde 10 Stunden bei –80°C gefroren, in einem gekühlten Vakuumtrockner (VirTis Freezemobile 12XL) über Nacht getrocknet und zerkleinert. 0,5 g getrocknetes und zerkleinertes Gewebe wurden in einer hinreichenden Menge Methanol in einem 10 ml Kolben suspendiert, 1 Stunde bei 60°C mit Ultraschallschwingungen inkubiert und gekühlt. Dann wurde Methanol bis zu einem Endvolumen von 10 ml zugegeben. Die Suspension wurde mit einem Whatman Nr. 1 Filterpapier gefiltert. Die filtrierte Lösung wurde in braunen Probenfläschchen verschlossen und für weitere Experimente in einen Kühlraum gestellt.
Vor der Bestimmung des Tectorigeningehalts wurden der Tectorigeninstandard (Sigma T-9165, ψ-Tectorigenin) Lösung und die Proben durch einen 0,45 μm Filter filtriert. Für weitere Analysen wurden die filtrierten Proben in braunen 2 ml HPLC-Fläschchen verschlossen.
Messung der Gesamtmenge an Flavonoid
Die Gesamtmenge an Flavonoid wurde gemäß Lee et al., J. Agric. Food Chem. (2003) 51: 7292–7295 gemessen. Kurz gesagt wurden 4 ml deionisiertes Wasser und 0,3 ml 5% NaNO₂ wurden zu etwa 0,5 ml N. gracilis Extrakt gegeben, um eine Probenmischung zu bilden, und es wurde für etwa 5 Minuten reagieren gelassen. Dann wurden etwa 0,3 ml 10% AlCl₃ zu der reagierten Probenmischung gegeben, und es wurde für zusätzliche 5 Minuten unter gründlichem Schütteln reagieren gelassen. Dem folgte die Zugabe von 2 ml 1 N NaOH und 2,9 ml deionisiertem Wasser zu der weiter reagierten Probenmischung. Dann wurde die Gesamtmenge an Flavonoid in der resultierenden reagierten Probenmischung durch Messen der Absorption bei 510 nm Wellenlänge mit einem UV-Spektrophotometer (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech) gemessen, und durch Vergleichen der Daten mit der Standardkurve unter Verwendung von ψ-Tectorigenin als Standard bestimmt.
Messung von Tectorigenin durch HPLC
Der Tectorigeningehalt des Gewebeextrakts wurde durch HPLC-Analyse unter Verwendung einer Cosmosil 5 C18-AR-II-Säule (5 μm, 4,6 × 250 mm), einer Lichrospher^® 100 RP-18e-Guard-Säule (45 × 4,6 mm, 5 μm, Merck), einer Degasser (ER-3415α)-Pumpe, einem Waters 600E Autosampler und Injektor (Schambeck SGD GmbH S5200), einem Waters TM 486 UV/VIS-Detektor und einem Integrator (SISC Xunhua Ltd.) bestimmt. Die Analyse wurde unter Verwendung eines Methanol:H₂O (0,1% Essigsäure) Verhältnisses von 55:45, einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,8 ml/min und einer Detektionswellenlänge von 265 nm durchgeführt. Der Tectorigeninpeak des Standards erschien bei etwa 13 min.
Statistische Auswertung
Alle Messungen wurden dreimal wiederholt. Die experimentellen Daten wurden unter Verwendung von Duncans multiplem Vergleichstest mit 5% Signifikanzniveau (Duncan D. B. 1955, Biometrics, 11:1–42) ausgewertet.
Morphologische Beobachtung und Photographie
Morphologische Untersuchungen wurden unter einem Seziermikroskop (Olympus SZ-ET) durchgeführt. Photographische Aufnahmen wurden unter Verwendung einer Digitalkamera (Nikon Coolpix 8700) gemacht.
Beispiel 2: Wirkung des Inokkulumgewichts auf das Gewebewachstum in der Kolbenkultur
Flüssig kultiviertes N. gracilis-Rhizomgewebe wurde in ein Submedium inokkuliert, das MS, 0,5 mg/l BA, 0,1 mg/l 2,4-D und 0,84 mg/l NAA bei einem Inokkulumgewicht von 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 10 oder 15% (g Frischgewicht (F.G.)/100 ml Medium) enthält. Wie in 2 gezeigt, bewirkte ein Inokkulumgewicht von 3% (g Frischgewicht (F.G.)/100 ml Medium) die höchste Wachstumsgeschwindigkeit, d. h. etwa einen vierfachen Anstieg des Frischgewichts ((mehrfacher Anstieg des Frischgewichts = End-Frischgewicht – anfängliches Frischgewicht)/anfängliches Frischgewicht). Der Gewichtszuwachs nimmt ab, wenn das Inokkulumgewicht größer als 4% ist, wahrscheinlich aufgrund des begrenzten Platzes und der Nährstoffzufuhr im Kolben.
Beispiel 3: Wirkung von PWR auf das Gewebewachstum und den Tectorigeningehalt in der Kolbenkultur
Das N. gracilis-Rhizomgewebe wurde bei 3% Inokkulumgewicht (g F.G./100 ml) in das Kulturmedium inokkuliert, das mit verschiedenen Mengen an PWR (Tabelle 2) ergänztes MS enthält. Das Kulturmedium wurde gewechselt, und das Frischgewicht der Gewebe wurde alle zwei Wochen gemessen. Während der 6–8 Kultivierung wurden signifikante Anstiege an Frischgewicht beobachtet.

Unter den 15 in Tabelle 2 aufgelisteten Kinetin/IAA Kombinationen führten nur 4 Kombinationen (d. h. B1, C1, C2 und D1) zu signifikanten Anstiegen beim Tectorigeningehalt. Unter den 4 Kombinationen, die zu erhöhtem Tectorigeningehalt führten, stellte die Kombination mit 0,5 mg/l IAA/0 mg/l Kinetin den höchsten Tectorigeningehalt von 37,6 ± 4,9 mg/kg D.W. (Tabelle 4) bereit. Es scheint, daß das Zugeben von Kinetin Kulturmedium nicht zu einem Anstieg bezüglich des Tectorigeningehalts führte. Tabelle 4. Wirkungen von IAA und Kinetin auf das Trockengewicht und den Tectorigenin-Anteil im Rhizomgewebe von Neomarica gracilis

Pflanzenwachstums-Regulator [mg/l]
IAA	Kinetin	Trockengewicht [g]¹	Tectorigenin [mg/kg D.W.]¹
0	0	1,08 ± 0,16 bc²	3,0 ± 0,24 d²
0,5	0,1	0,93 ± 0,06 c	37,0 ± 1,2 a
0,1	0	1,26 ± 0,22 b	11,8 ± 8,4 b
0,5	0	1,02 ± 0,11 bc	37,6 ± 4,9 a
1	0	1,70 ± 0,08 a	29,0 ± 0,29 c

1. Die Daten wurden nach 8-wöchiger Kultur gesammelt, und die Werte sind Mittelwerte von 3 Wiederholungen ± Standardabweichung.
2. Die Mittelwerte innerhalb einer Spalte, denen die gleichen Buchstaben (a bis d) nachfolgen, unterscheiden sich nach Duncans multiplem Vergleichstest (P > 0,05) nicht wesentlich.

Bei Anwesenheit von 2,4-D und NAA wurde außerdem in allen kultivierten Geweben ein erhöhter Tectorigeningehalt gefunden, ebenso wie in einigen nur mit NAA kultivierten Geweben (Tabelle 5). Die höchsten Tectorigeningehalte wurden bei Geweben gefunden, die in Anwesenheit von 1,0 mg/l NAA und 0,1 mg/l 2,4-D (60,9 ± 0,67 mg/kg D.W.), nur 0,5 mg/l NAA (58,9 ± 0,23 mg/kg D.W.) und nur 0,1 mg/l NAA (55,5 ± 0,67 mg/kg D.W.) kultiviert wurden. Wenn NAA alleine verwendet wurde, führte ein Anstieg der NAA-Konzentration zu einem verringerten Trockengewicht. Das höchste Trockengewicht wurde mit einer NAA-Konzentration von 0,1 mg/l (Tabelle 5) erhalten. Tabelle 5. Wirkungen von NAA und 2,4-D auf das Trockengewicht und den Tectorigenin-Anteil im Rhizomgewebe von Neomarica gracilis.

Pflanzenwachstums-Regulator [mg/l]
2,4-D	NAA	Trockengewicht [g]¹	Tectorigenin [mg/kg D.W.]¹
0	0	1,17 ± 0,02 ab²	8,2 ± 0,42 e²
0	0,1	1,39 ± 0,32 a	55,5 ± 0,67 ab
0	0,5	1,03 ± 0,31 bc	58,9 ± 0,23 ab
0	1,0	1,05 ± 0,20 bc	49,0 ± 0,81 bc
0	2,0	0,75 ± 0,02 cd	9,4 ± 0,22 e
0,1	0	0,92 ± 0,15 bc	38,9 ± 1,17 cd
0,1	0,1	1,06 ± 0,03 bc	49,5 ± 1,21 bc
0,1	0,5	0,92 ± 0,13 bc	40,1 ± 0,55 cd
0,1	1,0	0,95 ± 0,01 bc	60,9 ± 0,67 a
0,1	2,0	0,93 ± 0,02 bc	14,5 ± 0,67 e
1,0	0	1,17 ± 0,21 ab	36,7 ± 0,33 cd
1,0	0,1	1,39 ± 0,54 a	35,3 ± 0,23 d
1,0	0,5	1,03 ± 0,12 bc	33,4 ± 0,16 d
1,0	1,0	1,05 ± 0,10 bc	16,5 ± 0,80 e
1,0	2,0	0,75 ± 0,03 cd	38,0 ± 1,13 cd

1. Die Daten wurden nach 8-wöchiger Kultur gesammelt, und die Werte sind Mittelwerte von 3 Wiederholungen ± Standardabweichung.
2. Die Mittelwerte innerhalb einer Spalte, denen die gleichen Buchstaben (a bis e) nachfolgen, unterscheiden sich nach Duncans multiplem Vergleichstest (P > 0,05) nicht wesentlich.

Beispiel 4: Wachstumsgeschwindigkeit von N. gracilis und der Tectorigeningehalt während des Wachstums
Das Rhizomgewebe wurde bei 3% Inokkulumgewicht (g F.G./50 ml) in ein Kulturmedium inokkuliert, das ein mit 0,1 mg/l NAA oder eine Mischung aus 1 mg/l NAA und 1,0 mg/l 2,4-D ergänztes MS Basismedium enthielt. Die Gewebe wurden für acht aufeinanderfolgende Wochen jede Woche gewogen und bezüglich des Tectorigeningehalts analysiert.
Wie in 4 gezeigt, wuchs Rhizomgewebe, das in einem mit 0,1 mg/l NAA ergänztem MS Basismedium kultiviert wurde, während Zeiträumen von 3–4 Wochen und 6–7 Wochen schnell. Während Woche 5 und Woche 8 gab es nur geringes Wachstum. Rhizomgewebe, das in einem mit 1 mg/l NAA und 1,0 mg/l 2,4-D ergänztem MS Basismedium kultiviert wurde zeigte eine ähnliche Wachstumskurve.
Im Hinblick auf den Tectorigeningehalt während des Wachstums wurde bei beiden Kulturbedingungen (jeweils 56 ± 2,82 mg/kg D.W. und 43 ± 2,15 mg/kg D.W. für 0,1 mg/l NAA und 1 mg/l NAA/1,0 mg/l 2,4-D) während Woche 1 der höchste Gehalt nachgewiesen. In Woche 2 verringerte sich der Tectorigeningehalt signifikant, er erreichte 7 ± 0,42 mg/kg D.W. am niedrigsten Punkt und stieg über die Wochen 3–4 schrittweise an. Bei Woche 5 zeigte der Tectorigeningehalt eine weitere signifikante Verringerung, und stieg während der Wochen 6–8 wieder an (5).
Der Gesamtgehalt an Flavonoid in in MS0 (d. h. MS-Medium ohne PWR) in fester Kultur kultivierten Geweben ist im Allgemeinen größer als in MS in flüssigem Kulturmedium und in TIS bei dem gleichen Zeitraum bei der Kultivierung. Der Gesamtgehalt an Flavonoid in fester Gewebekultur, die für etwa 8 Wochen MSO enthielt, war gleich zu etwa 10,74 ± 0,31 ψ-Tectorigenin mg/g Trockengewicht, was dem gesamten Flavonoidgehalt, der von der Pflanze Belamacanda chinensis extrahiert wurde, ähnlich ist, welche für ihren hohen Gehalt an Flavonoid wohlbekannt ist. Der Gesamtgehalt an Flavonoid in der B. chinensis betrug etwa 11,50 ± 0,1 ψ-Tectorigenin mg/g Trockengewicht, das auf dem gleichen wie hier verwendeten Messverfahren basiert.
Beispiel 5: Die Wirkung von Ancymidol auf die Triebbildung und den Tectorigeningehalt von kultivierten N. gracilis-Rhizomgeweben

Flüssig kultiviertes N. gracilis-Rhizomgewebe wurde bei 3% Inokkulumgewicht (g F.G./100 ml) zu einem Subkulturmedium inokkuliert, das MS, 0,5 mg/l BA, 0,1 mg/l 2,4-D und 0,84 mg/l NAA enthält. Am Tag 7 und 14 der Kultur wurde steril gefiltertes (0,2 μm) Ancymidol bis zu einer Endkonzentration von 0,5, 1,0 oder 2,0 mg/l zu dem Kulturmedium zugegeben. Das Wachstum des Gewebes wurde überwacht, und der Tectorigeningehalt analysiert. Wie in Tabelle 6 gezeigt, führte die Zugabe von 0,5 oder 2,0 mg/l Ancymidol zur Gewebekultur am Tag 14 zu einem reduzierten Tectorigeningehalt. Die Zugabe von Ancymidol am Tag 7 der Gewebekultur beeinflusste den Tectorigeningehalt nicht. Jedoch führte die Ancymidolzugabe zur Gewebekultur am Tag 7 zu einer deutlichen Verringerung der Triebbildung (6). Tabelle 6. Wirkung von Ancymidol auf den Tectorigenin-Gehalt von N. gracilis-Rhizomgewebe

Ancymidol [mg/l]	Zugabe-Zeit [Tag]	Tectorigenin¹ [mg/kg D.W.)
Kontrolle	-	32,81 ± 0,72 ab²
0,5	7	28,31 ± 0,11 b
1,0	7	27,74 ± 0,08 b
2,0	7	35,65 ± 0,18 a
0,5	14	18,59 ± 0,07 c
1,0	14	30,81 ± 0,35 a
2,0	14	13,36 ± 0,13 d

1. Die Daten wurden nach 3-wöchiger Kultur gesammelt. Die Werte sind Mittelwerte von 3 Wiederholungen ± Standardabweichung.
2. Die Mittelwerte innerhalb einer Spalte, denen die gleichen Buchstaben (a bis d) nachfolgen, unterscheiden sich nach Duncans multiplem Vergleichstest (P > 0,05) nicht wesentlich.

Beispiel 6: Wirkung des Inokkulums auf den Biomassenanstieg von N. gracilis
Die TIS-Kulturkammer wurde in vier Bereiche aufgeteilt, und in jedem Bereich wurde flüssig kultiviertes N. gracilis-Rhizomgewebe mit einem Inokkulumgewicht von 1,5, 3, 6 und 9 g inokkuliert. Das Kulturmedium war ein mit PWR ergänztes MS-Medium, wie in den Proben TI2, TI7 und TI8 von Tabelle 3 beschrieben. Das kultivierte Gewebe wurde alle zehn Tage gewogen. Wie in 7 gezeigt, stellte das Inokkulumgewicht von 1,5 g in mit 1 mg/l Kinetin ergänztem MS-Medium das beste Gewebewachstum bereit – es erreichte ein Frischgewicht (6,76 ± 0,33 g), das in 30 Tagen das 4,5-fache des Inokkulumgewichts betrug. Alle anderen Inokkulumgewicht/PWR-Kombinationen führten zu langsamerem Wachstum (7).

Um die Wirkung von PWR auf den Tectorigeningehalt zu bestimmen, wurden zehn Teile von flüssig kultiviertem N. gracilis-Rhizomgewebe (jeweils 1,5 g) in MS und PWR enthaltendes Kulturmedium inokkuliert, wie in den Proben MS0, TI3, TI4, TI5 und TI6 von Tabelle 3 beschrieben. Die Gewebe wurden nach 4 Wochen geerntet und hinsichtlich des Tectorigeningehalts analysiert. Wie in Tabelle 7 gezeigt, wurde der höchste Tectorigeningehalt (48 ± 0,22 mg/kg D.W.) mit MS-Medium erhalten, das mit 0,1 mg/l 2,4-D und 1,0 mg/l NAA ergänzt wurde. Tabelle 7. Wirkung von PWR auf das Wachstum und den Tectorigeningehalt von N. gracilis-Rhizomgewebe in TIS Kultur

PWR [mg/l]	F.G. [g]	Wachstumsgeschwindigkeit¹	Tectorigenin [mg/kg D.W.]
Kontrolle	42,63 ± 3,51	1,84 ± 0,23	22 ± 0,11
Kinetin 1,0	46,12 ± 2,18	2,07 ± 0,15	10 ± 0,15
NAA 0,1	40,65 ± 2,09	1,71 ± 0,14	38 ± 0,57
NAA 0,5	31,47 ± 3,12	1,10 ± 0,21	33 ± 0,38
NAA 1,0 + 2,4-D 0,1	30,84 ± 1,13	1,06 ± 0,08	48 ± 0,22
BA 0,5 + 2,4-D 0,1 + NAA 0,84	33,50 ± 1,03	1,23 ± 0,07	40 ± 0,52

Die Werte sind Mittelwerte von 3 Wiederholungen ± Standardabweichung
1. Wachstumsgeschwindigkeit = (End-F.G. – anfängliches F.G.)/anfängliches F.G.

Beispiel 7: Vergleich von Tectorigeningehalt in in Kolben und in TIS kultivierten N. gracilis-Rhizomgeweben
Basierend auf dem Ergebnism von Beispiel 2 stellt die Kombination von 2,4-D und NAA einen höheren Tectorigeningehalt als die Kombination aus IAA und Kinetin bereit. Die höchsten Tectorigeningehalte wurden bei dem MS-Medium erhalten, das mit 0,1 mg/l NAA (Tectorigenin 55,5 ± 0,67 mg/kg D.W.) 0,5 mg/l NAA (Tectorigenin 59,9 ± 0,23 mg/kg D.W.) oder 0,1 mg/l NAA und 1 mg/l 2,4-D (Tectorigenin 60,9 ± 0,67 mg/kg D.W.) ergänzt wurde. Die gesamten Flavonoidgehalte wurden ebenfalls unter diesen Kulturbedingungen bestimmt.
Beispiel 8: Vergleich von Tectorigeningehalten in Rhizomgeweben von kultivierter N. gracilis und Wildtyp-N. gracilis
Tabelle 8 zeigt den Tectorigeningehalt in Rhizomgeweben von kultivierter N. gracilis und Wildtyp-N. gracilis. Die Ergebnisse zeigen, daß Wildtyp-N. gracilis-Rhizomgewebe kein Tectorigenin aufwiesen, aber die kultivierten N. gracilis-Rhizomgewebe wiesen einen Tectorigeningehalt von 55,5 ± 0,67 mg/kg D.W. auf. Tabelle 8. Der Tectorigenin-Gehalt in Rhizomgeweben von kultivierter N. gracilis und Wildtyp N.-gracilis

Tectorigenin [mg/kg D.W.]²

im Kolben kultiviertes Rhizom¹ 55,5 ± 0,67

Wildtyp-Rhizom ND³

1. Das Rhizom Kulturmedium war MS mit 0,1 mg/l NAA
2. Die Werte sind Mittelwerte von 3 Wiederholungen ± Standardabweichung
3. ND = nicht detektierbar

Beispiel 9: Das Extrakt von kultiviertem N. gracilis-Rhizomgewebe inhibiert Tumorzellenwachstum
Das Extrakt von kultiviertem N. gracilis-Rhizomgewebe, das unter Verwendung des in Material und Methoden beschriebenen Arbeitsablaufs erhalten wurde, wurde in vitro in kultivierten Tumorzellen getestet. Das Extrakt zeigte gegenüber menschlichen normalen Darmzellen in dem Konzentrationsbereich von 0,1% bis 20% keine Toxizität. Allerdings inhibiert das Extrakt das Wachstum von Mausmelanomzellen (B16-F0) bei Konzentrationen von 3,13%, 25% und 50%. Das Extrakt wurde auch gegenüber der akuten myeloischen Leukämiezelllinie PLB985 und der menschlichen Brustkrebszelllinie MCF7 unter Verwendung der Lucigeninanalyse getestet, um die Bildung von Peroxid zu überwachen, gefolgt von der Analyse freier Radikale durch einen Antioxidans-Analysator. Das Ergebnis zeigte, daß das Extrakt das Wachstum der zwei Tumorzelllinien inhibierte.
Die in dieser Beschreibung veranschaulichten und diskutierten Ausführungsformen sind lediglich dazu beabsichtigt, den Fachleuten den den Erfindern besten bekannten Weg zu lehren, um die Erfindung durchzuführen und zu verwenden. Nichts in dieser Beschreibung sollte als die vorliegende Erfindung einschränkend betrachtet werden. Die oben beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung können modifiziert oder variiert werden, und es können Elemente zugefügt oder weggelassen werden, wie es von Fachleuten angesichts der obigen Lehren verstanden wird, ohne von der Erfindung abzuweichen. Daher ist es verständlich, daß die Erfindung anders als speziell beschrieben ausgeführt werden kann.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Nicht-Patentliteratur

- (s. z. B. Midddledton et al., Pharmacological Reviews, 2000, 52: 673–751) [0004]
- Lee et al., J. Agric. Food Chem. (2003) 51: 7292–7295 [0060]
- (Duncan D. B. 1955, Biometrics, 11:1–42) [0062]

Claims

An Flavonoiden reiches in vitro-Gewebe aus Neomarica gracilis, das aus einer Gewebekultur-Präparation erhalten wird, welche den Flavonoidgehalt der N. gracilis ändert, wobei das an Flavonoiden reiche Gewebe Tectorigenin umfasst.
An Flavonoiden reiches in vitro-Gewebe aus N. gracilis gemäß Anspruch 1, wobei das an Flavonoiden reiche in vitro-Gewebe ein Rhizomgewebe ist, das aus einem N. gracilis-Gewebe kultiviert wird, das zur Proliferation befähigt ist.
An Flavonoiden reiches in vitro-Gewebe aus N. gracilis gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das N. gracilis-Gewebe Wurzel oder Stiel, Rhizom, Blatt oder Basalabschnitt eines Blattes umfasst.
An Flavonoiden reiches in vitro-Gewebe aus N. gracilis gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Gewebekultur-Präparation ein Kulturmedium umfasst, welches einen Pflanzenwachstums-Regulator enthält.
An Flavonoiden reiches in vitro-Gewebe aus N. gracilis gemäß Anspruch 4, wobei der Pflanzenwachstums-Regulator Cytokinine oder Auxine umfasst.
An Flavonoiden reiches in vitro-Gewebe aus N. gracilis gemäß Anspruch 5, wobei die Pflanzenwachstums-Regulator mindestens einer ist, der aus der aus Indol-3-essigsäure, 2-4-Dichlorophenoxyessigsäure, α-Naphthalinessigsäure, 6-Benzylaminopurin und Kinetin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
An Flavonoiden reiches in vitro-Gewebe aus N. gracilis gemäß Anspruch 4, wobei die Konzentration des Pflanzenwachstums-Regulators etwa 0,01 bis 2,0 mg/l beträgt.
An Flavonoiden reiches in vitro-Gewebe aus N. gracilis gemäß Anspruch 4, wobei das Kulturmedium ferner ein Murashige- und Skoog-Basissalzmedium (MS-Medium) umfasst.
An Flavonoiden reiches in vitro-Gewebe aus N. gracilis gemäß Anspruch 8, wobei das MS-Medium Natrium, Kalium, Nitrate, Ammonium, Magnesium, Sulfat, Calcium, Eisen, Chlorid, Phosphat, Mangan, Jod, Borat, Zink, Kupfer, Molybdän, Kobalt oder eine Mischung davon umfasst.
An Flavonoiden reiches in vitro-Gewebe aus N. gracilis gemäß Anspruch 4, wobei das Kulturmedium ferner ein Kohlenhydrat umfasst.
An Flavonoiden reiches in vitro-Gewebe aus N. gracilis gemäß Anspruch 10, wobei das Kohlenhydrat Myo-Inositol oder Saccharose oder eine Mischung davon ist.
An Flavonoiden reiches in vitro-Gewebe aus N. gracilis gemäß Anspruch 4, wobei das Kulturmedium ferner ein Vitamin umfasst.
An Flavonoiden reiches in vitro-Gewebe aus N. gracilis gemäß Anspruch 12, wobei das Vitamin mindestens eines ist, das aus der aus Thiamin·HCl, Pyridoxin·HCl und Nikotinsäure bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
An Flavonoiden reiches in vitro-Gewebe aus N. gracilis gemäß Anspruch 4, wobei das Kulturmedium ferner ein Ancymidol umfasst.
An Flavonoiden reiches in vitro-Gewebe aus N. gracilis gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Kulturmedium einen pH von etwa 5 bis 7 aufweist.
An Flavonoiden reiches in vitro-Gewebe aus N. gracilis gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Gewebekultur-Präparation eine Kolbenkultur, ein temporäres Eintauchsystem (TIS) oder eine Kombination davon ist.
An Flavonoiden reiches in vitro-Gewebe aus N. gracilis gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Menge an Tectorigenin etwa 2,5 bis 65 mg pro kg Gewicht des trockenen Gewebes beträgt.
Verfahren zum Erhalt des an Flavonoiden reichen in vitro-Gewebes aus N. gracilis gemäß Anspruch 1, umfassend: Inokkulieren eines N. gracilis-Gewebes in ein Kulturmedium der Gewebekultur-Präparation; wobei das N. gracilis-Gewebe zur Proliferation befähigt ist; und Züchten des N. gracilis-Gewebes in der Gewebekultur-Präparation für einen ausreichenden Zeitraum, um einem Rhizomgewebe zu ermöglichen, sich zu bilden.
Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei das Kulturmedium bei etwa 20°C bis 30°C gehalten wird.
Verfahren gemäß Anspruch 18 oder 19, wobei das N. gracilis-Gewebe eine Wurzel oder einen Stiel, ein Blatt, einen Basalabschnitt eines Blattes oder ein Rhizom umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei die Gewebekultur-Präparation eine Kolbenkultur, ein temporäres Eintauchsystem (TIS) oder eine Kombination davon ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei der ausreichende Zeitraum etwa 4 bis 8 Wochen beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei das TIS dem N. gracilis-Gewebe erlaubt, etwa alle 2–4 Stunden für etwa 1–3 Minuten in das Kulturmedium eingetaucht zu werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 bis 23, wobei das Kulturmedium einen Pflanzenwachstums-Regulator, ein Salzmedium und ein Kohlenhydrat umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei der Pflanzenwachstums-Regulator Cytokinine oder Auxine umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei der Pflanzenwachstums-Regulator mindestens einer ist, der aus der aus Indol-3-essigsäure, 2-4-Dichlorphenoxyessigsäure, α-Naphthalinessigsäure, 6-Benzylaminopurin und Kinetin bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei die Konzentration des Pflanzenwachstums-Regulators etwa 0,01 bis 2,0 mg/l beträgt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 27, wobei das Salzmedium ein Basissalzmedium nach Murashige und Skoog (MS-Medium) ist, welches Natrium, Kalium, Nitrat, Ammonium, Magnesium, Sulfat, Calcium, Eisen, Chlorid, Phosphat, Mangan, Jod, Borat, Zink, Kupfer, Molybdän, Kobalt oder eine Mischung davon umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Kohlenhydrat Myo-Inositol oder Saccharose oder eine Mischung davon ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 29, wobei das Kulturmedium ferner ein Vitamin umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei das Vitamin mindestens eines ist, das aus der aus Thiamin·HCl, Pyridoxin·HCl und Nikotinsäure bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 31, wobei das Kulturmedium einen pH von etwa 5 bis 7 aufweist.
Verfahren zum Extrahieren von Tectorigenin aus dem an Flavonoiden reichen in vitro-Gewebe von N. gracilis gemäß Anspruch 1, umfassend: Trocknen des an Flavonoiden reichen in vitro-Gewebes von N. gracilis, um ein getrocknetes, an Flavonoiden reiches Gewebe zu erhalten; Zugeben eines Alkohols zu dem an Flavonoiden reichen in vitro-Gewebe, um eine Suspension zu bilden; Erwärmen der Suspension, um eine erwärmte Suspension zu bilden; und Filtern der erwärmten Suspension, nachdem die erwärmte Suspension abgekühlt hat, um ein Filtrat zu sammeln, welches das Tectorigenin enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 33, wobei das getrocknete, an Flavonoiden reiche in vitro-Gewebe dadurch erhalten wird, dass das getrocknete, an Flavonoiden reiche in vitro-Gewebe einer Gefriertrocknung unterworfen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 33 oder 34, wobei die Suspension auf etwa 50–70°C erwärmt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 33 bis 35, wobei die Suspension unter Vibration erwärmt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 36, wobei die Vibration durch Ultraschallwellen erzeugt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 33 bis 37, wobei der Alkohol Methanol oder Ethanol ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 33 bis 38, wobei das Filtrat durch Passieren der erwärmten Suspension durch einen Whatman^® Nr. 1 Filter gesammelt wird.
Verfahren zum Bestimmen der Menge des Tectorigenins in dem an Flavonoiden reichen in vitro-Gewebe aus N. gracilis gemäß Anspruch 33, umfassend: Bestimmen der Menge des Tectorigenins durch eine Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC).
Verfahren gemäß Anspruch 40, wobei die HPLC eine Cosmosil^® 5 C18-AR-II-Säule enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 40 oder 41, wobei das Tectorigenin mit einer Eluenslösung eluiert wird, die Methanol und Wasser (mit 0,1% Essigsäure) in einem Volumenverhältnis von 55:45 enthält.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 40 bis 42, wobei die Menge des Tectorigenins bei einer Wellenlänge von etwa 265 nm unter Verwendung eines ψ-Tectorigenins als Standard gemessen wird.
Extrakt des an Flavonoiden reichen in vitro-Gewebes aus N. gracilis gemäß Anspruch 33, wobei das Extrakt eine Anti-Tumor-Wirkung aufweist.